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Universidad de Chile

Facultad de Ciencias

Fisiología General 2014.

Guía de estudio para las exploraciones computacionales.

Este documento contiene la teoría necesaria para entender las exploraciones computacionales de tres

días lunes por la tarde. Se presenta el modelo de dos estado aplicado a canales de iones activados por

voltaje. En las exploraciones computacionales se harán simulaciones de los corrientes que se registran

en membranas con canales únicos, pocos canales y muchos canales. Se aplica diversas técnicas de

análisis de señales para descubrir las características de estos canales. Las simulaciones están en libros

Microsoft Excel® y funcionan bajo las versiones 2007 o 2010. Los programas usan macros y necesitan

que el complemento Solver está instalado. Los programas se pueden descargar de U-Cursos y se espera

que los estudiantes lean esta guía, se familiaricen con los programas y practiquen los ejercicios antes de

las ayudantías. Tres días lunes por la tarde (ver calendario del programa del curso) habrá una sala con

computadores para practicar las exploraciones computacionales con la ayuda prestada por profesores y

ayudantes del curso. La asistencia a las ayudantías es voluntaria, pero los contenidos de esta actividad

serán tema de preguntas de las pruebas del curso.

El modelo de dos estados.

Muchas veces en biología encontramos sistemas que se comportan como si tuvieran dos estados. Por

ejemplo, una enzima puede estar activa o inactiva, una proteína puede estar unida o no con un ligando,

un residuo puede estar o no fosforilado, un canal de iones puede estar abierto o cerrado. En este

trabajo examinaremos las propiedades del modelo de dos estado usan como ejemplo los canales de

iones.

Examinemos un sistema compuesto de N canales. Cada canal puede estar solo en una de dos estados:

abierto o cerrado. Representamos con las letras A y C los estados abierto y cerrado del canal. Para

analizar la dinámica del sistema vamos a dividir el tiempo en intervalos pequeños, t. La constante es

la probabilidad de un canal cerrado se abra durante un t. La constante es la probabilidad de un canal

abierto se cierre durante un t. En el sistema hay Na canales abiertos y Nc canales cerrados. En cada t

se abren y se cierran algunos canales. La variación del número de canales abiertos, Na, en un intervalo

de tiempo t es igual al número de canales que se cierran, Nat, menos el número de canales que se

abren, Nct.

tNctNaNa (1)

La probabilidad de encontrar un canal abierto, p se define como Na/N. Como los canales tiene solo dos

estados, entonces la probabilidad de encontrar un canal cerrado es 1-p = Nc/N.

tptpp 1 (2)

2

Dividiendo por t y para un intervalo de tiempo infinitesimal, encontramos la ecuación diferencial que

describe la el cambio de la probabilidad del canal abierto:

ppdt

dp 1 (3)

Que queda más clara en esta forma:

pdt

dp (4)

Para resolver la ecuación definamos una variable x = -(+)p, cuya derivada con respecto al tiempo es

dx/dt =-(+)dp/dt =-(+)x, que se puede integrar resultando lnx(t)= -(+)t + Cte. El resultado de la

integración de la ecuación 4 es entonces:

Ctettp )(ln (5)

Que podemos escribirla como: tAetp )( , donde A = eCte. Dividiendo por +

obtenemos:

teA

tp

)( (6)

Para un tiempo muy largo, la función exponencial decrece a cero y la probabilidad del canal abierto se

hace independiente del tiempo y en estado estacionario, p() resulta ser:

)(p (7)

Si la condición inicial es una probabilidad p(0), entonces

A

pp )()0( , con lo que

encontramos la constante que faltaba: )()0(

ppA

. La ecuación 6 entonces se puede

escribir como;

teppptp )()0()()( (8)

Se define el valor recíproco de la sumas de las constantes alfa y beta como la constante de tiempo del

sistema, y se designa con la letra .

1 (9)

3

La ecuación 8 escrita de otra forma nos dice que si se desplaza el equilibrio desde el estado estacionario

hacia un valor cualquiera p(0), el sistema vuelve al estado estacionario a través de una función

exponencial: /)()0()()( teppptp (10)

Para una membrana con N canales, el número de canales abiertos en estado estacionario es N[/(+)].

Si alfa = beta el número de canales abiertos es N/2. En caso de un sistema con N=1 la ecuación 7 se

cumple cuando el canal único esta abierto la mitad del tiempo y cerrado al otra mitad del tiempo. En

general:

cerradotiempoabiertotiempo

abiertotiempop

)(

(11)

Si aplicamos una diferencia de potencial eléctrico a través, V, de una membrana que tiene un solo canal,

esperamos medir una intensidad de corriente, i, que en promedio en el tiempo será:

)()( ViVgpi (12)

En esta ecuación g es la conductancia del canal único y Vi es el potencial eléctrico en que la corriente se

hace cero, es el potencial de inversión de la corriente del canal. La intensidad de la corriente se mide en

amper, A, el potencial eléctrico en volt, V, y la conductancia en siemens, S. Si a un canal que tiene una

conductancia de 1 pico siemens se le aplica una diferencia de potencial de 1 volt sobre Vi, pasará una

corriente de 1 pico amper, cuando está abierto. Si observamos el curso temporal de la corriente

manteniendo V constante veremos intervalos de tiempo en que la corriente toma el valor 0 cuando el

canal está cerrado y toma el valor i = g(V-Vi) cuando está abierto. Este es un ejemplo de la corriente

registrada en un canal de 25 pS cuando se le aplica una diferencia de potencial de 50 mV, simulada en la

hoja de cálculo Excel® que usará durante este trabajo

En la figura se observa que la corriente toma dos valores: cerca de 1 pA para el estado abierto y 0 pA

para el cerrado, que la probabilidad de encontrarlo abierto es cercana a 1/2, que los intervalos abiertos

y cerrados son todos de diferente duración, y que hay una fluctuación rápida de la corriente tanto en

estado cerrado como abierto, que simula el ruido instrumental.

Problema: De la figura se puede leer que la intensidad de la corriente es 0.9 pA para el canal abierto. Si g = 25 pS y V = 0.05 volt,

calcule Vi, usando la ecuación 12.

Solución usando Solver de Excel®. El problema es muy simple de resolver usando el álgebra, pero lo resolveremos en forma numérica esta vez usando el Complemento Solver de Excel®, para conocerlo y comprobar que esté instalado en sus sistema, porque más adelante lo usaremos en problemas más complicados. La ecuación está planteada así:

4

En la celda B1 está el resultado esperado, en B2 la conductancia, B3 el potencial de la membrana y en B4 el potencial de inversión de la corriente. En B5 está la ecuación de la corriente en función de los parámetros g, V y Vi: =B2*(B3-B4) que representa i = g(V-Vi). Vi = 0, i= 1.25. Ahora usamos Solver para buscar qué valor en la celda B4 hace que el contenido de B5 se exactamente 0.9. El complemento Solver se encuentra en el menú Datos. Para resolver el problema se escoge B5 como la celda objetivo, para buscar un valor de 0.9, cambiando las celdas variables B4. Solver también se puede usar para buscar máximos o mínimos, como se ve le la figura. La búsqueda de mínimos la usaremos más adelante para hacer ajustes de curvas usando como criterio la minimización de los errores al cuadrado.

Solver resuelve el problema después al hacer Clic sobre el botón Resolver. El potencial de inversión de la corriente es 14 mV.

El valor promedio de la corriente del canal único es la suma de la corriente de cada estado multiplicada

por su probabilidad. La corriente del canal abierto es i y su probabilidad es p. La del canal cerrado es 0 y

su probabilidad es 1-p. Por lo tanto <i> = ip + 0(1-p), <i> = ip. Para una membrana con N canales <I> =

Nip.

)( NipI (13)

La varianza de la corriente es la suma de la diferencia entre la corriente de cada estado y la corriente

promedio, al cuadrado, y multiplicadas por su probabilidad. 2=(i-ip)2p+(0-ip)2(1-p). Sacando factor

común i2p(1-p) tenemos 2=i2p(1-p)(1-p+p) o bien 2=i2p(1-p). Para una membrana con N canales la

varianza es 2=Ni2p(1-p). (La demostración la hacen ustedes, ver más abajo). Usando la ecuación 13 la

varianza de la corriente para una membrana con N canales es:

N

IiII

22

(14)

La ecuación 14 nos dice que podemos conocer la conductancia unitaria y contar el número de canales

presentes en una membrana si podemos medir la corriente promedio y su varianza, haciendo

experimentos que nos permita cambiar la probabilidad del canal abierto. Por ejemplo usando diferentes

concentraciones de un agonista que abra el canal, o cambiando la tensión a la cual está sometida la

membrana, la temperatura, o el potencial eléctrico.

Para el caso de los canales que se abren con variaciones del potencial eléctrico, la intensidad de la

corriente depende tanto de la probabilidad del canal abierto como del potencial eléctrico. ( Ver ecuación

12) En estos casos es más conveniente estudiar la conductancia del canal, ya que es independiente del

potencial aplicado. La varianza de la conductancia de una membrana con N canales se obtiene

dividiendo la varianza de la corriente por (V – Vi)2. Ahora <G> es la conductancia promedio de la

membrana.

N

GgGG

22

(15)

5

Tarea: Demuestre que para una membrana con 2 canales la varianza de la corriente es 2i2p(1-p). Recuerde que la corriente

promedio es 2ip, la corriente para dos canales abiertos es 2i y su probabilidad es p2, la corriente de un canal abierto es ip y su

probabilidad 2p(1-p); la corriente de 2 canales cerrados es 0 y su probabilidad es (1-p)2. Con este resultado y con la varianza

2=i2p(1-p) para N = 1, demuestre que

2=Ni2p(1-p).

Duración promedio de los eventos abiertos y cerrados. Para esta análisis vamos a extraer cada uno de

los eventos, desde el principio del evento hasta su

final. El primer evento abierto empieza en t = 8 y

termina en t = 50. Este evento está copiado en la

segunda fila, pero desplazándolo hasta el origen de la

escala de tiempo. El mismo procedimiento lo

repetimos para los seis eventos siguientes que están

en la filas 3 al la 7.

En la fila 8 está la suma de todos los eventos

extraídos. Esta fila nos muestra el número de eventos

que dura al menos el tiempo señalado en el eje

horizontal. Los seis eventos duran al menos 1 unidad

de tiempo pero ninguno dura más de 55 unidades de

tiempo. Este análisis se puede hacer para todos los

eventos de un registro de la corriente de un canal

único. Supongamos que hemos extraído N eventos.

Para t = 0 tenemos N canales pero a medida que pasa

el tiempo el número de canales va decreciendo. Como

nuestra observación de cada evento termina cuando

el canal se cierra, para nunca más abrirse, es como si

la constante fuera cero. De acuerdo con las

ecuaciones 7 y 9, p() = 0, = 1/ y el número de

canales que duran al menos t unidades de tiempo es:

n(t) = Ne-t. Es una función exponencial decreciente

que termina en cero para t muy largos. La duración

promedio de los eventos la podemos calcular

integrando el área bajo la curva n(t) y usando la

definición de promedio de una función ( ver mean of a

function más abajo). La integral entre t = 0 e es N/.

Un rectángulo de N por 1/ tiene igual área por lo

tanto la duración promedio de los eventos abiertos es

1/ unidades de tiempo. Por el mismo procedimiento, podemos encontrar que la duración promedio de

los eventos cerrados es 1/. Tenemos dos nuevas ecuaciones:

11 cerradoabierto tt (16a, b)

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Mean of a function (http://en.wikipedia.org/wiki/Mean)

In calculus, and especially multivariable calculus, the mean of a function is loosely defined as the average value of the function over

its domain. In one variable, the mean of a function f(x) over the interval (a, b) is defined by

b

adxxf

abf )(

1.

La probabilidad de encontrar el canal abierto depende de la energía del canal abierto y de la energía del canal cerrado. La probabilidad de encontrar el iésimo estado, en un sistema de que tiene muchos estados depende de su energía Ei.

kTE

iie

ZEp

/1)(

(17)

Esta ecuación se conoce como la distribución de Boltzmann, donde Ei s la energía del estado, k es la constante de Boltzmann, que es energía por kelvin, T la temperatura absoluta, kelvin. Z se conoce como la función de partición que tiene un valor tal que la suma de las probabilidades de todos los estados sea = 1.00. Si la energía se expresa en unidades de energía por mol el denominador debe tener las mismas unidades por lo que multiplica k por el número de Avogadro, mol-1. El producto Nk es R la constante de los gases. A 25°C, 298 kelvin, el producto RT es 0.6 kcal/mol, o 2.5 kJ/mol.

Para un canal de iones que tiene dos estados, con energía Ea, para el abierto y Ec para el cerrado, la probabilidad del canal abierto es:

kTEckTEa

kTEa

eZ

eZ

eZp

//

/

11

1

(18)

Que también se puede expresar como

kTEaEcep

/1

1

(19)

Donde se ve que cuando los dos estados tienen la misma energía la probabilidad del canal abierto es 0.5. Si la energía del canal cerrado es mayor que la del canal abierto el exponente será negativo, la función exponencial tendrá un valor pequeño y la probabilidad del canal abierto será alta, el canal estará abierto. Si la energía del canal cerrado es menor que la del canal abierto el exponente será positivo, la función exponencial tendrá un valor grande y la probabilidad del canal abierto será pequeña, el canal estará cerrado. La diferencia de energía entre los estados abierto y cerrado puede depender de la temperatura, de la tensión de la membrana, de la fosforilación de un residuo, de la concentración de un agonista, o del potencial eléctrico.

Consideremos el caso de los canales de sodio de los nervios. En estado de reposo de la célula existe un potencial eléctrico negativo en su interior y los canales están cerrados. Estos canales se abren si la membrana se despolariza, es decir, si pierde su potencial eléctrico negativo. Por lo tanto, en ausencia de un potencial eléctrico los canales están abiertos. En ausencia de un potencial eléctrico la energía de los canales abiertos es menor que la de los canales cerrados. En presencia del potencial eléctrico la energía de los canales cerrados es menor y los canales se cierran.

El potencial eléctrico es la energía por unidad de carga eléctrica, joule/coulomb. 1 J/C es 1 volt. En las membranas de las células tiene una diferencia de potencial, V, del orden de las decenas de milivolt, el lado intracelular negativo con respecto al extracelular. Una carga eléctrica, Q, en el borde intracelular de

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la membrana tiene una energía eléctrica igual a QV . Si esta carga se desplaza en el interior de la membrana recorriendo desde el borde extracelular hasta una fracción f del espesor de la membrana, su energía eléctrica será QfV. Para un residuo que tenga una valencia z, la cantidad de carga por mol es el z veces el número de Faraday, F, y su energía eléctrica es zfFV . F = 96500 coulomb por mol.

Supongamos que nuestro canal tiene una carga móvil positiva acoplada a la compuerta del canal. Se

llama carga de compuerta. Cuando la carga está cerca del borde extracelular de la membrana, f 0, la

compuerta está abierta, si la carga se nueve hasta estar cerca del borde intracelular de la membrana, f 1, cierra la compuerta.

La diferencia de energía entre los estados abiertos y cerrados tiene un componente que es independiente del potencial eléctrico, Ec – Ea, debido a la conformación de la proteína, a esta energía conformacional hay que agregarle la energía eléctrica. Para el estado abierto la carga de compuerta se encuentra a una distancia fa del borde de la membrana por lo tanto la energía del estado abierto es Ea + zfaFV. Para el estado cerrado la energía es Ec + zfcFV. La diferencia de energía del estado cerrado menos

la energía del estado abierto es entonces Ec-Ea + zFV, donde es fc -fa. Incluyendo la energía eléctrica en la ecuación 19 podemos escribir una ecuación para p en función de V.

RTFVzEaEcep

/1

1

(20)

Como suponemos Ec > Ea, en ausencia de potencial eléctrico el exponente de la ecuación 20 es negativo y la probabilidad del canal abierto es alta. El exponente cambia de signo al aplicar un potencial negativo suficientemente grande y los canales se cierran. La probabilidad del canal abierto es 0.5 para un

potencial Vo tal que 0 FVozEaEc , por lo tanto FVozEaEc . La probabilidad del canal abierto es entonces

RTVoVFzep

/1

1

(21)

A 25°C el producto RT es 2.5 kJ/mol y F es aproximadamente 105 coulomb/mol, entonces RT/F es aproximadamente 2.5 10-

2 J/C o 25 mV.

La figura representa las energías de los estados abierto y cerrado de un canal hipotético. La escala vertical es energía en unidades de RT/F y la escala horizontal es f, la posición de la carga en el espesor de la membrana En el estado abierto, la carga eléctrica se encuentra a una distancia 0.2 del borde extracelular de la membrana y en estado cerrado esta distancia es 0.8. Los pozos de energía marcados con línea delgada representan las energías conformacionales de los estados abierto y cerrado en ausencia de potencial eléctrico Ea y Ec. Un potencial intracelular de -100mV es igual a 8 RT/F para z = 2. La energía eléctrica de esta carga z = 2 en función de f está representado por la línea recta. Los pozos marcados con líneas gruesas resultan de la suma de la energía eléctrica más las energías conformacionales. En ausencia de potencial Ea - Ec = -

2.4 RT/F y la probabilidad del canal abierto es 0.92. Para V = -100 mV, Ea – Ec +zFV/RT = +2.4 RT/F y la probabilidad del canal abierto es 0.08

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Ejercicio: Dibuje la curva p vs V a 25°C para zf = 3 y Vo = -20 mV.

Solución usando Solver de Excel®.

En las celdas B1, B2 y B3 van las constantes que definen la función.

En las celdas A9, A10, A11 y siguientes van las variables independientes. En este cado una lista de potenciales entre -100 y + 100 mV.

En la celda B9 la formula de p en función de V, Vo, y z, Note que las referencia a las constantes llevan signos $ lo que significa que son referencias absolutas a las celdas B1, B2 y B3. La referencia a la celda A9 no lleva $, es una referencia relativa. Al estar en la celda B9 , A8 hace referencia a la celda de la misma fila en la columna de la izquierda.

Si copia la fórmula de B9 a B10, la celda B10 tendrá la fórmula =(1+EXP(-$B$1*(A10-$B$2)/$B$3))^-1

Si copia la fórmula de B9 a B11, la celda B11 tendrá la fórmula =(1+EXP(-$B$1*(A11-$B$2)/$B$3))^-1.

Copiando la fórmula de B9 en el intervalo B10 hasta B29 se calcula p para todos los valores de V.

Para hacer una representación gráfica XY seleccione el intervalo desde A9 hasta B29, luego haga clic sobre los botones Insertar y Dispersión

El resultado es

Que con un poco de trabajo queda más presentable así:

Tarea: Dibuje la curva i vs V para un canal que tiene una curva p vs V del ejercicio anterior, una conductancia de 10 pS y un potencial de inversión de -70 mV.

Tarea: Dibuje la curva i vs V para un canal que tiene una curva p vs V del ejercicio anterior, una conductancia de 10 pS y un potencial de inversión de +40 mV.

Solución usando Solver de Excel®.

A la hoja de cálculo del ejercicio anterior agregue en el intervalo C9 a C29 la curva i vs V para el canal abierto. La ecuación es i = g(V-Vi) que tiene dos constantes g y Vi. Luego en el intervalo D9 a D29 calcule el producto de las columnas B * C para obtener i = gp(V-Vi).

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Exploración computacional.

El libro Excel CanalesUnicos.xlsm, disponible en U-Cursos, contiene un simulador de canales únicos dependientes de voltaje. Este libro funciona bajo Excel 2007 o 2010 con el complemento Solver instalado y contiene macros. A ejecutar el libro por primera vez es necesario habilitar el uso de macros. Para que las simulaciones se ejecuten rápido es necesario configurar Excel para cálculo manual de las planillas (Las hojas de cálculo se actualizan cada vez que se toca la tecla F9 ).

En la Hoja1 de CanalesUnicos.xlsm está el control del simulador y en las Hojas 2, 3 y 4 estarán los resultados de las simulaciones.

La primera simulación.

En la celda A2 está el voltaje al cual se hará la simulación. Escriba 50 en la celda A2 y acepte la entrada

con Enter . La simulación se ejecuta al apretar la tecla F9, y se presenta en forma gráfica la intensidad de la corriente, pA, en función del tiempo, ms. Cuando el canal está cerrado la intensidad de la corriente es cercana a 0 pA y cuando está abierto es cercana a 0.9 pA. En las celdas A8 a G8 está el resultado de un análisis de la simulación.

A8 es el potencial de la membrana, V, en milivolt. B8 es la intensidad de corriente promedio, <I>, medida en pA.

C8 es la varianza de la intensidad de la corriente, 2I, medida en pA2.

D8 es la intensidad de la corriente para el canal abierto, i, pA. E8 es el la suma de los intervalos de tiempo en que el canal estuvo abierto, en ms. F8 es el la suma de los intervalos de tiempo en que el canal estuvo cerrado, en ms. G8 es el número de veces que el canal se abrió durante la simulación.

Análisis de la simulación:

Intensidad de la corriente. Compare la intensidad de la corriente unitaria para el canal abierto, i, y con la intensidad de corriente promedio <I>. Use la ecuación 13 para explicar porqué <I> < i.

Estado estacionario p(): Calcule la probabilidad del estado abierto, como la fracción del tiempo que los

canales se encuentran abiertos, p() ecuación 11.

Compruebe que el resultado es el esperado de la ecuación 7: p= /( +). En las celdas D2, D3, yD4

están los valores de , y la razón /( +) con que se hizo la simulación.

Cinética , . Calcule la duración promedio de los eventos abiertos y cerrados dividiendo el tiempo total

en cada estado por el número de eventos, ecuación 11. Calcule las constantes y tomado el valor recíproco del tiempo promedio abierto y cerrado, como lo indica las ecuaciones 16 a y b. Compare su cálculo con los valores esperados (D2 y D3).

Segunda simulación:

Escriba 70 en la celda A2 y acepte la entrada con Enter y haga la simulación, F9.

Intensidad de la corriente. Compare la intensidad de la corriente del canal abierto, medida a 70 mV con la que midió a 50 mV. Compruebe que aunque la corriente aumenta con el potencial eléctrico el cambio no es proporcional. Use la ecuación 12 y las corrientes medidas a 50 y 70 mV para calcular la conductancia unitaria del canal, g, y el potencial de inversión de la corriente, Vi. Como está usando la corriente del canal abierto p = 1.

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Estado estacionario: Compare la probabilidad del canal abierto, medida a 70 mV con la que midió a 50

mV. La ecuación 7 se puede escribir como p()=1/(1+/) para compararla con la ecuación 21. Calcule

la razón / para 70 mV y compárela con la medida 50 mV. Determine el signo de z de la ecuación 20

sobre la base de comparar las razones /. Note que el razón / puede cambiar cambiando , o ambas a la vez. Esto se aclara con el paso que sigue.

Cinética. Determine y usando la duración promedio de los estados cerrados abiertos para encontrar

el origen del cambio a la razón /.

Más simulaciones.

En la Hoja1 hay unos Controles que llaman subrutinas escritas en Visual Basic. Para que funcionen se debe permitir los Macros al iniciar Excel.

Opciones O, H y A Controlan el análisis de los resultados. Clic sobre una Opción para activarla, y anular las otras dos. Por ahora dejar marcado 0 para un análisis mínimo y rápido.

Simula. Clic sobre Simula ejecuta una simulación usando el potencial eléctrico contenido en la ComboBox con la etiqueta V. Copia el resultado del analisis de la simulacion en la Hoja2 ( Celdas A8 a G8). Además, suma al contenido de la ComboBox V el contenido de la Combo Box Delta V.

Borra. Clic sobre este control limpia los resultados acumulados en la Hoja2, Hoja3 u Hoja4, según la Opción seleccionada y copia el contenido de la ComboBox V en la celda A2.

El contenido de las Combo Box V y Delta V se selecciona usando la el botón .

Genere una serie de 16 simulaciones usando potencial eléctrico desde -30 mV hasta 120 mV. V = -30 mV, Delta V = 10 mV. Para analizar los resultados active la Hoja2 donde encontrá una lista como la de la figura.

Determinacion de la conductacia unitaria y el potencial de inversión de la corriente. Haga un gráfico de la intensidad de la corriente del canal abierto en función del potencial eléctrico. Note que no hay dato en la culumna i abierto para V = 10 y V = 20 mV. Seleccione los datos que usará en el gráfico, dejando fuera las filas que no tienen celdas en blanco. Manteniendo apretada la tecla Ctrl, haga clic sobre las celdas que incluirá en el gráfico. Una vez seleccionadas las celdas haga clic sobre Insertar en el menu superior y luego sobre Dispersión. Agregue una Linea de Tendencia Lineal, haciendo clic con el botón derecho sobre el gráfico y luego clic sobre Agregar Linea de Tendencia. En la ventana de la línea de tendencia escoja el tipo Lineal y pida Presentar la ecuación en el gráfico. Con la ecuación de la línea de tendencia y calcule la conductacia g en pS y el potencial de inversión en mV ( Ecuación 12 con p = 1). Compare los valores obtenidos con los que calculó antes usando sólo dos determinaciones, 50 y 70 mV.

V prom i var i i abierto t, abierto t, cerrado eventos

mV pA pA2 pA ms ms

-30 -0.0022 0.0026 -1.1292 7 4993 7

-20 -0.0020 0.0029 -0.8826 13 4987 11

-10 -0.0035 0.0029 -0.6301 26 4974 18

0 -0.0061 0.0032 -0.3751 86 4914 29

10 -0.0054 0.0015

20 0.0104 0.0021

30 0.0638 0.0206 0.3749 847 4153 92

40 0.2144 0.0889 0.6250 1716 3284 115

50 0.4758 0.1905 0.8749 2718 2282 123

60 0.7338 0.2883 1.1249 3263 1737 110

70 1.1679 0.2422 1.3746 4248 752 88

80 1.4966 0.1933 1.6252 4604 396 62

90 1.7976 0.1405 1.8752 4793 207 56

100 2.0851 0.0840 2.1250 4906 94 36

110 2.3490 0.0621 2.3751 4945 55 26

120 2.6136 0.0311 2.6251 4978 22 15

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Conductacia unitaria y el número de canales.

La ecuación 15 nos dice que podemos conocer la conductancia unitaria y contar el número de canales presentes en una membrana si podemos medir la conductancia promedio y su varianza. En la Hoja2, columnas B y C encontramos los datos de la corriente promedio y la varianza de la corriente.

Calcule una columna con la conductancia promedio, en pS, a partir de la intensidad de corriente promedio, pA, el potencial eléctrico, V, y el potencial de inversión determinado anteriormente.

ViV

IG

(22)

Recuerde dividir por 1000 el potencial eléctrico para calcular la conductancia en pS.

La varianza de la corriente tiene un componente que no corresponde a la fluctuación de la corriente de los canales sino que al ruido instrumental del equipo de medida. Esta varianza es necesario sustraerla

del total. Para estimar esta varianza, 2

Vi , haga una simulación para V = Vi, en que en que no hay

corriente pasando por los canales y solo hay ruido instrumental. En este caso Vi = 15 mV. Calcule una

columna con la varianza de conductancia, 2

G en pS2, a partir de la varianza de corriente promedio, pA2,

el potencial eléctrico, V.

222

2

ViV

VoIg

(23)

Recuerde dividir por 1000 el potencial eléctrico para calcular la varianza en pS2.

Haga un gráfico de la varianza de la conductancia vs la conductancia promedio. Agréguele una línea de tendencia polinómica de orden 2 y pida mostrar la ecuación en el gráfico. Según la ecuación 15,

N

GgGG

22

, el coeficiente de <G>2 es -1/N, N = 1 como era de esperar. El coeficiente de <G> es g

la conductancia unitaria del canal, que resultó ser 25 pS. Compare este resultado con el usado para la simulación (Hoja1 celda F4). Este método se usa para determinar la conductancia unitaria y el número de canales para membranas que tengan muchos canales, de la misma clase.

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La probabilidad del canal abierto.

Calcule la probabilidad del canal abierto para cada potencial eléctrico en que tenga datos t, cerrado y t, abierto. Haga un gráfico de p vs V como el la figura de la dercha. Excel no sabe ajustar una línea de tendencia a este tipo de curvas. La vamos a encontrar usando el método del mínimos cuadrados.

Calcule una función p vs V usando una estimación inicial de z y Vo para

la ecuación 21. Por ejemplo z = 1 y Vo = 70 mV. Agregue estos datos a la figura. Para agregar los datos seleccione las dos columnas, V y p(calculado). Copie las columnas usando Ctrl c, haga clic sobre la figura y pegue los datos así: clic sobre la figura, clic sobre Pegar, Pegado especial, Nuevas Serie, Columnas y Categorías en la primera columna. La figura queda ahora como se ve a la derecha.

Calcule la suma de los errores al cuadrado para cada fila

[p(experimental) – p(Calculado)]2 en la celda F3.

Pida a Solver que encuentre un MÍNIMO para la celda que contiene suma de cuadrados (F3 en este

ejemplo) modificando las celdas que contienen z y Vo (E1 y E2). Con este procedimiento encuentra los

valores de z y Vo, en este ejemplo, 1.9 y 49 mV. La figura queda ahora como se ve a la derecha. Compare los resultados con los valores usados por el simulador, que están en la Hoja1 celdas H1 y F2.

Calcule la diferencia de energía entre los estados abierto y cerrado en ausencia de potencial eléctrico

aplicado. Exprese la energía en kJ/mol, y kcal/mol. FVozEaEc .

Cinética. , . Para cada potencial calcule la duración promedio de los eventos abiertos y cerrados dividiendo el tiempo total en cada estado

por el número de eventos, ecuación 11. Calcule las constantes y tomado el valor recíproco del tiempo promedio abierto y cerrado, como lo indica las ecuaciones 16 a y b. Haga un gráfico de alfa y beta en función de V y agregue una línea de tendencia exponencial. Esta observación nos enseña que este canal es dependiente de voltaje porque las constantes alfa y beta son funciones exponenciales del

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voltaje. Con las ecuaciones de las líneas de tendencia calcule Vo, el

potencial al cual = Compare este valor con el determinado de las

mediciones de la p vs V. Calcule 0, el valor de alfa y beta para Vo.

Cambie la escala del potencial restando Vo. Con este cambio de escala podemos escribir ecuaciones para las constantes alfa y beta de esta forma:

RTVoVFxze /

0

RTVoVFzxe /1

0

(24a,b)

La ecuación 7 se puede escribir como p=1/(1+/) para compararla con la ecuación 21. Encuentre la

ecuación para p() usando los ecuaciones 24 a y b y compruebe que recupera la ecuación 21.

RTVoVFzep

/1

1

El parámetro x de las ecuaciones 24 determina cómo se reparte el efecto del potencial eléctrico sobre alfa y beta. En este caso x = 0.5 que es el valor usado por el simulador (Hoja1, celda H2). Para x = 0 alfa sería independiente de V y todo el efecto del potencial sería sobre beta. Lo opuesto aplica para x = 1.

Distribución de los intervalos de tiempo abierto y cerrado.

En la sección anterior calculamos las constantes y a partir de la duración promedio de los eventos, ecuaciones 16 a y b. Pero estas ecuaciones las encontramos para una distribución exponencial de los tiempos de permanencia en los estados abierto y cerrado. Ahora vamos a demostrar que esto se cumple para nuestro canal simulado.

Al activar la Opción H nuestro libro Excel construye el histograma de la duración de los eventos abiertos y cerrados dejando los resultados en la Hoja3. Active la Opción H y haga simulaciones desde 30 a 70 mV con delta V de 5 mV. Abra la Hoja3 y compruebe que la distribución de la duración de los eventos es exponencial y que las constantes de las exponenciales son beta y alfa.

Autocorrelación.

La ecuación 10 nos indica el curso temporal de la probabilidad del canal abierto en función del tiempo.

La probabilidad tiende siempre a volver a p() si se la perturba. El curso temporal es una función

exponencial con una constante de tiempo igual a (+ ; /)()0()()( teppptp

Esta constante de tiempo se puede recuperar calculando la función de autocorrelación, R, de un registro de la corriente que pasa por el canal. Para una serie de N medidas de la corriente en función del tiempo x(i), tomadas a intervalos regulares de tiempo, se puede calcular la función auto correlación con esta fórmula.

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xixxix

xtixxix

tRtNi

i

tNi

i

)()(

)()(

)(

1

1 (25)

Para t = 0 la función R vale 1.0. R decrece exponencialmente con el tiempo t con una constante de

tiempo igual a (+

Nuestro libro Excel calcula la función auto correlación cuando se activa la Opción A y deja los resultados en la Hoja4. Active la Opción A y haga simulaciones desde 30 a 70 mV con delta V de 5 mV. Abra la Hoja4 y compruebe que las funciones de auto correlación para cada potencial son funciones exponenciales con constantes que son las suma de beta + alfa.

En este ejemplo calculado para v = 50 mV la constante de la

exponencial es 0.103 que es igual a la suma de + para V = 50 mV (Celdas D2 y D3 de la Hoja1).

Calcule las constantes de tiempo para V desde 30 hasta 70 mV en intervalos de 5 mV. Compare la curva con la esperada para la

constante de tiempo =1/(α+β).

Segunda exploración computacional.

Membranas con muchos canales.

El libro Excel MuchosCanales.xlsx contiene un simulador de membranas con muchos canales como los vistos en la exploración anterior usando el libro CanalesUnicos.xlsx. Los controles de este simulador se encuentran en la Hoja1 y para que funcionen debe estar habilitado el uso de Macros.

Borra. Limpia las hojas 2, 3 y 4 donde se guarda los resultados de las simulaciones. Simula. Ejecuta una simulación. V. El potencial eléctrico al cual se hace la simulación. Delta V el cambio de V de una simulación a la siguiente. Estado t = 0. Determina el estado inicial de los canales: Abierto, p=1, Cerrado, p = 0, o

Estacionario, p = /(+). N. El número de canales en la membrana. O. Simulación con un mínimo de análisis. Los resultados quedan en la Hoja2. R. Simulación con registro de la cinética de relajación de la corriente. Esta opción se activa sólo si el estado inicial de los canales es Abierto o Cerrado. A. Simulación con cálculo de la función de auto correlación. Esta opción se activa sólo si el estado inicial de los canales es Estacionario.

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Intensidad de la corriente en función del potencial eléctrico.

La intensidad promedio de la corriente que pasa por una membrana con N canales es <I>=Ngp()(V-Vi). Investigue la forma de esta curva usando simulaciones a diferentes potenciales. Por ejemplo, para explorar desde -30 mV hasta 120 mV en pasos de 10mV, use V =-30 mV, Delta V = 10 mV, N = 1000, estado t== Estacionario, opción O. Cada vez que haga clic sobre Simula el sistema simula una registro de la corriente de 5000 milisegundos y lo muestra gráficamente. El promedio de la corriente y su varianza quedan en una lista en la Hoja2. Haga un gráfico de <I> vs V usando los datos de la Hoja2.

La conductancia de la membrana es <G> = Ngp(). Para p() = 1 la conductancia es la máxima Gmax = Ng. La probabilidad del canal abierto en función de V la encontramos antes y multiplicando la ecuación 21 por Ng tenemos

RTVoVFze

GG

/

max

1

(26)

Para calcular la conductancia se necesita conocer Vi.

Cálculo de la conductancia máxima y del potencial de inversión. Para este cálculo necesitamos hacer

medidas con todos los canales abiertos, p() = 1, tal como lo hicimos en la exploración anterior mirando sólo los eventos abiertos. Par esto haremos simulaciones que empiecen con todos los canales abiertos. Esta simulación imita un experimento en que primero se abren los canales aplicando un potencial muy grande y espera hasta llegar a un

estado estacionario en que se cumpla p() = 1. Luego cambiamos el potencial y medimos la corriente instantánea, que se registra a este

potencial, antes de que cambie la probabilidad p() = 1 que va a evolucionar hasta una probabilidad dada por la ecuación21 siguiendo un curso temporal dado por la ecuación 8. Esto se logra especificando Estado t = 0 Abierto.

Colecte datos de la corriente instantánea. Por ejemplo, para explorar desde -30 mV hasta 120 mV en pasos de 10mV, use V =-30 mV, Delta V = 10 mV, N = 1000, estado t=0 Abierto, opción O. Clic V para definir V de la primera simulación, clic en Simula 16 veces, esperando que la simulación termine para cada V. Los resultados de la corriente instantánea quedan en la Hoja2. Haga un gráfico con Línea de Tendencia Lineal. La pendiente de la recta es Gmax en pA/mV, o nano siemens, nS. La recta corta el eje de V en Vi, el potencial de inversión de la corriente.

Medida del número de canales, N y la conductancia unitaria, g. Estas propiedades se pueden obtener del análisis de la varianza de la conductancia. Con los datos de la corriente promedio y el potencial de inversión de la corriente calcule una columna con la conductancia de la membrana <G> = <I>/(V-Vi) y

otra columna con la varianza de la conductancia 2G=2

I/(V-Vi)2. Haga un gráfico con una Línea de Tendencia Polinómica de orden 2. Calcule N y g usando la ecuación 23 para interpretar los coeficientes del polinomio. Compruebe que Gmax = Ng.

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Medida de los parámetros que definen p() en función de V: z y Vo. Grafique la conductancia promedio en función del potencial eléctrico. La ecuación de la curva es la descrita por la ecuación 26. Para obtener

z y Vo usando Solver, tenemos que calcular <G> en función de V usando la ecuación 26 con parámetros arbitrarios, tales que la curva

teórica pase cerca de la experimental. Por ejemplo Gmax = 2000, z = 3 y Vo= 40. Calcule la suma de los errores al cuadrado y pida a Solver que

busque un mínimo para esta suma cambiando Gmax, z y Vo. Con estos valores encontrados por Solver la curva teórica pasa por sobre todos los puntos experimentales

Con z y Vo puede calcular p() para cada potencial. Con la probabilidad a cada V, Gmax y Vi puede se puede recuperar la curva <I> vs V. Haga el cálculo y compruebe.

Medida de la constante de relajación 1/(a+). La constante de relajación se puede medir calculando la función auto correlación, como lo vimos en la primera exploración en membranas con un solo canal.

Conociendo la constante de relajación para cada V y p(), se pueden calcular las constantes y para cada V. Nuestro libro Excel calcula la función auto correlación. Por ejemplo, para explorar desde 30 mV hasta 70 mV en pasos de 10mV, use V =30 mV, Delta V = 10 mV, N = 1000, estado t=0 = Estacionario, opción A. Clic en Auto correlación hace la simulación y la función auto correlación se copia en la Hoja4. Grafique la función auto correlación en función del tiempo y agregue una Línea de Tendencia

Exponencial. El coeficiente del exponente es -(+ ). Haga un

gráfico de la constate de tiempo y p() vs. V, y p(). Observe que

para Vo p() = 0.5 y tau es máxima. Calcule ypara cada potencial y grafique los valores en función

de V en escala logarítmica. Usando la ecuaciones 24 a y b calcule x, z y Vo.

Medida directa de la constante de relajación. Nuestro Libro Excel calcula la curva de relajación de las corrientes usando la opción R para Estado t=0 ya sea Abierto o Cerrado. El curso temporal de la corriente será función del curso temporal de la probabilidad del canal abierto, que está descrita por la ecuación 10. Por ejemplo, para explorar desde 0 mV hasta 60 mV en pasos de 10mV, use V =0 mV, Delta V = 10 mV, N = 1000, estado t=0 = Abierto, opción R. o, para explorar desde 40 mV hasta 100 mV en pasos de 10mV, use V =40 mV, Delta V = 10 mV, N = 1000, estado t=0 = Cerrado, opción R. La curva de relajación se copia en le Hoja5 donde está preparado el escenario para encontrar la constante de relajación de la ecuación 10, usando el ajuste de mínimos cuadrados y Solver.

Compruebe que la constante de relajación resulta ser la misma si se parte desde todos los canales abiertos o todos los canales cerrados. Compare los resultados con los obtenidos usando la función auto correlación.

La distribución binomial. En una membrana con N canales, el número de canales abiertos debe seguir la distribución binomial. Por ejemplo, para una membrana con dos canales la probabilidad de encontrar todos los canales abiertos es p2 la probabilidad de encontrar uno abierto y uno cerrado es 2p(1-p) y la probabilidad de encontrar todos los canales cerrados es (1-p)2. Haga simulaciones con N = 1, 2, 3 o 4 para diferentes potenciales y vea si estos canales obedecen a la distribución binomial. El procedimiento

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de análisis lo crean ustedes los estudiantes del curso. La lista de las corrientes está en la Hoja1, columna B desde B11 hasta B5010. Ejemplo para N = 3 y V = 50 mV.