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Índice:
Índice y objetivos: Página 1 Separación proteínas por electroforesis (SDS-PAGE): Página 2 Digestión con tripsina: Página 5 Espectrometría de masas: Página 6
Objetivos:
El objetivo de la práctica consiste en aislar una proteína de un grupo de ellas e identificarla. Para alcanzar el fin del experimento se debe concluir una serie de pasos, estos siguen una temporalidad a lo largo de cinco días.
Los procesos resumidos son:1. Separación proteínas mediante electroforesis de 1 dimensión. (separación
en función de masa).2. Digestión con tripsina que corta la posiciones carboxilo de los residuos de
Lisina y Arginina (ambos con cadena laterales cargadas positivamente).3. Después de la hidrólisis obtenemos los péptidos.4. Mediante una cromatografía en fase reversa separamos los trozos
obtenidos de la hidrólisis de los no cortados.5. La medición del tamaño de péptidos la haremos mediante una
Espectrometría de masas; obtenemos la huella peptídica de la proteína, que es caraterística de cada proteína.
6. La bioinformática nos permite conocer que proteína es la que estamos tratando, al acudir a una base de datos en la que introducimos el peso molecular de la proteína y de cada trozo cortado con tripsina. Para esto necesitamos un programa Aldente y nos conectaremos a él a través de un servidor de acceso libre: EXPASY.
Sin embargo, es importante definir la utilidad de cada paso a seguir en el proceso aislamiento e identificación de la molécula.
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Separación de Proteínas Mediante Electroforesis (SDS-PAGE)
Es una técnica que se utiliza para separar proteínas de acuerdo con su movilidad electroforética. Gracias al SDS la mayoría de proteínas adquieren una relación carga/masa idéntica, por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece únicamente a la longitud de la cadena.
El proceso de separación ocurre gracias a dos fases formadas con diferentes composiciones de geles; en la parte baja va el gel de separación más concentrado que el de empaquetamiento. Con esta distribución logramos que en el gel de empaquetamiento las moléculas corran igualmente, llegando a la vez al gel de separación, por el que corren dependiendo de su longitud.
Para realizar la electroforesis se utilizan los siguientes compuestos químicos:
Acrilamida (C 3 H 5 NO): Es un sólido que cuando se encuentra en disolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta; el resultado es que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. Sin embargo, si se le añaden radicales libres el proceso ocurre mucho más rápido. La acrilamida es un compuesto neurotóxico.
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Bisacrilamida(C7H10N2O2). Su estructura está compuesta por dos moléculas de poliacrilamida enlazadas por sus grupos amino, no reactivos de cara a la polimerización. Por ello, la bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de poliacrilamida, y así evita el deslizamiento de éstas y conduce a la formación del gel.
PSA (persulfato amónico) es la fuente de radicales libres y con ello es el iniciador de la pilomerización.
TRIS (C 4 H 11 NO 3). Su pKa es de 8,3 a 20 ° C, por lo que es un buffer muy satisfactorio en el rango de pH de aproximadamente 7 a 9. Este agente químico irá en todos los tampones: separación, empaquetamiento, de carga y reservorio, pero en diferentes concentraciones.
Glicina (amino ácido acético) (C 2 H 5 NO 2).Se ha utilizado como la fuente de iones de arrastre o lento debido a su pKa es 9,69 y la movilidad de glicinato son tales que la movilidad efectiva se puede establecer a un valor inferior al de las proteínas más lento conocido de carga negativa neta en el rango de pH.. El pH mínimo de este rango es de aproximadamente 8,0.
Temed (C6H16N2). Es un propagador de la polimerización. Aumentando su contenido se disminuye la longitud media de la cadena de polímero y se incrementa la turbidez del gel, al tiempo que disminuye su elasticidad. Se añadirá al gel de separación.
Glicerol (C3H8O3). Contribuye a que la muestra baje por los pocillos que se encuentran en la parte superior (gel empaquetamiento) debido a su densidad. Va en el tampón de carga.
2-mercaptoetanol (HS-CH2CH2OH). Es un agente reductor que se utiliza para romper los enlaces disulfuro garantizando que la proteína está totalmente desnaturalizada antes de la carga en el gel, así se garantiza que la proteína corra de manera uniforme a través del gel. Va en el tampón de carga.
Azul de bromofenol (BPB) (C19H10Br4O5S). Es el colorante marcador universal. Las proteínas y ácidos nucleicos son en su mayoría incoloros. BPB es el medio más utilizado de seguimiento, porque es viable en pH neutro y alcalino, es una molécula pequeña, es ionizable y está cargado negativamente, por encima de pH 4.6 y por lo tanto, se mueve hacia el ánodo. Al ser una pequeña molécula que se mueve por delante de la mayoría de las proteínas y ácidos nucleicos, nos sirve como indicación de cuando terminar la electroforesis. Se enlaza con las proteínas débilmente y dar color azul.
Dodecilsulfato sódico (SDS) (C12H25NaO4S). se envuelve alrededor del polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven
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insignificante cuando se compara con las cargas negativas aportadas por SDS. Sin SDS, proteínas con pesos moleculares similares que migran de manera diferente debido a las diferencias en la proporción de carga en masa, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico y peso molecular particular a su estructura primaria. Añadir SDS resuelve este problema, ya que se une a la proteína y la rodea, dando una cierta carga negativa uniforme a lo largo de la longitud del polipéptido.
Para hacer la electroforesis se necesita poner la muestra en el tampón de carga que se inoculará en los pocillos. A medida que se aplica un voltaje, los aniones (y las muestras de moléculas cargadas negativamente) migran hacia el electrodo positivo en el gel inferior. Puesto que el voltaje cae entre los buffers de cloro y glicina, las proteínas se apilan en finas capas. Los polipéptidos irán moviéndose en función de su tamaño los que más abajo vayan serán los más pequeños y viceversa.
El siguiente paso consiste en teñir con azul de Coomasie el gel de separación y se retira el de empaquetamiento. Es de tipo aniónico, y se une a proteínas de modo inespecífico. Su estructura es predominantemente no polar, por lo que habitualmente se usa en disolución con metanol y acético . Las proteínas del gel se fijan gracias al ácido acético y al mismo tiempo se tiñen. El colorante en exceso que se incorpora en el gel se puede eliminar destiñendo con una disolución de composición idéntica excepto por el colorante. Luego se aclara todo con agua y se deja sumergido una noche. Las proteínas se detectan como bandas azules contra un fondo claro. Posteriormente se escanea el gel.
Mi banda corresponde a la banda de 50 kD. Sin embargo el resultado de la recta patrón no es ese sale alrededor de 100 kD incluso corrigiendo al descartar valores altos y bajos de tamaño del estándar. Podría ser que el estándar no estuviese en buen estado y a la hora de hacer la recta me salen datos muy desviados.
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Digestión con tripsina de las proteínas separadas mediante electroforesis SDS-PAGE.
Lo primero que se hace es recoger el gel y cortar la banda que queremos e introducirlo en tubo con una disolución de bicarbonato amónico que sirve para ir retirando el tinte y esto se hace combinado con temperatura y agitación.
Es importante definir cual es el mecanismo de acción de la tripsina, que se añade a continuación para entender el experimento.
El mecanismo enzimático que es similar a otras serín proteassa.. Estas enzimas contienen una tríada catalítica consiste en histidina-57, aspartato-102, y serina-195. Estos tres residuos forman un relé de carga que sirve para hacer el sitio activo nucleofílico con serina. Esto se logra mediante la modificación del medio ambiente electrostático de la serina. La reacción enzimática que catalizan tripsinas es termodinámicamente favorable, pero requiere la energía de activación significativa (que es "cinéticamente desfavorable"). Además, la tripsina contiene un "agujero oxianión" formado por los átomos de hidrógeno de las amidas de la Gly-193 y Ser-195 que forman el esqueleto, que sirve para estabilizar la carga negativa sobre el átomo de oxígeno carbonilo de la amida troceados.
El residuo de aspartato (Asp 189) en el bolsillo catalítico (S1) de las tripsinas es responsable de captar y estabilizar cargado positivamente la lisina o arginina, y es por tanto responsable de la especificidad de la enzima. Esto significa que la mayor parte de tripsina rompe las proteínas en la parte carboxilo (o "C-terminal") de la lisina, y arginina, excepto cuando uno es seguido por prolina. Las tripsinas se consideran endopeptidasas, es decir, la división se produce en la cadena polipeptídica en lugar de en las zonas terminales situada en los extremos de los polipéptidos.
Las tripsinas tienen un pH óptimo de funcionamiento de alrededor de 8 y la temperatura óptima de funcionamiento de alrededor de 37 ° C.
La tripsina es producida en el páncreas, en forma de zimógeno inactivos, en forma de tripsinógeno.
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Representación esquemática de la tripsina
Por lo tanto una vez añadido el enzima a la muestra ya tendríamos péptidos aunque también polipéptidos (la tripsina), nos interesa quedarnos con los primeros, y desechar los segundos.
Preparación de los péptidos para la espectrometría de masas
Antes de pasar la muestra por el espectrómetro de masas se debe separar los péptidos trípticos de los polipéptidos restantes. Esto se consigue mediante una cromatografía en fase reversa, siendo la fase estacionaría una columna de C18 (Zip-Tip ed Millipore). En la fase móvil (líquida) iría la muestra.
Previamente se desnaturaliza la muestra gracias al ácido trifluoro acético (TFA), pero siempre en unas cantidades que no hagan bajar el pH por debajo de 2 porque sino se iniciaría un proceso de hidrólisis, dando péptidos no deseados al no ser trípticos. También habría que someter a ultrasonidos la muestra para desprender el péptido del gel.
La cromatografía en fase reversa (Zip-Tip), se hace con el fin de se separar la muestra (los péptidos cortados) de la tripsina que queda desnaturalizada y unida a la fase estacionaria. Además este proceso sirve para concentrar la muestra y para eliminar sales.
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Con acetonitrilo se lava la Zip-Tip, también se la añade TFA que aparte de para el lavado sirve también para equilibrar. Una vez equilibrado el Zip-Tip se añade la muestra que se carga y descarga varias veces con el fin de impregnar la fase estacionaria con la tripsina. Posteriormente se lava varias veces, para que salga toda la cantidad de péptidos posible, esto se hace acetonitrilo y TFA.
Una vez obtenida la muestra libre de la tripsina se coloca en la placa Maldi y se añade la matriz.
La matriz consiste en ácido α-ciano-4-ácido hidroxcinámico, también TFA y acetonitrilo. Sus características son: . Peso molecular relativamente bajo (para permitir la evaporación superficial), pero son lo suficientemente grandes (con una baja presión de vapor suficiente) no se evapore durante la preparación de la muestra o mientras está parado en el espectrómetro. . A menudo son ácidos, por lo tanto actuar como una fuente de protones para fomentar la ionización de la muestra. . Tienen una fuerte absorción óptica ya sea en el rango de UV o infrarrojos, para que rápida y eficientemente absorba la radiación láser. . Tienen grupos polares con lo que permite su uso en soluciones acuosas.
Los solventes se vaporizan, dejando sólo la matriz recristalizada, pero ahora con las moléculas de la muestra extendido por todo el cristal.
Se colocaría luego en el espectrómetro. Nosotros haremos un Maldi-Tof.Se denomina MALDI por sus siglas en castellano Matriz Asistida láser de desorción / ionización, y por el TOF detector de iones que se acopla al MALDI cuyo nombre procede de sus siglas en castellano Time-Of - de vuelo.
1. Esquema general de funcionamiento
El láser se dispara en los cristales en el lugar de MALDI. La matriz absorbe la energía del láser y se cree que en primer lugar la matriz es ionizada por este
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evento. La energía del láser expulsa iones de la matriz electrónicamente excitados, cationes y macromoléculas neutrales, que crean una densa nube de gas por encima de la superficie de la muestra. La macromolécula es ionizada por las colisiones. La transferencia de energía es suficiente para promover la transición de las moléculas de la matriz y los péptidos del estado sólido al estado gaseoso. Entonces, las moléculas se aceleran en el campo eléctrico de un espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones, donde su llegada se detecta como una señal eléctrica. Su masa es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) y se puede calcular en consecuencia.
2. Placa portamuestras 3.Tubo de vuelo
Para calibra el aparato se utiliza una serie de péptidos (cuya masa se conoce) provenientes de proteínas como ACT, angiotensina e insulina bovina.
El análisis espectrométrico de masas produce una lista de los pesos moleculares, y la secuencia de cada fragmento. Estos datos son recogidos y comparados en grandes bases de datos. Utilizamos entonces el Aldente a través de EXPASY, en él se introduce nuestra huella peptídica y además el peso total de polipéptido que teníamos antes de haberlo digerido con tripsina, esto lo habíamos calculado a través de una recta patrón. También hay que indicar de qué tipo de organismo proviene y tipo de enzima utilizado para el corte , para afinar más la búsqueda. Así obtendríamos un nombre para la proteína con la que estuvimos trabajando.Sin embargo, los datos provenientes de la espectrometría de masas no dan un tanto por ciento de similitud suficiente como para definir la proteína con la que trabajamos.
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