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Délivré par :
Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)
Présentée et soutenue par :
Jérôme LAPARRE
Le 21 septembre 2012
Titre : Elaboration d'une stratégie analytique pour l'identification de métabolites clés impliqués dans la
symbiose mycorhizienne entre Rhizophagus irregularis-Medicago truncatula
Ecole doctorale et spécialité :
ED SEVAB : Interactions plantes-microorganismes
Unité de recherche : Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales - UMR5546 CNRS-UPS
Laboratoire d’ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR INSA-CNRS 5504, INSA 792, Toulouse)
Jury : Pr. Guillaume BECARD Pr. Alain BOUCHEREAU
Dr Eliane DUMAS-GAUDOT Dr. Annick MOING
Pr. Jean-Charles PORTAIS
Co-directeurs de thèse : le Pr. Guillaume BECARD et le Pr. Jean-Charles PORTAIS
Remerciements
Je remercie très sincèrement toutes les personnes qui m’ont encadré et soutenu
durant cette aventure qu’a été cette thèse. Elle a débuté par un accueil chaleureux
des Professeurs Guillaume Bécard et Jean-Charles Portais dans leur équipe
respective. Elle s’est poursuivit au cours de ces années par un encadrement au
quotidien par Virginie Puech-Pagès et Fabien Létisse. Je tiens à témoigner tout
particulièrement ma reconnaissance à mes quatre encadrants pour leur disponibilité,
leur rigueur scientifique, leurs précieux conseils et la confiance qu’ils m’ont
témoignée tout au long cette thèse me permettant de travailler dans les meilleures
conditions possibles. Je tiens à remercier également Saida Danoun et Sylvie
Fournier pour leur aide précieuse dans l’utilisation du spectromètre de masse, leur
sympathie et nos discussions passionnées sur la spectrométrie de masse. Merci à
tous les collègues des deux laboratoires qui m’ont rendu de précieux services et qui
m’ont apporté de la bonne humeur au quotidien.
J’exprime également ma reconnaissance aux directrices de recherches Eliane
DUMAS-GAUDOT et Annick MOING ainsi que le Professeur Alain BOUCHEREAU
pour l’honneur qu’ils m’ont fait en acceptant d’évaluer mon travail de thèse.
Remerciements
Je remercie très sincèrement toutes les personnes qui m’ont encadré et soutenu
durant cette aventure qu’a été cette thèse. Elle a débuté par un accueil chaleureux
des Professeurs Guillaume Bécard et Jean-Charles Portais dans leur équipe
respective. Elle s’est poursuivit au cours de ces années par un encadrement au
quotidien par Virginie Puech-Pagès et Fabien Létisse. Je tiens à témoigner tout
particulièrement ma reconnaissance à mes quatre encadrants pour leur disponibilité,
leur rigueur scientifique, leurs précieux conseils et la confiance qu’ils m’ont
témoignée tout au long cette thèse me permettant de travailler dans les meilleures
conditions possibles. Je tiens à remercier également Saida Danoun et Sylvie
Fournier pour leur aide précieuse dans l’utilisation du spectromètre de masse, leur
sympathie et nos discussions passionnées sur la spectrométrie de masse. Merci à
tous les collègues des deux laboratoires qui m’ont rendu de précieux services et qui
m’ont apporté de la bonne humeur au quotidien.
J’exprime également ma reconnaissance aux directrices de recherches Eliane
DUMAS-GAUDOT et Annick MOING ainsi que le Professeur Alain BOUCHEREAU
pour l’honneur qu’ils m’ont fait en acceptant d’évaluer mon travail de thèse.
Auteur : Jérôme LAPARRE
Titre : Elaboration d'une stratégie analytique pour l'identification de métabolites clé impliqués dans la symbiose mycorhizienne entre Rhizophagus irregularis et Medicago truncatula
Directeurs de thèse : Pr. Guillaume Bécard / Pr. Jean-Charles Portais
Résumé.
La symbiose mycorhizienne à arbuscule (MA) est une interaction bénéfique entre les
racines de la plupart des plantes et certains champignons du sol appartenant aux
Gloméromycètes. La plante bénéficie d’une meilleure nutrition hydrique et minérale.
En échange elle fournit au champignon MA, symbiote obligatoire, sa source de
carbone qui lui permet d’accomplir son cycle de vie. Si quelques signaux
symbiotiques impliqués dans les phases précoces de la symbiose MA ont été
caractérisés ces dernières années, nos connaissances sont très limitées concernant
les molécules régulatrices de la symbiose échangées entre les partenaires in planta.
Dans ce contexte, nous avons élaboré une stratégie analytique dans le but
d’identifier des métabolites clés impliqués dans la symbiose mycorhizienne. Nous
avons associé une analyse différentielle du métabolome de racines mycorhizées et
non mycorhizées à une analyse de l’expression de gènes spécifique de la symbiose
mycorhizienne. L’analyse métabolique couplant la chromatographie liquide ultra
performante (UPLC) et la spectrométrie de masse haute résolution (Q-TOF) avec
des analyses statistiques non supervisées de type OPLS-DA, a permis de mettre en
évidence 71 métabolites au moins 10 fois plus présents dans les racines
mycorhizées. Parmi ces métabolites une cinquantaine n’avait jamais été identifiée
comme caractéristiques de la mycorhization, dont la propionyl-carnitine. Quant à
l’analyse transcriptomique, elle avait pour but de sélectionner parmi ces métabolites
criblés ceux pouvant avoir un rôle de signaux régulateurs de la symbiose, reflété par
leur activité sur le transcriptome du champignon MA. Nous avons réalisé une analyse
de l’expression de gènes spécifiques de la symbiose sur des spores de Rhizophagus
irregularis stimulées par des extraits racinaires fractionnés par HPLC. Par la
complémentarité des deux analyses (transcriptomique et métabolique), les
métabolites davantage présents dans les racines mycorhizées et détectés dans les
fractions HPLC qui modulent l’expression de gènes fongiques sont identifiés comme
des candidats potentiels.
1
Table des matières
Table des matières
Table des matières ________________________________________________________ 1
1 INTRODUCTION _______________________________________________________ 4
1.1. Présentation générale des Mycorhizes ___________________________________ 4 1.1.1. Les plantes et leur environnement ______________________________________________ 4 1.1.2. La symbiose mycorhizienne à arbuscule _________________________________________ 5
1.2. Les différentes phases de la symbiose MA ________________________________ 8 1.2.2. La phase pré-symbiotique _____________________________________________________ 9 1.2.3. La phase symbiotique ________________________________________________________ 14
1.2.3.1. Réorganisation cellulaire _________________________________________________ 14 1.2.3.2. Modulation de l’expression génique _______________________________________ 15
1.2.3.2.1. Chez la plante ________________________________________________________ 15 1.2.3.2.2. Chez le champignon MA _______________________________________________ 16
1.2.3.3. Le protéome ____________________________________________________________ 17 1.2.3.3.1. Chez la plante ________________________________________________________ 17 1.2.3.3.2. Chez le champignon MA _______________________________________________ 18
1.2.3.4. Modification métabolique _________________________________________________ 18 1.2.3.4.1. Chez la plante ________________________________________________________ 18 1.2.3.4.2. Chez le champignon MA _______________________________________________ 23
1.2.3.5. Signaux et facteurs de régulation pendant la symbiose MA ___________________ 25 1.2.3.5.1. La lyso-phosphatidylcholine ____________________________________________ 25 1.2.3.5.2. Hormones végétales ___________________________________________________ 25 1.2.3.5.3. Les microARN ________________________________________________________ 26
1.2.3.6. L’autorégulation de la symbiose par la plante _______________________________ 27 1.2.3.6.1. Les CLE peptides _____________________________________________________ 27
1.3. Objectif des travaux de thèse ___________________________________________ 28
2. CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES _____________________ 31
2.1. La culture _____________________________________________________________ 31 2.1.1. Choix des organismes ________________________________________________________ 31 2.1.2. Culture de M. truncatula en plante entière ou racines stériles _____________________ 32
2.1.2.1. Culture de racines stériles de M. truncatula _________________________________ 33 2.1.2.2. Amélioration des conditions de culture _____________________________________ 34
2.1.3. Durée de la culture___________________________________________________________ 35
2.2. L’analyse différentielle du métabolome __________________________________ 36 2.2.1. Mise en place de l’extraction et de l’échantillonnage _____________________________ 36
2.2.1.1. Exsudation et extraction liquide-liquide _____________________________________ 37 2.2.1.2. Extraction des tissus racinaires au méthanol pur ____________________________ 39 2.2.1.3. L’échantillonnage _______________________________________________________ 40
2.2.2. Mise en place de la méthode analytique ________________________________________ 40 2.2.2.1. La plateforme analytique _________________________________________________ 40 2.2.2.2. La chromatographie liquide _______________________________________________ 42
2.2.2.2.1. Description des principes chromatographiques ____________________________ 42
2
Table des matières
2.2.2.2.2. Optimisation des paramètres chromatographiques ________________________ 46 2.2.2.2.2.1. Les solvants et le gradient chromatographique ________________________ 47 2.2.2.2.2.2. Le débit chromatographique ________________________________________ 48 2.2.2.2.2.3. La température de la colonne _______________________________________ 49
2.2.2.3. La spectrométrie de masse _______________________________________________ 49 2.2.2.3.1. Description du fonctionnement des spectromètres et optimisation des paramètres 49
2.2.2.3.1.1. La source d’ionisation électrospray (ESI) _____________________________ 49 2.2.2.3.1.1.1. Principe de l’électrospray _______________________________________ 50 2.2.2.3.1.1.2. Le rendement d’ionisation en fonction du solvant __________________ 51 2.2.2.3.1.1.3. Transfert des ions de la source vers le quadripôle _________________ 51
2.2.2.3.1.2. Les analyseurs (quadripôle et TOF) __________________________________ 52 2.2.2.3.1.2.1. Le quadripôle _________________________________________________ 52 2.2.2.3.1.2.2. Le tube à temps de vol (TOF) ___________________________________ 52
2.2.2.3.1.3. La calibration _____________________________________________________ 54 2.2.2.3.1.4. Contrôle de la qualité des analyses par injection de standards __________ 55
2.2.3. Traitement des données ______________________________________________________ 56 2.2.3.1. Détection des pics chromatographiques et intégration _______________________ 56 2.2.3.2. Réalignement des pics chromatographiques ________________________________ 57 2.2.3.3. Normalisation des données _______________________________________________ 57 2.2.3.4. Détermination des ions discriminants ______________________________________ 58 2.2.3.6. Utilisation de Markerlynx _________________________________________________ 59
2.2.4. Illustration de la méthode d’analyse différentielle du métabolome __________________ 60
3. CHAPITRE 2 : LES RESULTATS _______________________________________ 65
3.1. L’analyse différentielle du métabolome __________________________________ 65 3.1.1. Sélection des ions les plus discriminants _______________________________________ 67
3.1.1.1. Elimination des faux positifs et des adduits _________________________________ 67 3.1.1.2. Elimination des ions les moins caractéristiques de la symbiose _______________ 68 3.1.1.3. Elimination des ions d’origine fongique_____________________________________ 68 3.1.1.4. Validation des ions discriminants de faible intensité _________________________ 69
3.1.2. Recherche des ions issus d’un même métabolite ________________________________ 71 3.1.3. Utilisation d’un appareil de plus haute résolution_________________________________ 75 3.1.4. Bilan de l’analyse différentielle du métabolome __________________________________ 76
3.2. Couplage d’une approche de métabolomique et d’une analyse d’expression génique _____________________________________________________________________ 83
3.2.1. L’analyse d’expression génique _______________________________________________ 83 3.2.1.1. Principes et objectifs _____________________________________________________ 83 3.2.1.2. La méthodologie utilisée _________________________________________________ 83 3.2.1.3. Résultats de l’analyse d’expression génique ________________________________ 85 3.2.1.4. I’identification des métabolites discriminants dans les fractions _______________ 88 3.2.1.5. La propionyl-carnitine ____________________________________________________ 89
4. DISCUSSION ET PERSPECTIVES ______________________________________ 90
4.1. La méthodologie _______________________________________________________ 91 4.1.1. L’extraction et l’échantillonnage _______________________________________________ 91 4.1.2. La gamme dynamique des concentrations en métabolites ________________________ 92 4.1.3. Le traitement des données ____________________________________________________ 93
3
Table des matières
4.2. Les résultats de l’analyse du métabolome _______________________________ 94 4.2.1. Identification structurale des métabolites, un défi majeur chez les végétaux _________ 95
4.2.1.1. L’apport de la précision de masse _________________________________________ 96 4.2.1.2. L’apport du profil isotopique dans la génération de formule brute ______________ 97 4.2.1.3. Les différentes difficultés dans l’indentification structurale ____________________ 98
4.2.2. Utilisation d’une stratégie originale ____________________________________________ 100 4.2.2.1. La propionyl-carnitine ___________________________________________________ 103
4.3. Les perspectives à plus long terme ____________________________________ 104
4.4. Conclusions __________________________________________________________ 105
5. ANNEXES __________________________________________________________ 107
5.1. Matériels et méthodes _________________________________________________ 107 5.1.1. Culture des racines et mise en germination du champignon MA __________________ 107
5.1.1.1. Culture de racines mycorhizées et non mycorhizées ________________________ 107 5.1.1.2. La germination de spores du champignon MA _____________________________ 107
5.1.2. Extraction et quantification du taux de mycorhization ____________________________ 108 5.1.2.1. Quantification du taux de mycorhization ___________________________________ 108 5.1.2.2. Extraction des racines __________________________________________________ 108
5.1.2.2.1. Pour l’analyse du métabolome _________________________________________ 108 5.1.2.2.2. Pour l’analyse transcriptomique ________________________________________ 109
5.1.2.3. Extraction de Rhizophagus irregularis ____________________________________ 109 5.1.3. Analyse par LC-MS _________________________________________________________ 109
5.1.3.1. Reprise des échantillons ________________________________________________ 109 5.1.3.2. Analyse par UPLC-Q-TOF (Waters) ______________________________________ 110 5.1.3.3. Analyse par UHPLC-Q-TOF (Bruker Daltonics) ____________________________ 111 5.1.3.4. Génération de formules brutes ___________________________________________ 111
5.1.4. Traitements des données ____________________________________________________ 111 5.1.5. Constitution des fractions par HPLC préparative ________________________________ 112 5.1.6. Stimulation des spores pré germées de Rhizophagus irregularis _________________ 112
5.1.6.1. Par les fractions issus des extraits racinaires ______________________________ 112 5.1.6.2. Par la propionyl-carnitine ________________________________________________ 113
5.1.7. Analyse transcriptomique ____________________________________________________ 113
5.2. Liste des gènes utilisés pour l’analyse transcriptomique_________________ 115
5.3. Données des analyses métabolomiques ________________________________ 119
5.4. Références bibliographiques __________________________________________ 123
4
INTRODUCTION
1 INTRODUCTION
1.1. Présentation générale des Mycorhizes
1.1.1. Les plantes et leur environnement
Les plantes sont des organismes phototrophes. Elles produisent leur propre
matière organique à partir de dioxyde de carbone fixé par leurs parties aériennes
grâce à la photosynthèse et aux sels minéraux puisés dans le sol via leurs racines.
La disponibilité en eau et en sels minéraux du sol ainsi que la présence de lumière
sont donc des facteurs environnementaux essentiels au développement des plantes.
Les sols sont en général riches en phosphate mais celui-ci est souvent complexé
avec d’autres particules ou éléments comme le fer, le rendant non absorbable par les
racines. Afin de rendre le phosphate assimilable, les racines exsudent des acides
organiques qui jouent le rôle de chélateurs en se complexant avec les éléments tels
que le fer pour libérer le phosphate (Bais et al., 2006). Une caractéristique des
végétaux est leur immobilité, et cette inaptitude à se mouvoir est compensée par une
grande capacité d’adaptation à l’environnement. Les plantes sécrètent de
nombreuses molécules afin de modifier les propriétés physico-chimiques du sol et
rendre les nutriments contenus dans celui-ci plus accessibles. La rhizosphère, région
du sol à proximité des racines, est très riche en molécules organiques issues des
sécrétions de la plante ou de la dégradation de certains tissus (débris cellulaires et
mucilage). Ce phénomène, appelé rhizodéposition, profite ainsi à divers organismes
et permet la prolifération d’une grande diversité d’espèces : plantes, champignons,
bactéries et animaux (Shaw et al., 2006). Une multitude d’interactions est observée
entre les plantes et les microorganismes du sol, allant de la symbiose au
parasitisme. Les composés exsudés par les racines sont principalement des
métabolites secondaires qui représentent plus de 200 000 molécules décrites dans la
littérature (Dixon, 2001a). Ces molécules jouent un rôle majeur dans les interactions
plantes-microorganismes, notamment dans les processus de défense, certaines
ayant des propriétés antifongiques ou antibactériennes (Bais et al., 2004). Parmi les
interactions symbiotiques, hautement bénéfiques pour les plantes, les plus connues
5
INTRODUCTION
sont les symbioses fixatrices d’azote et les symbioses mycorhiziennes. Dans notre
étude nous allons nous intéresser plus particulièrement à la symbiose mycorhizienne
à arbuscule (MA).
1.1.2. La symbiose mycorhizienne à arbuscule
Une symbiose est une association durable, à bénéfice mutuel, entre deux
organismes d’espèces différentes. L’origine étymologique du mot « mycorhize »
provient du grec myco (champignon) et rhiza (racine). La symbiose mycorhizienne
résulte en effet de l’association entre certains champignons du sol et les racines des
plantes. On distingue deux grands types de symbioses mycorhiziennes, définis par
les relations physio-anatomiques qui s’établissent entre les deux partenaires.
D’abord les ectomycorhizes concernent un grand nombre d’espèces ligneuses et
plusieurs milliers d’espèces de champignons, principalement basidiomycètes. Le
mycélium du champignon forme un manchon autour de la racine. Ses hyphes
pénètrent également dans les tissus racinaires périphériques, en se développant
entre les cellules, pour former une interface symbiotique appelé « réseau de Hartig »
(Nehls, 2008). Ensuite les champignons ectomycorhiziens ne traversent pas la paroi
des cellules végétales contrairement aux champignons endomycorhiziens dont les
plus répandus sont les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA) (Figure 1-1).
6
INTRODUCTION
Figure 1-1 Comparaison de la colonisation des racines par les ectomycorhizes (en bleu) et les endomycorhizes à arbuscules (en rose) (Bonfante & Genre, 2010).
Le champignon ectomycorhizien enveloppe la racine en formant un manteau d’hyphes. Entre les cellules de l’épiderme se forme le réseau de Hartig. Le champignon endomycorhizien à arbuscules passe à travers les cellules de l’épiderme pour atteindre le cortex où il forme les arbuscules, des structures très ramifiées.
Les champignons MA appartiennent au groupe des gloméromycètes (Redecker et
Raab, 2006), dont on a décrit à ce jour environ 200 espèces (Schüßler et al., 2001).
Les premières traces de la symbiose MA remontent à 400 millions d’années
avec la découverte de fossiles de plantes présentant dans leurs tissus les mêmes
structures fongiques que celles observées aujourd’hui dans les racines des plantes
contemporaines (Remy et al., 1994). Ces observations confirment une étude
moléculaire datant les champignons MA de -353 à -462 millions d’années (Simon et
al., 1993). L’apparition des champignons MA et les premières traces de la symbiose
7
INTRODUCTION
endomycorhizienne coïncideraient avec le début de la colonisation du milieu terrestre
par les plantes. Environ 80% des plantes terrestres sont aujourd’hui mycotrophes,
une conséquence probable de la coévolution entre plante et champignon MA (Kistner
et Parniske, 2002). Chez les familles de plantes non mycotrophes, on trouve les
Brassicaceae dont fait partie Arabidopsis thaliana. Cette plante modèle ne peut donc
pas être utilisée pour l’étude de la symbiose mycorhizienne, par conséquent nos
différents travaux ont été effectués avec Medicago truncatula une autre plante
modèle utilisée pour l’étude des symbioses racinaires.
Après la formation d’un hyphopodium à la surface de la racine, le champignon
colonise le cortex racinaire. Il se développe entre les cellules corticales puis les
hyphes traversent les parois cellulaires, se ramifient et forment des structures
intracellulaires appelées arbuscules (du latin arbusculum : arbuste). C’est le lieu
privilégié d’échange de nutriments entre les deux partenaires. Le champignon peut
consommer jusqu’à 20% des produits de la photosynthèse sous forme de
carbohydrates (Solaimanand et Saito, 1997; Bago et al., 2000; Bago et al., 2003). En
contrepartie il fournit à sa plante hôte, grâce à son mycélium extra racinaire (Finlay,
2008), des sels minéraux mais également de l’eau (Harrison, 2005a). Les
champignons MA peuvent former jusqu’à 100 mètres d’hyphes par centimètre cube
de sol (Miller et al., 1995). En plus d’améliorer considérablement la nutrition hydrique
et minérale des plantes, la symbiose MA contribue également à augmenter leur
tolérance à différents stress abiotiques comme le stress salin (Aroca et al., 2007;
Evelin et al., 2009) et le stress aux métaux lourds (Hildebrandt et al., 2007). Elle leur
permet aussi de résister plus efficacement à certains agents pathogènes. Plusieurs
études ont montré chez les plantes mycorhizées une diminution des dommages
causés par certains microorganismes fongiques et bactériens ainsi que par des
nématodes (Whipps, 2004; De La Peña et al., 2006). Ces effets peuvent être
associés à une induction locale et systémique de l’expression de certains gènes de
défense (Liu et al., 2007), parfois corrélée à une augmentation de la concentration en
acide jasmonique (Hause et al., 2002). Les champignons MA stimuleraient les
réactions de défense des plantes les rendant ainsi plus résistantes à d’éventuels
pathogènes (Pozo et Azcon-Aguilar, 2007). Ces phénomènes de plus grande
résistance ou tolérance dépendent cependant (i) des champignons MA qui colonisent
la plante (ii) des agents pathogènes (iii) des différentes conditions
8
INTRODUCTION
environnementales ainsi que de la composition biotique de la rhizosphère (Azcon-
Aguilar et Barea, 1997; Whipps, 2004).
Une publication récente définit la symbiose endomycorhizienne comme une
coopération réciproque, avec des échanges de nutriments et des contrôles
bidirectionnels. Les partenaires qui offrent les meilleurs flux d’échange sont
récompensés, ceux qui permettent d’apporter le maximum de bénéfices en fonction
de l’environnement sont favorisés (Kiers et al., 2011). Selosse et Rousset emploient
le terme de “biological markets“ pour définir la relation qui unit la plante et le
champignon MA et leur capacité à changer de partenaires en fonction des bénéfices
apportés (Sélosse et Rousset, 2011).
1.2. Les différentes phases de la symbiose MA
L’établissement de la symbiose MA peut se décrire en trois phases distinctes.
La phase non symbiotique où les deux partenaires ne sont pas encore en interaction.
La phase pré-symbiotique où chaque partenaire perçoit la présence de l’autre, et se
prépare à l’association symbiotique. Enfin la phase symbiotique qui conduira à la
synthèse des structures d’échanges nutritionnels entre les deux partenaires.
1.2.1. La phase non symbiotique
Les spores de champignons MA sont capables de germer spontanément, si
les conditions physico-chimiques sont favorables, en absence de plante hôte. Mais
dans ces conditions, la croissance des hyphes germinatifs sera extrêmement limitée
et cessera après quelques jours. Le cytoplasme des hyphes germinatifs se rétractera
jusqu’à retourner dans la spore (Logi et al., 1998). Pendant cette phase le
champignon a une respiration réduite et consomme très peu ses réserves (Bécard et
al. 2004). Ce processus permet de maintenir la viabilité et la capacité de la spore à
germer à nouveau pour éventuellement coloniser les racines d’une plante à
proximité. C’est une manifestation de la biotrophie obligatoire des champignons MA.
9
INTRODUCTION
Ces organismes ne peuvent en effet se développer significativement qu’à partir de
carbone fournit par une plante hôte.
1.2.2. La phase pré-symbiotique
Lors de cette phase, les deux partenaires ne sont pas encore en contact
physique, mais commencent à interagir. Chaque partenaire décèle la présence de
l’autre par l’intermédiaire de signaux moléculaires diffusibles. Ces signaux
déclenchent chez les deux partenaires des modifications d’expression de gènes, une
reprogrammation génétique nécessaire à l’établissement des structures
symbiotiques (Bécard et al., 2004).
Les plantes produisent notamment dans leurs exsudats racinaires des
molécules capables de stimuler la germination des spores et/ou la prolifération
cellulaire des champignons MA (Buée et al., 2000; Sbrana et Giovannetti, 2005).
Parmi ces molécules, on trouve les strigolactones (Akiyama et al., 2005; Besserer et
al., 2006). Ce sont des apocaroténoïdes à très forte activité biologique capables
d’activer en quelques minutes, et à des concentrations inférieures au nano-molaire,
le métabolisme mitochondrial du partenaire fongique (Besserer et al., 2006; Besserer
et al., 2008; Besserer et al., 2009). Dans ces nouvelles conditions physiologiques le
champignon engage véritablement son processus de germination et utilise
pleinement ses réserves. La nature labile des strigolactones en fait des molécules
facilement hydrolysables avec une durée de vie limitée dans la rhizosphère. Elles
sont exsudées en très faible quantité. Les racines de coton par exemple sécrètent
environ 15pg de strigol par jour (Sato et al., 2005). L’instabilité des strigolactones fait
qu’un gradient de concentration se forme autour de la racine de telle sorte que leur
perception par le champignon est un indicateur fiable de la proximité d’une plante
hôte (Parniske, 2005). Les strigolactones étaient déjà connues comme signaux
racinaires capables d’induire la germination des graines de plantes parasites Striga
et Orobanche. Ces organismes végétaux sont des biotrophes obligatoires comme les
champignons MA. Ils doivent, pour leur survie, déceler la présence d’une plante hôte
avec la meilleure efficacité possible (Bouwmeester et al., 2007). Outre leurs rôles
dans la rhizosphère, les strigolactones jouent aussi dans la plante le rôle d’hormones
10
INTRODUCTION
végétales, notamment impliquées dans le contrôle architectural de la partie aérienne
(Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008).
Réciproquement, les champignons MA produisent des signaux diffusibles
capables de modifier l’expression des gènes de la plante et de provoquer des
réponses racinaires comme des variations calciques cytosoliques ou la production de
racines latérales (Weidmann et al., 2004; Oláh et al., 2005; Kosuta et al., 2008; Kuhn
et al., 2010). Ils affectent également le métabolisme racinaire des sucres notamment,
avec un stockage plus important d’amidon dans certaines cellules du cortex (Gutjahr
et al., 2009). Récemment, une famille de lipochitooligosaccharides, appelée Myc-
LCOs ou facteur Myc, a été identifiée dans les exsudats du champignon MA
Rhizophagus irregularis, molécules de même nature chimique que les facteurs Nod
produits par les bactéries Rhizobium et connues pour le rôle indispensable qu’elles
jouent dans la symbiose fixatrice d’azote (Maillet et al., 2011). Des études
génétiques ont établi que les Myc-LCOs et les facteurs Nod déclenchent des voies
de signalisations symbiotiques induisant respectivement les programmes génétiques
de mycorhization et de nodulation. Ces voies Myc et Nod partagent au moins huit
protéines impliquées dans la transduction du signal des facteurs Myc et Nod. C’est la
“common symbiosis pathway“ (CSP) (Bonfante et Genre, 2010) (Figure 1-2).
Figure 1-2 La voie de signalisation “common symbiosis pathway“ (Maillet et al., 2011).
Les facteurs Nod et Myc sont perçus par des récepteurs. La perception des facteurs nod et des facteurs myc
active une voie de signalisation faisant intervenir plusieurs protéines. La « common symbiosis pathway » (CSP),
identifié chez Medicago truncatula, est composé d’un récepteur putatif, DMI2, une kinase possédant des
domaines riches en Leu-répétées. CSP est composé d’un canal à cations, DMI1. Pendant les remodelages
intracellulaires qui précèdent l’infection, des oscillations calciques faibles sont induites dans les cellules
corticales. Ces oscillations calciques deviennent plus importantes lors de l’entrée des deux symbiontes dans
l’apoplasme (Sieberer et al., 2009, Chabaud et al., 2011). Cette oscillation calcique est décodée par une kinase
calcium / calmoduline-dépendante, codée par DMI3, localisée dans le noyau des poils absorbants de M.
truncatula (Smit et al., 2005). Le facteur de transcription (NSP2) et d’autres protéines interviennent ensuite pour
11
INTRODUCTION
mettre en place les programmes symbiotiques. Les facteurs Nod et Myc induisent respectivement la nodulation et
la mycorhization et une ramification racinaire.
Il a été proposé que la voie de signalisation Nod a évolué il y a 60 millions d’années
chez les légumineuses à partir de la voie de signalisation Myc beaucoup plus
ancienne (Parniske, 2008).
La production des strigolactones par les plantes dépend de la disponibilité en
phosphate. Dans des conditions de culture avec un faible apport en phosphate, la
quantité de strigolactones sécrétée est plus élevée (Yoneyama et al., 2007). Chez
des plantes mycorhizées la production de strigolactones est fortement diminuée,
conséquence peut être due à une meilleure nutrition en phosphate lors de la
symbiose (Lopez-Raez et al., 2011). En ce qui concerne la production des facteurs
Myc, il n’existe pas de données faisant référence à certaines conditions
préférentielles de production. Par contre, les spores en germination sont capables de
sécréter ces molécules sans avoir été en contact avec des exsudats de plante, mais
en très faible quantité (Maillet et al., 2011). Actuellement aucune étude ne fait
référence à l’effet des strigolactones sur la production de facteurs Myc et
inversement.
Quand les deux partenaires rentrent physiquement en contact, l’hyphe du
champignon AM peut parcourir quelques millimètres à la surface d’une racine
latérale de son hôte et se ramifier, avant de gonfler à son extrémité et de se
différencier en hyphopodium. L’hyphopodium adhère à la racine en formant plusieurs
protrusions de sa paroi vers la paroi végétale afin de s’y ancrer (Bonfante et Genre,
2010) (Figure 1-3 page 12).
12
INTRODUCTION
Figure 1-3 L’adhésion du champignon MA à une racine par l’intermédiaire de sa structure d’attachement : l’hyphopodium (Bonfante & Genre, 2010).
(a) Photographie d'un hyphopodium de Gigaspora gigantea formé à la surface d'une racine de carotte. La racine mycorhizée a été colorée à l’aide de fuchsine acide (barre, 10µm). (b) photographie d’un hyphopodium ancré à la paroi d’une cellule épidermique observé par microscopie électronique à transmission. La paroi du champignon MA forment des protrusions (flèches) permettant ainsi l’adhésion (barre, 2µm).
Les mécanismes mis en jeux lors de l’établissement de cette structure de contact
restent encore inconnus. Une fois l’hyphopodium formé, après 4 à 6 heures, l’hyphe
pénètre dans la racine (Genre et al., 2008). Pendant ce laps de temps, la cellule
épidermique immédiatement sous-jacente se prépare à la colonisation du symbionte.
L’expression de nombreux gènes varie, dont une partie est aussi réguléé par les
signaux diffusibles du champignon MA (Chabaud et al., 2002; Weidmann et al.,
2004). La cellule épidermique servant de point d’entrée pour le champignon
réorganise son cytoplasme de manière à former une structure spécifique et
13
INTRODUCTION
indispensable à l’entrée de l’hyphe dans la racine, appelée « prepenetration
apparatus » (PPA) (Genre et al., 2005). La membrane cytoplasmique de la cellule
épidermique s’invagine créant ainsi un tube dont l’orientation est prédéfinie par le
noyau (Genre et al., 2005; Genre et al., 2008). Le cytosquelette et un ensemble
d’organites comme le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi et des vésicules
interviennent activement dans la formation de ce tunnel (Genre et al., 2008) (Figure
1-4).
Figure 1-4 Schéma détaillant la formation du « PrePenetration Apparatus » (PPA) (Parniske 2008).
Lors de l’entrée du champignon MA dans la racine, se développe le PPA. Il correspond à la formation d’un chemin que l’hyphe pourra emprunter afin d’atteindre le cortex racinaire. La membrane de la cellule végétale s’invagine, formant un tube bordé par un grand nombre d’organites dont le réticulum endoplasmique nécessaire dans la construction d’un squelette de microfilaments. Le noyau précède cette structure et l’oriente à travers la cellule.
Une fois le PPA constitué, l’hyphe se fraie un chemin vers les cellules du cortex
racinaire où le champignon s’étend rapidement à travers l’apoplaste pour former des
arbuscules (Parniske, 2004; Paszkowski, 2006).
Lors de l’établissement de la symbiose, un processus moléculaire et cellulaire très
précis, et probablement très conservé, se met donc en place pour favoriser et rendre
possible l’interaction entre les deux partenaires. Des changements morphologiques
14
INTRODUCTION
et physiologiques se produisent tels que la formation d’hyphopodia par le
champignon et l’élaboration du PPA par la plante ainsi que l’édification d’arbuscules
comme lieu privilégié d’échanges. Les facteurs de l’environnement peuvent
contrarier ce processus. Par exemple, de nombreuses études ont montré que la
disponibilité en phosphate affectait la mycorhization (Smith et Read, 2008). Quand le
phosphate est abondant, la nutrition phosphatée des racines se fait
préférentiellement par la voie nutritionnelle directe, non mycorhizienne, qui est moins
coûteuse en énergie (Nagy et al., 2009). De nombreux gènes décrits comme induits
lors de la phase pré-symbiotique sont réprimés par de fortes concentrations en
phosphate (Breuillin et al., 2010). De même, en condition élevée de phosphate, la
formation d’hyphopodium est inhibée malgré l’apport exogène de strigolactones
synthétiques ajoutées pour compenser la faible synthèse de strigolactones
provoquée par cette condition (Balzergue et al., 2011). Il suffit qu’un des gènes
impliqués dans la voie de signalisation CSP soit muté pour que le processus
d’établissement de la symbiose se fige après l’étape de formation des hyphopodia et
ne puisse se poursuivre par la pénétration du champignon dans la racine (Barker et
al., 1998; Catoira et al., 2000; Marsh et Schultze, 2001).
1.2.3. La phase symbiotique
On peut considérer que la formation des arbuscules dans le cortex racinaire
marque le début de la phase symbiotique, phase pendant laquelle les échanges de
nutriments entre les deux partenaires sont opérationnels.
1.2.3.1. Réorganisation cellulaire
Dans la cellule corticale racinaire, l’hyphe du champignon se ramifie
intensément. Autour de cette structure fongique très ramifiée, la membrane
plasmique végétale s’invagine et doit se développer considérablement pour former la
membrane périarbusculaire (PAM). Un espace périarbusculaire se crée entre les
deux organismes, formant une interface d’échange entre les deux partenaires où
15
INTRODUCTION
transitent nutriments et signaux. Cet espace périarbusculaire est une matrice
composée essentiellement de molécules retrouvées dans les parois primaires de
plante telle que des β-1,4-glucanes, des homogalacturonanes, des xyloglucanes et
en arabinogalactanes ainsi que des protéines riches en hydroxyproline (Bonfante et
Perotto, 1995; Harrison, 1999; Harrison, 2005a). L’élaboration de cette interface
symbiotique est associée à de très fortes activations métaboliques. De la même
manière que pour la conception du PPA les cellules du cortex racinaire anticipent la
création des arbuscules. Autour de la membrane périarbusculaire prolifèrent et se
concentrent des organites (réticulum endoplasmique, appareils de Golgi, plastes et
vésicules) (Genre et al., 2008; Pumplin et Harrison, 2009). La taille du noyau
augmente et la chromatine se décondense, signe d’une plus forte activitée
transcriptionnelle (Genre et al., 2008; Bonfante et Genre, 2010). L’arbuscule est une
structure éphémère dont la durée de vie n’excède pas quelques jours (4-5 jours).
La paroi fongique commence alors à se collapser au niveau des fines ramifications et
le cytoplasme se rétracte. Progressivement, ce processus de sénescence s’étend à
l’ensemble de l’arbuscule. A sa disparition, la cellule corticale retrouve son
organisation cellulaire originelle (Javot et al., 2007; Bonfante et Genre, 2010). Il n’y a
pas de synchronisation dans la formation des différentes structures symbiotiques : on
peut observer simultanément dans une même racine tous les stades de colonisation,
depuis les hyphopodia jusqu’aux vésicules intra-racinaires et arbuscules sénescents.
1.2.3.2. Modulation de l’expression génique
Cette profonde réorganisation cellulaire lors de la colonisation des racines par
le champignon est associée à d’importants changements dans l’expression génique
des deux partenaires.
1.2.3.2.1. Chez la plante
Plusieurs études transcriptomiques ont été réalisées chez plusieurs espèces
végétales : M. truncatula (Liu et al., 2003; Brechenmacher et al., 2004; Hohnjec et
al., 2005; Küster et al., 2007; Gomez et al., 2009), Oryza (Grunwald et al., 2004;
16
INTRODUCTION
Güimil et al., 2005) et Lotus japonicus (Guether et al., 2009). Ces études ont mis en
évidence plus de 500 gènes dont le niveau d’expression est modulé par la symbiose.
Parmi les plus significatifs, on retrouve des gènes codant pour des protéines
impliquées dans le transport de nutriments, la synthèse de membranes, la
dynamique cellulaire, et la signalisation cellulaire. Quelques protéines sont décrites
comme essentielles à la symbiose, car la mutation de leur gène ou leur non
expression empêche la formation d’arbuscule ou provoque une dégénérescence
précoce. Elles se localisent généralement autour des arbuscules, plus
particulièrement sur la membrane périarbusculaire comme celles impliquées dans les
processus de transport de molécule : le transporteur de phosphate MtPT4 chez M.
truncatula (Javot et al., 2007), deux transporteurs ABC (Zhang et al., 2010) et un
transporteur d’oses MtSuc1 chez M. truncatula (Baier et al., 2010). D’autres
protéines importantes dans la symbiose aux fonctions encore inconnues ou mal
définies sont localisées dans les zones de colonisation du champignon MA comme le
gène de la vapyrin codant pour une protéine cytoplasmique (Pumplin et al., 2010),
une famille de subtilases (protéases) (Takeda et al., 2009) et la blue copper protéine
(Pumplin et Harrison, 2009).
1.2.3.2.2. Chez le champignon MA
Les champignons MA sont des biotrophes obligatoires, l’interaction avec une
plante leur est indispensable pour accomplir leur cycle de vie. A l’état symbiotique, ils
forment, simultanément, deux types de mycélium: (i) le mycélium extra racinaire qui
explorent la rhizosphère, colonise d’autres plantes et sporule, et (ii) le mycélium intra
racinaire, qui s’approvisionne en carbone et fournit à la racine l’eau et les éléments
minéraux assimilés dans le sol par le mycélium extra racinaire. Ce dernier possède
différents transporteurs dont certains ont été bien caractérisés, comme un
transporteur de phosphate GiTP (Harrison et van Buuren, 1995) dont la transcription
du gène est modulée par la quantité de phosphate (Maldonado-Mendoza et al.,
2001). De plus, l’identification des transporteurs d’ammonium de haute affinité
GintAMT1 et GintAMT2 (López-Pedrosa et al., 2006; Pérez-Tienda et al., 2011) ainsi
que la caractérisation d’une amino acid permease (AAP), protéine dont l’abondance
17
INTRODUCTION
du transcrit est corrélée avec la quantité d’azote organique disponible (Cappellazzo
et al., 2008). Le phosphate absorbé est rapidement transformé en poly-phosphate
capable de migrer le long de l’hyphe jusqu’à l’arbuscule par un mécanisme de
transport encore inconnu (Hijikata et al., 2010), tandis que l’ammonium est transféré
sous forme d’arginine (Govindarajulu et al., 2005). Les hyphes intra racinaires
présentent un transporteur de monosaccharides MST2 dont l’expression génique est
corrélée à celle du transporteur de phosphate PT4 spécifique de la symbiose pour la
plante (Helber et al., 2011).
1.2.3.3. Le protéome
1.2.3.3.1. Chez la plante
Le développement d’outils d’analyse du protéome de M. truncatula, tel que la
séparation des protéines sur gel d’acrylamide en deux dimensions suivie d’une
identification par spectrométrie de masse (Watson et al., 2003) et l’analyse par
chromatographie liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse (Lei et al., 2005)
ont permis l’étude de profils protéiques dans la symbiose mycorhizienne. La création
d’une base de données protéiques spécifiques des légumineuses, dont M. truncatula
fait partie, a également facilité l’indentification des protéines (Lei et al., 2011). Des
travaux basés sur l’analyse différentielle du protéome montrent qu’une vingtaine de
protéines sont identifiées comme subissant une régulation consécutivement à trois
semaines de colonisation par le partenaire fongique (Bestel-Corre et al., 2002). La
présence du champignon MA affecte des protéines qui ont des fonctions dans les
processus de réponse au stress oxydatif (comme les péroxidases et la glutathione-S-
transférase), dans la respiration et dans la structuration des parois. D’autres travaux
effectués sur les protéines membranaires révèlent aussi la régulation d’une vingtaine
de protéines, dont la fonction reste inconnue pour une majorité d’entre elles (Valot et
al., 2005; Valot et al., 2006).
18
INTRODUCTION
1.2.3.3.2. Chez le champignon MA
Contrairement à M. truncatula, on ne dispose pas de génome séquencé pour
R. irregularis et ne sont disponibles que des données sur le transcriptome, très
récemment publiées (Tisserant et al., 2012). Par conséquent l’identification des
protéines par une analyse protéomique est moins aisée. La biotrophie du
champignon MA vis-à-vis du carbone fourni par la plante, ne permet pas sa culture
pure et la réalisation d’analyses différentielles du protéome entre un état symbiotique
et non symbiotique. Cependant, une carte du protéome d’hyphes extra-racinaires de
R. irregularis cultivés avec des racines de carotte a été réalisée par séparation sur
un gel en deux dimensions. 438 spots ont été observés dont 4 ont été identifiés par
analyse en spectrométrie de masse (Dumas-Gaudot et al., 2004). D’autres protéines
du champignon MA ont été identifiées dans les hyphes intra-racinaire (Valot et al.,
2005), dont la fonction est conforme à l’utilisation du carbone par le champignon MA
avec l’identification de protéines intervenant dans les processus énergétiques
(comme le cycle de Krebs) et dans l’homéostasie du potentiel d’oxydoréduction
(Recorbet et al., 2010).
1.2.3.4. Modifications métaboliques
1.2.3.4.1. Chez la plante
Différentes analyses du métabolome ont déjà été menées sur des racines de
plantes mycorhizées, la plupart d’entre elles ont ciblé spécifiquement une famille de
métabolites. Les flavonoïdes et isoflavonoïdes sont deux familles métaboliques qui
ont été largement étudiées dans la symbiose mycorhizienne. Ces molécules sont
associées à la croissance des plantes et à leur développement. On leur confère un
rôle dans la protection contre les UV, également dans l’inhibition du transport
d’auxine et comme molécules signal dans les interactions entre plantes et
microorganismes (Dakora et al., 1993; Harrison et Dixon, 1994; Baggett et al., 2002).
Il a été démontré que certains flavonoïdes sont présents en plus forte quantité dans
des racines mycorhizées comme : la daidzeine, le coumestrol, 4’,7-dihydroxyflavone,
19
INTRODUCTION
la formononetine malonyl glycoside (malonylononine) et la medicarpine malonyl
glycoside (Harrison, 1993). Ces molécules appartiennent à la voie des
phénylpropanoïdes (Figure 1-5).
Figure 1-5 Biosynthèse de la médicarpine par la voie des phénylpropanoïdes (adapté d’Harrison et Dixon 1993).
Les flavonoïdes (coumestrol, daidzeine, formononetine, dihidroxyflavone et médicarpine) qui s’accumulent dans
les racines de plantes colonisées par les champignons MA appartiennent à cette voie de biosynthèse.
Sous l’effet de la colonisation du champignon MA, les gènes des enzymes qui
conduisent à la formation de la médicarpine sont surexprimés au niveau des cellules
contenant les arbuscules (Harrison et Dixon, 1994). La medicarpine est un
20
INTRODUCTION
flavonoïde qui possède une activité inhibitrice sur certains champignons pathogènes
(Baggett et al., 2002). De plus, la daidzeine précurseur de la formononetine et de la
médicarpine stimule la germination des spores de Glomus mosseae et de R.
irregularis (Kape et al., 1993). D’autres travaux ont montré que dans des temps
précoces de la symbiose le rapport de concentration de la formononetine, de la
medicarpine et de leurs conjugués glycosylés augmente. Alors qu’à des temps plus
tardifs ce rapport diminue pour tendre vers une valeur de 1 (Volpin et al., 1995).
Malgré tous ces travaux sur les flavonoïdes, leurs rôles dans la mycorhization restent
encore non résolus, principalement en raison des différences de concentrations
observées. Elles dépendent de plusieurs facteurs : (i) le champignon MA utilisé
(Larose et al., 2002), (ii) la plante étudiée (Harrison, 1993), (iii) et le temps de culture,
les flavonoïdes s’accumulant au cours du temps dans les tissus indépendamment de
la symbiose (Tiller et al., 1994). Bécard et collaborateurs (1995) ont montré que des
plantes de maïs mutées sur le gène codant pour la chalcone synthase étaient
normalement mycorhizées par différents champignons MA malgré leurs incapacités à
synthétiser ces flavonoïdes (4’,7-dihydroxyflavone, la formononetine, la daidzeine et
la médicarpine).
D’autre part, l’observation d’une prolifération de plastes et de mitochondries
autour des arbuscules témoigne d’une forte activation métabolique des cellules
racinaires colonisées (Lohse et al., 2005; Lohse et al., 2006). La mise en évidence
de l’accumulation d’apocaroténoïdes dans les racines mycorhizées atteste d’une
forte stimulation de ce métabolisme dans la plante hôte. Ces apocaroténoïdes sont
issus de la dégradation oxydative du carotène en C13 (cycloxanones) et C14
(mycoradicines) sur lesquels se greffent entre autres des glycosides et des fonctions
malonyles (Schliemann et al., 2006). La déficience en 1-deoxy-D-xylulose-5-
phosphate synthase2 (DXS2), une protéine de la voie du methylerythritol-phosphate
(MEP), voie de biosynthèse des isoprènes localisée en amont des caroténoïdes,
diminue le pourcentage d’arbuscules matures et actifs ainsi que la quantité
d’apocaroténoïdes (Floss et al., 2008) (Figure 1-6).
21
INTRODUCTION
Figure 1-6 Voie de biosynthèse des apocaroténoïdes s’accumulant dans les racines de plantes colonisées par les champignons MA (Strack et Fester 2006).
Les apocaroténoïdes composés de cyclohexanone (C13), de dérivés cyclohexanones, de mycoradicine (C14) et
de dérivés mycoradicines sont issus du clivage du beta-carotène, lui-même synthétisé par la voie du
méthylerythritol 4-phosphate (MEP). Les différentes enzymes intervenant dans cette biosynthèse des
apocaroténoïdes : DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase ; DXR, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate
reductoisomerase ; PDS, phytoene desaturase ; ZDS, beta-carotène desaturase ; CCD, carotenoïd cleavage
dioxygenase.
Ces résultats suggèrent qu‘une ou des molécules participant à la vitalité des
arbuscules peuvent être issues d’apocaroténoïdes. Ces molécules pourraient
contrôler la colonisation du champignon ou protéger les cellules corticales des
racines contre les dommages oxydatifs induits par une forte activité d’échange de
nutriments entre les deux partenaires. Elles pourraient aussi comme celles issues de
MEP
22
INTRODUCTION
la mycoradicine (apocaroténoïdes en C14), être associées à la dégradation des
arbuscules (Fester et al., 2002). Rappelons que les strigolactones et l’acide
abscissique sont issus du clivage de beta-caroténoïdes par une famille d’enzymes :
les « carotenoïd cleaving dioxygenase » (CCDs) (Strack et Fester, 2006). La
synthèse des gibbérellines et des cytokinines dépend également de la voie du MEP.
A partir de plantes entières de M. truncatula, une étude de métabolomique
globale sur des racines mycorhizées avec R. irregularis et non mycorhizées a été
réalisée par Schliemann et collaborateurs, à différents temps de culture (Schliemann
et al., 2008). Les métabolites primaires ont été analysés par GC-MS, trois acides
aminés (acide aspartique, acide glutamique et asparagine) sont davantage présents
dans les racines mycorhizées à 42 jours de culture. A l’inverse le cis-aconitate et le
fumarate, métabolites du cycle de Krebs, ont des concentrations réduites dans les
racines mycorhizées. Ce résultat peut traduire une activation du métabolisme
mitochondrial et plastidique durant la mycorhization. La prolifération de plastes et
une augmentation de l’expression des gènes de biosynthèse supporte cette
hypothèse (Lohse et al., 2005; Lohse et al., 2006). De plus, le tréhalose, un sucre
typiquement fongique, a logiquement et seulement été détecté dans les racines
colonisées par le champignon MA.
Pour les métabolites non polaires, certains acides gras, glycérides et stérols
ont également été détectés seulement dans les racines mycorhizées. Ils sont
d’origine fongique et sont caractéristiques de la colonisation des racines par le
champignon MA. De plus, l’acide palmitique et l’acide oléique ont été retrouvés en
plus grande quantité dans les racines mycorhizées.
En ce qui concerne les métabolites secondaires, les flavonoïdes et
apocaroténoïdes ont été analysés par HPLC avec un détecteur de type UV. A 56
jours de culture, quinze composés ont été détectés exclusivement dans les racines
mycorhizées dont douze apocaroténoïdes et trois métabolites non identifiés. Les
apocaroténoïdes étaient des dérivés de cyclohexanones identifiées comme des
bluemenols et des dérivés de mycoradicine connus pour être synthétisés pendant la
symbiose mycorhizienne (Strack et Fester, 2006). De plus, ces analyses ont montré
l’accumulation des flavonoïdes avec le temps de culture, en accord avec de
précédents travaux (Tiller et al., 1994). A partir de 35 jours de culture, la daidzeine,
l’ononine et la malonylononine ont été retrouvées en plus grandes quantités dans les
racines colonisées par le champignon MA que dans les racines non mycorhizées.
23
INTRODUCTION
Antérieurement, Harrison et Dixon avaient mis en évidence l’accumulation de ces
flavonoïdes à 40 jours de culture dans les racines de M. truncatula colonisées par
G.versiforme (Harrison, 1993). Une autre classe de métabolites très présente dans
les racines, les saponines (triterpènes glycosylés), et reliées à de nombreuses
activités biologiques avec notamment des propriétés anti-fongiques (Osbourn, 2003;
Dinda et al., 2010; Lanzotti et al., 2012), ont été détectées mais sans différence
significative entre racines mycorhizées et racines témoins ; comme pour les
flavonoïdes, les saponines s’accumulent au cours de la croissance de la plante
indépendamment de la colonisation par le champignon MA. Suite à une hydrolyse
alcaline permettant une libération des composés liés aux parois, les métabolites
phénoliques ont également été analysés lors de ces travaux. Il est connu que des
changements dans la composition des métabolites phénoliques de la paroi
interviennent lors d’interactions entre plantes et pathogènes. Il est proposé que ces
modifications confèrent une meilleure résistance des parois face aux enzymes de
lyse des envahisseurs (pathogènes) ainsi qu’un renforcement physique des parois
(Stewart et Mansfield, 1985; Dixon, 2001b; Hahlbrock et al., 2003). Le tyrosol a été
caractérisé comme le composé phénolique des parois le plus produit dans les
racines de M. truncatula colonisées par le champignon MA. Cependant, chez le
poireau (Allium porrum), le tyrosol est l’un des composants majeurs des métabolites
phénoliques liés à la paroi. Aucune diminution ou augmentation de la concentration
de celui-ci n’a été mesurée à l’état mycorhizé chez le poireau (Codignola et al.,
1989). Ces observations suggèrent que le tyrosol ne joue pas un rôle majeur dans la
symbiose endomycorhizienne.
1.2.3.4.2. Chez le champignon MA
Il semble que les capacités réelles du champignon à transporter et
métaboliser des sucres tels que le glucose ou le fructose ne s’exercent que dans son
mycélium intra-racinaire. En effet, lorsque des sucres marqués au 13C ou au 14C sont
fournis au mycélium extra-racinaire, aucun marquage n’est observé dans les tissus
du champignon (Pfeffer et al., 1999 ; Bécard et al., 2004). Par contre un marquage
direct des métabolites du champignon, notamment du tréhalose, est observé lorsque
24
INTRODUCTION
ces sucres marqués sont apportés aux racines mycorhizées, c’est-à-dire au
mycélium intra-racinaire. Il a également été montré que le partenaire fongique n’était
capable de synthétiser l’acide palmitique, précurseur de tous ses acides gras, qu’au
niveau de son mycélium intra-racinaire (Pfeffer et al., 1999; Trépanier et al., 2005).
Le fait que le transport des sucres et la synthèse des acides gras ne s’opèrent chez
le champignon que dans l’apoplasme d’une racine suggère que ces compétences
métaboliques fongiques sont en réalité sous le contrôle de la plante hôte. Les
mécanismes subtils qui contrôlent ces fonctions trophiques et métaboliques du
champignon ne sont pas connus, mais leur élucidation pourrait à elle seule expliquer
une grande partie du caractère obligatoire de la biotrophie des champignons MA.
Ceci est d’autant plus vrai que la principale réserve carbonée de ces champignons
est sous forme lipidique, et plus particulièrement sous forme de triglycérides. Une
fois assimilés par les hyphes intra-racinaires, les hexoses sont ensuite transformés
en tréhalose, glycogène et lipides. Ces derniers sont ensuite acheminés vers les
hyphes extra-racinaires (Bago et al., 2002; Bago et al., 2003) (Figure 1-7).
Figure 1-7 Les flux métaboliques dans la symbiose endomycorhizienne à arbuscule. (Parniske, 2008).
Ce schéma représente les différents flux métaboliques échangés entre les hyphes extra racinaires (à droite) et
les hyphes intra racinaires (à gauche). A droite l’hyphe extra racinaire absorbe le phosphate et l’azote du sol par
l’intermédiaire de transporteurs spécifiques. L’azote est stocké sous forme d’arginine. Le phosphate est
25
INTRODUCTION
transformé en polyphosphate puis il est complexé à l’arginine et transféré vers l’hyphe intra racinaire. L’arginine
est convertie en urée, la forme sous laquelle est échangé l’azote. Les polyphosphates se dégradent pour fournir
du phosphate capté par la plante via un transporteur de phosphate spécifique de la symbiose. En contre partie,
l’hyphe puise des hexoses de la plante via les transporteurs de sucrose dans l’espace périarbusculaire. Il forme
du glycogène et des triglycérides qui seront exportés vers l’hyphe extra racinaire.
1.2.3.5. Signaux et facteurs de régulation pendant la symbiose MA
Ainsi pendant la phase symbiotique, les programmes génétiques, cellulaires,
physiologiques et métaboliques des deux partenaires sont profondément modifiés.
Peu de choses sont connues sur les mécanismes qui sous-tendent ces
reprogrammations. Il se peut que certains signaux moléculaires d’origine végétale ou
fongique, comme lors de la phase pré-symbiotique, jouent des rôles clés. La
caractérisation de ces signaux, impliqués dans des stades plus tardifs et échangés
entre les partenaires symbiotiques in planta, au niveau le plus intime de la symbiose,
est un véritable défi que nous avons essayé de relever dans ce travail de thèse.
1.2.3.5.1. La lyso-phosphatidylcholine
Dans cette recherche des signaux ou facteurs régulateurs de la symbiose MA,
il faut mentionner la lyso-phosphatidylcholine (LPC). Ce métabolite est trouvé en plus
grande quantité dans les racines mycorhizées. Il induit l’expression des gènes StPT3
et StPT4 de la pomme de terre et LePT4 de la tomate qui codent pour des
transporteurs de phosphate spécifiques de la symbiose (Drissner et al., 2007; Bucher
et al., 2009).
1.2.3.5.2. Hormones végétales
Les phytohormones sont également des molécules candidates dans la
régulation de la symbiose mais le rôle qu’elles jouent dans la mycorhization n’est pas
26
INTRODUCTION
bien établi. De nombreuses études indiquent que leurs concentrations varient au
cours de la symbiose (Hause et al., 2007). L’interprétation des résultats est difficile
car elles n’agissent pas seules, mais de façon interdépendante. Une revue décrit
l’importance du couple acide jasmonique et acide salicylique ainsi que du ratio entre
les deux dans le déclenchement des défenses des plantes face aux parasites et aux
interactions mutualistes (Gutjahr et Paszkowski, 2009). Une suppression partielle de
l’expression du gène codant pour une “ allene oxide cyclase “ (AOC1) et intervenant
dans la synthèse de l’acide jasmonique a pour conséquence de réduire le nombre
d’arbuscules et de provoquer un retard dans le processus de colonisation (Isayenkov
et al., 2005). Ces résultats suggèrent qu’un plus faible niveau d’acide jasmonique
peut déséquilibrer le ratio acide jasmonique / acide salicylique influençant ainsi le
niveau de défense de la racine et pénalisant l’interaction avec le symbionte. Les
strigolactones sont une classe d’hormones végétale mais aussi une famille de
molécules signal perçues par le champignon MA. Elles provoquent une forte
augmentation de l’activité mitochondriale du champignon MA ainsi qu’une importante
ramification de ses hyphes. La production de strigolactones est dépendante de la
concentration en phosphate in planta, concentration elle-même modulée par la
symbiose mycorhizienne. Quand le champignon MA colonise les racines, la
concentration en strigolactones décroit. Peut on relier cette diminution de
concentration à un contrôle des strigolactones sur la mycorhization en fonction de la
quantité de phosphate fournit par le partenaire fongique ? A ce jour, aucune donnée
ne permet d’établir un lien entre cette hormone et la régulation de la mycorhization in
planta. Même si certaines hormones végétales contrôlent jusqu’à un certain point
l’interaction symbiotique et donc directement ou indirectement le partenaire fongique,
il est vraisemblable que d’autres molécules signal, en amont ou en aval, totalement
inconnues à ce jour, soient également impliquées.
1.2.3.5.3. Les microARN
Les microARN sont également étudiés dans la symbiose mycorhizienne pour
leur capacité à moduler l’expression des gènes (Branscheid et al., 2010; Gu et al.,
2010; Branscheid et al., 2011). Des études plus fines mettront certainement en
évidence dans les prochaines années le rôle joué par certains de ces microARN
27
INTRODUCTION
dans la régulation de la mycorhization. D’ailleurs très récemment, un micro ARN, le
miR 171h a été mis en évidence pour son rôle dans la régulation de la colonisation
des racines par le champignon MA. Une surexpression du miR 171h dont la cible est
le gène NSP2 (gène appartenant à la CSP) altère le taux de mycorhization
(Lauressergues et al., 2012).
1.2.3.6. L’autorégulation de la symbiose par la plante
L’autorégulation de la mycorhization par la plante a été démontrée par un
certain nombre de travaux, notamment grâce à des cultures de plantes entières dont
le système racinaire est divisé en deux parties. Différentes conditions ou traitements
appliqués dans l’un des compartiments racinaires, affectent le taux de mycorhization
dans le second par l’intermédiaire de signaux systémiques non identifiés à ce jour
(Catford et al., 2003; Staehelin et al., 2011a).
1.2.3.6.1. Les CLE peptides
On mentionnera ici l’identification de signaux de régulation appartenant à la
famille des CLE peptides (Oka-Kira et Kawaguchi, 2006; Magori et Kawaguchi, 2009;
Mortier et al., 2010). Ces peptides initialement découverts chez l’animal (Jun et al.,
2008), régulent le développement cellulaire des plantes (Wang et Fiers, 2010; Katsir
et al., 2011). La plupart des mutants affectés dans l’autorégulation de la symbiose
rhizobienne le sont également dans la symbiose mycorhizienne, suggérant une
similitude dans les mécanismes de régulation (Staehelin et al., 2011b). Par
conséquent, Il semble très probable que les CLE peptides soient aussi impliqués
dans l’autorégulation de la symbiose mycorhizienne (Staehelin et al., 2011a).
1.2.3.6.2. Le phosphate
Il est bien connu que des concentrations trop élevées de phosphate inhibent la
28
INTRODUCTION
mycorhization (Smith & Read, 2008). Les mécanismes de cette régulation négative
par le phosphate sont encore mal connus mais ils pourraient agir très tôt et impliquer
des signaux systémiques provenant des parties aériennes de la plante (Breuillin et
al., 2010 ; Balzergue et al., 2011). Par ailleurs, le phosphate fourni par le
champignon MA est essentiel au maintien des structures symbiotiques et au
développement de la mycorhization (Javot et al., 2007). Enfin les concentrations en
phosphate dans le milieu et in planta influencent la production de strigolactones dont
on sait le rôle stimulateur sur les champignons MA (Yoneyama et al., 2007; Lopez-
Raez et al., 2011). On peut donc faire l’hypothèse que le phosphate agit comme un
signal de régulation de la symbiose (Yang et Paszkowski, 2011).
1.3. Objectif des travaux de thèse
Nous avons vu que l’expression d’un grand nombre de gènes des deux
partenaires était modulée par la symbiose mycorhizienne. L’extinction de la
transcription de ces gènes par l’utilisation de mutants ou par l’usage d’organismes
modifiés génétiquement, produisant des ARN d’interférences (Coleman et al., 1984;
Mizuno et al., 1984; Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b) a permis de mettre
en évidence de nombreux gènes codant pour des protéines essentielles au bon
développement de la symbiose mycorhizienne. Pour une partie de ces protéines, leur
rôle et leur fonction dans la symbiose ne sont pas définis. La croissance du
champignon MA à l’intérieur des racines et le développement d’arbuscules au niveau
des cellules corticales requièrent de nombreux processus cellulaires. Cela laisse
présager une régulation et une signalisation complexes (Harrison, 2005b). Malgré
tous les travaux menés sur la symbiose mycorhizienne et la grande quantité de
données accumulées, nos connaissances sur le développement et le maintien de
cette interaction restent parcellaires. Les mécanismes de régulations sont encore
largement inconnus et la mise en évidence de ces processus demeure un défi.
Notre objectif a été d’identifier des métabolites d’origine fongique ou végétale
qui jouent un rôle, in planta, dans la régulation de la symbiose mycorhizienne à
arbuscule. Nous nous sommes focalisés sur les petites molécules (taille moléculaire
< 1 500 Dalton). Pour cela nous avons suivi une stratégie en trois étapes (Figure 1-
29
INTRODUCTION
8).
Figure 1-8 Schéma général de la stratégie mise en place pour identifier des molécules impliquées dans la symbiose.
Cette stratégie se décompose en trois parties : (I) la mise en évidence des différences métaboliques entre des
extraits de racines mycorhizées ou non mycorhizées grâce à des analyses différentielles par spectrométrie de
masse (profils métabolomiques). (II) Un bio-essais visant à sélectionner les molécules pouvant avoir un rôle dans
cette symbiose. Pour cela une analyse transcriptomique permet de mettre en évidence les molécules qui
affectent des gènes spécifiques de la mycorhization. (III) les molécules criblées comme différentielles et affectant
l’expression de gènes spécifiques de la symbiose sont ensuite pré purifiées, caractérisées chimiquement et
testées à nouveau sur l’expression des gènes en vue d’une identification structurale.
Au cours des dernières années, grâce aux avancées technologiques importantes
dans les domaines de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse,
ont émergé de nouveaux outils analytiques, permettant des analyses globales telles
que la métabolomique. Aujourd’hui, une analyse de métabolomique différentielle
permet de comparer simultanément plusieurs milliers de analytes entre différents
échantillons (Dunn et al., 2011), ce qui en fait une technique de choix pour des
investigations sans apriori (Patti, 2011). Cette approche est particulièrement justifiée
dans les cas où les connaissances biologiques sont limitées. La somme des
données accumulées et leurs analyses permettent une exploration du métabolome
dont les résultats engendrent souvent la naissance de nombreuses études plus
30
INTRODUCTION
ciblées (Kell et Oliver, 2004). La première partie du travail a été consacrée à la mise
en place de la méthode expérimentale et à l’ensemble du processus analytique
(Chapitre 1) pour mener une étude comparative des métabolomes de racines
mycorhizées et non mycorhizées.
La deuxième partie du travail a consisté à traiter les données afin de définir
les composés présents en plus grande quantité dans les racines mycorhizées.
Ensuite nous avons tenté de repérer parmi les différentes molécules criblées par les
profils métaboliques celles qui pourraient jouer un rôle régulateur dans la symbiose.
Le métabolome des deux conditions (mycorhizée ou non) a été fractionné par HPLC
préparative pour tester l’effet des différentes fractions sur l’expression de certains
gènes d’intérêts du champignon MA (Chapitre 2).
31
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
2. CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
La stratégie élaborée pour identifier des métabolites importants dans la
symbiose mycorhizienne couple deux approches i) une analyse différentielle du
métabolome de racines mycorhizées versus non mycorhizées par LC-MS, dans le
but d’identifier des ions caractéristiques de la condition mycorhizée, ii) une analyse
de l’expression de gènes, connus pour être régulés durant la symbiose
mycorhizienne, en réponse à des extraits de racines mycorhizées versus non
mycorhizées, fractionnés par chromatographie liquide. L’hypothèse de travail est que
le couplage de ces deux approches devrait permettre à terme l’identification de
molécules spécifiquement synthétisées in planta pendant la symbiose, et ayant un
rôle symbiotique régulateur.
En premier lieu, il s’est avéré nécessaire de développer l’ensemble des
méthodologies permettant de mener à bien cette stratégie en commençant par
optimiser les conditions de cultures pour obtenir un matériel biologique en
adéquation avec l’utilisation de la chromatographie liquide couplé à la spectrométrie
de masse.
2.1. La culture
2.1.1. Choix des organismes
Medicago truncatula est une plante modèle particulièrement adaptée aux
études des symbioses rhizobiennes et mycorhiziennes. De nombreuses ressources
génétiques, transcriptomiques et génomiques sont maintenant disponibles pour
l’étudier (Bell et al., 2001; Cannon et al., 2005; Young et al., 2011). Le partenaire
fongique Rhizophagus irregularis (DAOM 197198), anciennement appelé Glomus
intraradices, est l’organisme modèle pour l’étude de la symbiose endomycorhizienne.
Il a été adopté par la communauté scientifique internationale parce qu’il est cultivable
in vitro sur racines transformées (Pawlowska et al., 1999; Chabot et al., 1992). Son
génome est en cours de séquençage. De plus, la création d’un consortium
Rhizophagus irregularis, auquel mon équipe d’accueil participe, a conduit à la
32
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
réalisation de plusieurs banques d’EST (expressed sequence tag) et l’élaboration de
puces transcriptomiques, qui ont permis de cartographier les gènes exprimés sous
différentes conditions (Tisserant et al., 2012) (http://mycor.nancy.inra.fr/IMGC/).
2.1.2. Culture de M. truncatula en plante entière ou racines stériles
La culture de M. truncatula en plante entière, mycorhizée ou non, est
réalisable au laboratoire. Toutefois, elle présente de nombreux inconvénients par
rapport à des cultures de racines stériles en boites de pétri, comme la place
nécessaire en chambre de culture pour entreposer les pots. Il faut définir la « photo
période » la plus adaptée, contrôler l’intensité lumineuse avec une exposition
homogène entre tous les échantillons, contrôler l’arrosage. De plus, le suivi visuel du
développement du champignon est impossible, cela nécessite l’arrêt de la culture
pour quantifier la présence du champignon dans les racines. Enfin, la culture en
plante entière n’étant pas stérile, elle ne permet pas de contrôler strictement la
coinfection par d’autres microorganismes. Or, le métabolisme secondaire des plantes
est très sensible à la présence de microorganismes dans la rhizosphère (Dixon,
2001a). Par conséquent, une culture pure de racine avec ou sans son partenaire
fongique permet de cribler les différences exclusivement engendrées par la présence
du champignon MA.
Une alternative est la culture stérile (in vitro) de racines de M. truncatula
transformées par Agrobacterium rhizogenes (A. rhizogenes), c'est-à-dire en absence
des parties aériennes. De ce fait sans partie aérienne, la photosynthèse est abolie et
la source de carbone pour la culture de racine est apportée par le milieu de culture
sous la forme de sucrose. Des interrogations sur le comportement de ces racines
composites vis-à-vis de la mycorhization sont légitimes. Cependant, une étude a
démontré que le taux de colonisation, les structures fongiques et les profils
transcriptomiques restent inchangés dans une plante chimérique comportant des
racines transformées par rapport à une plante sauvage (Mrosk et al., 2009).
Toutefois, il faut garder à l’esprit que tout signal systémique faisant intervenir les
parties aériennes serait par conséquent aboli.
33
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
2.1.2.1. Culture de racines stériles de M. truncatula
La culture in vitro dans la gélose (Phytagel à 3g/l) de Rhizophagus irregularis
sur racines transformées par Agrobacterium rhizogenes (« hairy roots») avec un
milieu minimum M (Bécard et Fortin, 1988), est bien maîtrisée au sein du laboratoire.
Dans ces conditions, le champignon se développe, forme des mycorhizes typiques,
sporule et donc accomplit son cycle de vie comme s’il était en symbiose avec une
plante entière. Le milieu M est constitué de sels minéraux, de vitamines et de
saccharose. Les faibles quantités d’azote et de phosphate de ce milieu favorisent
l’établissement de la symbiose. L’ensemble des paramètres de cultures :
composition du milieu, température et hygrométrie sont bien contrôlés. La
température influence les échanges dans la symbiose ; certains travaux rapportent
que les valeurs optimales pour Rhizophagus irregularis se situeraient entre 23C° et
25C° (Smith et Roncadori, 1986; Liu et al., 2004). Le taux de mycorhization traduit
l’état de colonisation de la racine par le partenaire fongique. Cette valeur correspond
au pourcentage du système racinaire qui présente au moins une structure fongique
(hyphe, arbuscule, spore ou vésicule) au niveau de son cortex racinaire. La
quantification du taux de mycorhization s’effectue selon la méthode de la Gridline
Intersect Method (Giovannetti et Mosse, 1980). Une grande variabilité du taux de
mycorhization est mesurée entre différentes cultures, les valeurs s’échelonnent de
quelques pourcents jusqu’à 50%. L’observation des cultures permet de mettre en
évidence que dans les zones de forte densité d’hyphes, aucune racine n’est présente
et inversement, les deux organismes semblent être en compétition vis-à-vis de
l’occupation du milieu. Le taux de mycorhization est optimum après 8 semaines de
culture, dans une boîte de Petri ronde (145Ø x 20 mm). Au-delà, la colonisation des
racines par le champignon MA ne progresse plus.
Toutefois, cette culture dans la gélose présente quelques défauts pour une
analyse métabolomique. La première difficulté réside dans l’extraction des racines de
la gélose sans abimer les tissus racinaires ; toute altération pouvant provoquer des
perturbations métaboliques. De plus, le processus analytique est perturbé par
l’impossibilité d’éliminer totalement la présence de la gélose. Cette dernière, même
sous forme de trace altère nos analyses en spectrométrie de masse. Lors de la
resolubilisation des échantillons un précipité se forme emprisonnant une partie des
34
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
métabolites présents induisant une grande variabilité. Enfin, la colonisation du
partenaire fongique dans les racines est inégale entre différentes cultures, le taux de
mycorhization moyen est de 29% avec un coefficient de variation de 56%.
Nous avons dû adapter nos conditions de culture afin de rendre compatible
une analyse métabolomique avec l’utilisation de la spectrométrie de masse et
d’améliorer la reproductibilité du taux de mycorhization entre différentes cultures, tout
en maintenant une colonisation satisfaisante de la racine par le champignon MA.
2.1.2.2. Amélioration des conditions de culture
Afin de contourner les problèmes engendrés par l’utilisation du Phytagel (3
g/L), la première initiative a été de réduire sa concentration dans le milieu. Pour
déterminer la quantité minimale de Phytagel nécessaire au bon développement des
racines et du champignon MA, différentes cultures ont été réalisées avec des
concentrations variant de 0,5 à 2,75 g/L (Figure 2-1).
Figure 2-1Développement des racines composites et de la mycorhization en fonction de la concentration de Phytagel dans le milieu gélosé.
Les différentes photographies de (A) à (J) correspondent à des cultures de
racines transformées de M. truncatula, en présence de 500 spores de Rhizophagus irregularis, après quinze jours
de croissance sur des milieux M gélosés avec saccharose, contenant de 0.5 à 2,75g/L de Phytagel. Le tableau
rapporte le taux de mycorhization de ces cultures à huit semaines, déterminé selon la méthode de la Gridline
Intersect (Giovannetti et Mosse, 1980). Le pourcentage moyen de mycorhization est calculé à partir de cinq
échantillons de racines mycorhizées pour chaque concentration de Phytagel.
A quinze jours de culture, les racines poussent correctement au-delà de 1g/L de
Phytagel. Toutefois à huit semaines de culture, le partenaire fongique colonise
Phytagel
en g/L
taux de
mycorhization (en%)
0,5 0 0,75 0
1 4 1,25 3 1,5 7
1,75 15 2 33
2,25 31 2.5 37
2.75 35
35
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
faiblement son hôte en dessous de 2 g/L. Cependant, les concentrations dans
lesquelles se développe correctement le champignon MA (> 2 g/L de Phytagel) ne
permettent pas l’extraction du système racinaire sans abîmer les racines, la gélose
demeure trop dense. Une étape de dissolution du Phytagel avec un tampon citrate à
10 mM a été testée. Elle n’est efficace que sous agitation à 100 rpm, ce qui provoque
la rupture des racines latérales. Les tentatives infructueuses d’extraire des racines
sans la présence de gélose ont conduit à explorer la possibilité de séparer
physiquement les racines du Phytagel. Un papier filtre a été inséré entre la gélose et
les racines. Ce processus permet aux racines de croître à la surface du papier filtre
et au partenaire fongique de se frayer un chemin entre les mailles des fibres du
support papier pour atteindre la gélose où il peut se développer. En fin de culture, les
racines posées sur le papier filtre ne présentent aucune trace de gélose, leur
extraction n’oppose plus de résistance mécanique. De plus, le taux moyen de
mycorhization est élevé avec une moyenne à 47%, à huit semaines, et la variabilité
entre culture est relativement plus faible avec un coefficient de variation de 9%.
Grâce à la présence du papier filtre, il
n’y a plus de compétition entre les deux partenaires vis-à-vis de l’occupation du
milieu, la culture est compartimentée, une partie supérieure constituée
principalement de racines et une partie inférieure colonisée par le partenaire
fongique.
Le dernier défi a concerné la quantité de racines à produire. En effet, la taille
des boîtes de Petri utilisées pour la culture limite l’échelle de production. Nous avons
fait appel à la société Agronutrition, spécialiste du domaine pour produire les
quantités nécessaires de racines mycorhizées et non mycorhizées. Un système de
culture inspiré de celui que nous avions optimisé a été utilisé, mais les boîtes de
Petri ont été remplacées par des unités de production plus grandes. Ce changement
d’échelle a multiplié par cinq la quantité de racines, avec environ 5g obtenus par
unité de production, contre 1g par boîte de Petri.
2.1.3. Durée de la culture
36
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Une forte colonisation des racines implique d’importants flux d’échanges et
une grande coopération entre les deux partenaires. La dynamique du taux de
mycorhization représente le bilan entre la création et la sénescence de structures
fongiques dans la plante. Pour générer la plus grande quantité possible de
métabolites spécifiques de la symbiose, le taux de mycorhization doit être optimal et
donc la durée de culture doit être suffisamment longue. Cependant un temps de
culture trop long génère l’accumulation de composés induits par le vieillissement des
tissus racinaires. Avec le système de production de la société Agronutrition, la durée
de culture a été fixée à dix semaines au lieu de huit semaines en boîte de Petri et
des taux de mycorhization moyens 49% ont été obtenus.
2.2. L’analyse différentielle du métabolome
Cette analyse se scinde en trois étapes successives ; (i) la récolte,
l’échantillonnage et l’extraction, (ii) l’analyse du contenu des extraits racinaires par
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse et (iii) le traitement des
données pour réaliser l’analyse comparative (Zhou et al., 2011). La caractérisation
du maximum de différences entre l’état symbiotique et non symbiotique par une
approche d’empreinte métabolique repose sur la reproductibilité et la robustesse de
la méthode. Nous avons également eu le souci d’utiliser une démarche transposable
à d’autres systèmes biologiques, particulièrement dans le domaine des interactions
plantes/microorganismes.
2.2.1. Mise en place de l’extraction et de l’échantillonnage
Un organisme produit plusieurs milliers de métabolites avec des propriétés
physico-chimiques très diverses, aucune méthode ne permet à ce jour d’extraire et
d’analyser l’ensemble de ces molécules (Werner et al., 2008b). Le type d’extraction
pratiqué et le(s) solvant(s) employé(s) conditionnent la nature des métabolites
extraits.
37
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
2.2.1.1. Exsudation et extraction liquide-liquide
L’extraction des molécules échangées, au niveau des arbuscules, entre les
deux partenaires, était notre objectif initial. Parmi ces métabolites, se trouvent
vraisemblablement des molécules échangées entre les deux partenaires ayant des
propriétés de molécules signal capable de modifier l’expression des gènes du
partenaire opposé. Elles présentent un grand intérêt biologique et scientifique. On
suppose que certaines de ces molécules, circulant dans l’apoplasme racinaire, sont
solubilisables et extractibles par rinçage dans l’eau. Dans le sens inverse, c’est de
cette manière que la solution du sol parvient jusqu’aux cellules corticales des racines
(voie apoplasmique). C’est par l’analyse des exsudats racinaires obtenus dans l’eau
que les strigolactones ont par exemple été identifiées comme signaux symbiotiques
de la mycorhization (Akiyama et al., 2005; Besserer et al., 2006). Dans un souci de
limiter les perturbations du métabolisme des racines, l’exsudation a été réalisée avec
le milieu de culture (milieu M) à la place de l’eau. Les racines, environ 4g (poids
frais), sont introduites stérilement dans un Erlenmeyer contenant du milieu M et
mises sous agitation pendant 24h. Afin de définir le bon volume de milieu M à utiliser
ainsi que la meilleure agitation, différents tests ont été menés en faisant varier ces
deux paramètres. Notre critère de sélection a été l’état de coloration des racines
entre ces différentes conditions ; une teinte brunâtre indiquant une dégradation des
tissus racinaires et une perturbation du métabolisme (Figure 2-2).
Figure 2-2 Photographies de racines de M. truncatula transformées en cours d’exsudation.
38
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Différents tests ont été effectués avec quatre systèmes racinaires de M. truncatula transformés par A. rhizogenes
par Erlenmeyer. Différents volumes de milieu M (100, 150 et 200 ml), quatre conditions d’agitation (80, 90, 100,
110 et 120 rpm) ont été testés. Les racines ont été mises à exsuder durant deux semaines avec un suivi
d’apparition d’une coloration brunâtre, indiquant une dégradation de l’état physiologique des racines. Les
photographies suivantes illustrent les différentes teintes obtenues. La comparaison entre les photographies A et B
ou C et D permettent de voir l’influence néfaste d’une augmentation de volume. De la même façon l’agitation a
une incidence, les racines à 90 rpm (C et D) sont d’avantage pigmentées que celles soumises à 100 rpm (A et B)
Pour amplifier la visualisation de l’impact de ces deux paramètres (agitation et
volume de milieu M), l’exsudation a été prolongée sur deux semaines au lieu de 24h.
Grâce à ces tests, nous avons déterminé que la meilleure condition d’exsudation
s’obtenait avec 100 ml de milieu M et une agitation de 100 rpm. Les exsudats ont été
filtrés pour éliminer les débris cellulaires puis extraits par extraction liquide-liquide
avec un mélange eau et acétate d’éthyle (50/50). La phase organique a été
concentrée puis injectée en LC-MS. Les profils chromatographiques obtenus ont
montré une grande variabilité entre différents échantillons appartenant à la même
condition. L’analyse en composante principale (ACP) ne permet pas de distinguer
deux groupes d’échantillons (Figure 2-3).
Figure 2-3 Analyse par LC-MS d’exsudat racinaire extrait à l’acétate d’éthyle et de broyat racinaire extrait au méthanol pur.
Représentation graphique de l’analyse en composantes principales (ACP), (A) de 12 échantillons d’exsudats
racinaires extraits à l’acétate d’éthyle et (C) de 6 échantillons de broyats racinaires extraits au méthanol. Pour (A)
et (C) chaque échantillon est analysé à deux reprises par UPLC-Q-TOF, les extraits de racines mycorhizées sont
39
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
représentés par des points rouges et non mycorhizées par des points bleus. Seul le graphe (C) fait apparaitre
deux groupes d’échantillons correspondant aux racines mycorhizées et non mycorhizées. (B) et (D) sont des
chromatogrammes à trois dimensions avec en abscisse le temps de rétention (min), en ordonnée m/z et le
contraste blanc sur noir indique le niveau d’intensité des ions détectés : d’un échantillon (B) d’exsudat racinaire
extrait à l’acétate d’éthyle (D) d’un broyat de racine extrait au méthanol. Seul le chromatogramme (B) présente
des ions caractéristiques du polyéthylène glycol (PEG), et des polymères, reliés à l’utilisation de l’acétate
d’éthyle.
De plus, un bruit de fond important est observé dans les chromatogrammes, dont
l’origine est attribuée au solvant, malgré l’utilisation d’acétate d’éthyle le plus pur (ou
de grade le plus élevé). Dans l’hypothèse qu’une variabilité du pH entre différents
exsudats soit à l’origine d’une perturbation lors de l’extraction liquide-liquide, le pH de
chaque échantillon a été suivi, mais aucune variation significative n’a été observée.
Le temps d’exsudation pouvant également être incriminé, il a été raccourci à une
heure. Seulement peu de métabolites sont détectés en spectrométrie de masse. La
transition entre un substrat solide et l’immersion dans une solution de milieu M
provoque très certainement des changements métaboliques conséquents avec une
réadaptation aux nouvelles conditions.
Malgré les atouts d’une extraction par exsudation dans notre démarche, ces
observations ont montré qu’elle n’était pas compatible avec une approche
d’empreinte métabolique qui repose sur la reproductibilité et la robustesse de la
méthode. Par conséquent, une nouvelle stratégie d’extraction a été développée.
2.2.1.2. Extraction des tissus racinaires au méthanol pur
Dans le but de limiter l’impact de l’extraction sur le métabolisme des deux
symbiotes, nous avons choisi de réaliser des broyats de tissus racinaires dans
l’azote liquide puis de les extraire dans un faible volume de méthanol à température
ambiante. Cette méthode a l’avantage de figer le métabolome, et de limiter les
perturbations. Le choix du méthanol comme solvant est déterminé par sa capacité à
extraite un large spectre de molécules biologiques à l’exception des plus apolaires.
De plus, le volume de solvant utilisé pour l’extraction est divisé par 400 (1 ml au lieu
de 400 ml dans le cas d’une exsudation). Lors de l’étape de concentration des
échantillons, l’accumulation des contaminants provenant du solvant est largement
minimisée et par voie de conséquence le bruit de fond est réduit (Figure 2-3).
40
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Les racines sont tout d’abord partiellement broyées dans l’azote liquide afin
d’obtenir un mélange homogène de fragments d’environ un centimètre ; une petite
quantité étant prélevée pour déterminer le taux de mycorhization. Puis le reste est
réduit en poudre. 150 mg de broyat (poids frais) sont introduits dans un tube en verre
avant d’ajouter 1 ml de méthanol. Ce mélange subit trois fois une minute de
sonication suivi d’une minute de vortex. L’élimination des débris cellulaires se fait par
centrifugation à 6000 rpm, le surnageant est évaporé sous flux d’azote et conservé à
-80°C. La reproductibilité de cette méthode d’extraction a été vérifiée par HPLC. Les
profils chromatographiques obtenus avec des échantillons extraits à partir d’une
même culture racinaire ou de différentes cultures sont similaires.
2.2.1.3. L’échantillonnage
Dans les cultures, les racines sont repiquées au centre d’une boîte en
présence ou non de spores de Rhizophagus irregularis. Après dix semaines de
croissance, les tissus les plus âgés se situent au centre de la boîte et ont une teinte
plus jaunâtre que ceux à la périphérie, plus jeunes. Suite à la mesure du taux de
mycorhization de ces différentes zones, cette coloration jaune-orangé est corrélée
avec une colonisation plus forte par le champignon MA. Une bonne homogénéisation
du système racinaire est nécessaire avant de prélever des fragments de racines qui
servent à déterminer le taux de mycorhization. Chaque échantillon se compose de
cinq systèmes racinaires indépendants, soit le contenu en racine de cinq unités de
production équivalent à 25 g de racines au total (poids frais), afin de moyenner les
variations biologiques. Les analyses seront ensuite faites avec trois répétitions
biologiques : 3 x 25 g de racines par condition (mycorhizées ou non).
2.2.2. Mise en place de la méthode analytique
2.2.2.1. La plateforme analytique
41
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
De multiples technologies peuvent être utilisées pour réaliser des profils
métaboliques. En général, en amont d’un détecteur, les métabolites sont séparés en
fonction de leurs propriétés physico-chimiques par des méthodes telles que
l’électrophorèse capillaire (CE), la chromatographie liquide (LC) et la
chromatographie gazeuse (GC). Quant aux détecteurs, les plus utilisés sont l’infra
rouge (IR), la résonance magnétique nucléaire (RMN), les ultraviolets (UV), la
fluorescence et la spectrométrie de masse (Sumner et al., 2003). La sélection de la
méthode analytique dépend de la sélectivité et de la sensibilité qu’offrent les
différentes technologies. La détection par fluorescence est la technique la plus
sensible mais elle est restreinte aux molécules fluorescentes. La spectrométrie de
masse a également une bonne sensibilité mais un beaucoup plus large spectre de
molécules détectables. La RMN est la technique la plus informative pour la
détermination structurale des composés mais possède une sensibilité réduite par
rapport à la spectrométrie de masse. En outre, l’analyse d’un mélange complexe
nécessite l’utilisation d’une méthode de séparation comme la chromatographie
liquide ou gazeuse pour augmenter la sélectivité. Généralement la GC/MS et la
LC/MS sont les techniques les plus employées car elles offrent un bon compromis
entre sensibilité et sélectivité.
L’analyse des métabolites présents dans les extraits racinaires a été réalisée
à l’aide d’une Chromatographie Liquide Ultra Performance (UPLC) couplée avec un
spectromètre de masse de haute résolution possédant une source d’ionisation par
électrospray (ESI) et un analyseur de type quadripôle couplé à un temps de vol (Q-
TOF). L’utilisation de l’UPLC augmente la sélectivité et la sensibilité par rapport à
l’HPLC et un spectromètre de masse de type Q-TOF offre une haute résolution de
masse indispensable pour l’identification de composés à partir de bases de données.
Lors de la chromatographie liquide, les molécules présentes dans l’échantillon
analysé sont séparées en fonction de leur nature chimique, puis ionisées dans la
source ESI et enfin les ions sont caractérisés par leur intensité et par leur rapport
masse sur charge (m/z). Le couplage des types d’analyse permet d’obtenir un
résultat en trois dimensions défini par le temps de rétention, l’intensité et le rapport
m/z. Une baisse de signal est observée quand plusieurs molécules sont co-éluées et
atteignent la source du spectromètre de masse au même moment. Ce phénomène
s’explique par une compétition au niveau de l’ionisation de ces composés (King et
al., 2000; Müller et al., 2002). Il est donc nécessaire d’ajuster les paramètres
42
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
chromatographiques pour augmenter le pouvoir de séparation des composés, tout en
se plaçant dans des conditions en adéquation avec un couplage en spectrométrie de
masse. De même, l’optimisation des réglages du spectromètre de masse permettra
d’améliorer la sensibilité et la précision de mesure.
2.2.2.2. La chromatographie liquide
2.2.2.2.1. Description des principes chromatographiques
En chromatographie liquide, la capacité séparative d’une colonne, appelé
« résolution chromatographique » ainsi que sa capacité à séparer un mélange
complexe, dépendent du nombre de plateaux théoriques. Ils correspondent à une
modélisation de la chromatographie selon laquelle chaque soluté se déplacerait
progressivement en une suite d'étapes distinctes. La colonne de longueur L serait
découpée en N petits disques fictifs de même hauteur H. Pour un disque donné, la
concentration en soluté dans la phase stationnaire est en équilibre avec sa
concentration dans la phase mobile. A chaque nouvel équilibre, le soluté a progressé
d'un petit disque supplémentaire appelé plateau théorique. On définit ainsi la hauteur
équivalente en plateaux théoriques HEPT ou H :
H = L / N (équation 1)
Ce modèle issu de la mécanique des fluides a été mis au point par J.J. Van Deemter (1956).
En 1956, ce physicien a établi l'équation qui relie H (HEPT) aux caractéristiques
physiques de la colonne et de la phase mobile :
H = 2λdp + 2GDm/μ + ω(dp or dc)2μ/Dm + Rd2f μ/Ds (équation 2)
λ facteur de remplissage de la colonne, dp diamètre des particules, G, ω, et R des constantes, Dm coefficient de
diffusion du soluté dans la phase mobile, dc diamètre de la colonne, df épaisseur de la phase stationnaire, Ds
coefficient de diffusion du soluté dans la phase stationnaire, μ vitesse linéaire d’écoulement de la phase.
Elle peut être simplifiée en trois composantes (Figure 2-4):
43
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
H = A + B/µ + C.µ (équation 3)
Figure 2-4 Equation de Van Deemter et courbes reliant la Hauteur en plateau théorique (H) d’une colonne donnée en fonction du débit d’élution.
En rouge la courbe de Van Deemter indique la hauteur en plateau théorique (H) d’une colonne en fonction de la
vitesse linéaire d’écoulement du solvant (μ) qui est relié au débit d’éluant. Elle est la résultante des trois autres
courbes définies par les trois termes de l’équation de Van Deemter: La courbe A correspond à la diffusion d’Eddy,
la courbe B à la diffusion longitudinale et la courbe C aux équilibres d’interactions entre soluté et phase.
Le terme “A” correspond à la diffusion turbulente ou diffusion d’Eddy.
L’écoulement d’un fluide au travers d’une colonne est perturbé par la présence
d’obstacle (la phase stationnaire) qui provoque des turbulences, elles se manifestent
par un changement de la vitesse d’écoulement. Si la taille et la forme des particules
de la phase stationnaire sont hétérogènes, la vitesse d’écoulement de la phase
mobile est irrégulière au travers de la colonne. Suivant les chemins empruntés par la
phase mobile et l’analyte, le temps mis à parcourir la longueur de la colonne diffère.
La diffusion d’Eddy contribue à l'élargissement des pics (Figure 2-5).
44
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Figure 2-5 L’influence de la taille et de la forme des particules de la phase d’une colonne sur la diffusion d’Eddy.
Le pic 1 symbolise l’élution standard d’un composé sur une colonne avec une phase de taille et de forme homogènes contrairement au pic 2 moins résolutif avec une diffusion d’Eddy plus forte, le composé est dilué par rapport au pic 1. (B) De la même façon la taille des particules influe sur la diffusion d’Eddy, le pic 1 est plus résolutif que le pic 2.
Donc, plus les particules sont petites et plus le remplissage est homogène, plus
l’efficacité de la colonne augmente.
Le terme “B/µ” traduit la tendance naturelle des molécules de solutés à se
disperser c'est-à-dire à diffuser dans toutes les directions, cette dispersion et d'autant
plus grande que le débit est faible. Dans un flux de liquide, les molécules sont
entrainées par celui-ci limitant ainsi le phénomène de diffusion.
Le dernier terme “C.μ” traduit la résistance des solutés à se répartir à
l'équilibre entre les deux phases. Plus le débit augmente, plus l'équilibre est difficile à
atteindre, en cause l’apparition de turbulences et de gradients de concentration plus
forts. Les colonnes les plus efficaces sont celles avec un petit diamètre interne qui
sont remplies de façon homogène où le diamètre des particules de la phase
stationnaire est le plus faible possible. L’équation de Van Deemter démontre que la
performance d’une colonne à séparer un grand nombre de composés est
principalement définie par la taille des particules qui composent la phase stationnaire
(Figure 2-6).
45
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Figure 2-6 La diminution de la taille des particules d’une colonne augmente sa résolution. (D’après Jorgenson J.W., 2010)
Trois courbes de Van Deemter sont représentées sur ce graphique, elles caractérisent des colonnes qui diffèrent
par la taille de leurs particules (5µm, 3µm et 1µm). Les hauteurs des plateaux théoriques diminuent avec le
diamètre des particules de la colonne.
L’apport technologique de l’UPLC réside dans la conception de colonnes avec des
particules de plus petite taille d’environ 1,7 μm contre 3 à 5µm en HPLC classique.
En contrepartie, les pompes des systèmes UPLC doivent être capables de subir des
pressions jusqu’à 1000 bars. En effet, le maillage de la phase stationnaire étant plus
fin, l’écoulement du solvant au travers requiert une énergie plus importante. D’après
l’équation 1, le nombre de plateaux théorique est proportionnel à la longueur de la
colonne mais la diffusion des molécules définies par la composante B de l’équation
de Van Deemter l’est également. Si la taille de la colonne est trop importante, le pic
46
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
chromatographique s’élargit et perd en intensité pénalisant ainsi la résolution (Figure
2-7).
Figure 2-7 Profil chromatographique en fonction de la longueur de colonne
En augmentant la longueur d’une colonne, le terme B de l’équation de Van Deemter s’accroît également. Le
soluté se disperse longitudinalement au cours du temps. Une distance plus importante à parcourir au travers de
la phase implique un temps de rétention plus élevé et une dispersion plus grande. En réduisant la distance
parcourue par le soluté, le profil chromatographique s’affine et l’intensité augmente puisque l’aire du pic reste
inchangée (même quantité de soluté).
2.2.2.2.2. Optimisation des paramètres chromatographiques
La nature de la phase, le choix des solvants, le gradient imposé, le débit et la
température de la colonne sont autant de paramètres chromatographiques à définir
et à ajuster afin d’optimiser la séparation d’un mélange complexe. Dans un premier
temps, les conditions utilisées ont été similaires à celles employées dans des travaux
de métabolomique différentielle de tissus racinaires, utilisant les mêmes
appareillages, c’est a dire un couplage UPLC-Q-TOF (Chan et al., 2007; Dan et al.,
2008; Matsuda et al., 2009a). Dans un deuxième temps, en fonction des résultats
obtenus, des optimisations ont été apportées.
L’utilisation d’une colonne UPLC en phase inverse, plus particulièrement de
type C18, semblait la plus adaptée à la nature des composés, de polarité
intermédiaire, extraits par le méthanol. L’avantage d’utiliser ce genre de chimie de
séparation réside dans l’abondance des références présentes dans la littérature.
D’autres phases ont été testées (HILIC, amino, C8 et phényl) lorsque des molécules
candidates ont été identifiées, pour comparer leurs comportements
chromatographiques avec ceux de standards commerciaux.
Aucune relation mathématique ne permet de décrire le comportement d’un
composé en fonction des caractéristiques d’une colonne et des différentes conditions
47
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
chromatographiques. Afin d’améliorer la séparation, les différents paramètres sont
testés, l’optimisation en chromatographie liquide se fait toujours de façon empirique.
L’objectif a été d’obtenir une élution des composées sur l’ensemble du
chromatogramme de façon à augmenter la résolution chromatographique.
2.2.2.2.2.1. Les solvants et le gradient chromatographique
Les éluants classiquement employés en chromatographie liquide sont l’eau
(A) et l’acétonitrile (B) dans lesquels sont ajoutés de l’acide formique à 0,05%.
L’acidité des solvants contribue à la qualité chromatographique et favorise très
significativement l’ionisation des molécules par ESI (ElectroSpray Ionisation).
Le premier gradient d’élution testé était linéaire, de 5% à 100% de B en 15
minutes, avec une température de colonne à 40°C et un débit de 0,4 ml par minute.
Nous avons observé que la majorité des métabolites étaient élués dans la première
partie du chromatogramme (Figure 2-8).
48
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Figure 2-8 Optimisation du gradient pour une meilleure résolution chromatographique.
Les chromatogrammes A et B représentent des acquisitions réalisées par UPLC-Q-TOF d’un extrait méthanolique
de racines de M. truncatula mycorhizées sur une colonne C18. Le chromatogramme A correspond à une élution
avec un gradient linéaire d’un mélange eau/acétonitrile avec 0,1% acide formique allant de 5% à 100%
d’acétonitrile en 15 minutes. Le chromatogramme B décrit une élution avec un gradient à deux pentes, une
première de 5 à 50% d’acétonitrile de 0 à 11 min et une seconde pente plus forte de 50 à 100% d’acétonitrile de
11 à 15 min.
D’autres gradients d’élution ont été testés afin « d’étaler » les élutions sur l’ensemble
du chromatogramme, de façon homogène. Le gradient sélectionné se compose de
deux parties : la première avec une faible pente (de 5 à 50% de B de 0 à 11 min)
suivie d’une seconde partie dont la pente est plus forte (50 à 100% de B de 11 à 15
min). Ce gradient a permis de rééquilibrer l’allure générale du chromatogramme
(Figure 2-8) avec une température de colonne à 40°C et un débit de 0,4 ml par
minute.
La durée du gradient chromatographique a été optimisée, différents temps
d’élution ont été testés (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 minutes). Comme attendu, un
temps d’élution trop long amplifie le phénomène de diffusion, les pics s’élargissent
signe d’une perte de résolution. La conséquence directe est une diminution de
l’intensité des signaux. Un temps d’élution de 15 minutes est un bon compromis pour
avoir une bonne séparation et des pics assez fins.
2.2.2.2.2.2. Le débit chromatographique
En ce qui concerne le débit, la courbe de Van Deemter fournie avec la
colonne, indique que la valeur optimale se situe autour de 0,7 ml par minute.
Différents débits ont été appliqués, sur deux échantillons. Le nombre de pics
détectés et dépassant une valeur seuil d’intensité, fixée arbitrairement à 1500 coups
par spectre, augmente avec le débit ainsi que leur résolution chromatographique.
Effectivement ce paramètre influence fortement la diffusion et la dispersion du soluté
dans la colonne. Malheureusement les valeurs permettant d’obtenir une résolution
chromatographique optimale ne sont pas compatibles avec le spectromètre de
masse en aval, à ce débit le spectromètre s’encrasse trop rapidement, la sensibilité
49
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
décroit au bout d’une dizaine d’injections. De plus, par injection directe d’une solution
de leucine enképhaline (solubilisé dans 50% eau et 50% acétonitrile), utilisé comme
molécule test, nous avons déterminé que la sensibilité maximale du spectromètre de
masse a été optimale pour un débit de 0,1 ml par minute et une chute significative
été observée au delà de 0,45 ml par minutes.
2.2.2.2.2.3. La température de la colonne
Une hausse de la température du four de colonne entraine une baisse de la
viscosité, qui abaisse la pression et les turbulences dans la colonne. Les équilibres
entre phase stationnaire et phase mobile sont plus rapidement atteints pour chaque
soluté. Les termes A et C de l’équation 3 diminuent et participent au
raccourcissement de la hauteur équivalente en plateaux théorique (HEPT).
Toutefois, une température plus importante accroît la diffusion longitudinale à travers
la colonne. Ce phénomène s’amplifie quand le débit optimal de la colonne n’est pas
atteint. Une montée de l’agitation thermique exacerbe le terme B de l’équation 3,
contrebalançant la réduction des termes A et C. De ce fait, une température trop
élevée conduit à un élargissement des pics, alors qu’une température trop faible
prolonge le temps de rétention menant aussi à un élargissement des pics
chromatographique. Après avoir effectué différents tests, la valeur de 40 C° semble
être un bon compromis.
2.2.2.3. La spectrométrie de masse
2.2.2.3.1. Description du fonctionnement des spectromètres et optimisation des paramètres
2.2.2.3.1.1. La source d’ionisation électrospray (ESI)
Les appareils utilisés pour réaliser ces travaux sont un Q-TOF PremierTM
(Waters) et un Q-TOF Maxis (Bruker) tous deux équipés d’une source à ionisation
50
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
par électro-nébulisation, ou ESI (ElectroSpray Ionisation). Ce type de source a été
développé par J.B. Fenn (prix Nobel 2002) et a révolutionné la spectrométrie de
masse, notamment dans le domaine de l’analyse de protéines. En effet, cette source
permet de transformer directement des molécules d’un échantillon liquide en ions en
phase gazeuse.
2.2.2.3.1.1.1. Principe de l’électrospray
La connexion entre la sortie de la colonne chromatographique et la source
s’opère grâce à un tube de très faible diamètre interne (100 microns). Le volume
mort est minimisé et limite le phénomène de diffusion longitudinale. Dans la source,
la phase mobile traverse un capillaire métallique à l’extrémité duquel est appliquée
une tension de plusieurs Kilovolts. Le courant électrique traverse le solvant et
provoque son électrolyse, comme pour les molécules d’eau qui se dissocient et
forment des ions hydroxydes (OH-) et des protons (H+), ces derniers s’associant aux
molécules pour les ioniser. Lorsque les espèces ioniques émergent à la pointe du
capillaire, elles suivent un mouvement électrophorétique en réponse au champ
électrique imposé. Les ions de même polarité que le champ s’éloignent de la pointe
tandis que les ions de polarité opposée au champ électrique refluent vers l’intérieur.
Par conséquent, les ions de même polarité sont enrichis à la surface du liquide
sortant du capillaire, par force électrostatique. La solution est expulsée pour former
un cône dynamique, appelé « cône de Taylor ». Sous l'effet d'un flux d'azote coaxial
chauffé, l'effluent liquide se transforme en nuage de fines gouttelettes (spray) qui
sortent du capillaire avec une charge négative ou positive en fonction de la polarité
de la tension appliquée.
Ce mode d’ionisation présente les avantages de fonctionner à basse
température, à la pression atmosphérique et de transmettre peu d’énergie aux
composés ce qui permet d’ioniser un grand nombre de molécules (polymères et
biomolécules) sans rompre les liaisons covalentes. Les inconvénients majeurs de
l’ESI sont une grande sensibilité aux sels, entrainant une suppression de signal et
une faible ionisation des molécules les plus apolaires.
51
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
2.2.2.3.1.1.2. Le rendement d’ionisation en fonction du solvant
Lors de la séparation en chromatographie liquide, l’élution des différents composés
s‘opère grâce à un gradient de solvant, le pourcentage d’acétonitrile dans la phase
mobile augmentant au cours du temps. Or, le rendement d’ionisation de
l’électrospray diminue en présence de solvants organiques, qui possèdent une faible
conductivité du courant (Marginean et al., 2007; Crotti et al., 2011). Pour
contrebalancer ce phénomène, une augmentation de la tension s’avère nécessaire.
Hélas, les appareils utilisés ne permettent pas de réaliser un gradient de tension.
Pour obtenir le rendement d’ionisation le plus efficace sur l’ensemble de l’analyse, le
voltage utilisé correspondra à la valeur maximale pour laquelle il n’y aura pas
l’apparition d’arc électrique avec la composition en solvant du début de gradient. Si la
tension est trop élevée une décharge coronaire survient, l’air devient conducteur
phénomène dû à une forte densité de charges, le rendement d’ionisation devient nul.
En fonction de la géométrie et de la structure de la source d’un spectromètre
de masse, celui-ci a une sensibilité optimale pour une certaine gamme de débit de
solvant. A l’intérieur de cette gamme de débit, les paramètres tels que le débit
d’azote et sa température permettent d’optimiser la sensibilité de l’appareil. Les
fabricants définissent les valeurs les plus adéquates en fonction des débits
chromatographiques dans le cas de solvants largement utilisés comme l’eau et
l’acétonitrile. Toutefois le flux d’azote et sa température en source ont été optimisés
par rapport au débit chromatographique que nous avons définis précédemment (0,4
ml par minute).
2.2.2.3.1.1.3. Transfert des ions de la source vers le quadripôle
Dans le cas des spectromètres utilisés, l’orifice qui sépare la partie de la
source sous pression atmosphérique à celle sous un vide modéré ne se trouve pas
dans l’axe du spray. L’application d’une seconde tension permet d’y transmettre les
particules chargées et d’éliminer les autres. L’utilisation d’un trop fort gradient de
52
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
potentiel en source provoque une accélération des molécules. Elles acquièrent une
grande énergie cinétique et sous un vide modéré, la collision avec l’azote fragmente
les composés. A l’inverse, un trop faible gradient de potentiel affaiblie le taux de
transmission des ions vers l’analyseur. Dans le but d’optimiser la sensibilité,
différents tests ont été menés pour définir la valeur de tension qui favorise la
transmission des ions sans entrainer de fragmentations moléculaires.
2.2.2.3.1.2. Les analyseurs (quadripôle et TOF)
2.2.2.3.1.2.1. Le quadripôle
De la source d’ionisation, les ions produits sont transmis vers les analyseurs
du spectromètre de masse. Le quadripôle est constitué de quatre électrodes
parallèles soumises au même potentiel et dont les électrodes adjacentes ont des
polarités opposées. Au cours du temps, leurs polarités s’alternent suivant une
certaine fréquence. La trajectoire sinusoïdale d'un ion pénétrant dans le quadripôle
se décrit par les équations de Mathieu (Baranov, 2003; Baranov, 2004; Ding et
Kumashiro, 2006) selon la fréquence d’oscillation et la valeur du potentiel. Le
quadripôle est un filtre à ions, dans notre application il sert simplement à définir une
gamme de masse. Entre le quadripôle et le tube à temps de vol, se trouve la cellule
de collision, composée de diverses lentilles. Elle permet de fournir de l’énergie aux
ions sous forme d’énergie cinétique. Avec l’aide d’un flux de gaz de collision (azote
ou argon), les molécules chargées peuvent être fragmentées. Dans le cas d’une
analyse différentielle du métabolome, l’objectif est de caractériser la molécule
entière, la fragmentation n’est pas souhaitée. La cellule de collision servira
simplement de focalisateur d’ions pour améliorer la sensibilité de détection. Par
contre, la fragmentation dans cette cellule sera utile dans le cadre de l’identification
des métabolites, en mode MS/MS.
2.2.2.3.1.2.2. Le tube à temps de vol (TOF)
2.2.2.3.1.2.2.1. Principe du TOF
53
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Une cellule de transfert accumule les ions avant leur entrée dans le tube à
temps de vol où se situe le vide le plus poussé du spectromètre de masse. Les ions
y acquièrent des vitesses élevées et par conséquent, les forces de frottement doivent
être minimisées pour éviter toute fragmentation. Les vitesses de différents ions
accélérés par un champ électrique dépendent de leurs masses selon l’équation de
l’énergie cinétique :
Ec = ½ m v2 (équation 4)
(Ec : énergie cinétique, m : masse de l’ion sur le nombre de charge qu’il porte et V : vitesse de l’ion)
La résolution de l’équation d’énergie cinétique permet de déterminer la masse
sur charge des ions. Leurs vitesses sont calculées à partir de la mesure du temps
qu’ils mettent à parcourir le tube à temps de vol dont la longueur est connue. La
valeur de l’énergie cinétique est déduite en fonction de la tension appliquée pour
générer le champ électrique responsable de l’accélération des ions.
2.2.2.3.1.2.2.2. Vitesse d’acquisition, sensibilité et résolution chromatographique
Dans le cas d’un spectromètre de masse à temps de vol, la vitesse de scan et
la gamme de masse influent sur la sensibilité. La forte résolution chromatographique
de l’UPLC se traduit par des pics chromatographiques très fins (d’une largeur de
quelques secondes à mi-hauteur), ce qui impose une vitesse d’acquisition adaptée.
La quantification relative de chaque métabolite s’établit avec l’intégration de son pic
chromatographique. La précision de cette mesure est d’autant plus grande que le
nombre de points qui définit le pic chromatographique est important. Cependant
l’augmentation de la vitesse de scan induit une perte de sensibilité. En effet,
l’acquisition d’un scan correspond à la somme de plusieurs milliers de spectres de
masse, en diminuant leur nombre la sensibilité s’amenuise. Le rapport signal sur
bruit d’un pic varie selon la racine carré du nombre de spectres de masses
accumulés durant un scan. Dans le cas de notre étude, une dizaine de points par pic
chromatographique s’est avérée un bon compromis entre sensibilité et précision de
la quantification relative.
54
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
2.2.2.3.1.2.2.3. Gamme de masse et sensibilité
Comme l’indique l’équation de l’énergie cinétique, la vitesse d’une molécule
chargée dans le tube à temps de vol est reliée à sa masse, les plus lourdes sont les
plus lentes et mettent plus de temps à parcourir la distance jusqu’au détecteur. Par
conséquent, le temps d’enregistrement d’un spectre de masse est défini par la plus
haute masse analysée. Cette masse influe sur le nombre de spectres sommés par
scan, ce qui affecte la sensibilité. De plus, avant de subir une forte accélération
orthogonale dans le tube à temps de vol les ions sont stockés dans une cellule de
transfert linéaire, dont l’ordre d’entrée va des ions les plus légers au plus lourds. Si la
gamme de masse est trop importante, alors les plus légers commencent à ressortir
de cette cellule avant que les plus lourds n’y entrent. Pour permettre l’entrée de tous
les ions de la gamme de masse sélectionnée dans cette cellule linéaire,
l’accélération qu’ils subissent en amont doit être réduite. Il en résulte alors une perte
de sensibilité due à une perte d’efficacité dans la focalisation des ions. Un gain de
sensibilité est réalisé en réduisant au maximum la gamme de masse analysée. Suite
à l’analyse d’un échantillon composé d’un mélange d’extraits racinaires mycorhizés
et non mycorhizés (50/50), avec l’acquisition de spectres de 50 à 2000 m/z, nous
observons que la grande majorité des pics sont détectés entre 100 et 1000 m/z. Par
conséquent, nous avons délimité notre gamme de masse de 100 à 1000 m/z.
2.2.2.3.1.3. La calibration
Pour une bonne précision de masse, la calibration du spectromètre est
essentielle. Deux types de calibration sont réalisés dans nos travaux. Une première
calibration, dite externe, permet d’étalonner l’analyseur de masse (TOF). Elle
s’effectue avant l’analyse des échantillons, par injection de différents composés de
masse connue. Pour les analyseurs de type TOF, une absence de linéarité est
observée entre la vitesse des ions et leurs masses comme l’indique la loi de l’énergie
cinétique. Afin de procéder à une calibration efficace, il est nécessaire de définir avec
55
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
une grande précision les variables de l’équation polynômiale d’ordre cinq définissant
la courbe quadratique qui régit le comportement des ions dans l’analyseur (TOF).
Cette courbe traduit l’augmentation et la diminution exponentielle de l’erreur de
mesure en fonction, respectivement, des plus petits et des plus importants rapports
masse sur charge. Pour cela, le calibrant choisi doit permettre d’obtenir un nombre
important de points, répartis de façon homogène sur l’ensemble du spectre de
masse. Dans notre étude, le calibrant utilisé est un mélange de sodium, de formate
et d’acide acétique formant des clusters, couvrant un spectre de 50 à 1500 m/z par
pas de 68 unités de masse. Au cours de l’analyse des différents échantillons, une
seconde calibration, dite interne est accomplie. Ce procédé permet de corriger les
déviations de masse apparues au cours du temps, conférant ainsi une meilleure
précision de masse au spectromètre. En ce qui concerne le Q-TOF PremierTM
(Waters), une précision de masse de 3 à 5 ppm (parties par million du rapport erreur
de masse / masse de la molécule) est attendue avec la calibration interne, dont le
calibrant est composé de leucine enképhaline, injectée toute les dix secondes dans
la source par l’intermédiaire d’une deuxième voie, appelée « lock mass ». Pour le Q-
TOF Maxis, une précision de masse d’environ 1ppm est attendue. La calibration
interne est réalisée grâce à un coton hydrophobe imbibé de méthyl-stéarate et
déposé dans la source, son évaporation au cours du temps permet d’obtenir un
signal à 299 m/z sur tous les spectres.
2.2.2.3.1.4. Contrôle de la qualité des analyses par injection de standards
L’élaboration d’un mélange de standards s’est avérée nécessaire afin de
contrôler le comportement chromatographique et celui du spectromètre de masse au
cours du temps une fois les paramètres sélectionnés. Un mélange de 12 flavonoïdes
a été constitué afin de couvrir une grande partie du chromatogramme (cf annexe).
L’injection répétée de ce cocktail en début, au milieu et en fin d’une série
d’échantillons offre la possibilité de superviser le déroulement de l’analyse et
d’examiner si les temps de rétention, les aires des différents pics ainsi que la
précision de masse sont constantes et uniformes au cours du temps. De plus, entre
56
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
chaque échantillon est injecté un blanc, constitué du même ratio eau/acétonitrile
qu’en début de gradient, contrôle indispensable pour vérifier qu’une injection ne
contamine pas la suivante.
2.2.3. Traitement des données
Une étude différentielle du métabolome accompli par LC-MS génère une
grande quantité de données. Au cours d’une analyse de 15 minutes, si le
spectromètre de masse acquiert 3 spectres par seconde, au final 2700 spectres sont
enregistrés et chacun d’eux se compose de plusieurs centaines de milliers de points.
En multipliant ces données par le nombre d’échantillons, la quantité est telle que
seule l’utilisation de logiciels sophistiqués permet de traiter ce flux d’informations. A
partir des données brutes collectées par le spectromètre de masse, plusieurs
plateformes de traitement des données sont nécessaires afin d’exploiter au mieux
l’ensemble des données.
2.2.3.1. Détection des pics chromatographiques et intégration
La première étape du processus consiste à détecter l’ensemble des pics
caractérisant les ions issus des métabolites présents dans les différents échantillons.
Cependant, plusieurs types de bruits de fond, aléatoires et chimiques, viennent
perturber la détection de ces signaux. Le bruit chimique est typiquement causé par
des molécules provenant des solvants et des solutions tampons, se manifestant
généralement en début et en fin d’élution (Hilario et al., 2006). Par ailleurs, certains
métabolites peuvent avoir des interactions chaotiques avec la phase stationnaire de
la colonne chromatographique. Ils ne sont alors pas élués sous forme de pics et se
diffusent au cours du temps, provoquant un bruit de fond chimique, également
nommé effet matrice. Le bruit aléatoire, réparti de manière stochastique sur les
spectres de masse est principalement attribué au détecteur. Pour faciliter la détection
des vrais ions et limiter les faux positifs, différents traitements du signal permettent
de réduire le bruit de fond. Néanmoins, ces processus peuvent altérer les données.
57
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Pour la détection de pics, la stratégie la plus courante est basée sur la découpe des
données LC-MS en de fines tranches de masse sur charge (entre 1 et 0,1 m/z),
appelée « bucketing ». D’un chromatogramme en trois dimensions (masse sur
charge, temps de rétention et intensité), processus permettant d’obtenir une
multitude de chromatogrammes en deux dimensions (temps de rétention et intensité)
plus facile à manipuler. Chacun d’eux est traité de façon indépendante. Un filtre
Gaussien d’ordre deux est appliqué ; les points d’inflexion de chaque pic sont définis
et permettent leur intégration. Divers filtres peuvent être ajoutés à la détection
comme une valeur seuil d’intensité, la résolution chromatographique et / ou spectrale
et bien d’autres.
2.2.3.2. Réalignement des pics chromatographiques
La seconde étape du processus a pour but de réaligner les chromatogrammes
des différents échantillons analysés les uns par rapport aux autres, dans le but de
comparer par la suite tous les ions détectés dans chaque échantillon en fonction de
leurs aires chromatographiques et leurs temps d’élution. En chromatographie liquide,
le temps d’élution d’une molécule varie légèrement d’une injection à une autre,
malgré l’utilisation de paramètres identiques. Cette variation est plus ou moins
importante en fonction des caractéristiques de la colonne. Elle demande un
réalignement des chromatogrammes de tous les échantillons analysés. Cependant,
l’utilisation de l’UPLC permet une bonne répétabilité des temps d’élution entre
différentes injections. Dans le cadre de notre étude, sur cinquante injections
consécutives, le plus grand écart observé est inférieur à une seconde. De ce fait, le
réalignement des chromatogrammes n’est pas nécessaire, cette variation étant faible
par rapport à la largeur d’un pic chromatographique d’environ 10 secondes. Dans le
cas de l’utilisation de colonne de type HPLC, un réalignement est généralement
nécessaire.
2.2.3.3. Normalisation des données
58
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
La troisième étape du processus est la normalisation des données dont le but
est de corriger et de minimiser les biais apparus lors de l’extraction, la préparation
des échantillons et leurs injections en LC-MS. Les stratégies pour normaliser les
données de profil métabolomique peuvent être divisées en deux classes. La
première comprend l’utilisation de standards internes ou externe. L’intensité ou l’aire
de ces standards doivent être identiques au cours des différentes acquisitions. Dans
le cas contraire, un facteur de correction est appliqué à ces standards ainsi qu’à
l’ensemble des pics. Une autre stratégie de normalisation consiste à utiliser les
données dans leur globalité. L’ensemble des aires ou des intensités est sommé pour
chaque acquisition, un facteur de correction est appliqué afin que toutes les sommes
soit égales. La méthode de normalisation par l’utilisation de standards (interne ou
externe) permet de suivre les biais subis par un seul métabolite (ou quelques
métabolites) contrairement à la deuxième méthode qui prend en compte la globalité
des données. Cependant, la normalisation selon la méthode « globale » repose sur
l’hypothèse que la quantité totale des métabolites détectés est similaire entre tous
les échantillons des différentes conditions analysées. Cette hypothèse devra être
vérifiée avant de pouvoir utiliser cette méthode de normalisation.
2.2.3.4. Détermination des ions discriminants
La quatrième partie du processus consiste à classifier toute l’information
obtenue pour l’ensemble des ions détectés en fonction de leur temps de rétention et
leur aire (ou intensité) dans chaque échantillon. Les études de métabolomique
génèrent des tableaux de données très complexes pour lesquels des outils
statistiques appropriés sont requis afin d’isoler les ions caractéristiques des
différentes conditions. Les analyses statistiques multi-variées et non supervisées
comme l’analyse en composantes principales (ACP) fournissent des informations
qualitatives sur les différents échantillons. Quant aux analyses supervisées de la
famille des régressions des moindres carrés partiels comme les PLS (Partial Least
Square), OPLS (Orthogonal Partial Least Square) et OPLS-DA (Orthogonal Partial
Least Square – Discriminant analysis), elles permettent de distinguer rapidement
l’ensemble des ions discriminants (Wiklund et al., 2008).
59
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
2.2.3.5. Logiciels de traitements des données
De multiples logiciels proposent de traiter les données issues d’analyses
différentielles du métabolome, dont ceux proposés par les fabricants de
spectromètres de masse comme MarkerLynx (Waters) et Metabolic Profiler (Bruker
Daltonic) (Wiklund et al., 2008). Des logiciels libres sont aussi disponibles comme
XCMS, fonctionnant en langage R (Smith et al., 2006), MZmine (Katajamaa et al.,
2006; Pluskal et al., 2010), MathDAMP (Baran et al., 2006) et metAlign (Lommen,
2009) ; cette liste n’étant pas exhaustive.
Dans le cadre de mon travail de thèse, j’ai testé et comparé plusieurs logiciels,
toutefois le plus utilisé a été Markerlynx (Waters). Ce choix se justifie en partie par sa
simplicité d’utilisation et d’autre part, ce logiciel est adapté aux types de données
générées par l’UPLC et le Q-TOF PremierTM, puisqu’il est fourni par le constructeur
de ces appareils.
2.2.3.6. Utilisation de Markerlynx
La détection des pics et leur intégration demeurent des étapes cruciales qui
conditionnent la qualité de l’analyse dans sa globalité. La principale difficulté réside
dans la définition de la frontière entre « bruit de fond » et « vrai signal ». Il est
possible de jouer sur le seuil d’intensité, une valeur élevée abaissant la quantité
d’artéfacts intégrée et facilitant le traitement des données. En contrepartie, la
couverture du métabolome exploré est plus étroite. Inversement, un seuil d’intensité
trop bas, conduit à l’intégration du bruit de fond. Le traitement des données devient
alors chaotique et les outils statistiques ne peuvent supporter des données contenant
trop d’artefacts. Or le bruit de fond se répartit de façon inégale entre le début et la fin
d’un gradient chromatographique, de même sur les spectres, la zone des masses les
plus basses contient d’avantage de bruit chimique que celle des masses au-delà de
300 Daltons.
60
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
Dans ce travail, le seuil d’intensité est fixé à dix fois la valeur moyenne du bruit
de fond calculée par le logiciel Markerlynx. Aucun filtre supplémentaire n’est appliqué
pour éliminer le bruit de fond. La normalisation s’effectue selon la méthode globale,
c'est-à-dire, l’ensemble des aires de chaque échantillon est sommé et un facteur de
correction est appliqué afin que toutes les sommes soit égales. Préalablement, nous
avons vérifié que la concentration d’une grande partie des analytes restait
constantes entre les profils métaboliques de racines colonisées ou non par le
champignon MA afin de justifier l’utilisation de la méthode de normalisation
« globale ». La caractérisation des ions discriminants s’effectue par l’intermédiaire
d’une analyse statistique de type OPLS-DA. Sa représentation graphique sous la
forme d’un S-plot ou chaque point est un ion, met en évidence les ions qui
caractérisent chaque condition. La variable au niveau des abscisses correspond à la
covariance de chaque ion. Elle est égale à zéro si l’ion est indépendant des deux
conditions (mycorhizé et non mycorhizé). L’ordonnée indique le niveau de corrélation
entre les valeurs des aires de chaque condition. Les zones aux extrémités du « S »
représentent les ions les plus discriminants et avec les taux de confiance les plus
élevés.
2.2.4. Illustration de la méthode d’analyse différentielle du métabolome
La méthodologie mise en place et décrite dans ce chapitre a été appliquée à
une analyse différentielle du métabolome de racine de pois cultivées dans de fortes
ou de faibles concentrations en phosphate. Ce travail faisait suite à de récentes
études menées au sein de l’équipe, qui montraient que de fortes concentrations en
phosphate inhibaient la mycorhization au niveau de la formation d’hyphopodium,
structure fongique permettant l’adhésion à une racine (Balzergue et al., 2011). Les
auteurs ont fait l’hypothèse de la présence de molécules d’origine végétale dans le
milieu de culture, qui contrôleraient la différentiation des hyphopodia. L’analyse
différentielle du métabolome a permis de mettre en évidence 28 molécules
davantage présentes dans les racines cultivées avec peu de phosphate et seulement
61
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
4 pour de fortes concentrations en phosphate. Ces résultats ouvrent des
perspectives et des pistes dans la recherche de molécules impliquées dans la
régulation de l’initiation de la colonisation par le champignon MA.
Ce travail de métabolomique sur des racines cultivées sous deux régimes
phosphatés a fait l’objet d’une publication présentée ci après :
62
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
63
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
64
CHAPITRE 1 : DEVELOPPEMENT DES METHODES
65
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
3. CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Les résultats de ce chapitre sont actuellement soumis pour publication dans la revue
Molecular Plant : Search of arbuscular mycorrhizal signals involved in late symbiotic
stage ; Jérôme Laparre, Mathilde Malbreil, Fabien Letisse, Jean Charles Portais,
Christophe Roux, Guillaume Bécard, et Virginie Puech-Pages.
3.1. L’analyse différentielle du métabolome
Trois échantillons indépendants (correspondant à des répétitions biologiques)
de racines mycorhizées et non mycorhizées, ont été constitués chacun à partir de
cinq unités de production (voir Chapitre 1). Chaque unité de production produisant
environ 5 g de racines, approximativement 25 g de racines non mycorhizées et
mycorhizées, ont été réduis en poudre pour chaque échantillon par broyage dans
l’azote liquide puis extraits au méthanol (100%). Le taux de mycorhization des trois
échantillons de racines mycorhizées a été estimé à 51%, 49% et 49%.
Pour l’analyse différentielle du métabolome, chaque échantillon a été réalisé à
partir de 150 mg de racines fraîches, suivant la méthode décrite au Chapitre 1. Lors
de la mise en place de la méthode du traitement des données (Chapitre 1), le seuil
de détection des ions avait été fixé à dix fois le bruit de fond moyen. Pour augmenter
la sensibilité de l’analyse, ce seuil a été abaissé par trois provoquant une
augmentation du nombre de faux positifs. Contrairement à la méthode décrite dans
le Chapitre 1, des acquisitions supplémentaires ont été nécessaires pour valider une
partie des données. Après analyse des données par OPLS-DA, les ions sélectionnés
comme les plus discriminants représentent les points du S-plot avec des valeurs de
corrélation en ordonnée comprises entre 0,9 et 1 (Figure 3-1).
66
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-1 Le S-Plot est la représentation graphique de l’analyse par OPLS-DA des données acquises par UPLC-Q-TOF de trois échantillons indépendants de racines mycorhizées et non mycorhizées
Chaque point représente un ion détecté en LC-MS. Les ions se répartissent sur l’axe des abscisses en fonction
de leur spécificité à une des deux conditions. Les ions les plus caractéristiques de racines mycorhizées sont les
points les plus à gauche. L’ordonnée indique le pourcentage de corrélation entre les ions détectés dans les
différents échantillons d’une même condition par rapport à l’autre condition. Les points encadrés par un carré
rouge sont tous les ions caractéristiques de racines mycorhizées et avec un pourcentage de corrélation compris
entre 1 et 0,9.
A ce stade, 532 ions ont été criblés comme d’avantage ou exclusivement présents
dans les extraits de racines mycorhizées. Plusieurs étapes, manuelles pour la
plupart, ont permis la sélection parmi cette liste des ions les plus pertinents pour
lesquels des tentatives de détermination de formule brute voire de détermination
structurale ont ensuite été menées (Figure 3-2).
67
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-2 Schéma de l’ensemble des étapes du processus de sélection des ions discriminants les plus pertinents jusqu’aux tentatives d’indentification structurale.
La sélection des ions caractéristiques de la symbiose mycorhizienne se déroule en sept étapes distinctes : (1)
Elimination des signaux issus du bruit de fond et d’une mauvaise intégration, (2) exclus ion des ions fongiques
non spécifiques de la symbiose, (3) nouvelles acquisitions en mode pseudo-SIM pour augmenter le signal sur
bruit des ions faiblement détectés afin de confirmer ou d’infirmer leur pertinence, (4) sélection en fonction du
rapport mycorhizé / non mycorhizé, (5) identification et regroupement des ions issus d’un même métabolite, (5)
nouvelles acquisitions sur spectromètre de plus haute résolution et (6) détermination de formules brutes afin (7)
d’interroger les bases de données.
3.1.1. Sélection des ions les plus discriminants
3.1.1.1. Elimination des faux positifs et des adduits
Tous les ions sélectionnés subissent une vérification manuelle à partir des
données brutes. Pour cela des appels d’ions sont réalisés pour chacun des six
échantillons. La visualisation des chromatogrammes obtenus permet d’apprécier la
68
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
qualité de l’intégration et d’éliminer la présence de faux positifs. La grande majorité
des ions exclus représente des intégrations du bruit de fond de type chimique. Les
adduits sont également écartés, mais leur nombre est restreint avec une dizaine
d’adduits sodium.
3.1.1.2. Elimination des ions les moins caractéristiques de la symbiose
Pour identifier des métabolites vraiment caractéristiques de l’état symbiotique,
nous n’avons sélectionné que les ions qui présentaient des concentrations au moins
10 fois plus élevées dans les échantillons de racines mycorhizées. Certains de ces
ions n’ont pas du tout été détectés dans les racines non mycorhizées (environ un
tiers des ions). Après ce filtre, 213 ions ont été conservés pour les études ultérieures.
3.1.1.3. Elimination des ions d’origine fongique
Dans cette analyse, les métabolites des extraits de racines mycorhizées
proviennent de deux organismes, la plante et le champignon in planta. Dans la
comparaison des métabolomes obtenus à partir des racines mycorhizées et non
mycorhizées, nous avons choisi de ne pas considérer les métabolites fongiques déjà
produits lors des phases non symbiotiques (spores seules ou spores germées). Des
extraits méthanoliques de spores non germées ou en germination (7 jours dans le
milieu M) ont donc été analysés de la même façon que les échantillons de racines.
Quinze ions ont été détectés à la fois dans les racines mycorhizées mais aussi chez
le champignon MA seul, que l’on a donc ensuite écartés. Ce nombre d’ions d’origine
fongique produit de façon constitutive peut paraître faible mais il s’explique par la
nature biochimique des spores de champignons AM et par la méthode d’extraction
employée. Une spore se compose essentiellement de plusieurs couches de paroi et
de réserve en carbone sous forme lipidique, l’ensemble représentant 50 à 75% de sa
masse (Beilby et Kidby, 1980). Les hyphes lors de la germination sont également
très riches en lipides (Bago et al., 2002). Or, notre processus analytique ne permet
pas d’observer les métabolites les plus hydrophobes comme les lipides. D’autres
69
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
technologies comme la GC-MS ou l’utilisation d’une source à ionisation chimique à
pression atmosphérique (APCI) seraient plus adaptée à la détection de ces
composés (Dunn et al., 2005; Lytovchenko et al., 2009; Zhou et al., 2011).
Avec le protocole utilisé, tout ion fongique spécifique de l’état symbiotique
sera donc bien inclus dans notre analyse, mais parmi tous les ions associés à la
mycorhization on ne pourra pas distinguer ceux provenant d’un analyte végétal ou
fongique.
3.1.1.4. Validation des ions discriminants de faible intensité
Pour lever les incertitudes concernant les ions discriminants de faible intensité, une
vérification de leur présence dans les deux conditions a été menée grâce à de nouvelles
analyses en mode « Pseudo-Single Ion Monitoring » (Pseudo SIM) visant à augmenter la
sensibilité et le rapport « signal sur bruit » (S/N) des ions concernés. Au niveau du
spectromètre de masse, les tensions appliquées sur le quadripôle sont ajustées pour
optimiser la transmission de chaque ion analysé, selon le diagramme de stabilité de
Mathieu (Baranov, 2003; Baranov, 2004; Ding et Kumashiro, 2006). L’ion sélectionné a
une trajectoire stable à travers le quadripôle, la quantité d’ion transmis augmente par
rapport à un mode dit « full scan » correspondant à une analyse des ions sur une gamme
large de 100 à 1000 m/z. De plus, sur des spectromètres de masse de type Q-TOF, un
gain non négligeable de sensibilité peut être obtenu au niveau de la cellule de transfert
des ions en amont du tube à temps de vol. Cette cellule linéaire stocke dans des temps
extrêmement brefs les ions avant qu’ils ne subissent une forte accélération orthogonale
dans le « pusher » (succession de lentilles à l’entrée du tube à temps de vol). Selon le
temps d’accumulation, la position des ions dans cette cellule diffère en fonction de leur
rapport masse sur charge (m/z). Dans le cas d’une acquisition pseudo SIM, les
paramètres sont adaptés pour que l’ion analysé se trouve au centre de la cellule. Ainsi la
quantité d’ion pénétrant dans le tube à temps de vol augmente, leur transmission jusqu’au
détecteur s’améliore grâce à cette trajectoire bien centrée (Figure 3-3).
70
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-3 Transfert des ions dans un spectromètre de masse de type Q-TOF et gain de sensibilité au niveau du TOF.
Schéma général du parcours des ions à l’intérieur du Q-TOF premier (Waters). (B) Schéma du transfert des ions
entre la cellule de collision et le tube à temps de vol. Les flèches symbolisent le parcours des ions, les flèches
rouges représentent la trajectoire des ions dont la transmission est optimale, en fonction des tensions appliquées
sur les lentilles de transfert et du temps d’accumulation des ions dans la cellule de transfert. Avant la forte
accélération orthogonale, les ions se positionnent en fonction de leur masse sur charge dans la cellule de
transfert. Au moment de l’accélération provoquée par le pusher, les ions au centre de la cellule de transfert ne
subissent pas de perte par collision avec la paroi du tube à temps de vol.
En moyenne le gain du signal sur bruit est d’un facteur cinq à dix par rapport à un
mode full scan. Une acquisition en mode pseudo-SIM permet de suivre plusieurs
ions à la fois, les paramètres d’acquisition pouvant être modifiés au cours du temps.
71
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Parmi les 198 ions sélectionnés, nous avons constitué un premier groupe
composé d’ions les plus abondants c'est-à-dire avec des aires supérieures à 30 ua
(unité arbitraire). Des acquisitions en mode MS/MS ont été réalisées sur ces ions les
plus intenses, afin d’enrichir les données en vue d’une tentative d’identification
structurale. Un second groupe a été créé, comprenant les ions les plus faiblement
détectés avec une aire inférieure à 10 ua ou avec un signal sur bruit inférieur à 150.
Parmi ces ions du second groupe, certains ont été identifiés comme des fragments
des ions les plus abondants, grâce aux acquisitions MS/MS précédentes, et ont été
retirés de cette liste. Un programme d’acquisition en mode pseudo-SIM se compose
de plusieurs séquences, chaque séquence représente les paramètres de masse
adaptés à la détection d’un ion du second groupe. Une dizaine d’acquisitions ont
permis d’augmenter le signal sur bruit de 73 ions discriminants de faible intensité
dont la pertinence pouvait être remise en cause. Parmi les 31 ions rejetés, figurent
ceux dont le signal sur bruit ne s’est pas accru. D’autres ions ont été éliminés parce
que leur ratio « mycorhizé / non mycorhizé » n’atteignaient pas le seuil de 10. Après
avoir amélioré le gain de sensibilité, ces ions ont pu être détectés dans les
échantillons non mycorhizées alors qu’ils ne l’étaient pas lors des acquisitions en
mode full scan. Au final 168 ions sont identifiés et validés comme étant
caractéristiques de la mycorhization.
3.1.2. Recherche des ions issus d’un même métabolite
Les molécules peuvent se fragmenter dans le spectromètre de masse de
façon plus ou moins importante suivant leurs propriétés physico-chimiques. Une
certaine quantité d’énergie est fournie aux molécules pour les ioniser et les conduire
de la source à l’analyseur du spectromètre de masse jusqu’au détecteur. Cet apport
d’énergie peut aboutir à la rupture des liaisons covalentes les plus fragiles comme
celles entre hétéroatomes. Il est nécessaire de regrouper les ions qui proviennent
d’un même métabolite pour en déduire le nombre de molécules criblées par l’analyse
métabolomique, permettre l’interrogation des bases de données avec les ions
parents (le métabolite initialement ionisé).
72
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
L’ion parent et ses ions fils (qui représentent les fragments ionisés), ont le
même temps de rétention et leur abondance relative est propre à la molécule dont ils
sont issus. Grâce à ces deux caractéristiques, des auteurs ont développé des tests
statistiques pour mesurer les niveaux de corrélation entre tous les ions, en fonction
de ces deux variables, afin de déterminer ceux qui proviennent d’un même
métabolite (Cloarec et al., 2005; Werner et al., 2008a; Ipsen et al., 2010). Toutefois
le bruit de fond de type chimique induit par les échantillons et le bruit de fond
électronique induit par le détecteur perturbent ces tests (Ipsen et al., 2010). Des
données de MS-MS sont parfois nécessaires pour lever des ambigüités.
Notre intérêt pour les ions discriminants de faible intensité n’étaient pas
compatibles avec l’utilisation de tels tests. L’identification des ions issus d’un même
métabolite a donc été réalisée de façon manuelle. Les ions avec des temps de
rétention très proches (inférieur à 0,01 minute) ont été regroupés et leurs
chromatogrammes ont été superposés afin de vérifier leur co-élution (Figure 3-4).
Figure 3-4 Vérification de la co-élution d’ions ayant un temps de rétention similaire
Des racines mycorhizées ont été extraites au méthanol, deux échantillons indépendants M1 et M2 ont été
analysés par UPLC-Q-TOF PremierPM (Waters). Plusieurs ions (listés sur le chromatogramme) présentent des
temps de rétention très proches (inférieur à 0,01 minutes). Les « Extracted Ions Chromatogram » (EIC) pour tous
ces ions ont été tracés sur un même chromatogramme. Les pics des différents ions sont parfaitement
superposables. De plus, les chromatogrammes de l’échantillon M1 et M2 sont semblables. Enfin, dans les deux
73
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
échantillons mycorhizés (M1 et M2) les aires de tous les pics sont conservées entre M1 et M2. Ces ions
proviennent probablement du même métabolite, l’analyse est reproductible.
En complément, des spectres MS-MS ainsi que des acquisitions en mode pseudo-
SIM ont permis de lever certaines ambiguïtés. Dans les analyses en mode pseudo-
SIM, le quadripôle permet de sélectionner un ion d’intérêt, sans fragmentation dans
la cellule de collision, le spectre de masse associé doit présenter un signal au niveau
de son m/z. Cependant, dans plusieurs de nos spectres de masse, nous avons
recensé des pics avec des m/z inférieur à celui sélectionné par le quadripôle. Nous
avons émis l’hypothèse selon laquelle une fragmentation de l’ion sélectionné dans la
cellule de collision pouvait avoir lieu car le Q-TOF premier (Waters) impose
l’utilisation de l’argon comme gaz vecteur dans cette cellule, un élément de forte
densité propice à la fragmentation. Cette hypothèse a été validée par de nouvelles
acquisitions en abaissant l’énergie transmise aux ions dans la cellule de collision.
Aucun fragment n’est observé. Alors que l’abondance de l’ion parent devrait
augmenter sans fragmentation, nous observons le phénomène inverse. Cette baisse
de sensibilité est la conséquence d’une réduction de l’efficacité de la focalisation des
ions, engendrant également un effondrement de la précision de masse.
Grâce à l’ensemble de ces observations, il a pu être déduit que les 168 ions
discriminants sont issus de 56 métabolites (Tableau 3-1).
Tableau 3-1 Les métabolites criblés comme étant au moins dix fois plus concentrés dans les racines mycorhizées (M) par rapport aux racines non mycorhizées (NM).
Les métabolites criblés sont classés par ordre croissant d’élution chromatographique. Les ions en rouge et en vert sont respectivement et exclusivement détectés sur le Q-TOF Maxis et sur le Q-TOF Premier. Les ions détectés sur les deux spectromètres de masse sont en noir. Les astérisques correspondent aux ions détectés sous forme d’ions multichargés mais convertis à la masse sur charge de l’ion monochargé. Le ratio M/NM de chaque métabolite correspond à sa concentration relative entre la condition mycorhizée et non mycorhizée. Quand un métabolite est criblé par plusieurs ions, son ratio M/NM est égal à la moyenne des ratios M/NM de tous ses ions. Le symbole M caractérise les métabolites détectés uniquement dans la condition mycorhizée et les astérisques représentent l’intensité de détection du métabolite (faible, *moyenne, **intense). Les formules brutes générées par SmartFormula3D sont en gras si une seule composition atomique est proposée ou si le score de la première proposition est 10 fois supérieur à celle du second rang, dans le cas contraire la formule est en italique.
métabolite Rt les ions détectés (m/z) ratio formule (min) M/NM brute 1 0,67 426,0928 M 2 0,83 397,1241 M C17H21N2O9 3 0,85 265,0835 12 4 0,99 752,2221; 388,1361 M* 5 1,05 218,1385 M** C10H20NO4 6 1,59 345,1445; 182,0811 M* C18H21N2O5 7 1,90 232,1543 M** C11H22NO4 8 3,17 984,3148 M* 9 3,25 1275,45695*; 849,3021; 843,33075*; 805,385; 736,3286; 447,1124;
441,1518; 425,1769; 403,196; 241,1434; 223,1327; 221,0751; 41 205,124; 195,1379; 159,1173
74
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
10 3,42 555,22075* M* 11 3,44 2259,09135** M* 12 3,47 813,39415*; 683,2028; 561,2176; 517,3003; 507,1705; 259,1545;
241,1434; 223,1327; 195,138; 167,0713 M** 13 3,49 269,1375 M 14 3,52 733,23635* M* 15 3,66 225,1507; 161,1339 M* 16 3,70 492,2133*; 446,20635* M* 17 3,76 458,2292 M* 18 3,79 710,3419 28 19 3,79 685,2701 M* 20 3,90 1760,59055*; 1326,46975*; 363,15475* M* 21 4,14 285,077; 267,0659 M* 22 4,19 977,3861; 527,152; 511,1776; 489,1962; 453,1758; 241,1434;
237,1151; 195,1383 31 23 4,26 587,1936 M 24 4,30 1205,39335*; 1119,39375*; 935,28355*; 855,2592; 849,28435*;
609,18455*; 585,1466; 579,17415*; 541,2279; 428,2124; 271,1173; 253,1059; 225,1138; 207,1023; 181,0766 M**
25 4,33 689,3018; 659,1845; 418,1925; 367,1381; 345,1543; 327,1435; 291,1242; 241,1455; 223,0909; 205,1237; 195,139 M** C35H50N2O8PS
26 4,36 489,1969 M** C22H33O12 27 4,60 428,2099 M* 28 4,60 161,1338 12 29 4,64 848,4379 11 30 4,83 223,0626; 205,0508 M* 31 4,83 521,2236 M* C28H35N4O2P2 32 4,94 813,1944; 807,22235; 791,2601; 769,2752; 751,2645; 733,2599;
593,2463; 575,2316; 557,2242; 501,1957; 483,1862; 399,2004; 325,1626; 307,1548 54
33 5,03 475,2176; 209,1541 M* C22H35O11 34 5,36 453,2480; 275,2005 M* 35 5,45 289,1644; 253,1437 28 C14H25O6 36 5,49 410,148; 392,135 13 37 5,53 605,2969; 605,29675*; 559,29055* M** 38 5,64 291,1955; 273,1848 M* C18H27O3 39 5,78 501,1984 M* 40 5,80 1193,5005; 587,2869; 472,2366 M** 41 5,91 1402,75595*, 327,1439 M* 42 6,00 418,0977 19 43 6,05 539,2483; 347,1848; 275,2007 M* 44 6,13 459,2223; 211,1707; 193,1595 10 45 6,14 505,1336 M* 46 6,16 1077,48895*; 787,2771; 771,3039; 749,322; 541,30015; 459,2227;
436,2128; 420,2238; 413,1207; 397,1469; 392,1915; 375,1647; 19 357,1541; 253,1434; 235,1328; 211,1691
47 6,19 577,2852 M 48 6,19 547,1441 M C26H27O13 49 6,30 620,3661 27 50 6,45 617,3158; 455,2633 M* 51 6,66 724,3763; 652,3912; 612,3949; 499,1208; 483,147; 478,1914 20 52 6,75 713,3146 M* 53 6,90 541,2649; 455,2651; 293,2111; 275,2007; 209,1546 15 C28H37N4O7 54 7,05 738,3904 M 55 7,10 447,3117 M* 56 7,13 620,3634 M* 57 7,23 695,3069 M C39H43N4O8 58 7,33 655,2960 M C32H47N4O14 59 7,48 602,317; 586,3231; 579,21115*; 563,2462; 541,2641; 523,2536;
505,2418; 487,2293; 479,2637; 461,2505; 293,211; 275,2006; 257,1904 275 C30H44N5O8
60 7,58 411,2525 M 61 7,74 623,302; 277,2145; 259,2065 M* 62 7,77 601,3216; 583,2747; 439,2689; 335,2224; 275,2007 M* 63 7,80 741,2964; 723,2863; 459,2278; 211,1704 21 C35H42N8NaO9 64 8,13 283,0963 M** C17H15O4 65 8,20 725,26895; 687,3219; 525,2691; 507,2595; 489,2525; 463,2713;
445,2591; 277,2156; 259,2075 133 66 8,60 644,3271; 621,23; 605,2567; 583,2745; 335,2216; 311,1141;
275,2026; 257,1908 34 67 9,18 586,3225; 570,3307; 563,2271, 547,2514, 525,2692, 507,2595;
489,2484; 463,2705; 445,2602; 282,1116; 277,2161; 259,2067 36 68 9,24 837,3591 M 69 9,49 863,3696 M* 70 9,95 275,2010 23 71 10,34 587,2871 M*
75
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Dans l’objectif de déterminer la composition atomique de ces molécules, de
nouvelles acquisitions sont menées sur un spectromètre de masse de plus haute
résolution (Q-TOF, Maxis, Bruker Daltonics). La stratégie d’identification repose à la
fois sur l’interrogation de bases de données dédiées mais aussi sur l’analyse du
massif isotopique de la molécule.
3.1.3. Utilisation d’un appareil de plus haute résolution
Une grande précision de mesure sur la masse et sur l’abondance relative du
massif isotopique est un atout dans l’élucidation de la formule brute d’un ion.
L’utilisation un appareil de plus haute résolution comme le Q-TOF Maxis (résolution
de 50 000) permet d’obtenir des mesures plus précises que celles obtenues par le Q-
TOF Premier (résolution de 10 000). Le traitement des données est effectué selon la
méthode mise en place dans le chapitre précédent. Les ions discriminants sont
sélectionnés par OPLS-DA via le S-PLOT puis vérifiés manuellement de la même
façon que précédemment, à la différence près que les ions avec un faible signal sur
bruit sont éliminés. Aucune acquisition en pseudo-SIM n’a pu être réalisée dans le
temps disponible.
Dans les analyses réalisées sur le Q-TOF Maxis, des ions multichargés ont
été observés : 28 ions di-chargés et un ion tri-chargé, neuf d’entre eux ayant une
masse calculée supérieure à 1000 Dalton. Or, la gamme de masse des acquisitions
menées sur cet appareil avait été fixée entre les valeurs 100 et 1000 m/z, puisque
au-delà de cette limite, aucun ion différentiel n’avait été précédemment détecté sur le
Q-TOF premier (Waters). De nouvelles analyses, avec une fenêtre de masse de 500
m/z à 3000 m/z, ont permis de cribler deux autres ions différentiels. Le premier est
un ion di-chargé à 1130,05 m/z déjà identifié sous la forme d’un ion tri-chargé à
753,69 m/z pour le métabolite 10. Le second à 1193,50 m/z correspond à un ion
monochargé, sa fragmentation engendre l’apparition d’un fragment à 587.28 m/z
provenant du métabolite 40 (Tableau 3-1). Au final, 134 ions discriminants sont
recensés, dont la moitié étaient déjà identifiés lors de la première analyse. Parmi les
76
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
autres ions, 47 sont issus de métabolites déjà criblés et 23 ions servent à cribler 17
nouveaux métabolites.
A partir des profils isotopiques, des logiciels sont capables de générer de
nombreuses formules brutes auxquels ils attribuent un score de pénalité, calculé en
fonction de l’écart entre les valeurs mesurées et les valeurs théoriques. Les logiciels
diffèrent selon l’algorithme utilisé et la façon dont ils pondèrent les calculs par rapport
à la précision de masse et à la précision sur la mesure de l’abondance relative des
ions du massif isotopique. Le générateur de formules brutes utilisé, Smart Formula
3D (Bruker Daltonics) est inclus dans le logiciel d’exploitation Compass (Bruker
Daltonics) du spectromètre de masse. L’algorithme est adapté à la précision de
mesure de l’appareil pour ces deux paramètres. La génération de formules brutes
attribue à 34 ions et à 5 molécules (5, 6, 7, 38, 64) une seule composition atomique
(Tableau 3-1).
3.1.4. Bilan de l’analyse différentielle du métabolome
La première partie de l’analyse métabolomique s’achève avec une liste de 231
ions, dont la concentration est au moins 10 fois plus élevée dans les racines
mycorhizées et correspondant à 71 métabolites (classés par ordre d’élution et par
masse décroissante (Tableau 3-1).
Près de la moitié de ces métabolites sont identifiés par au moins deux ions. 15
d’entres eux présentent plus de 4 fragments (le métabolite 32 se caractérise par 14
ions). La fragmentation de ces molécules rend difficile l’identification de l’ion
moléculaire. Son abondance diminue jusqu’à disparaitre totalement au profit des ions
fils. Il est très compliqué, voire impossible, d’identifier un métabolite par
l’interrogation des bases de données uniquement sur la base de la masse des ions
fils. En effet, en LC-MS contrairement à la GC-MS, il existe très peu de bases de
données constituées de spectres de fragmentations (Dunn, 2008), l’ionisation et la
fragmentation étant peu reproductibles entre différents spectromètres de masse
équipés de source de type ESI. Sur l’ensemble des 231 ions, plusieurs possèdent la
même masse, vingt deux sont élués à plusieurs temps de rétentions et dix huit
77
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
métabolites ont au moins en commun un ion. Leur regroupement a permis de mettre
en évidence trois situations différentes (Figure 3-5).
Figure 3-5 Mise en évidence de familles de métabolites
Chaque ligne représente un métabolite criblé par l’analyse métabolomique, différentes informations sont
indiquées comme son temps de rétention ainsi que les ions qu’il génère. Six groupes de métabolites sont
constitués et symbolisés par un code couleur ; ils ont en commun un ou plusieurs ions de masses identiques
mais avec des temps de rétentions différents. Les groupes B et C présentent des écarts de masse de 16 Daltons
entre certains de leurs ions ; cette différence de masse correspond à la perte d’un hydroxyle.
On peut tout d’abord rencontrer le cas de deux métabolites criblés par un seul
ion et dont la masse est commune. Leur composition atomique est très probablement
identique et l’hypothèse de la présence de deux isomères semble la plus plausible,
mais il est impossible de dissocier une isomérie de position ou une stéréo-isomérie à
ce stade.
Dans une deuxième situation, plusieurs métabolites caractérisés par de
multiples ions possèdent en commun quelques ions de faible masse avec un écart
de masse inférieur à 0,002 Da. Cette observation suggère l’existence d’un squelette
moléculaire commun sur lequel viendraient se greffer divers groupements ou
fonctions chimiques pour ainsi former de multiples molécules. Cinq groupes de
métabolites se partagent des ions dont le groupe C, composé des métabolites (61),
(65) et (67) (Tableau 3-1). Tous les trois présentent l’ion à 277,216 m/z, leurs
spectres MS-MS sont semblables et se caractérisent par les fragments suivant :
121,073 m/z, 133,076 m/z, 151,089 m/z, 175,130 m/z et 259,201 m/z. Aucun ion de
78
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
masse supérieure à 277 m/z n’est détecté pour le (61), par contre le (65) et le (67)
ont en commun cinq ions supplémentaires : 445,260 m/z, 463,271 m/z, 489,248 m/z,
507,260 m/z et le 525,269 m/z dont la fragmentation du 525,269 m/z produit les
quatre autres ions de plus petites masses. Seul pour le (67) sont détectés quatre
ions de plus hautes masses : 547,252 m/z, 563,227 m/z, 570,331 m/z et 586,322
m/z. L’hypothèse de trois métabolites issus d’une même voie métabolique ici semble
envisageable.
Enfin, dans une troisième situation, deux groupes de métabolites B et C
présentent un écart de masse de 16 Dalton entre tous les ions communs à leur
groupe. La comparaison des spectres de fragmentation des ions de plus haute
masse (525,2691 m/z groupe C et 541,2641 m/z groupe B) fait apparaitre une
grande similitude dans les profils, seul un décalage de 16 unités de masse subsiste.
La soustraction des deux ions parents donne une valeur de: 15,9950, correspondant
à la masse d’un atome d’oxygène (15,9949). Un hydroxyle supplémentaire est greffé
sur les métabolites du groupe B et tous les ions fils portent cette fonction alcool.
L’ensemble de ces observations montrent que l’analyse différentielle a mis en
évidence des familles de métabolites appartenant à des voies métaboliques
probablement affectées par la symbiose.
Si on compare notre étude à celle de Schliemann et collaborateurs (2008) qui
comparait aussi, avec la même plante hôte et le même champignon, les
métabolomes de racines mycorhizées et non mycorhizées, on voit qu’elles sont très
complémentaires. Notre approche méthodologique et analytique utilisée pour réaliser
une analyse différentielle des métabolites secondaires, extractibles au méthanol, est
sensiblement différente. Schliemann et collaborateurs (2008) avaient mis en
évidence 22 composés dont 15 ont une concentration au moins 10 fois plus
importante dans les racines mycorhizées. Parmi les 15 composés, trois d’entre eux
n’ont pas été identifiés, douze ont été caractérisés comme des apocaroténoïdes dont
huit possèdent un squelette de mycoradicine libéré après hydrolyse alcaline et quatre
autres apocaroténoïdes de la famille des blumenols. Dans nos analyses, nous avons
probablement criblé deux des quatre blumenols uniquement détectés dans les
racines en symbiose par Schliemann et collaborateurs (2008). Sous ionisation
positive le 13-Hydroxyblumenol C 9-O-β-(6’-malonylglucoside) et le blumenol C 9-O-
β-(6’-malonylglucoside) produisent respectivement les ions suivant : 475,2179 m/z [M
+ H]+, 209,1541 m/z [M - malonyl -H2O + H]+, 459,2230 [M + H]+ et 211,1698 [M +
79
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
H]+ (Schliemann et al., 2006). Nous retrouvons dans nos analyses des ions
discriminants de masses 475,2171 m/z (± 1,68 ppm), 209,1541 m/z (± 0 ppm),
459,2223 (± 1,52) et 211,1707 (± 4,30 ppm). En ce qui concerne les onze
métabolites dont la structure chimique n’a pas été élucidée, on ne peut rien conclure
de leur éventuelle présence dans nos 71 métabolites discriminants. Aucune
information sur la masse de ces molécules n’est disponible et connue. Schliemann et
collaborateurs avaient également identifié trois isoflavonoïdes qui s’accumulaient
entre 2,8 et 4 fois plus dans des racines en symbiose : la ononine, la daidzeine et la
malonylononine. Nous retrouvons aussi des ions aux masses correspondantes à ces
molécules avec des ratios de 2.1 à 3.4 entre les extraits de racines mycorhizées et
non mycorhizées.
Par rapport aux travaux de Schliemann et collaborateurs (2008), nos analyses
ont criblé au moins 58 métabolites supplémentaires comme caractéristiques de la
mycorhization. De plus, dans notre processus analytique, nous avons utilisé des
spectromètres de masse à haute résolution fournissant des informations sur la
masse des composés et ou sur leurs profils de fragmentation avec une précision de
masse comprise entre 1 à 5 ppm. Ces données fournissent quelques informations
sur la structure de ces molécules et pourront plus tard servir de travail d’appui pour
mener de nouvelles études sur le métabolisme de la symbiose mycorhizienne.
Dans toute analyse comparative du métabolome, après l’identification des
signaux discriminants, l’élimination des informations redondantes et l’établissement
des liens entre les ions issus d’un même composé, la dernière étape consiste à
identifier structuralement les métabolites criblés. Cette partie du travail est la plus
laborieuse, très couteuse en temps et surtout très aléatoire. Selon la molécule
étudiée et sa présence ou non dans les bases de données, son identification
structurale est plus ou moins aisée.
Dans notre étude, la grande majorité des ions susceptibles de correspondre à
des métabolites ionisés, possèdent des masses au-delà de 500 daltons. Compte
tenu de la résolution en masse (1 à 5 ppm), la génération de formule brute ne permet
pas d’accéder à une seule composition atomique. Seuls quatre ions, de moindre
taille, correspondants aux métabolites 5, 6, 38 et 64 ont été associés à une seule
formule brute (Tableau 3-1). Diverses approches ont alors été menées pour tenter
d’identifier les molécules.
80
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Le métabolite 64 criblé par l’ion 283,0963, dont la formule brute générée est
C17H14O4 (forme non protonée), peut potentiellement correspondre à 74 molécules
présentes dans la base de données DNP (Dictionary of Natural Products), la plus
complète en molécules issues du vivant et plus particulièrement du monde végétal.
La fragmentation de cet ion est infructueuse. D’une part parce qu’il est présent en
faible quantité, aucun fragment n’est détecté pour des valeurs d’énergie de collision
inférieure à 20 eV, et au-delà de cette énergie aucun signal n’est détecté, même pas
l’ion parent à 283,0963 m/z. L’augmentation de la vitesse de l’ion dans la cellule de
collision couplé à un flux d’azote coaxial provoque une instabilité dans sa trajectoire,
le rendement de transmission chute, aboutissant à une perte de sensibilité si bien
que les ions fils ne peuvent être détectés. D’autre part, cet ion co-élue avec un autre
ion dont la masse diffère de quelques Dalton seulement rendant plus difficile la
sélection de l’ion parent dans le quadripôle avec une fenêtre de tolérance réduite à
quatre unités de masse centrées sur 283 m/z. Il en résulte une perte de sensibilité
avec une moins bonne transmission des ions au niveau du quadripôle. Une des
solutions à ce problème consiste à pré- purifier ce composé afin d’augmenter sa
concentration par rapport aux autres molécules présentes dans l’échantillon. Malgré
l’obtention de spectres de fragmentations, cette approche ne garantit pas
l’identification du métabolite.
La composition atomique du métabolite 38 correspond à 39 composés de la
base de données DNP. Là encore, aucun spectre de fragmentation n’a pu être
obtenu pour tenter de sélectionner la bonne molécule.
Le métabolite 6, identifié par l’ion à 345,1445 m/z, dont la formule brute
générée est C18H20N2O5 (forme non protonée), correspond à une seule molécule de
la base de donnée DNP, la 3,4-Dimethoxybenzaldehyde N-(3,4-dimethoxybenzoyl)
hydrazone (figure 3-6).
81
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-6 Proposition d’une structure pour le métabolite 6 et proposition d’une fragmentation
Structure de la 3,4-Dimethoxybenzaldehyde N-(3,4-dimethoxybenzoyl) hydrazone, la rupture de la liaison entre
les deux azotes pourrait former un ion fils à 182m/z.
Le métabolite produit un fragment d’une masse de 182,0812 daltons que l’on peut
attribuer à la libération de C9H11NO3 (182.0817 Da), provoquée par une éventuelle
rupture de la liaison entre les deux azotes de la fonction hydrazone. Néanmoins, une
grande incertitude demeure sur la caractérisation de ce composé formé par deux
cycles aromatiques portant chacun deux groupes O-méthyles. En effet, on peut
penser que cette molécule est apolaire. Or la polarité de cette molécule ne
correspond pas à celle du métabolite 6 élué en début de gradient chromatographique
sur une colonne de type inverse (C18). Cette molécule n’est pas disponible
commercialement. Par contre, dans la base de données ChemSpider, 2547
molécules sont recensées avec la même formule brute que le métabolite 6,
l’acquisition de spectres de fragmentations n’est d’aucune utilité avec autant de
candidats.
Le métabolite 5 se caractérise par l’ion 218,1386 m/z dont la formule brute est
C10H19NO4. L’interrogation de la base de données DNP conduit à 8 molécules. La
fragmentation du métabolite 4 a permis de générer deux fragments compatibles avec
l’une des 8 molécules, la propionyl-carnitine. Les ions fragments sont l’ion 159,0653
avec perte de l’amine quaternaire suivie de la perte du groupement propanoate avec
l’ion 85,0278. L’identification de la propionyl-carnitine a été confirmée par la co-
élution avec un standard de L-propionyl-carnitine, la forme biologiquement active, sur
une colonne de type inverse (C18) et normale (Hilic) (figure 3-7).
82
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-7 L’identification de la propionylcarnitine par co-élution avec le standard
Trois échantillons ont été analysés par LC-MS, un standard de L-propionyl-carnitine (Sigma Aldrich), un
échantillon de racines mycorhizées et un échantillon composé d’un mélange des deux. Les chromatogrammes
représentent les appels d’ion à 218,13 m/z (masse de la propionyl-carnitine) des trois échantillons sur (A) sur
colonne de type Hilic (UPLC BEH Hilic : 2,1 x 150 mm, 1,7 µm et (B) une colonne de type inverse C18 (UPLC
BEH C18 : 2,1 x 150 mm, 1,7 µm).
Leur fragmentation génère les mêmes ions fils à 159 et 85 m/z mais également deux
autres ions moins abondants à 144 et 160 m/z.
Nous avons vu qu’une approche de métabolomique non ciblée par LC-MS
couplée à des analyses statistiques non supervisées de type OPLS-DA avaient
permis d’identifier, avec beaucoup de précision et de robustesse, la présence d’un
ensemble de métabolites uniquement ou d’avantage présents dans des racines
mycorhizées. Cependant cette approche bute ensuite sur l’identification structurale
proprement dite des molécules d’intérêt, une étape longue et difficile, sans garantie
de succès, surtout lorsque l’interrogation des bases de données s’avère infructueuse
(Kind et Fiehn, 2006; Kind et Fiehn, 2007; Werner et al., 2008b).
83
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Pour aller plus loin tout en respectant notre objectif visant à identifier de
nouveaux métabolites jouant un rôle dans la symbiose mycorhizienne dont font partie
les signaux symbiotiques, nous nous sommes intéressés aux propriétés biologiques
que certains de nos métabolites d’intérêt pourraient avoir potentiellement dans la
mycorhization.
3.2. Couplage d’une approche de métabolomique et d’une analyse d’expression génique
3.2.1. L’analyse d’expression génique
3.2.1.1. Principes et objectifs
L’objectif est d’identifier parmi les métabolites dont la concentration est plus
élevée dans les racines mycorhizées, ceux qui pourraient être capables de moduler
l’expression génique de l’un ou l’autre partenaire. S’ils activent des gènes impliqués
dans l’interaction mycorhizienne, ces métabolites pourraient alors être des
régulateurs potentiels de la symbiose. Le principe est de fractionner les extraits
racinaires mycorhizées de façon à répartir les métabolites criblés dans différentes
fractions. Des extraits de racines non mycorhizées sont également fractionnés pour
servir de témoin. Elles sont préparées de la même façon et testées en parallèle sur
les mêmes gènes. On évalue ensuite l’activité des fractions de racines mycorhizées
par rapport à celle des fractions de racines non mycorhizées.
A l’aide du test biologique sur l’expression génique, cette approche doit
permettre i) de sélectionner les métabolites potentiellement les plus intéressants sur
lesquels pousser plus loin la caractérisation structurale, ii) de fournir les premières
informations sur le rôle de ces métabolites dans la symbiose grâce aux fonctions des
gènes qu’ils affectent.
3.2.1.2. La méthodologie utilisée
84
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Dans l’étude présentée ici l’effet des extraits racinaires ont été testés
exclusivement sur les gènes du partenaire fongique. Nous avons mesuré le niveau
d’expression de 91 gènes de R. irregularis, sélectionnés à partir de plusieurs études
transcriptomiques réalisées sur ce champignon (le consortium R. irregularis ;
http://mycor.nancy.inra.fr/IMGC/) (Tisserant et al., 2012). Le choix de 76 gènes a été
fait en fonction de leurs différences d’expression entre les hyphes intra-racinaires et
les spores. Les autres gènes ont été sélectionnés par rapport à des fonctions
biologiques d’intérêt comme des gènes impliqués dans le métabolisme lipidique ou
dans la synthèse de paroi fongique (chitine) (Annexes 5.2). La spécificité des
amorces des 91 gènes a été testée et validée par qRT-PCR. Nous avons utilisé une
micro-puce Biomark II (Fluidigm) qui permet un haut débit d’analyse avec 9 216
réactions de qRT-PCR réalisées simultanément et offre la possibilité de quantifier 96
transcrits dans 96 conditions différentes. Cette technologie miniaturisée, très
sensible et qui utilise de faibles quantités d’ARN s’est imposée car il n’existe pas
actuellement de puce fiable, de type Nimblegen, pour faire des arrays d’expression
chez les champignons MA. La technologie MiSeq (Illumina) n’aurait pas non plus été
possible car beaucoup trop coûteuse.
La détermination des ratios d’expression entre les extraits racinaires des
fractions mycorhizées / fractions non mycorhizées a été calculée par la méthode des
delta-delta Ct (2- ΔΔCt). Les différences d’expression entre les extraits fractionnés de
racines mycorhizées et non mycorhizées ont été validées par les tests statistiques de
Student (P < 0,05). N’ayant pas d’autre choix, nous avons testé les fractions
racinaires mycorhizées et non mycorhizées sur l’expression des gènes de spores en
germination de R. irregularis. Ce stade de développement est le seul que le
champignon peut réaliser sans la plante hôte et donc le seul que l’on peut maîtriser
expérimentalement. Pour ajuster les quantités de racines à extraire et éviter
d’éventuels effets toxiques que pourraient avoir des extraits trop concentrés, nous
nous sommes basés sur des données publiées faisant référence à des stimulations
du champignon MA avec un apport exogène de flavonoïdes. Dans une revue,
Vierheilig et collaborateurs ont recensé une soixantaine de tests de croissance et de
germinations de champignons MA en présence de différents flavonoïdes. Les
concentrations utilisées oscillent autour d’une dizaine de micro-molaire (Vierheilig et
al., 1998a). Nous avons extrait vingt et un grammes de racines mycorhizées et non
mycorhizées pour que les concentrations de flavonoïdes soient approximativement
85
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
aux alentours d’une dizaine de micro-molaire. Les extraits racinaires ont été injectés
en chromatographie liquide afin d’obtenir dix fractions (prélevées toutes les 2
minutes pendant 20 minutes). Dans l’idéal, chaque fraction devrait contenir un seul
métabolite discriminant. Dans le cas où celui-ci affecte l’expression génique du
champignon MA, il n’y a pas d’ambigüité pour définir le composé activateur.
Malheureusement, la résolution d’une chromatographie liquide de type préparative
ne permet pas de séparer individuellement chaque métabolite discriminant.
L’obtention de dix fractions est un bon compromis entre la résolution
chromatographique et le nombre d’échantillons à analyser.
Nous avons utilisé une colonne XBridge Prep C18 OBD (Waters), de chimie
semblable à celle de l’analyse métabolomique. Son diamètre interne de 50mm est
adapté à la quantité de matériel extrait. Le gradient d’élution de 5% d’acétonitrile à
100% en 20 minutes et un débit de 17ml/min ont été définis en fonction des
proportions de la colonne par l’intermédiaire d’un logiciel (MassLynx, Waters) afin
que les métabolites soient élués comme dans l’analyse métabolomique où l’on avait
utilisé une colonne analytique. Les fractions sont collectées toutes les deux minutes,
un volume de 34 ml est recueilli par fraction et amené à sec par évaporation sous
vide. La reprise dans un mélange eau / acétonitrile (95/5) avec 5% de
diméthylsulfoxyde (DMSO) permet une bonne dissolution des composés.
3.2.1.3. Résultats de l’analyse d’expression génique
Le ratio des niveaux d’expressions des 91 gènes entre fractions mycorhizées,
non mycorhizées et témoin négatif (eau avec 0,01% d’acétonitrile) est calculé par la
méthode des delta-delta CT (2-ΔΔCT). Nous avons utilisé Normfinder pour identifier les
trois gènes les plus stables sur l’ensemble des analyses (Figure 3-8).
86
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-8 Evaluation par Normfinder de la stabilité de l’expression de 91 gènes de spores de Rhizophagus irregularis en germination traité avec des extraits fractionnés de racines mycorhizées et non mycorhizées
En abscisse chaque point représente un gène. L’ordonnée correspond à l’erreur standard des niveaux
d’expression de chaque gène entre les différents traitements (variance inter fraction) et les barres d’erreurs
indiquent la stabilité de l’expression des gènes entre répétitions biologiques (variance intra fraction). L’expression
du gène 47 est la plus stable aussi bien entre les différentes fractions qu’entre répétitions biologiques.
Une moyenne géométrique des trois gènes sélectionnés (Gene_37, Gene_08,
Gene_47) a été utilisée comme référence pour le calcul des delta-delta CT. Sur
l’ensemble des données, 6% des rapports d’expression entre fractions mycorhizées
et témoin négatif ainsi qu’entre fractions non mycorhizées et témoin négatif sont
significativement supérieur à 2 ou inférieur à 0,6 (Figure 3-9).
87
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Figure 3-9 Synthèse des résultats d’expression génique
(A) Les colonnes représentent les dix fractions séparées par HPLC préparative à partir d’extraits racinaires de M.
truncatula et de l’extrait brut. Les lignes correspondent à des gènes dont le rapport d’expression entre une
fraction mycorhizée et une fraction non mycorhizée est supérieur à 2 (vert) ou inférieur à 0,6 (rouge). Les valeurs
inscrites dans les cases indiquent les rapports d’expression mesurés. La transcription de certains gènes est
affectée par plusieurs fractions. (B) Tableau regroupant les gènes de spores de Rhizophagus irregularis dont
l’expression a été modulée par au moins une fraction d’extrait de racines mycorhizées. Les fonctions putatives
des gènes ont été définies par une recherche d’homologie sur les bases de données Swissprot, KOG, Pfam et
NCBI (blastx vs nr).
88
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
Les différences d’expressions entre fractions mycorhizées et non mycorhizées
représentent 4% des données. 22 gènes sont affectés par au moins une fraction
mycorhizée soit 24 % des gènes sélectionnés. L’expression d’un gène peut être
modulée par différentes fractions avec des régulations positives ou négatives.
L’extrait brut de racines mycorhizées, non fractionné, n’affecte qu’un seul gène. Ce
résultat est important car il indique que certains métabolites doivent avoir des actions
antagonistes sur le champignon MA et démontre l’intérêt de fractionner les extraits
racinaires. La représentation graphique du nombre de gènes surexprimés ou
réprimés pour chaque fraction issue d’extrait de racine mycorhizées ou non
mycorhizées indique que les fractions 2, 3, 4 et 7 n’ont pas d’impact sur les gènes
étudiés, à l’inverse les fractions 1, 5, 6, 8, 9 et 10 sont actives sur un certains nombre
de gènes (Figure 3-10).
Figure 3-10 Représentation graphique du nombre de gènes dont la régulation est affectée par une fraction HPLC
Les dix fractions HPLC séparées à partir d’extraits de racines de M. truncatula sont représentées en abscisse. Les gènes dont l’expression est régulée positivement (>2) par les fractions mycorhizées par rapport aux fractions non mycorhizées sont symbolisés par les barres en vert alors que la couleur rouge représente ceux régulés négativement (<0,6). Les fractions 1, 5, 6, 8, 9 et 10 sont celles qui affectent les gènes analysés, à l’inverse les fractions 2, 3, 4 et 7 n’ont aucun d’effet.
3.2.1.4. I’identification des métabolites discriminants dans les fractions
89
CHAPITRE 2 : LES RESULTATS
La recherche des métabolites discriminants dans les différentes fractions est
effectuée par LC-MS, dans les mêmes conditions que pour l’analyse différentielle du
métabolome. Des appels d’ions permettent alors d’identifier leurs présences au
temps de rétention attendu. Grâce à ces informations nous pouvons déterminer dans
quelle(s) fraction(s) est contenue chacun des 71 métabolites criblés (Annexes 5.3).
La grande majorité de ces métabolites sont contenus dans les six premières
fractions, alors que pour les fractions 8, 9 et 10 seulement deux métabolites
discriminants sont détectés. Cependant en étant moins exigeant sur le rapport des
concentrations relatives entre racines mycorhizées et non mycorhizées, 15 ions
supplémentaires sont criblés avec des ratios compris entre 2 et 9,9 pour les fractions
8, 9 et 10. Parmi ces 15 ions, 4 ont un ratio supérieur à 5, et 11 ont un ratio compris
entre 2 et 4,9. En se basant sur le temps de rétention de ces ions, nous estimons
que 14 métabolites s’accumulant lors de la mycorhization sont présents dans les
fractions 8, 9 et 10.
3.2.1.5. La propionyl-carnitine
La propionyl-carnitine, criblée et identifiée par l’analyse métabolique comme
un métabolite exclusivement présent dans les racines mycorhizées, est également
détectée dans la fraction 1 qui a modulée l’expression de quelques gènes du
partenaire fongique. Afin de vérifier si la propionyl carnitine est responsable de cet
effet de régulation, des spores en germination de R. irregularis, ont été stimulées par
différentes concentrations de L-propionyl-carnitine commerciale (10-5 mol.L-1, 10-7
mol.L-1 et 10-9 mol.L-1) pendant 24h, 48h et 7 jours. La mesure de l’expression des
gènes par q-RT-PCR indiquent que la propionyl-carnitine n’affecte pas l’expression
de ces gènes. Ce métabolite est issu de l’oxydation des acides gras et intervient
également dans la synthèse des acides gras présentant un nombre impair de
carbone. Parmi les métabolites discriminants présents dans la fraction 1, nous
éliminons la propionyl-carnitine des candidats potentiellement responsable de l’effet
de cette fraction sur l’expression des gènes du partenaire fongique.
90
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
4. DISCUSSION ET PERSPECTIVES
La symbiose mycorhizienne à arbuscule est une interaction intime et
complexe entre deux organismes eucaryotes qui ont co-évolué pendant des
centaines de millions d’années (Remy et al., 1994). Une racine mycorhizée
représente un nouvel organe, mixte, très intégré, dont certains aspects du
développement, comme le développement des racines latérales, et de la physiologie,
comme la nutrition minérale, sont clairement différents d’une racine non mycorhizée
(Smith et Read, 2008). Réciproquement, le partenaire fongique acquiert in planta de
nouvelles compétences qui le rendent par exemple capable de prélever des sucres
dans son milieu et de les métaboliser en lipides. Ces nouvelles propriétés et
compétences résultent de programmations génétiques modifiées chez les deux
partenaires et de l’interaction entre ces programmes. Un des grands objectifs
poursuivis par la communauté internationale est de décrire ces nouvelles
programmations et de comprendre comment elles sont déclenchées. L’hypothèse de
travail qui sous-tend la thèse présentée ici est que chaque partenaire influence
l’expression des gènes de l’autre, entre autre, par l’intermédiaire de signaux
moléculaires. Dans les étapes précoces par exemple, les lipochitooligosaccharides
(Myc LCOs) produits par le champignon régulent l’expression de plusieurs dizaines
de gènes chez la plante hôte (Czaja et al., 2012), y compris des microARN
(Communication personnelle Formey Damien, doctorant). Inversement les
strigolactones ou certains flavonoïdes sont aussi capables de modifier l’expression
génique du champignon. Plus tardivement la lysophosphatidyl-choline (LPC), dont
l’origine fongique ou végétale n’est pas encore établie, stimule chez la plante un
gène symbiotique clé, codant pour un transporteur de phosphate (Drissner et al.,
2007). Pour décrire les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la
mise en place d’une racine mycorhizée, les approches d’imagerie cellulaire, de
mutagenèse, de transcriptomique, de protéomique et de génétique inverse ont été
privilégiées (Smith et Read, 2008).
Elles ont conduit à des découvertes importantes sur les mécanismes
impliqués dans les processus de reconnaissance, d’infection et de colonisation
racinaire. Des voies de signalisation et certains signaux précoces échangés entre les
partenaires ont été mis en évidence. Très peu d’études ont exploité l’approche
91
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
métabolomique et aucune, avant notre travail, n’a cherché à exploiter cette approche
pour rechercher, sans a priori, d’éventuels métabolites ou signaux régulateurs de la
symbiose mycorhizienne.
4.1. La méthodologie
4.1.1. L’extraction et l’échantillonnage
La première partie du travail a consisté à mettre en place l’ensemble de la
méthodologie analytique et de développer un savoir-faire dans l’analyse différentielle
du métabolome et plus particulièrement dans le cadre de l’interaction mycorhizienne.
Parmi les métabolites impliqués dans la régulation de la symbiose, nous postulons
que certains sont échangés entre les deux partenaires et notre premier objectif a été
de pouvoir les détecter et les identifier. L’extraction par exsudation a d’abord été
envisagée afin de recueillir les molécules à l’interface symbiotique sans extraire les
contenus cellulaires. Cette interface est apoplasmique et devait pouvoir être extraite
par simple rinçage. Cependant, ce type d’extraction s’est révélé inadapté pour
réaliser des analyses différentielles du métabolome. Nous avons observé une trop
grande variabilité entre les échantillons probablement induite par des conditions
d’exsudation insuffisamment contrôlées et par des lésions sur les racines lors du
transfert d’un milieu solide à liquide. Dès lors, une extraction plus conventionnelle
avec un solvant organique après un broyage mécanique des tissus dans l’azote
liquide a été adoptée pour limiter les perturbations engendrées par l’exsudation. Les
racines sont broyées puis extraites au méthanol, sans passer par une étape de
lyophilisation qui peut être une cause supplémentaire de variabilité.
Un travail pionnier de métabolomique sur la symbiose mycorhizienne avait
montré que le métabolisme secondaire semblait être plus affecté que le métabolisme
primaire, lors de l’interaction entre la plante et le champignon MA (Schliemann et al.,
2008). Nous avons focalisé notre étude sur les métabolites secondaires, de polarité
intermédiaire, et utilisé des techniques analytiques très performantes. Le méthanol a
permis de solubiliser un large spectre de molécules avec une bonne reproductibilité.
Le nombre d’échantillons nécessaires pour réaliser une analyse différentielle
92
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
du métabolome dépend principalement de la variabilité entre échantillons et de
l’objectif à atteindre. La variabilité est la somme de la variance analytique induite par
l’approche expérimentale et de la variance biologique. La variance analytique diffère
selon la technologie des appareils utilisés lors de l’analyse et selon l’extraction
effectuée. Malgré des cultures réalisées dans des conditions les plus identiques
possibles, des variations biologiques subsistent et leurs origines sont indéterminées.
La part de la variabilité biologique est en générale plus importante que la variabilité
technique dans les analyses différentielles du métabolome. Roessner et al. (2000)
rapportent un facteur de dix entre la variabilité technique et biologique dans ces
analyses par GC/MS, (Roessner et al., 2000) et Sumner et al. (2003) estime la
variance biologique à environ 50% pour leurs cultures de M. truncatula. Un moyen de
réduire la variabilité biologique consiste à regrouper plusieurs cultures dans un
même échantillon, moyennant ainsi cette variabilité biologique. Notre objectif de
mettre en évidence les différences métaboliques les plus marquées entre des
racines en symbiose et des racines non symbiotiques, justifie l’utilisation de trois
échantillons par condition. Chaque échantillon se compose de cinq systèmes
racinaires indépendants afin d’atténuer la variabilité biologique. Un nombre réduit
d’échantillons permet d’économiser du temps d’acquisition en LC-MS mais
également lors du traitement des données. Ce temps a été mis à profit pour réaliser
d’autres analyses complémentaires (pseudo-SIM) dans le but d’améliorer la
sensibilité des analyses.
4.1.2. La gamme dynamique des concentrations en métabolites
Apprécier avec précision les différences de concentrations entre les
métabolites présents dans une cellule ou un tissu constitue l’un des défis de la
métabolomique. La gamme dynamique des concentrations moléculaires couvre
plusieurs décades, avec des métabolites présents à l’échelle du milli-molaire
jusqu’au fento-molaire, voire à des concentrations inférieures (Sumner et al., 2003;
Makkar et al., 2007). Toutes les techniques de détection sont limitées par un effet de
saturation si bien que la détection des composés est seulement possible sur une
échelle de concentration de quelques décades. La gamme dynamique est de 4 à 5
décades selon les spectromètres de masse. Par conséquent pour une approche de
93
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
métabolomique différentielle, la limite de détection est dépendante des composés les
plus concentrés dans l’échantillon. Par rapport à la concentration de ces composés
majoritaires, les métabolites les moins concentrés, mais encore détectables, seront
ceux présents en quantité jusqu’à 100 000 fois plus faible.
Pour augmenter la sensibilité de l’analyse, les critères de sélection des pics
ont été moins stringents lors du traitement des données, afin de ne pas éliminer les
signaux de faible intensité. En contrepartie, des acquisitions complémentaires en
mode pseudo-SIM ont permis de valider certains ions sur lesquels pesaient une
incertitude due à leur faible intensité et leur faible rapport « signal sur bruit ». D’autre
part, pour optimiser la sensibilité de mesure, la quantité d’échantillon injectée a été
augmentée jusqu’à atteindre la limite de saturation en spectrométrie de masse, tout
en veillant à ne pas saturer la colonne chromatographique.
4.1.3. Le traitement des données
Pour le traitement des données, il a fallu choisir le logiciel le plus adapté à nos
objectifs. Les critères de sélection ont été l’efficacité dans la détection des pics et la
qualité de l’intégration, un logiciel adapté aux caractéristiques des appareils utilisés
(UPLC et Q-TOF) et une prise en main rapide. Selon les différents logiciels
disponibles, le nombre de retraitement des données et des filtres proposés fluctuent
énormément. L’optimisation des réglages de ces paramètres dépend de multiples
facteurs : (i) la technologie de la chromatographie (UPLC, HPLC et GC), qui
influence la résolution et la nécessité d’un réalignement chromatographique, (ii) le
type de spectromètre de masse, c’est-à-dire sa précision de masse, sa résolution
spectrale, son détecteur et ses niveaux d’intensité du bruit de fond électronique et du
mode d’acquisition (profil ou centroïde) (iii) la nature des échantillons qui génère du
bruit de fond de type chimique.
Par conséquent, plus un logiciel applique de traitements et plus il est laborieux
d’ajuster les différents paramètres. De plus, les réglages sont plus ou moins
empiriques, ce qui demande de réaliser différents tests au préalable et de comparer
les résultats pour juger de leur efficacité. La vérification manuelle des résultats est
longue mais indispensable dans la mise en place de nouvelles méthodes de
traitement des données. Nous avons choisi MarkerLynx, parce qu’il a été développé
94
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
par Waters dans le cadre d’analyses du métabolome réalisées sur UPLC-Q-TOF.
D’autre part, les processus de retraitement des données se limitent au strict
minimum, facilitant l’optimisation des réglages.
Les extraits de racines en symbiose se composent de métabolites d’origine à
la fois fongique et végétale. Naturellement, dans un comparatif avec des racines non
mycorhizées, toutes les molécules provenant du champignon MA seront criblées
comme différentielles. Or nous avons choisi de nous focaliser sur les métabolites
fongiques spécifiques de l’état symbiotique. Nous avons donc choisi d’éliminer de
nos analyses tous les métabolites retrouvés dans des spores germées ou non
germées (avec 100 000 spores par condition).
4.2. Les résultats de l’analyse du métabolome
Les profils d’extraits méthanoliques de racines mycorhizées et non mycorhizées ne
présentaient aucune différence visible sur les chromatogrammes enregistrés. Grace
au traitement des données et à une maîtrise de la variabilité biologique et technique
tout au long du processus analytique, nous avons identifié plus de 200 ions au moins
10 fois plus abondants dans les racines mycorhizées. Avec des analyses
complémentaires, nous avons pu déterminer que ces ions sont issus de 71
métabolites dont 51 sont exclusivement détectés dans les racines en symbiose. Plus
de 10% de ces ions sont présents à différents temps de rétention avec une
différence de masse inférieure à 10 ppm. Certains métabolites se fragmentent dans
le spectromètre de masse et la plupart d’entre eux produisent des ions de même
masse (à 10 ppm), mettant en évidence des familles de métabolites affectées par la
symbiose. Ce résultat va dans le sens de nombreux travaux d’expression génique.
Ils font état d’une régulation positive de nombreux gènes intervenant dans le
métabolisme secondaire comme l’induction de gènes codant pour des enzymes de la
synthèse des flavonoïdes et des iso flavonoïdes : chalcone synthase, (Bonanomi et
al., 2001), isoflavonoïde glycosyl-transférase (Liu et al., 2007). La voie de
biosynthèse du méthylerythritol-phosphate, précurseur dans la synthèse de
monoterpènes, diterpènes, xanthophylles et apo-caroténoïdes, est davantage
sollicitée lors de la symbiose. La 1-déoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 2 (DXS2)
95
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
est spécifiquement exprimée lors de la mycorhization (Floß et al., 2008). De plus, de
nombreux travaux de transcriptomique mettent en évidence la surexpression d’une
dizaine de gènes codant pour des cytochromes P450 (Liu et al., 2003;
Brechenmacher et al., 2004; Grunwald et al., 2004; Güimil et al., 2005; Hohnjec et
al., 2005; Küster et al., 2007; Gomez et al., 2009; Guether et al., 2009). Cette famille
de protéines catalyse une large variété de réactions de mono-oxygénation et
d’hydroxylation dans le métabolisme secondaire des plantes (Mizutani et Sato,
2011). De plus, la sélection des ions discriminants avec un ratio de concentration de
10 entre racines mycorhizées et non mycorhizées, donne de la robustesse à ce
résultat.
4.2.1. Identification structurale des métabolites, un défi majeur chez les végétaux
L’identification de métabolites à partir d’analyses du métabolome réalisées par
spectrométrie de masse, est un véritable défi. Le processus qui mène à la
caractérisation d’un métabolite est long, laborieux et incertain ; sa présence dans les
bases de données est la condition nécessaire et pratiquement indispensable (Kind et
Fiehn, 2007; Werner et al., 2008b) mais pas suffisante. Le règne végétal produit une
diversité de substances naturelles exceptionnelle, dont la structure chimique est
parfois très complexe. Afendi et collaborateurs estiment à environ un million le
nombre de métabolites d’origine végétale (Afendi et al., 2012). Près de 200 000
composés sont actuellement répertoriés par la base de données DNP. Chaque
espèce possèderait entre 15 000 à 20 000 métabolites spécifiques (Dixon, 2001b;
Fernie et al., 2004; Hartmann et al., 2005).
A partir de données obtenues par spectrométrie de masse, le processus
d’identification structurale peut se dérouler de deux façons :i) soit avec les ions fils,
en s’appuyant sur des bases de données (rares) contenant des informations de
MS/MS et de comportements chromatographique comme : la « metabolome
tomato » (MoTo) (Moco et al., 2006), la KNApSAcK (SHINBO et al., 2006) et la
MassBank (Taguchi et al., 2007) de la Platform for Ricken Metabolomics (PRIME)
(Matsuda et al., 2009b), ii) soit avec l’ion parent et la génération de formules brutes.
96
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Toutefois, le nombre de métabolites contenus dans les bases de données avec des
informations spectrales reste très marginal.
4.2.1.1. L’apport de la précision de masse
La génération de formules brutes à partir d’un ion dépend de la précision de
masse et de la taille de la molécule (Figure 4-1).
Figure 4-1Nombre de formules brutes générées en fonction de la précision de masse et de la mesure du profil isotopique. (D’après Fiehn 2006)
Les formules brutes générées sont conformes aux deux règles chimiques de Lewis et Senior. Le nombre de
possibilités augmente selon deux facteurs, la masse du composé recherché et la précision de mesure, aussi bien
de la masse que du profil isotopique. De façon remarquable une précision de masse de 3 ppm couplée à une
précision de 2% sur le profil isotopique permet d’égaler la performance d’un spectromètre de masse qui aurait
une précision de 0,1ppm soit trente fois supérieur.
La détermination de la composition atomique d’un composé, en vue de son
identification structurale, requiert une bonne précision de masse. L’utilisation de
spectromètre de masse à haute résolution est indispensable pour y parvenir. Les
premières analyses ont été effectuées sur un Q-TOF Premier (Waters) avec une
précision de masse de 5 à 3 ppm, puis sur un Q-TOF Maxis (Bruker Daltonics) de
plus haute résolution avec une précision de 1 ppm. Suivant le détecteur utilisé sur les
Q-TOF, de type analogique ou digital, des correcteurs de masses sont appliqués.
Dans le cas d’un détecteur digital, l’erreur de masse dérive de façon linéaire en
97
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
fonction de l’intensité. Le système Time-to-Digital Converter (TDC) applique un
algorithme pour supprimer cet effet indésirable et permettre une meilleure précision
de masse. Néanmoins, les ions de plus faibles intensités ainsi que ceux de plus
fortes intensités présentent les plus grandes erreurs de masse et ne peuvent pas
être corrigés (Mihaleva et al., 2008).
4.2.1.2. L’apport du profil isotopique dans la génération de formule brute
Par ailleurs, même une très bonne précision de masse aux alentours de 1
ppm, ne suffit pas à attribuer une seule formule brute, hormis pour les plus basses
masses inférieures à 300 daltons (Figure 4-1). Cependant, la composition atomique
des métabolites des organismes vivants dépend de l’abondance naturelle des
isotopes, comme le C13 (1,1% de l’isotope du carbone léger C12), O18 (0,2 % de O16),
N15 (0,36% de N14) et S33 et S34 (respectivement 0,79% et 4,43% de S32). Par
conséquent, le profil isotopique d’un ion représente une signature de sa composition
atomique. La masse du pic mono isotopique (M0), couplée à la mesure de
l’abondance des différents isotopes (M0, M + 1, M + 2, M + 3) permet de réduire
sensiblement le nombre de formules brutes proposées (Kind et Fiehn, 2006). Seules
les données acquises sur le Q-TOF Maxis ont servi à générer les formules brutes par
l’intermédiaire de SmartFormula3D (Bruker Daltonics). Avec une plus grande
précision de masse et une meilleure définition du profil isotopique (2% d’erreur) par
rapport au Q-TOF Premier, le nombre de formules brutes proposées est réduit.
Certaines contraintes peuvent être imposées dans la génération de formules brutes :
(i) une restriction sur le nombre d’éléments pouvant entrer dans la composition
atomique, (ii) une compatibilité avec des règles chimiques de LEWIS et de SENIOR,
(iii) un contrôle des ratios entre le nombre des différents éléments par rapport au
nombre de carbones, (iv) dans le cas de dérivation, l’utilisation de la présence de
triméthylsilylation (Kind et Fiehn, 2007). Systématiquement, tous les ions criblés
dans l’analyse du métabolome ont subi une génération de formules brutes, restreinte
aux éléments suivant : C, H, O, N, P, S, Cl, Na et K. Parmi les 134 ions
caractéristiques de la mycorhization qui ont été détectés sur le Q-TOF Maxis, le
98
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
logiciel Smart formula3D a proposé une ou plusieurs formules brutes avec un score
inférieur à 100 pour 62 ions. Au-delà d’un score de 100, les formules brutes
générées respectent rarement les règles chimiques. De plus les ratios entre atome
de carbone et les autres atomes ne correspondent pas à ceux de 98% des
molécules biologiques contenu dans les bases de données, selon Kind et Fiehn
(Kind et Fiehn, 2007). Au final, 38 ions se voient attribuer une seule formule brute
dont 5 sont des ions parents.
4.2.1.3. Les différentes difficultés dans l’identification structurale
Plusieurs obstacles sont apparus au cours de la détermination des
compositions atomiques. Tout d’abord avec les métabolites qui ont subi une forte
fragmentation dans le spectromètre de masse, une incertitude subsiste sur
l’identification de l’ion parent (métabolite ionisé). Dans le cas de métabolites criblés
avec plusieurs ions un doute demeure quant à l’identification de l’ion parent, la
fragmentation a peut être entrainé sa disparition au profit des ions fils. D’autre part,
les métabolites identifiés avec des ions présents en faible quantité ont des profils
isotopiques tronqués et faussés. En effet, pour obtenir un profil isotopique de bonne
qualité avec la détection d’un grand nombre d’isotopes, l’intensité de l’ion doit être
suffisamment élevée. Dans le cas contraire, à faible intensité peu d’isotopes sont
détectés. La mesure de l’abondance isotopique est alors moins précise et le bruit de
fond prend une part plus importante et non négligeable dans les aires des pics du
profil isotopique. La dernière difficulté est liée aux ions de masse supérieure à 500
daltons dont le nombre de formules brutes générées augmente significativement. Ce
phénomène s’amplifie quand les ions sont détectés à de faibles intensités, le profil
isotopique est alors de moins bonne qualité.
L’importance de déterminer une seule formule brute par composé à identifier
se justifie amplement surtout pour les métabolites avec des masses supérieures à
300 Dalton. Le choix de la base de données dépend de l’organisme étudié. Nous
avons privilégié dans un premier lieu les plus spécifiques pour aller ensuite vers les
plus généralistes. Or, l’interrogation des bases de données génère de nombreuses
molécules. Pour la formule brute C15H12O7, 129 composés sont recensés dans la
base de données DNP (figure 4-2).
99
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Figure 4-2 Exemple d’une interrogation des bases de données avec la formule brute suivante : C15H12O7 (d’environ 300Da) (d’après Fiehn 2006).
Pour une molécule de 300 Da, la recherche dans la base de données Dictionary of Natural Product
(DNP) avec sa formule brute fournit 129 composés.
Sur la base des analyses en spectrométrie de masse, la génération de formule brute
donne une seule possibilité pour les cinq ions parents des métabolites 5, 6, 7, 38 et
64. Les interrogations dans la base de données DNP propose de 4 à 74 molécules.
Par spectrométrie de masse, seules des acquisitions en MSn peuvent fournir des
informations supplémentaires dans l’objectif d’identifier le métabolite, ou du moins,
de réduire le nombre de candidats potentiels. La fragmentation du métabolite peut
engendrer des pertes de groupement comme des oses, O-méthyl, malonyl, CO2
etc…, tous ces indices permettent d’éliminer certaines molécules. Certains logiciels,
comme ADC/MS fragmenter et Fragment iDentificator, prédisent les différents
fragments que peut produire une molécule. Certains auteurs affirment que ces
logiciels permettent dans plus de 80% des cas d’identifier le bon métabolite. En plus
de l’interrogation des bases de données avec une formule brute, la comparaison des
spectres de tous leurs candidats potentiels générés in silico avec les spectres de
fragmentations expérimentaux, offre la possibilité de trouver la bonne structure
moléculaire (Heinonen et al., 2008; Tyrkkö et al., 2010). Dans le cas où un seul
métabolite concorde, son identification devra être confirmée par l’utilisation d’un
standard afin de vérifier que son comportement chromatographique et sa
fragmentation coïncident. Dans les cas contraires, d’autres méthodes
complémentaires devront être employées, les plus fréquentes étant la
100
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
RMN, l’UV, et l’IR afin d’enrichir les informations sur le métabolite (Werner et al.,
2008b).
Seul le métabolite 5 génère un spectre de fragmentation exploitable menant à
l’identification de la propionyl-carnitine, confirmée par l’utilisation du standard de
cette molécule. Pour les 3 autres métabolites, un enrichissement par pré-purification
est nécessaire, afin de pouvoir obtenir des spectres de fragmentations exploitables.
Dans le cas des 67 autres métabolites, la plupart ont des masses supérieures
à 500 Da. En admettant que tous ces composés soient contenus dans les bases de
données, même un enrichissement par purification partielle ne garantirait ni la
détermination de leur formule brute ni leur identification étant donné le nombre élevé
de molécules proposées. Un recours à la RMN impliquerait la purification de chaque
métabolite et l’obtention de quantité de l’ordre de la micro-mole à une dizaine de
nano-mole en fonction du spectromètre utilisé.
4.2.2. Utilisation d’une stratégie originale
Dans notre objectif d’identifier des métabolites clés impliqués dans la
symbiose mycorhizienne, nous avons élaboré une stratégie qui associe une analyse
du métabolome à une analyse d’expression de gènes affectés durant la symbiose.
L’analyse différentielle du métabolome a pour but de cribler un ensemble de
métabolites candidats en sélectionnant ceux qui sont d’avantage présents dans les
racines mycorhizées. Quant à l’analyse transcriptomique, elle a pour but de
sélectionner parmi ces métabolites criblés ceux qui présentent un intérêt biologique,
reflété par leur activité sur le transcriptome du champignon MA. Seuls les
métabolites soupçonnés d’avoir un rôle régulateur dans la symbiose justifient une
identification structurale. De plus cette stratégie permet d’obtenir les premiers
éléments d’informations pour élucider le rôle biologique de chaque métabolite criblé
grâce aux fonctions des gènes dont il module l’expression.
Pour limiter le coût et le temps d’analyse, nous devions faire un choix entre
réaliser une analyse transcriptomique sur des gènes fongiques ou des gènes
végétaux. Grâce à notre maîtrise de la culture du champignon MA et nos
compétences en transcriptomique au sein de l’équipe, et à notre participation au
consortium de R. irregularis qui nous permet de disposer de données sur le
101
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
transcriptome du champignon MA, nous avons choisi d’étudier l’expression de gènes
fongiques. Nous avons choisi 91 gènes dont les expressions sont affectées durant la
symbiose. La stimulation des spores du champignon MA avec des extraits
méthanoliques de racines mycorhizées ou non mycorhizées fractionnées par HPLC a
permis d’observer des variations d’expression de certains gènes. Ce résultat est
remarquable puisque dans un système expérimental sans la présence de la plante et
avec le champignon MA dans un état physiologique différent de celui de la symbiose,
des gènes spécifiques de la symbiose ont été régulés par la présence d’extraits
racinaires. Cela nous permet de valider l’hypothèse que nous faisions, à savoir que
l’on peut dans une certaine mesure simuler les conditions in planta, avec des spores
en germination, par l’apport d’extraits racinaires. Cela rappelle les travaux de
Hildebrandt et collaborateurs qui avaient montré que les hyphes de R. irregularis
Sy167 en présence de bactéries Paenibacillus validus (DSM ID617 et ID618)
pouvaient croître un certain temps sans la présence de la plante en produisant des
structures ressemblants à des arbuscules et des spores filles capable de germer. Ils
avaient également mis en évidence des inductions d’expression génique chez le
champignon en présence d’exsudats bactériens (Hildebrandt et al., 2002;
Hildebrandt et al., 2006). L’ensemble de ces observations suggèrent que la
biotrophie du champignon MA pourrait en partie être contrôlée par des signaux
externes. On peut espérer un jour créer un système expérimental ex planta pour
étudier les mécanismes de régulation de la symbiose endomycorhizienne.
Les fractions 1, 5, 6, 8, 9 et 10 sont les plus actives sur la régulation des
gènes spécifiques de la symbiose chez le champignon MA. Cependant pour les
fractions 8 et 10, l’analyse métabolique n’a criblé aucun métabolite discriminant. Cela
pourrait s’expliquer par la nature plus apolaire des métabolites contenus dans ces
fractions, l’ionisation de type ESI étant moins efficace sur les composés plus
hydrophobes. La perte de sensibilité pénalise l’analyse différentielle dans cette zone
du chromatogramme. Une source d’ionisation de type APCI ou une analyse par GC-
MS seraient probablement plus efficaces. La nature chimique de la colonne
chromatographique n’est peut être pas adaptée aux molécules actives de ces
fractions. Une autre possibilité serait que la concentration des molécules actives soit
très faible. La technologie utilisée ne permettrait alors pas de les identifier. Une autre
hypothèse pourrait être que les concentrations des molécules actives et présentes
dans les fractions 8, 9 et 10 ne seraient pas dix fois plus concentrées dans les
102
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
racines mycorhizées. Le caractère extrêmement complémentaire des deux
approches métabolomique et transcriptomique offre ici la possibilité de revenir sur
des données déjà acquises pour y extraire de nouvelles informations. La recherche
de nouveaux ions discriminants à des temps de rétention correspondants aux
fractions 8, 9 et 10, a conduit à cribler potentiellement 24 métabolites
supplémentaires dont les concentrations sont de 2 à 9,9 fois plus importantes dans
les racines mycorhizées. Ces ions mériteront d’être étudiés plus amplement dans le
futur et plus particulièrement ceux présents dans la fraction 10.
Parmi les métabolites que nous avons criblés dans la fraction 5, qui est très
active sur l’expression des gènes du champignon MA, le métabolite 38 a la même
composition atomique que 39 composés présents dans la base de données DNP.
Certains sont caractérisés par une activité antimicrobienne et antifongique, comme la
chromomoric acid C (Liu et al., 1994; Ragasa et al., 2008), la ML 236A, de la famille
des statines inhibitrices des 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzyme A reductase
(HMG-CoA réductase) impliquée dans la synthèse des stérols (Endo et al., 1976;
Endo et al., 1977) et la bakuchiol, molécule composée d’une fonction phénol et d’une
structure partielle de terpènes (meroterpène), retrouvée dans Psoralea corylifolia
(babchi) et Otholobium pubescens, des plantes médicinales de la famille des
Fabaceae, tout comme Medicago truncatula (Katsura et al., 2001; Hsu et al., 2009).
Cette fraction 5 contient des molécules responsables d’un effet inhibiteur sur
l’expression de six gènes. L’activité biologique connue des molécules pouvant
correspondre au métabolite 38 concorde avec l’action de la fraction 5 sur
l’expression des gènes fongiques. De plus, parmi les gènes dont l’expression est
réprimée par la fraction 5, le gène 11 code pour une lyso-phosphatidylcholine-O-
acyltransferase, impliquée dans la synthèse de lyso-phosphatidylcholine. Or Drissner
et collaborateurs avaient démontré que la lyso-phosphatidylcholine régulait
positivement l’expression d’un transporteur de phosphate spécifique de la
mycorhization et essentiel dans le maintient de la symbiose (Drissner et al., 2007).
Ces travaux ne déterminaient pas si la lyso-phosphatidylcholine était un signal
d’origine fongique ou végétal. La fraction 5 est très intéressante puisqu’elle contient
potentiellement un métabolite pouvant réguler la production de lyso-
phosphatidylcholine, elle même jouant un rôle dans la symbiose mycorhizienne. Le
métabolite 38 est donc un candidat intéressant. Cependant, il faudrait vérifier qu’un
extrait pré-purifié du métabolite 38 est bien capable d’inhiber la transcription du gène
103
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
impliqué dans la synthèse de la lyso-phosphatidylcholine, avant de se concentrer sur
son identification.
A moyen terme, l’objectif est d’identifier les métabolites qui affectent
l’expression de gènes spécifiques de la symbiose chez le champignon MA. Pour
cela, les métabolites criblés dans les fractions HPLC les plus actives, comme le
métabolite 38, devront être prioritairement isolés avant de tester individuellement
leurs effets sur le champignon MA. Dans le cas où ils affectent le transcriptome du
champignon MA des investigations seront menées afin d’identifier leurs structures.
De nouvelles acquisitions en spectrométrie de masse avec un échantillon pré-purifié
permettront d’obtenir des profils isotopiques de meilleure qualité par rapport aux
mélanges complexes des extraits racinaires bruts et ainsi de faciliter la détermination
d’une formule brute. Si l’interrogation des bases de données et l’exploitation des
spectres de masse ne permettent pas une identification du métabolite alors des
analyses en RMN devront être envisagées sur des molécules pures.
4.2.2.1. La propionyl-carnitine
La propionyl-carnitine est détectée exclusivement dans les racines en
symbiose, cette molécule appartient à une famille de composés, les acylcarnitines,
dont l’unité de base est la carnitine, découverte en 1905 par des chercheurs russes,
Gulewitsch et Krimberg, alors qu’ils étudiaient des extraits de muscle de bœuf. Le
nom de la carnitine provient du mot latin « carnis » qui signifie chair. Les
acylcarnitines sont au cœur du métabolisme énergétique. Elles interviennent dans le
métabolisme oxydatif des acides gras. Fritz est le premier à l’avoir mis en évidence
en 1955 (Fritz, 1955). La carnitine est un transporteur d’acyles, elle fait transiter les
acyles aux travers de la membrane interne des mitochondries, afin d’alimenter les
cycles du glyoxylate et le cycle de Krebs ou à l’inverse d’alimenter la synthèse des
acides gras. Elle permet le transfert des acyles grâce à une condensation, ainsi les
acylcarnitines formées peuvent traverser la membrane interne des mitochondries via
des transporteurs spécifiques d’acylcarnitines, caractérisés chez l’homme (Rubio-
Gozalbo et al., 2004). Dans les génomes de champignons, comme Saccharomyces
cerevisiae et Candida albicans, sont retrouvés trois acylcarnitines transférases
104
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
putatives (Elgersma et al., 1995; Kawachi et al., 1996; Prigneau et al., 2004; Strijbis
et al., 2008). Le métabolisme énergétique des champignons MA est très largement
relié aux lipides qui constituent la forme très majoritaire de réserve carbonée et
d’énergie (Beilby et Kidby, 1980; Bago et al., 2002). De plus, les champignons MA
sont des biotrophes obligatoires, incapables de réaliser leur cycle de vie sans un flux
de carbone délivré par la plante sous forme de monosaccharides. Le métabolisme
carboné est au cœur de la dépendance du partenaire fongique vis-à-vis de la plante.
Or le traitement des spores de Rhizophagus irregularis avec la propionyl-carnitine ne
montre aucun effet sur l’expression des gènes affectés par la fraction 1. Ce
métabolite n’est pas une molécule « signal » perçu par le champignon MA. Il semble
aussi peu probable qu’il soit issu de l’oxydation des acides gras puisque en symbiose
le champignon synthétise ces acides gras contrairement à la phase pré-symbiotique
où il puise dans ces réserves lipidiques pour croître. Or la propionyl-carnitine
s’accumule spécifiquement lors de la symbiose MA. Deux hypothèses peuvent être
formulées à ce stade : (i) la propionyl-carnitine est produite par la plante et non par le
champignon MA, soit (i) elle est un substrat dans la synthèse des acides gras à
longues chaînes avec un nombre de carbone impair.
4.3. Les perspectives à plus long terme
Dans une perspective à plus long terme, des analyses transcriptomiques
identiques à celles effectuées sur le champignon MA devront être réalisées sur la
plante. Un travail de sélection des gènes de plante, dont l’expression est modulée
lors de la symbiose, a déjà été accompli, ainsi que la détermination des couples
d’amorces associées pour réaliser des analyses d’expression génique par qRT-PCR.
D’autre part, des analyses du métabolome de plantes mutantes affectées dans le
fonctionnement de la symbiose, permettraient de mettre en évidence des métabolites
« clés » dans la régulation de cette interaction. La plupart des mutants décrits dans
la littérature altère l’initiation de la symbiose. Néanmoins, certains ont un impact dans
les phases plus tardives comme le mutant B9 chez Medicago truncatula avec une
augmentation de la fréquence des arbuscules (Morandi et al., 2009). De même, des
mutants de pois sur les gènes Sym36, Sym33, et Sym40 présentent une diminution
et une dégénérescence des arbuscules (Jacobi et al., 2003; Kuznetsova et al.,
105
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
2010). Et enfin, l’élargissement du champ d’investigation de l’analyse métabolique
pourrait être réalisé, via une exploration plus vaste du métabolome, avec la mise en
place de nouvelles méthodes analytiques incluant les métabolites plus hydrophiles et
plus hydrophobes.
4.4. Conclusions
Ce travail de thèse a permis de mettre en place une méthode d’analyse
métabolique non ciblée par LC-MS visant à identifier des métabolites impliqués dans
la symbiose mycorhizienne à arbuscules. Cette méthode a été axée sur des
métabolites de polarité intermédiaire. L’ensemble des étapes du processus
analytique a été optimisé. La culture des racines a été réalisée de façon à diminuer
la variabilité du taux de mycorhization et à faciliter le prélèvement des racines, sans
induire de perturbation métabolique avant l’extraction, grâce à une culture in vitro sur
gélose et papier filtre. Les différents paramètres chromatographiques et de
spectrométrie de masse ont été définis pour obtenir les meilleures résolutions
possibles. Le traitement des données a été adapté aux appareils utilisés (UPLC-Q-
TOF) et à des extraits de type racinaire. Cette méthode a été validée dans un projet
annexe, qui consistait à identifier des changements dans le métabolome de racines
cultivées avec de fortes et de faibles fertilisations en phosphate (Laparre et al.,
2011).
L’analyse métabolique a permis la discrimination de 71 molécules qui sont au
moins 10 fois plus présentes dans les racines mycorhizées que dans les racines non
mycorhizées. Parmi elles, une cinquantaine de métabolites n’avaient jamais été
criblés comme caractéristiques de la mycorhization. Bien que seule la propionyl-
carnitine ait été identifiée, nous fournissons pour les autres métabolites des
informations sur leur masse ou/et leur profil de fragmentation. Ces informations
représentent une bibliothèque de données, obtenues avec des organismes modèles,
qui s’ajouteront aux données génomiques, transcriptomiques et protéomiques déjà
existantes et qui pourront être exploitées comme ces dernières par l’ensemble de la
communauté des scientifiques qui étudient la symbiose MA. L’apport de l’analyse
transcriptomique permet de cibler les métabolites ayant potentiellement un rôle
106
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
important dans la symbiose et contribue à fournir les premières pistes dans une
étude fonctionnelle grâce aux fonctions biologiques que l’on attribue aux gènes
affectés.
L’exploitation agronomique de la symbiose MA pour réduire les besoins en
irrigation, en engrais chimique et en pesticides est encore extrêmement limitée. Elle
bute sur notre incapacité à maîtriser correctement la culture des champignons MA
pour produire de l’inoculum à grande échelle et bon marché. Nos connaissances sur
les mécanismes génétiques et moléculaires qui sous tendent la reconnaissance des
partenaires, la mise en place de la symbiose, son efficacité et sa durabilité, sont
encore trop fragmentaires. L’identification de métabolites affectant la symbiose
endomycorhizienne et la caractérisation de leur rôle biologique permettra de mieux
comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’interaction entre les plantes
mycotrophes et les champignons MA. Ces connaissances contribueront, peut être un
jour, à mieux contrôler la symbiose pour développer de nouvelles technologies en
agriculture durable.
107
ANNEXES
5. ANNEXES
5.1. Matériels et méthodes
5.1.1. Culture des racines et mise en germination du champignon MA
5.1.1.1. Culture de racines mycorhizées et non mycorhizées
Dans une boîte de Petri ronde (145Ø x 20 mm) sont introduit 100 ml de milieu
minimum (milieu M) (Bécard et Fortin, 1988) avec 10 g/L-1 de sucrose (Sigma) et
gélifié par 3 g/L-1 de phytagel (Sigma, Steinheim, Germany). Après la solidification de
la gélose, un papier filtre (Wattman no1 qualitatif) préalablement stérilisé est déposé
à sa surface. L’extrémité d’une racine latérale (d’une longueur ≈ 5 cm) de Medicago
truncatula transformée par Ri T-DNA d’Agrobacterium rhizogenes est apposée au
centre du papier filtre. Pour obtenir des racines mycorhizées, 500 spores stériles de
Rhizophagus irregularis DAOM 194757 (Agronutrition) sont déposées sur les
racines. La culture de racines composites dure huit semaines, à 24°C, à 80%
d’humidité et dans l’obscurité.
Pour les racines composites produites par Agronutrition, les conditions de
culture sont identiques, mais adaptées à l’échelle de l’unité de production et le temps
de culture est prolongé jusqu’à dix semaines.
5.1.1.2. La germination de spores du champignon MA
Les spores de Rhizophagus irregularis (DAOM 197198) sont mises à germer
dans une boîte de Pétri ronde (145Ø x 20 mm), dans 50 ml de milieu M sans
sucrose, pendant 5 jours, dans l’obscurité, à 28°C, avec une atmosphère à 2% de
CO2. Pour les spores stimulées par une strigolactone de synthèse, 100µl de GR 24
dissout dans un mélange eau /acétone (80/20) à 10-6 M, sont ajoutés pour atteindre
une concentration finale de 5.10-8 molaire.
108
ANNEXES
5.1.2. Extraction et quantification du taux de mycorhization
Les racines humides sont placées dans un mortier contenant de l’azote liquide
puis partiellement broyées avec le pilon pour obtenir des fragments d’environ un
centimètre.
5.1.2.1. Quantification du taux de mycorhization
Le mélange de fragments racinaires est homogénéisé, environ un gramme de
racine est prélevé pour quantifier le taux de mycorhization. Les racines sont placées
dans une solution de potasse caustique à 10%, portées à 90°C, pendant 6 minutes,
puis rincées abondamment à l’eau froide. Elles sont ensuite plongées dans une
solution d’acide acétique 5% et d’ancre de Shaeffer 5% et portée à ébullition durant 6
minutes (Vierheilig et al., 1998b). Des rinçages successifs à l’eau sont effectués
avant l’estimation du taux de mycorhization par la Gridline Intersect
Method (Giovannetti et Mosse, 1980), un minimum de 600 intersections sont
comptabilisées par échantillon.
5.1.2.2. Extraction des racines
Les fragments racinaires pré-broyées en fragments sont introduits dans un bol
en acier contenant de l’azote liquide et broyés à 6000 rpm pendant 20 secondes
dans un broyeur mécanique, cette opération est répétée trois fois, jusqu’à obtention
d’une fine poudre.
5.1.2.2.1. Pour l’analyse du métabolome
109
ANNEXES
La poudre de racines fraîches (150 mg) est extraite au méthanol pur dans un tube en
verre (1 ml) en subissant trois fois : une minute de sonication suivi d’une minute de
vortex. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 6 000 rpm durant 5
minutes à 20°C, le surnageant est ramené à sec sous un flux d’azote à 30°C et
conservé à -80°C.
5.1.2.2.2. Pour l’analyse transcriptomique
La poudre de racines fraîches (7 g) est extraite au méthanol pur (47 ml) dans
une ampoule à décanter subissant trois fois : une minute de sonication suivie d’une
minute d’agitation. Les débris cellulaires sont éliminés par filtration sur papier
(Wattman qualitatif N°1), le filtrat est ramené à sec avec un évaporateur rotatif, à 30
C° puis conservé à -80 C°.
5.1.2.3. Extraction de Rhizophagus irregularis
Environ 100 000 spores de Rhizophagus irregularis (DAOM 197198) non
germées ou germées (avec ou sans une strigolactone synthétique (GR 24) à 5.10-
8M) sont broyées dans l’azote liquide avec un mortier et un pilon, puis extraites avec
1 ml de méthanol pur, en réalisant trois fois : une minute de sonication suivie d’une
minute de vortex. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 6 000 rpm
durant 5 minutes, le surnageant est ramené à sec sous un flux d’azote à 30 C° et
conservé à -80 C°.
5.1.3. Analyse par LC-MS
5.1.3.1. Reprise des échantillons
110
ANNEXES
Les échantillons d’extraits racinaires (issus de 150mg de racines) et les
extraits de spores (issus de 100 000 spores) sont repris dans 100 μl d’eau / méthanol
(80 / 20).
5.1.3.2. Analyse par UPLC-Q-TOF (Waters)
Les analyses en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
ont été accomplies sur un système Waters AcquityTM Ultra Performance Liquide
Chromatographie (Waters Corporation, Milford, USA) équipé d’une pompe binaire,
d’un dégazeur en ligne, un injecteur automatique réfrigéré. Une colonne UPLC BEH
C18 (2,1 x 150 mm, 1,7 µm) a été utilisée pour la séparation des composés avec une
température de 40C°. Un gradient d’élution binaire est constitué de l’éluant A (eau et
0,05% d’acide formique), et de l’éluant B (acétonitrile et 0,05% acide formique), dans
des proportions : 0 à 0,5 min, B 5% ; 0,5 à 11 min, B 5-50% ; 11 à 15min, B 50-
100% ; 15 à 16 min, B 100%. L’injecteur automatique est conditionné à 5 C°, le
volume d’injection est de 10 μl, en mode « partial loop » et le débit est fixé à 400
µl.min-1. Le spectromètre de masse utilisé est un Q-TOF Premier (Waters, Co., UK)
équipé d’un Lock Spray et du logiciel d’exploitation MassLynx. Le voltage du
capillaire est réglé sur 3 kV et le voltage du cône sur 30 V. La température de la
source est paramétrée sur 100C° et la température de dé-solvatation sur 350C°.
L’azote et l’argon sont respectivement utilisés comme gaz pour le cône et la cellule
de collision. Au niveau du cône et pour la dé-solvatation, les débits de gaz sont de 60
et 600 L.h-1, respectivement. Les données de spectrométrie de masse sont acquises
en mode full scan avec une gamme de masse de 100 à 1000 m/z et 100 à 1500 m/z.
La leucine enképhaline est utilisée comme calibrant interne, infusée par la Lock
Spray. La vitesse de scan est de 0,4 secondes, avec un interscan à 0,05 secondes,
un spectre de leucine enképhaline est enregistré toutes les 10 secondes.
Les acquisitions en mode SIM ont été réalisées avec les mêmes paramètres,
hormis que le quadripôle a servi à sélectionner les ions de m/z souhaités. De même
les paramètres de la cellule linéaire en amont du tube à temps de vol sont redéfinis
automatiquement par l’appareil en fonction de la m/z de l’ion sélectionné en mode
« full enhanced ».
111
ANNEXES
5.1.3.3. Analyse par UHPLC-Q-TOF (Bruker Daltonics)
Les analyses ont été accomplies sur une chaîne UHPLC Ultimate 3000
(Dionex), équipée d’une pompe quaternaire, d’un dégazeur en ligne, un injecteur
automatique réfrigéré, l’ensemble piloté par Chromaléon (Dionex). Tous les
paramètres chromatographiques sont identiques à ceux appliqués précédemment
pour l’UPLC Waters. Le spectromètre de masse utilisé est un Q-TOF Maxis (Bruker
Daltonics). Le voltage du capillaire est réglé sur 4,5 kV, le « Set End plate Offset » à
-500V, le «Nebulizer » à 40,6 psi, le « Dry Heater » à 190°C et le « Gas Dry » à 12
l/min. Les données sont acquises en mode full scan avec une gamme de masse de
100 à 1000 m/z et 500 à 3000 m/z. Le méthyl-stéarate est utilisé comme calibrant
interne. La vitesse de scan est d’une seconde avec un délai interscan à 0,05
seconde. Les données sont exportées par Compass dans le format netCDF puis
retransformées par X-Bridges (Waters) au format de MarkerLynx pour permettre le
retraitement des données.
5.1.3.4. Génération de formules brutes
Les formules brutes sont générées grâce au logiciel SmartFormula3D. Les
différentes contraintes imposées sont la précision de masse de 2 ppm et la
composition atomique réduite aux éléments suivants : C, H, O, N, P, S, I, Cl, Na, et
K.
5.1.4. Traitements des données (métabolomique différentielle)
Le traitement des données LC-MS est réalisé grâce au logiciel MarkerLynx
(Waters), sur une gamme de masse de 100 à 1000 m/z, de 0 à 15 minutes et une
précision de masse définie à 0,05 Da. La résolution des pics chromatographiques (à
5%) est définie par le logiciel, ainsi que l’estimation du bruit de fond. Les
chromatogrammes ne sont pas réalignés en fonction de l’injection d’un standard et
112
ANNEXES
ne subissent aucun lissage. La détection des pics chromatographiques s’effectue
avec une valeur seuil d’intensité, fixée à trois fois le bruit de fond et d’une intensité
spectrale de 100 coups pour les analyses sur le Q-TOF Premier (Waters) et 1000
coups pour les analyses sur le Q-TOF Maxis (Bruker Daltonics).
5.1.5. Constitution des fractions par HPLC préparative
Les extraits, obtenus à partir de 7g de racines fraîches broyées et extraites au
méthanol pur, sont repris dans 1 ml d’un mélange eau/acétonitrile (95/5) et 5% de
diméthylsulfoxyde (DMSO). Les extraits de trois échantillons « mycorhizées » ou
« non mycorhizées » sont fractionnés sur un système d’auto purification HPLC / MS
(Waters) composé d’un injecteur 2767, d’une pompe binaire 2545, d’un détecteur par
photodiodes 2998 et d’un spectromètre de masse (3100 Mass Detector), le tout
piloté par les logiciels MassLynx et FractionLynx (Waters). Pour chaque échantillon,
le millilitre est injecté sur une colonne XBridge C18 OBD (10µm, 50 x 150 mm)
(waters), avec un débit de 17 ml.min-1 et un gradient d’élution constitué de l’éluant A
(eau et 0,05% d’acide formique), et de l’éluant B (acétonitrile et 0,05% acide
formique), avec le programme suivant : 0 à 2 min, B 0% ; 2 à 15 min, B 0-50% ; 15 à
20min, B 50-100% ; 20 à 22 min, B 100%. Les fractions sont récoltées toutes les 2
minutes, à partir de la deuxième minute, regroupées par condition pour être séchées
à l’évaporateur rotatif à 30°C.
5.1.6. Stimulation des spores pré germées de Rhizophagus irregularis
5.1.6.1. Par les fractions issus des extraits racinaires
Toutes les fractions sont reprises dans un volume de 700µl dans des
proportions eau / acétonitrile (95/5). Dans chaque boîte de Pétri ronde (35Ø x 10
mm), 20 000 spores de Rhizophagus irregulare (DAOM 197198) (Agronutrition) sont
113
ANNEXES
introduites avec 10 ml de milieu M et pré-germées deux jours à l’obscurité sous
atmosphère à 2% de CO2 et à 30°C. A 48 h les spores sont induites par 100 µl de
chaque fraction HPLC, pendant 24 h ou 7 jours. Trois réplicas biologiques sont
effectués par fraction HPLC et par temps d’induction.
5.1.6.2. Par la propionyl-carnitine
De la même façon que pour les fractions HPLC, 100 μl d’une solution de
propionyl-carnitine (Sigma-Aldrich) dissoute dans l’eau, à des concentrations finales
de 10-9, 10-7 et 10-5 M, a été ajouté aux spores pré-germées pour une induction de 24
h, 48 h et 7 jours. Trois répétitions biologiques sont réalisées pour chaque test.
5.1.7. Analyse transcriptomique
Les gènes ciblés ont été choisis à partir de données globales d’expression
géniques, réalisées par le consortium Glomus (http://mycor.nancy.inra.fr/IMGC/), sur
des hyphes extra-racinaires et intra racinaires, ainsi que sur des spores de
Rhizophagus irregularis. Un groupe de 91 gènes a été sélectionné en fonction de
leur niveau d’expression, leurs amorces PCR ont été définies à l’aide du logiciel
Primers 3, afin que les produits de PCR soient compris entre 90 et 110 bp avec un
Tm entre 58 et 62°C. La qualité des amorces et leur spécificité ont été testées et
validées par qPCR avec des cDNAs de M. truncatula colonisé par Rhizophagus
irregulare (culture de 7 semaines et un taux de mycorhization de 70%) et avec des
cDNAs de spores de Rhizophagus irregulare après 6 jours de germination à 30°C,
2% CO2 dans du milieu M. Les spores de Rhizophagus irregulare mises en présence
des fractions HPLC ont été filtrées et plongées dans l’azote liquide, les temps
d’induction 24 h et 7 jours ont été regroupés. Chaque échantillon a été broyé à froid
avec le Lysing Matrix A (MP Biomedical), par agitation. Les ARNs ont été extraits
avec le RNeasy plant mini kit (Qiagen) suivant les recommandations du fabricant
puis quantifiés par Nanodrop®, la qualité des extractions d’ARN a été vérifiée par
Agilent®. La Réverse transcription a été réalisée avec le Verso cDNA kit (Thermo
114
ANNEXES
Science) en utilisant 1μg d’ARN. Les ADNc obtenus ont été dilués à 5 ng/µl et leur
qualité a été vérifiée par PCR.
La mesure de l’expression des 96 gènes de spores de Rhizophagus irregularis
en germination et stimulés par les fractions HPLC a été réalisée par le système
Biomark II (Fluidigm) selon le protocole de la Plateforme Génomique de Toulouse.
La quantification relative du niveau d’expression de chaque gène a été réalisée selon
la méthode des ΔΔCt. Les différences d’expressions géniques entre fraction
mycorhizées et non mycorhizées ont été validés par un t-test (p<0,05), la robustesse
des répétitions biologiques a été évalué par la méthode du jackknife.
115
ANNEXES
5.2. Liste des gènes utilisés pour l’analyse transcriptomique
Gene id Gene list
A sso ciated metabo lism
R atio infected ro o t
M edicago / spo res
P utat ive funct io n e-value P rimer fo rward P rimer reverse
remain_c782 Gene_1Cell cycle
related protein27,23
Centromere-associated protein NUF2
3,E-33CGGATGCAACACTATTCGAC
CAGAGTGGAGTGGACCGATAA
step3_c2733 Gene_2 Other 0,00
Uncharacterized methyltransferase C1B3.06c OS=Schizosaccharomyces
pombe
4,E-06CGAACGATATAAATGATGTTGATAGG
ATCATCTTCAATCGGGGAAG
remain_c6205 Gene_3Energy
production and conversion
0,24NADH-cytochrome b5 reductase-like protein
OS=Arabidopsis thaliana 5,E-05
GCCGGTGGAGGTACAGAATA TTATCAAAACCACCGCCAAT
step3_c687 Gene_4 Other 0,02Leucine-rich repeat-containing
protein DDB0188916 OS=Dictyostelium disco ideum
3,E-09ACGGCAAAGACTTGACTGTTGA
GTTTTACTTGCCCGGTAGCA
step3_c664 Gene_5Amino acid
transport and metabolism
3,38Phosphoadenosine
phosphosulfate reductase OS=Emericella nidulans
6,E-65TTTAGCCCATTGGGATTTTG GCCAATCACCAACTGAACG
remain_c10423 Gene_6 Other 0,05Extended-synaptotagmin-1
OS=Homo sapiens 1,E-12
ACGTAAGGGTCGCTTTTACCG CATCATAACATCATGACTAAAGGAA
step3_rep_c943 Gene_7Transcription/t
ranslation1,32
Eukaryotic translation initiation factor 3 135 kDa subunit
OS=Schizosaccharomyces 1,E-40
AAGAGGCCATCGAGAACTTG AACATTTTGCTGTTGCTGGA
remain_c6389 Gene_8Lipid transport
and metabolism
3,12HM DH_PHYBL 3-hydroxy-3-
methylglutaryl-coenzyme A reductase (HM G-CoA
e-114ACCCAAAAACTCCTGGAACAA CAAATGACCCGCAGCTAAAG
emain_c2692 Gene_9 Other 0,00Uncharacterized
glycosyltransferase HI1696 OS=Haemophilus influenzae
6,E-06ATAGACGATGGGGATGTTCG CAATTTGGATGATGGGTCCT
remain_c9455 Gene_10Carbohydrate transport and metabolism
3,97Alpha-amylase 1 OS=Lipomyces
kononenkoae 9,E-26
GGAGTAGAACAAGATTTCACAGG TTGGAGTTGTTTGAGAGTATGATG
remain_c5699 Gene_11 Other 5,36Lysophosphatidylcholine acyltransferase OS=M us
musculus 4,E-38
CCATTAGCGTCATAACCATTGAG AGGAAAATTCTCCTTTACGAAGTATC
remain_c5098 Gene_12Signal
transduction mechanisms
0,46Cutinase gene palindrome-
binding protein [Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP]
4,E-47CGGCAGTGTCAGTACAGTTAACAC TCATGAAGTAGATTTTTCCACAGAA
step3_rep_c608 Gene_13Carbohydrate transport and metabolism
0,41
Regulation of carbohydrate metabolism-related protein
[Cryptococcusneoformans var. neoformans JEC21]
2,E-21GCATATTGAAGACCCGGTATAA ATCAACCACCACAATTTGTCA
remain_c3445 Gene_14 Other 0,39Uncharacterized high-glucose-
regulated protein3,E-06
TCTGTGTCCACGAAAATCTCC TCCAATTTCCCACCCATGTA
step3_c486 Gene_15 Other 0,27Uncharacterized high-glucose-
regulated protein 2,E-08
CGCTCACGATTATTCATCCA GTGGAGTTGGAGGAGGTCGT
remain_c5312 Gene_16Carbohydrate transport and metabolism
0,25Permease of the major facilitator superfamily
8,E-08TGCTGCTCCTACTCCTAATGG
TGATCATCTTTGTCTTCCTTCTTC
remain_c7013 Gene_17 Growth 0,00 chitin synthaseGCTGTCGAAGGTCTTTGGAG CATCTTGCGCTTTTTGGTTT
remain_c5026 Gene_18Carbohydrate transport and metabolism
27,43High affinity nitrate transporter
NrtB9,E-33
CCACTAAGGCCAACTGGAATAG TTTTTCGTACACTTATTGGACCAT
remain_c25428 Gene_19Signal
transduction mechanisms
19,95Serine/threonine-protein kinase
pk61c 3,E-08
GACCAGAAATTATAGAAGGCACAGA TGATAATTCTTTCGCAGTTGGT
step3_c2425 Gene_20Carbohydrate transport and metabolism
15,44Glycogen [starch] synthase
OS=Neurospora crassa 9,E-29
CCTTTGGCCTACAAGACTGC ACATCCATTTGACCCCTTGA
remain_c12627 Gene_21Inorganic ion transport and metabolism
4,36Ammonium transporter 1
OS=Schizosaccharomyces pombe
2,E-28CATGGAGGTGCAATAGATGG
TGCAGAAATACAAAAGGAATATGT
remain_c11853 Gene_22 Other 3,57Ankyrin repeat protein nuc-2
OS=Neurospora crassa 3,E-10
TGTCCAATCGTTACGGCATA CGGTCATAGTGAGGCAGCTA
116
ANNEXES
remain_c2226 Gene_23Carbohydrate transport and metabolism
2,33Galactose oxidase OS=Gibberella zeae
4,E-09GAAGAGACCGGATGGTGCTA ATGATCCTGCCGAACAAAAC
remain_c13673 Gene_24 Growth 1,13Extracellular protein SEL-1 and
related proteins6,E-08
TGTTCTGTTTCTTCTCCATCATTG GAAATTGTTTTCAAGAGCGTCA
step3_c1607 Gene_25 Other 0,27 STE3, Pheromone A receptor.. 2,E-06GCTTGGTCCTTTTCTGTGTAA AGGGACGAAACCTTCCAAAA
step3_c3477 Gene_26Carbohydrate transport and metabolism
0,25 Aquaporin 4,E-06CGCTTTAATGGCTACGAACC
CAAGTCAATGAGCCATGATCC
step3_c2660 Gene_27 Other 0,20Protein FUN34 [Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239]
2,E-28TGGAGTTATCGCTGCTTTTTG TCGGCCAAGTTTTTAAAGTGA
step3_c1192 Gene_28 protein
turnover, chaperones
0,20Alkyl hydroperoxide reductase/
Thio l specific antioxidant/ M alallergen
2,E-27AACGTGGATTACGTTTTTCGAT
GTAACTGGTTGGACCTGGTTCTTC
remain_c1497 Gene_29Carbohydrate transport and metabolism
0,00 GDP-D-mannose-3,5-
epimerase [M alpighia glabra]2,E-16
TGATTGCATTGAAACTTGAAGAA CAGCAAATATGGGAGGTGTC
step3_c1274 Gene_30 Growth 0,37 chitin synthaseATACTTGCCATGCCTGCTTT
TTTCTCTTCATCCGCCACTAC
remain_c17373 Gene_31 Other 1,46Cytoplasmic dynein 1 heavy chain 1 OS=M us musculus
5,E-19GCTGAATGGTTAACAGAAGCTG TGTGATGCATATTTTTCAATCC
remain_c14551 Gene_32Lipid transport
and metabolism
77,06Elongation of fatty acids protein
3 OS=Saccharomyces cerevisiae
2,E-12TAACCCCAATAACCGAGAGC GTTTCGTATCTCCGCTCGTT
remain_c27546 Gene_33Lipid transport
and metabolism
26,39Vacuolar endopolyphosphatase,
putative [Neosartorya fischeri NRRL181]
2,E-22TTTGTGATTCTCCGGTTGGT
GCCTAGAGTTATCACCAGTCCAT
remain_c8626 Gene_34Lipid transport
and metabolism
15,37Acetyl-CoA acetyltransferase
OS=Schizosaccharomyces pombe
e-142ATGGGTATGGCAGCTGAAGA CCTGTTGTGCACGTTGATAAG
remain_c25442 Gene_35Lipid transport
and metabolism
3,66Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 5 OS=Homo sapiens
2,E-17TGATTCTGAAGGGTGGCTTC
ATTCCGCCGCTTTTTGTC
step3_rep_c1221
Gene_36 Growth 3,17 chitin synthaseTTGGCTTTCCCATTGTTTTC
ACCTTTTTCACCCAGAACGA
remain_c904 Gene_37Lipid transport
and metabolism
1,31Polyunsaturated fatty acid
elongation enzyme [M ortierella alpina]
2,E-34TTTTCTTGGTCTCTTTGAGTTCAT
CCTTCTTCTGATCTTACTTCAGGATT
step3_rep_c394 Gene_38Lipid transport
and metabolism
1,31Enoyl reductase C646.07c
OS=Schizosaccharomyces pombe
8,E-75TAGAAATTTGTGCCCAAGCA GTATGGTCCCTGGAATGCTG
remain_c825 Gene_39Lipid transport
and metabolism
1,64Long-chain acyl-CoA
synthetases (AM P-forming) 1,E-06
GGTTCTGCCCCTTTAGATCC TTGCAACACCTTCAGTCTGC
step3_c1014 Gene_40Lipid transport
and metabolism
0,07Lipase OS=Thermomyces
lanuginosus 3,E-05
TCCGCTCGCATAATAAGAAAA AATGATCAGGAGGATCAGGAGA
remain_c12085 Gene_41 Other 13,60Stero idogenic acute regulatory protein, mitochondrial OS=Bos
taurus4,E-05
GGCAGATCAGCAACGGAATA TTTCTCTCCTGTGGTTTTGC
remain_c6920 Gene_42Signal
transduction mechanisms
1,08Oxystero l-binding protein-like
protein 1 OS=Schizosaccharomyces
2,E-15ACTGGAAGTTGGAGAGGTCAA
TTTACTTGCTTTGGAACAGCTTC
step3_c1211 Gene_43Lipid transport
and metabolism
0,58Hormone-sensitive lipase
OS=Spermophilus tridecemlineatus
7,E-12GACGAATCGACATTGCAGTC CTGAACCACTTTCCCGACTT
remain_c12136 Gene_44Lipid transport
and metabolism
0,52Oxystero l-binding protein-related
protein 3 OS=Homo sapiens 1,E-26
AGAATGGCAGAAGAGCTGGA TCCTGAAACTGCAAATGCTGA
remain_c9083 Gene_45 Other 70,91DASH complex subunit dad1 OS=Schizosaccharomyces
pombe 5,E-09
GAATCTGGTGCTAAAATCCGTA GGTTTTAGCAGCTTCACATTGTT
step3_rep_c2948 Gene_46Transcription/t
ranslation1,29
Ras-like protein Ras1 [Ustilago maydis]
2,E-37TTAAAACCTTGCATTTTTCCTTT
AAAAACCAAGATGCATAATCCTAT
remain_c12512 Gene_47Signal
transduction mechanisms
0,60M AP kinase kinase kinase wis4
OS=Schizosaccharomyces pombe GN=wis4 PE=2 SV=1
3,E-27TGACAGCCATAAGATCTCCAGT
GATGGCAACAAGGCAAATTTATAG
remain_c3147 Gene_48 Other 0,50Kinesin heavy chain
OS=Syncephalastrum racemosum
2,E-23ATATCGCGTGAGATGGCTTT
AGGAGGAGGAGCATTAATTGG
step3_c1457 Gene_49 Growth 14,39 chitin synthaseTTAAATGAACTGCGCCTGAA GGAAGATTGGGAACGAACAA
117
ANNEXES
step3_rep_c3002 Gene_50Energy
production and conversion
3,52Chitoo ligosaccharide
deacetylase OS=Rhizobium leguminosarum bv. viciae
4,E-07TTTAGGCACAGCCGTAAAGG GCATGCGTATTTGAATGGAG
remain_c3586 Gene_51 Growth 2,94Chitin synthase 1
OS=Phycomyces blakesleeanus 4,E-43
GGTGGTAATGGAGCTCAACC AGCGTTGATGTCTTGTCTTTCA
remain_c28302 Gene_52 Growth 2,23Chitin synthase [Gigaspora
margarita]1,E-35
GGTAAACCTGTTACGGGTCAT TGGAATTGATCTATCGGAACC
step3_c1457 Gene_53 Growth 1,46Chitin synthase 1
OS=Cryptococcus neoformans var. grubii
e-138GTTGGGAAGATTGGGAACGA TTAAATGAACTGCGCCTGAA
step3_c2624 Gene_54 Growth 1,32Chitin synthase export
chaperone OS=Fusarium oxysporum
3,E-80ATGGTTTCGTCGGATTCCA
TCAAGAAGAAAACTGCAACGA
remain_c1562 Gene_55 Growth 1,07CHS1_PHYBL Chitin synthase 1 (Chitin-UDP acetyl-glucosaminyl
transferase 1)2,E-38
TTGGATCCTTTCTAATGCTGCT CTGTTGCTACGTCGTTCTTCC
step3_rep_c2866 Gene_56 Growth 0,55Chitin syntase 2 [M alassezia
pachydermatis]1,E-13
TTTCAACCCACTCAATCACCT CGATGCAGGTGCGATTTT
step3_c1107 Gene_57 Growth 0,41Chitin deacetylase OS=M ucor
rouxii 5,E-19
ACATCCTGTACCGCAATGGT GAGCGACAGGAGGCAATC
default_c2512 Gene_58 Other 28,28Endopolyphosphatase
OS=Schizosaccharomyces pombe
5,E-07CGAATACCCAACATGGGATG
CCCATAAGGCGCTATTAAGTTC
step3_c3531 Gene_59 Growth 2,81 chitin synthaseGCGAAACCAGAAAAGTCGAG GATACGAGCACGTTCCCAAT
remain_c5050 Gene_60 Growth 1,69 chitin synthaseACGCGGATTTTTCACATCAC CCGTACACACCTCCATTTCC
remain_c4281 Gene_61Inorganic ion transport and metabolism
1,52Nitrogen regulatory protein NUT1
OS=M agnaporthe grisea 5,E-07
AACACCCTTATGGCGAAAGA GCATAGCGATAGGACGGTCT
remain_c4899 Gene_62Inorganic ion transport and metabolism
0,85 nitrite reductase (NAD(P)H) large subunit [P lanctomyces
maris DSM 8797]3,E-23
CCAATTTACAAGACACGAATGA TGATTTCACCTCCAGGTACTCTA
remain_c4779 Gene_63Inorganic ion transport and metabolism
0,55Inorganic phosphate transporter
PHO84 OS=Saccharomyces cerevisiae
3,E-52TACTTGGTTTGGGAGCCGTA
GACGCTTTCATTAGATTTCTTTCA
step3_c2831 Gene_64Inorganic ion transport and metabolism
0,31Inorganic phosphate transporter
PHO84 OS=Saccharomyces cerevisiae
8,E-34TGCAACAGTGGCTTCAGCA
CACCAATACCGATACCCATGAT
remain_c1795 Gene_65 Other 0,61Glucose-repressible protein and
related proteins [General function prediction only].
1,E-06ATTGATCAGCTTGGTGCATT
CAGTCCGGGTGTTTGTTCTAA
remain_c2198 Gene_68Transcription/t
ranslation16,97
DNA binding /transcription factor [Arabidopsis thaliana]
3,E-08CCAAAACAGGTCAACCTCAAA
TCAGTTTAACAAAAATGTTACAGACA
remain_c6073 Gene_69 Other 7,67E1_DerP2_DerF2, M L domain. M L domain - M D-2-related lipid
recognition domain.
pfam02221
CCAGTTGTCACAGGCCAAA TTCGTCCTTAAAATATGCCGTA
step3_c1270 Gene_70Lipid transport
and metabolism
0,22Lipase [Rhizopus microsporus
var. chinensis]5,E-24
CTTATGAACATCCTAGCGGTGA TTGGATCTTCTGGACCCTTG
remain_c3360 Gene_71Lipid transport
and metabolism
1,65Putative elongation of fatty
acids protein 1 OS=Schizosaccharomyces
8,E-14CATCGCGTTGGGATTATTCT
AAACACCCACGACAAACTGC
remain_c4549 Gene_72 Growth 1,00 CHS1_PHYBL Chitin synthase 1 e-112ACGTAGTATGCATAGTGTCCGATG CACCATCTTGATAAACGCCAATAG
step3_rep_c759 Gene_73 Growth 0,52Chitin deacetylase
[Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21]
1,E-49TTAATGCCCAGTTACCAGGAA TAGGAGCTTTCGGAACTTGTG
step3_c3245 Gene_74 Growth 0,49Chitin deacetylase [Rhizopus
sto lonifer]1,E-08
CCTGCTACTACCGGTCATATTTC CCAGCTTTTGTAACGATTGG
remain_c5937 Gene_75 Growth 0,44Chitin synthase/hyaluronan
synthase (glycosyltransferases)7,E-06
GCCCTAACAACAAAAATACGC GCATACCATTGAATTCGTCCAT
step3_c1699 Gene_76Secondary metabolites
biosynthesis, 1,95
Iron/ascorbate family oxidoreductases.
4,E-67GAGGAGTCTTTTTGGGTTATGAG
TTCACCGCAGCTAACACCTA
step3_c860 Gene_77Signal
transduction mechanisms
1,317tm_7, 7tm Chemosensory
receptor. 4,E-05
TCCTCCAAATGAACTCCCTTCT AACCATGAAAATGCTGCGTA
remain_c2490 Gene_78Posttranslatio
nal modification,
0,57Heat shock 70 kDa protein 12A
OS=M us musculus 1,E-23
CCTGGCCAAGTATGGTTTGT TGCTTTAGATTTCGGGACGA
118
ANNEXES
remain_c3520 Gene_79 Other 0,49Uncharacterized high-glucose-
regulated protein [General function prediction only].
9,E-32ACCAACAAGTCCAGGTGTGG CCACTTCCACCGTTCAAATTA
step3_c3430 Gene_80Posttranslatio
nal modification,
0,21Heat shock 70 kDa protein 12A
OS=M us musculus 9,E-09
AAATCATTTGTTGCGGTTGC TTTTATTGGGATGACGCTCAC
remain_c2942 Gene_81Posttranslatio
nal modification,
0,14Heat shock 70 kDa protein 12A
OS=M us musculus 1,E-09
AAATATCTCAACTCTGAGTCAACCTG CATCAAGCTTTTTGACTGTTGTAAA
step3_c3021 Gene_82Posttranslatio
nal modification,
0,09Heat shock 70 kDa protein 12A
OS=M us musculus 2,E-06
AAGCACTTATGAGCCCGATG GACATAATTAATGAACGATTTGTCA
step3_c509 Gene_83Posttranslatio
nal modification,
0,11Heat shock 70 kDa protein 12A
OS=M us musculus 2,E-13
CCAAGAATATTTACGCCAGGA TGAATCACAAAAATCTGCATCC
remain_c3702 Gene_85Transcription/t
ranslation0,02
Putative transferase caf17, mitochondrial OS=Aspergillus
niger 5,E-20
CATTATGCGACGAGAAACCA AATTGTACTAGATGTTCACCACAAGC
remain_c4572 Gene_86Posttranslatio
nal modification,
0,02Putative chaperone protein
[Lyngbya sp. PCC 8106]3,E-23
CAGGTTCATCACAGAACTTTGC CACTGTTGATCATCTTCATCCTC
step3_c1352 Gene_87Posttranslatio
nal modification,
0,01Heat shock 70 kDa protein 12B
OS=Homo sapiens 6,E-11
ACATTCCCACCCTCCCAAAT GAAAATTTCAATTAGAATTGCCAGA
remain_c13348 Gene_88 Other 0,00Sacsin OS=Homo sapiens
GN=SACS 8,E-32
TTTGAAGGATTGGCAAGGAC TCTTCTTGTTTTCCGCCAAC
remain_c14530 Gene_89 Other 0,00Hypothetical protein
DDBDRAFT_0184339 [Dictyostelium disco ideumAX4]
2,E-11CTCCAGGAATGAGCGATACG
AATGACGGCAGTTAATGATCC
remain_c19940 Gene_90Secondary metabolites
biosynthesis, 10426,85
Cytochrome P450 CYP4/CYP19/CYP26
subfamilies 2,E-10
CTTCCTGGACATAATCTTAATCCTT TAATCCTGATGGATGGATGGA
remain_c15064 Gene_91Lipid transport
and metabolism
4,24Acyl-CoA oxidase [Lipid
transport and metabolism].1,E-10
CGTGGATTAGAAACAACTGCAA CCCATTCCAATCCATATTTTTG
step3_c2923 Gene_92Lipid transport
and metabolism
0,01Peroxisomal acyl-coenzyme A
oxidase 1 OS=Bos taurus 3,E-13
TCCTTCAAATTTGGCTCAAGA CAATTTTGATCTATTAATTCCTTTCAA
remain_c1512 Gene_93 Other 42,82Arylester hydro lase
[Agrobacterium tumefaciens str. C58]
7,E-11TGGGATCCACAATGGTTTG
GTTATCGGGTTTATCGCTCCT
remain_c1512 Gene_94Lipid transport
and metabolism
1,76Acetyl-CoA acetyltransferase,
mitochondrial OS=M us musculus
2,E-74TCCATCACAAGCACTTCCAG GCACGAGCTACGACACTGAA
remain_c825 Gene_95Lipid transport
and metabolism
1,81Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1 [Pyrenophora tritici-
repentisPt-1C-BFP]1,E-34
TTTGGGACCAGAAACTGTGG ACCTTCGGAGCCAATTGAA
remain_c25442 Gene_96Lipid transport
and metabolism
3,66Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 5 OS=Homo sapiens
2,E-19TGAGGAGAAAGGTTACACTGTTGA
GCTGTTTGCTCTGGACGTTT
step3_c2354 Noc4 OtherNucleolar complex protein 4 homolog OS=Gallus gallus
3,E-31CATTGCTTTTCATGGGATCTG
GAGCATGTTAACAAATTGGGAAG
step3_c1641 Tubulin GrowthTubulin, alpha, ubiquitous
[Batrachochytrium dendrobatidis JAM 81]
e-114TGCCACCATCAAGACCAAA
AAGATCACCACCAGGGACAA
step3_rep_c11 ATP synthase
Energy production and
conversion
ATP synthase subunit beta [Coprinopsis cinerea okayama]
e-100TGGGTGGTATGCAGGAAAGAAT TGGATCAGTCAAATCGTCAGCC
119
ANNEXES
5.3. Données des analyses métabolomiques
Tableau des métabolites criblés comme étant au moins dix fois plus concentrés dans
les racines mycorhizées (M) par rapport aux racines non mycorhizées (NM).
Lorsqu’un ion n’est pas détecté une valeur par défaut lui est attribuée, elle est égale
à 0,1 pour les acquisitions effectuées sur le Q-TOF Premier et de 5 pour le Q-TOF
Maxis. Les formules brutes générées par SmartFormula3D sont en gras si une seule
composition atomique est proposée ou si le score de la première proposition est 10
fois supérieur à celle du second rang, dans le cas contraire la formule est en italique.
métabolite Rt
(min)ion détecté (H+) (m/z)
S/N (rms)
aire M
aire NM
ratio (M/NM)
S/N (rms)
aire M
aire NM
ratio (M/NM)
aire M
aire NM
ratio (M/NM) Formule brute fraction
(HPLC )
1 0,67 426,0928 380 7,6 0,1 76 3403 36 1,0 36 12 0,83 397,1241 41 1,6 0,1 16 196,0 5,0 39 23 0,85 265,0835 132 6,5 0,1 65 1121 31 2,5 12 2
752,2221 144 4,8 0,1 48 541 7 0,1 70388,1361 280 13,2 0,1 132
5 1,05 218,1385 1636 84,5 0,1 845 3133,3 5,0 627 C10H20NO4 1345,1445 291 20,6 0,1 206 703,6 5,0 141 C18H21N2O5182,0811 655 23,4 0,1 234 182,1 4,5 40 C9H12NO3
7 1,90 232,1543 372 17,5 0,1 175 261 64 0,1 640 C11H22NO4 18 3,17 984,3148 282 4,6 0,1 46 2562 26 0,1 260 2
1275,45695 638,2324 318,9 5,0 64849,3021 214 3,6 0,1 36 1692 28 0,5 61
843,33075 422,1693
(H2+) 472,6 5,0 95805,3850 1090,8 5,0 218736,3286 430,5 5,0 86447,1124 139 8,1 0,1 81 881 47 1,8 27441,1518 498 29,5 0,1 295 921,5 16,8 55425,1769 450 16,4 0,2 85 5423 149 4,0 37403,1960 781 21,5 1,1 20 2739,8 71,5 38 C19H31O9241,1434 1774 65,2 2,1 31 9406,5 278,1 34 C13H21O4223,1327 1693 52,9 1,2 45 1726,3 5,0 345 C13H19O3221,0751 590,1 5,0 118205,1240 89 11,8 0,1 118195,1379 1251 48,8 2,4 20 1013,5 5,0 203 C12H19O2159,1173 98 13,8 0,1 138
10 3,42555,22075
278,1143(H2+) 633,8 5,0 127
2
11 3,44
2259,09135 1130,0496
(H2+) 753,6917
(H3+) 589,6 5,0 118
2
Pseudo-SIM
0,99
1,59
3,25
4
6
9
Q-TOF Maxis (Bruker)
full scan
Q-TOF Premier (Waters)
full scan
1
2
2
120
ANNEXES
813,39415 407,201 267,2 5,0 53683,2028 455,6 22,6 20 C 22H36N8O15P561,2176 302 9,8 0,1 98 2079 69 1,0 69517,3003 1307,8 5,0 262 C26H45O10507,1705 332,5 5,0 67259,1545 575,1 5,0 115 C13H23O5241,1434 895 36,7 0,1 367 2782,5 5,0 556 C13H21O4223,1327 1406 43,3 0,1 433 1741,4 5,0 348 C13H19O3195,1380 540 22,7 0,1 227 452,0 5,0 90 C12H19O2167,0713 176 8,4 0,1 84
13 3,49 269,1375 70 3,5 0,1 35 618 26 0,1 260 2
14 3,52733,23635 367,1221
(H2+) 561,4 5,0 1122
225,1507 256 6,2 0,1 62161,1339 234 13,7 0,1 137492,2133 246,6099
154 7,7 0,1 77 1286 36 1,1 32349,6 5,0 70 3
446,20635 223,6071 416,0 5,0 83
3
17 3,76 458,2292 195 11,3 0,1 113 318 3,79 710,3419 558,4 19,6 28 319 3,79 685,2701 405,9 5,0 81 3
1760,59055 880,7992
(H2+) 282,4 5,0 561326,46975
663,7388 (H2+) 249,4 5,0 50
363,15475 182,0813
(H2+) 377,8 5,0 76285,0770 189 10,9 0,1 109267,0659 141 10,0 0,1 100 989 45 4,0 11977,3861 191 3,2 0,1 32 340 15 0,1 150 344,1 5,0 69527,1520 132 6,7 0,1 67 358,1 5,0 72
511,1776 165 5,8 0,1 58 1279 48 0,1 480
489,1962 322 5,8 0,1 58 4593,0 5,0 919
453,1758 251 8,6 0,1 132
241,1434 1455 59,9 2,0 29 2604,4 82,2 32 C13H21O4237,1151 68 5,7 0,1 57
195,1383 621 29,1 0,5 5623 4,26 587,1936 83 3,4 0,1 33 599 15 0,1 150 1 et 2
1205,39335 603,2006 277,3 7,9 35
1119,39375 560,2008
(H2+) 491,8 5,0 98935,28355 468,1457
(H2+) 331,8 5,0 66855,2592 124 3,5 0,1 35 606 18 0,1 180
849,28435 425,1461
(H2+) 682,5 5,0 137609,18455 305,0962
(H2+) 305,3 5,0 61585,1466 280 14,1 0,1 141
579,17415 290,091
(H2+) 1629,5 5,0 326541,2279 2422,4 5,0 484 C26H37O12428,2124 232 8,8 0,1 88 1415 39 0,7 56271,1173 19 4,6 0,1 46 3375,9 5,0 675 C13H19O6253,1059 1181 80,4 0,1 804 7577,7 5,0 1516 C13H17O5225,1138 276 14,9 0,1 149 1881 52 0,5 104207,1023 368 22,6 0,1 226181,0766 217 48,3 3,3 15 591,5 5,0 118 C10H13O3
3,90
12
15
20
21
3,47
3,66
4,14
4,1922
24 4,30
1 et 2
1
16
2
3
3
4
3,70
121
ANNEXES
1077,48895 539,2484
(H2+) 388,8 5,0 78787,2771 452,1 5,0 90
771,3039 431,4 5,0 86
749,3220 263,6 5,0 53
459,2227 1573,9 146,7 11 C22H35O10
436,2128 752,4 102,1 7
420,2238 310 10,5 0,2 49 2517 64
413,1207 599 33,7 2,2 15 2036,5 112,6 18
397,1469 761 60,0 0,1 600 1450,4 106,3 14 C17H26NaO9
392,1915 557,2 46,2 12 C17H30NO9
375,1647 168 6,9 0,1 69 731,0 5,0 146 C17H27O9
357,1541 88 5,0 0,1 50 610,8 27,4 22 C17H25O8
271,1540 262,7 5,0 53 C14H23O5
253,1434 390 20,1 0,1 201 849,3 5,0 170 C14H21O4
235,1328 147 41,4 0,1 414 627,9 5,0 126 C14H19O3
211,1691 350 22,1 0,1 221 547,2 5,0 109 C13H23O247 6,19 577,2852 242,5 5,0 4848 6,19 547,1441 1389,8 94,6 15 C26H27O13 349 6,30 620,3661 120 3,4 0,1 34 938 14 0,5 27 5
617,3158 348,7 5,0 70455,2633 375,6 5,0 75 C24H39O8724,3763 187 3,6 0,1 36 1631 24 0,5 52652,3912 85 7,3 0,1 73 972 43 1,5 28612,3949 287,9 5,0 58 C29H58NO12499,1208 271 18,5 1,3 15 1841 75 6,9 11 1080,6 96,7 11483,1470 332 30,3 2,3 13 1886 122 9,0 14 925,1 93,4 10478,1914 134 4,4 0,1 70 1103 21 0,1 210 450,1 18,2 25
52 6,75713,31455 357,1612
(H2+) 393,0 5,0 794
541,2649 143 14,6 0,1 146 808 43 2,5 17 611,0 5,0 122 C28H37N4O7455,2651 191,7 5,0 38293,2111 335 28,1 0,1 281 428,0 34,1 13 C18H29O3275,2007 227 19,8 0,1 198 677 23209,1546 276 12,2 0,1 122 951 17
54 7,05 738,3904 47 6,2 0,1 62 1592 40 1,3 31 432,4 5,0 86 655 7,10 447,3117 183 3,5 0,1 35 704 7 0,1 70 556 7,13 620,3634 274 6,2 0,1 62 657 7,23 695,3069 122 12,3 0,1 123 2542 113 3,2 36 466,4 5,0 93 C39H43N4O 8 558 7,33 655,2960 208 6,1 0,1 48 2199 59 1,4 42 769,2 75,1 10 C32H47N4O14 6
602,3170 545,8 5,0 109 C30H44N5O8586,3231 248 7,8 0,1 78 2136 37 0,7 57
579,2198 143 10,4 0,1 104 2681 99 2,3 43 393,9 5,0 79579,21115
290,109 1000,7 5,0 200563,2462 486,7 5,0 97
541,2641 511 55,2 0,1 552 7666,1 27,8 275 C27H41O11523,2536 412 24,7 0,1 247 768,5 5,0 154
505,2418 414 22,9 0,1 229
487,2293 357 11,8 0,1 118
479,2637 143 5,7 0,1 57 701 9 0,1 89
461,2505 385 18,4 0,1 184
293,2110 1126 82,8 0,1 828 1505,8 5,0 299 C18H29O3275,2006 1086 82,3 0,1 823 443,5 5,0 89 C18H27O2257,1904 326 21,0 0,1 210
60 7,58 411,2525 277 15,9 0,1 159 2039 79 2,2 36 4 et 5623,3020 49 1,8 0,1 18 840 40 0,1 400
277,2145 893 15,9 0,1 159
259,2065 170 10,7 0,1 107601,3216 394,3 5,0 79583,2747 217 7,3 0,1 73 760 14 0,1 140 546,1 5,0 109 C29H43O12439,2689 608,4 5,0 122 C24H39O7
335,2224 202 12,9 0,1 129 955 27 0,1 270
275,2007 266 21,3 0,1 176 762,7 5,0 153
6,45
7,77
6,66
6,90
7,48
6,16
61
46
50
51
53
59
62
7,74
5
2 et 3
1 et 2
4
4 et 5
6 et 7
122
ANNEXES
741,2964 243 9,3 0,5 19 1268 36 0,1 360 1239,3 153,2 8 C35H42N8NaO9723,2863 193 6,1 0,4 15 1096 24 1,0 240459,2278 169 16,0 0,5 31211,1704 203 16,0 1,1 15
64 8,13 283,0963 455 37,9 0,1 379 2577 126 0,1 1260 372,1 5,0 74 C17H15O4 5725,26895 363,1384 221,7 5,0 44687,3219 707,7 5,4 132525,2691 832 48,4 0,4 133 1887,7 5,0 378 C27H41O10507,2595 225 9,2 0,1 152489,2525 148 8,8 0,1 88463,2713 157 4,8 0,1 48 474 8 0,1 80445,2591 335 10,0 0,1 100419,2276 224,8 5,0 45 C20H35O9277,2156 1122 78,1 0,1 781 C18H29O2259,2075 155 8,9 0,1 89644,3271 283,9 18,7 15621,2300 196 6,4 0,1 49 2703 44 0,1 440 211,9 9,1 23
605,2567 597 8,4 0,1 84 7756 133 7,0 19 580,8 16,2 36
583,2745 780 20,1 0,4 57 5675,6 205,7 28 C29H43O12335,2216 944 26,9 0,7 41 1340,6 59,7 22 C20H31O4311,1141 26 6,2 0,1 75 350,3 18,7 19275,2026 2236 #### 1,9 73 572,1 5,0 114 C18H27O2257,1908 532 24,8 0,6 39
586,3225 473,4 21,6 22570,3307 261 8,5 0,1 81 2114 49 1,2 41563,2271 282,1116
(H2+)
211 14,7 0,1 100 2617 133 4,5 30
523,1 20,8 25547,2514 599 32,1 0,8 38 763,7 40,4 19525,2692 829 58,3 1,6 36 9077,2 294,1 31 C27H41O10507,2595 394 18,2 0,3 73489,2484 283 21,4 0,4 50 741 29 1,0 31463,2705 315 11,9 0,1 123 288 17 0,8 22445,2602 738 26,5 0,6 42282,1116 523,1 20,8 25277,2161 2337 #### 8,4 20 1962,1 53,6 37 C18H29O2259,2067 450 26,7 0,1 267 154 76 1,0 76
68 9,24 837,3591 168 4,0 0,1 40 694 30 1,0 30 669 9,49 863,3696 290 10,0 0,1 100 1400 69 0,1 1380 437,8 5,0 88 770 9,95 275,2010 105 11,4 0,5 23 325 30 971 #### 587,2871 103 4,1 0,1 41 860 35 0,1 350 9
9,18
7,80
8,20
8,60
65
66
67
63 5
5
5
6
10,34
123
ANNEXES
5.4. Références bibliographiques
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Title: Development of an analytical strategy for the identification of key metabolites involved in mycorrhizal symbiosis between Medicago truncatula-Rhizophagus irregularis. Abstract: The arbuscular mycorrhizal (MA) symbiosis is a mutualist interaction between soil fungi (Glomeromycota) and roots of most plant species. During symbiosis AM fungi provide plants with minerals and water, and obtain in return photoassimilates to carry out its life cycle. If some symbiotic signals involved in the early stages of the AM symbiosis have been characterized in recent years, our knowledge is very limited on regulatory molecules exchanged between the symbiotic partners in planta. In this context, we have developed an analytical strategy in order to identify key metabolites involved in mycorrhizal symbiosis. We associate a differential analysis of the metabolome of mycorrhizal roots and not mycorrhizal an analysis of the expression of genes specific mycorrhizal symbiosis. The analysis of metabolic coupling the high performance liquid chromatography (UPLC) and high resolution mass spectrometry (Q-TOF) analysis with statistical unsupervised type OPLS-DA, has highlighted 71 metabolites at least 10 times more prevalent in mycorrhizal roots. Among these metabolites fifty had never been identified as characteristics mycorrhization, including propionyl-carnitine. As for the transcriptomic analysis, it was to select among these those screened metabolites may have a role in regulating the symbiosis signals reflected by their activity on the transcriptome MA of the fungus. We conducted an analysis of the expression of specific genes on the symbiosis of spores of Rhizophagus irregularis stimulated by root extracts fractionated by HPLC. The complementarity of the two analysis (transcriptomics and metabolic), more metabolites present in mycorrhizal roots and detected in HPLC fractions that modulate the expression of fungal genes were identified as potential candidates.