Élaboration et caractérisation de biomatériaux osseux innovants à

Lirela première partie

de la thèse

http://ethesis.inp-toulouse.fr/archive/00002232/01/vandecandelaere_partie_1_sur_2.pdf

Chapitre VI :

Enrichissement en composés peroxydés

et étude de codopages

Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés


386

Ce chapitre sera consacré, dans une première partie, aux résultats préliminaires

obtenus lors de l’enrichissement d’apatites avec des espèces anioniques peroxydées,

comprenant par exemple les ions peroxyde (O22-) ou superoxyde (O2

-) afin de leur conférer

une potentielle propriété antibactérienne. La caractérisation physico-chimique de ces

composés sera présentée et des résultats préliminaires d’évaluation microbiologique seront

également évoqués. En deuxième partie de ce chapitre seront exposés les premiers essais

de codopoage des apatites (incorporation de deux agents potentiellement antibactériens

simultanément) ainsi que leurs caractérisations physico-chimiques et microbiologiques

préliminaires.

VI.1. La voie anionique – Cas des peroxydes

VI.1.1. Données bibliographiques

VI.1.1.1. Les composés peroxydés

Ces composés constituent une famille dont la structure contient le groupement

« peroxo », à savoir une liaison covalente entre 2 atomes d’oxygène : -O-O-. On distingue

les composés peroxydés dits « complexes » des composés peroxydés dits « simples ». Les

composés peroxydés complexes sont des composés dont le groupement peroxo est lié par

des liaisons covalentes au reste de la structure, alors que dans les composés peroxydés

simples, le groupement peroxo est lié de manière ionique aux autres éléments de la

structure (généralement des ions métalliques). Il est possible de classifier ces composés

peroxydés simples en 4 catégories selon la nature de l’ion oxygéné qui les compose

(Vol’Nov, 1966) :

- les peroxydes, caractérisés par la présence de l’ion peroxyde O22-. Les deux

atomes d’oxygène qui composent cet ion ont chacun un rayon de 1,35 Å et la

liaison qui les relie mesure 1,49 Å. Les peroxydes sont diamagnétiques et

généralement non colorés.

- Les superoxydes, caractérisés par la présence de l’ion superoxyde O2-. Cet ion

peut être représenté comme un ellipsoïde de révolution contenant deux atomes

d’oxygène de rayon 1,28 Å, dont la distance O-O est comprise entre 1,32 et 1,35

Å. Ces composés sont paramagnétiques et présentent une couleur jaune.

- Les ozonides, caractérisés par la présence de l’ion ozonide O3-. Cette structure

est composée de 3 atomes d’oxygène liés entre eux par des liaisons mesurant

1,19 Å et formant un angle de 100 °. Les ozonides sont paramagnétiques et de

couleur rouge.



387

- Les hydroperoxydes, caractérisés par la présence de l’ion hydroperoxyde HO2-.

Cette dernière catégorie comprend notamment le peroxyde d’hydrogène, H2O2,

un oxydant et un antiseptique puissant, et l’un des composés peroxydés les plus

simples et les plus utilisés.

Les propriétés caractéristiques des composés peroxydés comprennent la formation

de peroxyde d’hydrogène par réaction en solution avec des acides dilués, la libération d’O2

par décomposition thermique et la libération d’oxygène par réaction avec l’eau et divers

autres agents chimiques (Vol’Nov, 1966).

Ces caractéristiques et la nature oxydante de ces composés, et notamment du

peroxyde d’hydrogène, sont à l’origine de nombreuses applications dans divers domaines.

On peut par exemple citer leur utilisation pour blanchir certains produits (cellulose de bois,

savon, graisse ou encore fourrure), dans la composition de produits détergents, leur

addition dans l’industrie alimentaire (mise en conserve, fabrication du pain,…) ou

cosmétique, leur participation lors de synthèses organiques ou inorganiques (initiateur de

polymérisation, production de matériaux semi-conducteurs, vulcanisation du

caoutchouc,…), ou bien encore leur utilisation pour la génération d’oxygène ou la

dépollution des effluents (Falcon et al., 1993 ; Vol’Nov, 1966).

De plus, ces ions oxygénés ainsi que le peroxyde d’hydrogène sont également

connus pour avoir des effets antibactériens que nous présenterons dans la section

suivante.

VI.1.1.2. Les composés peroxydés en biologie et microbiologie

L’oxygène gazeux est un élément essentiel pour une grande majorité d’organismes.

Cet oxygène participe à de nombreux processus vitaux au niveau cellulaire comme par

exemple la production d’énergie (sous forme d’adénosine triphosphate, ATP) qui se réalise

par phosphorylation oxydative impliquant notamment la transformation de O2 en H2O via

une enzyme par la réaction O2 + 4e- + 4H+ 2 H2O (Lushchak, 2001). De la même

manière, diverses réactions enzymatiques impliquent l’oxygène. Cependant, au cours de

ces réactions, il peut y avoir formation d’espèces oxygénées réactives (nommées ROS,

pour Reactive Oxygen Species), parmi lesquelles on rencontre notamment le radical

hydroxyde (HO.) mais également l’ion superoxyde (O2-), l’ion peroxyde (O2

2-) ou le peroxyde

d’hydrogène (H2O2) (Lushchak, 2001).



388

De par leurs propriétés fortement oxydantes, les ROS présentent une certaines

toxicité pour les cellules (eucaryotes ou bactéries). Les ROS peuvent interagir avec les

protéines en modifiant certains acides aminés (oxydation des groupements thiols de la

cystéine ou de la méthionine, …), attaquer l’ADN (causant des ruptures de chaîne, ce qui

peut engendrer des mutations et la mort cellulaire) ou encore détériorer les lipides

(peroxydation lipidique44) (Farr & Kogoma, 1991 ; Lushchak, 2001 ; Storz et al., 1990).

Comme ces ROS sont générés naturellement et nécessaire à la vie, les cellules ont

développé des stratégies pour les contrôler, que l’on peut diviser en 3 actions (Lushchak,

2001) :

- Contrôler la génération des ROS

- Rendre les ROS moins toxiques sous l’action d’enzymes antioxydantes ou de

« quenchers45 »

- Réparer les éléments endommagés (ADN, protéines,…)

Parmi les enzymes qui luttent contre l’effet des ROS, il est important de mentionner

le rôle des superoxyde dismutases et des peroxydases. Les superoxyde dismutases

(habituellement abrégées SOD) sont des métalloenzymes catalysant la dismutation de l’ion

superoxyde en oxygène et en peroxyde d’hydrogène suivant les réactions :

22)1( OSODMOSODM nn

et

22)1(

2 2 OHSODMHOSODM nn

où M est un métal de transition comme Fe, Mn ou Cu.

Les peroxydases sont une classe d’enzymes, appartenant à la famille des

oxydases46, chargées de décomposer un grand nombre d’espèces contenant le

groupement peroxo, du type R-O-O-R’ par la réaction

OHRROHHeROOR '22'

Au sein de ces peroxydases, on retrouve notamment la catalase dont l’action est

focalisée sur la dismutation du peroxyde d’hydrogène en oxygène et en eau

(2 H2O2 O2 + 2 H2O). A l’instar des superoxyde dismutases, les peroxydases utilisent la

capacité des métaux de transition à exister sous plusieurs états d’oxydation pour exercer

leurs actions antioxydantes.

44 Formation de radicaux sur la chaine carbonée des lipides 45 Entité moléculaire capable de désactiver un état excité créé dans une entité moléculaire par transfert d'énergie, d'électron ou par un

mécanisme chimique 46 Famille d’enzymes catalysant une réaction d'oxydo-réduction impliquant l’oxygène



389

Ces enzymes antioxydantes sont généralement présentes chez tous les organismes

aérobies (tels que les cellules des mammifères ou les bactéries) et permettent de conserver

un équilibre entre le taux de ROS formées et le taux de ROS détruites. Cependant, si cet

équilibre est perturbé et que le taux de génération des ROS est trop important, les ROS

vont s’accumuler dans la cellule. On parle alors de stress oxydatif. L’accumulation des ROS

peut alors engendrer des lésions importantes dans la cellule (dénaturation de protéines

altération de l’ADN) et causer sa mort.

C’est d’ailleurs un des modes d’action de l’organisme humain pour lutter contre les

infections. En effet, les phagocytes produisent localement des ions superoxyde (O22-) via

une enzyme spécifique, l’oxidase NADPH phagocytique, afin de lutter contre les bactéries

(Rada & Leto, 2008 ; Shenep et al., 1985). La génération de ROS est également le mode

d’action de certains antibiotiques, tels que les fluoroquinolones (Albesa et al., 2004). C’est

pourquoi il a été reporté dans la littérature l’utilisation de composés peroxydés, et plus

particulièrement du peroxyde d’hydrogène (H2O2), en tant qu’agent antibactérien

(Feuerstein et al., 2006 ; Imlay et al., 1988 ; Müller & Janz, 1993 ; Pedahzur et al., 1995 ;

Shenep et al., 1985). Le peroxyde d’hydrogène n’est pas le plus toxique des ROS, mais sa

stabilité et sa facilité de manipulation (notamment en comparaison avec l’ion O22- ou des

espèces radicalaires telles que HO.) en font un outil de choix pour ces applications. N’étant

pas chargée, l’entité H2O2 pénètre facilement à l’intérieur des cellules (Sawai et al., 1998 ;

Shenep et al., 1985). De plus, en présence d’ions de métaux de transition (comme Fe ou

Cu), présents dans les milieux biologiques, le peroxyde d’hydrogène peut produire d’autres

espèces oxygénées réactives (Juven & Pierson, 1996), comme le radical hydroxyle HO.,

très toxique et à courte durée de vie, formé par la réaction de Fenton (Fenton, 1894 ; Imlay

et al., 1988) :

OHHOFeHOHFe 2.3

222



390

Ainsi, l’introduction directe d’H2O2 à des concentrations millimolaires dans des

cultures bactériennes a montré son efficacité à réduire la croissance de divers micro-

organismes, parmi lesquels Escherichia coli ou Streptococcus mutans (Feuerstein et al., 2006 ; Imlay et al., 1988). A titre d’exemple, pour S. mutans, la MIC50 (la concentration

minimale nécessaire à réduire de 50 % une population donnée) en H2O2 semble comprise

entre 3 et 30 mM (Feuerstein et al., 2006). Cependant, il apparaît également qu’une

surconcentration en H2O2 puisse avoir des effets antagonistes sur l’inhibition bactérienne

conduisant alors à une perte des effets antibactériens (Imlay et al., 1988). Ce phénomène

peut possiblement être expliqué par une série de réactions connues sous le nom du cycle

de Haber-Weiss (équation (1) à (3)) (Haber & Weiss, 1934), impliquant notamment la

réaction de Fenton (équation (1)) :

(1) OHHOFeHOHFe 2.3

222

(2) OHHOOHHO 2.

222.

(3) HFeOFeHO 22

3.2

Sur la base de ces réactions, Imlay suggère en effet que lorsque la concentration en H2O2

augmente l’équation (2) sera favorisée faisant alors diminuer la concentration en radicaux

HO. liés à l’effet antibactérien (Imlay et al., 1988). Il semble donc important de maîtriser les

concentrations en H2O2 pour pouvoir en atteindre des propriétés antibactériennes

optimales.

VI.1.1.3. Les apatites peroxydées

L’étude des apatites oxygénées (apatites dont les tunnels contiennent des espèces

oxygénées sous différents états d’oxydation) a depuis longtemps attisé la curiosité

scientifique (Trombe & Montel, 1978). Il a ainsi été montré que, outre les ions OH-, les

tunnels apatitiques (voir section I.2.5.4 du chapitre I) pouvaient accueillir bon nombre de

molécules, telles que H2O2 ou O2 (Rey, 1984) ou d’ions moléculaires parmi lesquels figurent

les ions peroxyde (O22-) et superoxyde (O2

-) (Dugas & Rey, 1977).

La synthèse d’apatites contenant des ions O22- et/ou O2

- peut se réaliser de diverses

manières comme par exemple par coprécipitation à 80 °C et pH 11,8 dans un milieu

contenant du peroxyde d’hydrogène (Dugas & Rey, 1977), par calcination d’hydroxyapatite

sous atmosphère d’oxygène sec (Trombe, 1971) ou encore par hydrolyse du βTCP en

milieu peroxyde d’hydrogène (Simpson, 1969).



391

La détection et la quantification de ces espèces peuvent être réalisées grâce à des

techniques d’analyses complémentaires comme la RPE qui permet notamment de détecter

les ions superoxyde (paramagnétiques), les spectroscopies vibrationnelles (infrarouge ou

Raman), ou bien les dosages chimiques permettant entre autre de quantifier les ions

peroxyde O22- ou le peroxyde d’hydrogène (par exemple par titrage au permanganate de

potassium en solution pour le peroxyde d’hydrogène) (Charlot, 1966).

La présence de ces espèces peroxydées est également à l’origine de certaines

modifications physico-chimiques sur des systèmes de nature apatitique, dont voici les

principales données relevées dans la littérature en comparaison avec l’hydroxyapatite

(Trombe, 1971 ; Rey, 1984 ; Yu et al., 2007 ; Zhao et al., 2000) :

- Dans la mesure où les ions peroxyde sont localisés dans les tunnels apatitiques

en remplacement des ions OH-, une diminution de l’intensité des bandes

infrarouge caractéristiques des ions OH- aux positions de 630 et 3570 cm-1 est

observée. Cette dernière semble subir également un décalage vers la position

3567 cm-1 avec l’incorporation des ions O22-. Cependant la spectroscopie IR se

révèle inapte à détecter directement des espèces diatomiques symétriques ; les

ions O22-, O2

- ou l’oxygène moléculaire (O2) ne peuvent donc être détectés par

FTIR (Rey, 1984).

- La spectroscopie Raman révèle la présence de bandes supplémentaires, lors de

l’incorporation des ions O22-, aux positions 3600 et 3622 cm-1 (attribuées à la

vibration d’ions OH- encore présents dans le réseau à proximité d’ions O22-) et à

750 cm-1 attribuée à la vibration symétrique de l’ion O22-. La présence d’ions O3

2-

et/ou O42- engendre également l’apparition de bandes d’absorption Raman larges

et disymétriques à 450 et 800 cm-1.

- Les résultats de DRX, et notamment en termes de paramètres de maille, reportés

sur des apatites peroxydées se révèlent dépendants des conditions de

préparation des échantillons. Trombe montre que l’incorporation d’ions peroxyde

dans le réseau apatitique (d’une apatite obtenue par calcination sous O2)

engendre une contraction des paramètres de maille « a » et « c » (Trombe,

1971), alors que Rey observe, pour des apatites non-stœchiométriques formées

par hydrolyse ou coprécipitation, une augmentation significative du paramètre de

maille « a » lorsque des groupements peroxydés, tels que O22-, sont présents

dans le réseau apatitique (Rey, 1984).



392

L’enrichissement des apatites en agents antibactériens par la voie anionique

apparaît donc différent de ceux précédemment décrits dans ce travail (effectués par voie

cationique). Les environnements des tunnels apatitiques renferment des sites particuliers

où des espèces variées peuvent être non seulement incorporées mais également

échangées relativement aisément, tout au moins dans certaines conditions expérimentales.

Dans ce chapitre, il nous a paru intéressant, en plus des apatites nanocristallines,

d’étudier l’enrichissement en ions peroxyde dans des apatites présentant un meilleur état

de cristallinité : la comparaison entre ces différents systèmes pouvant en effet permettre, a

priori, d’en apprendre davantage sur l’incorporation de telles espèces peroxydées dans un

réseau apatitique plus ou moins bien cristallisé.

Seront donc présentés dans les sections suivantes deux modes de synthèse

d’apatites :

- Par l’hydrolyse du βTCP (Ca3(PO4)2), réalisée en présence de peroxyde

d’hydrogène, aboutissant à l’obtention d’apatites relativement bien cristallisées.

Ces apatites sont généralement faiblement sous-stœchiométriques et révèlent la

présence d’ions HPO42- dans leur composition chimique (Rey, 1984).

- Par la voie de synthèse des apatites nanocristallines (par coprécipitation), comme

nous avons pu la décrire dans les chapitres précédents, mais qui sera réalisée en

présence de peroxyde d’hydrogène.

La caractérisation physico-chimique des composés obtenus par ces méthodes de

synthèse sera également présentée. Enfin, les résultats des premiers tests antibactériens

que nous avons pu réaliser seront exposés en fin de cette première partie de chapitre (la

seconde étant consacrée aux systèmes codopés). Les travaux présentés dans cette partie

du chapitre ont été réalisés en collaboration avec Françoise Bosc, technicienne de

laboratoire.

VI.1.2. Étude de l’hydrolyse du βTCP – Apatites peroxydées bien cristallisées

De nombreux phosphates de calcium présentent la propriété d’évoluer vers la

structure apatitique lorsqu’ils sont placés en solution aqueuse. Tel est le cas par exemple

de la brushite (CaHPO4.2H2O) (Montel, 1958 ; Lerch & Lemp, 1966), du phosphate

octocalcique (OCP, de formule Ca8(PO4)4(HPO4)2.5H2O) (Brown et al., 1962) ou bien

encore des phosphates tricalcique α et β (α et β-TCP de formule Ca3(PO4)2)

(Bredig et al., 1932 ; Monma & Kanazawa, 1976). Des études préliminaires sur l’hydrolyse

du β-TCP en présence de peroxyde d’hydrogène pour synthétiser des apatites oxygénées

ont été reportées dans la littérature (Simpson, 1969 ; Rey, 1984), c’est pourquoi nous avons

choisi d’approfondir cette voie de synthèse. Dans cette section nous présenterons donc la



393

synthèse et les résultats obtenus par la voie de l’hydrolyse du βTCP conduisant à la

formation d’apatites relativement bien cristallisées et contenant des espèces oxygénées à

différents degrés d’oxydation.

VI.1.2.1. Synthèse

Dans ce travail, l’hydrolyse du βTCP (β-Ca3(PO4)2) a été réalisée comme suit :

Une masse 20 mg de poudre de βTCP (obtenue par des synthèses préalablement réalisées

au laboratoire) est placée dans un récipient en verre muni d’un système d’obturation auquel

est ajouté un volume 60 mL d’eau désionisée. Le récipient est ensuite fermé et placé à

l’étuve préalablement portée à 100 þC pendant une durée de 24 heures ; après quoi le

milieu est laissé à refroidir puis le composé est filtré sur Büchner et enfin séché par

lyophilisation.

Cette voie de synthèse vise à conduire théoriquement à la formation d’(hydroxy-

)apatite (ne contenant pas d’espèces oxygénées), qui sera utilisée comme composé de

référence non dopé.

Pour la synthèse d’apatites peroxydées par hydrolyse du βTCP, le protocole suivi est

resté identique au précédent mais l’eau désionisée servant à l’hydrolyse a été remplacée

par une solution de peroxyde d’hydrogène diluée dans l’eau désionisée en différentes

proportions. La solution de peroxyde d’hydrogène initiale utilisée est une solution à 110

volumes (soit 9,82 mol/L de H2O2). Le Tableau VI.78 reporte les concentrations en peroxyde

d’hydrogène testées dans ce travail.

totalsolutiondeVolume

VolumeàOHdesolutiondeVolume )110(22* ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :

Référence de

l'échantillon

% volumique*de solution de H2O2

dans le milieu de réaction

c° molaire en H2O2

dans le milieu de réaction(mol/L)

H0% 0% 0

H5% 5% 0,49

H10% 10% 0,98

H25% 25% 2,46

H50% 50% 4,91

H75% 75% 7,37



Référence de

l'échantillon



c° molaire en H2O2

dans le milieu de réaction(mol/L)

H0% 0% 0

H5% 5% 0,49

H10% 10% 0,98

H25% 25% 2,46

H50% 50% 4,91

H75% 75% 7,37

Tableau VI.78 : Teneurs en peroxyde d’hydrogène testées lors de la synthèse d’apatites peroxydées par hydrolyse

du βTCP (* ce pourcentage correspond à la valeur du rapport : volume H2O2 (à 110 volumes) / volume total de solution



394

VI.1.2.2. Caractérisations physico-chimiques

Des analyses par diffraction des rayons X ont été réalisées sur les échantillons

synthétisés par hydrolyse du βTCP en milieu peroxyde d’hydrogène. Les diagrammes les

plus caractéristiques, en comparaison avec le βTCP utilisé initialement pour la synthèse et

avec l’hydroxyapatite (HAP), sont présentés sur la Figure VI.155.

25 30 35 40 45 500

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

H0%

H25%

H75%

o o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

oo

oo

o

o

o

oo

o

oo

raies caractéristiques du TCP

o raies caractéristiques de l'HAP

HAP

Inte

nsité

(cp

s)

2 (degré) (Cu

)

TCP

o

Référencede

l'échantillon

Figure VI.155 : Diagrammes de diffraction des rayons X d’échantillons synthétisés par la voie de l’hydrolyse du βTCP avec différentes teneurs en peroxyde d’hydrogène en comparaison avec le βTCP initial et l’hydroxyapatite



395

Les résultats de diffraction des rayons X indiquent que l’échantillon ayant été synthétisé

en milieu eau désionisée pure (échantillon H0%) ne se compose que de βTCP sans présence

d’hydroxyapatite. Il apparaît donc qu’en absence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu

réactionnel, l’hydrolyse du βTCP en HAP ne se produit pas.

Les échantillons ayant été synthétisés en milieu eau + peroxyde d’hydrogène montrent

qu’à mesure que la teneur en peroxyde d’hydrogène augmente dans le milieu réactionnel, la

phase apatitique se forme et sa proportion augmente progressivement aux dépens de la phase

βTCP (augmentation de l’intensité des raies de l’HAP et diminution de l’intensité de celles du

βTCP). Cependant, parmi les échantillons testés, seul l’échantillon H75% (dont le pourcentage

volumique de solution de H2O2 à 110 volumes dans le milieu réactionnel était de 75 %)

présente uniquement les raies de diffraction de la phase HAP, les autres pourcentages formant

des systèmes biphasés HAP/βTCP. L’incorporation de peroxyde d’hydrogène dans le milieu

favorise donc l’hydrolyse du βTCP mais elle n’est complète que pour des teneurs en peroxyde

d’hydrogène importantes.

Le diffractogramme de l’échantillon H75% montre des raies de diffraction fines

(contrairement aux diagrammes caractéristiques des apatites nanocristallines biomimétiques).

Ainsi, les apatites synthétisées par ce procédé ont un état de cristallinité supérieur aux apatites

nanocristallines que l’on a pu décrire dans les chapitres précédents. Une analyse par

microscopie électronique à balayage (MEB) réalisée sur ces échantillons, dont les

micrographies sont présentées à la Figure VI.156, montre des cristaux de forme aciculaire dont

les dimensions sont comprises entre 0,5 et 2 µm de largeur et allant jusqu’à plusieurs dizaines

de µm de longueur. La différence d’état de cristallinité entre les apatites nanocristallines et ces

échantillons-ci peut donc être expliquée en partie par la taille micrométrique des cristaux des

échantillons obtenus par hydrolyse du βTCP (à 100 þC) alors que les apatites nanocristallines

présentent des cristaux de taille nanométrique.

Figure VI.156 : Micrographies obtenues par microscopie électronique à balayage (MEB) sur l’échantillon H75%



396

Une analyse par spectroscopie infrarouge a également été réalisée sur le seul

échantillon ayant été obtenu ici présentant une structure apatitique monophasée (échantillon

H75%). Le spectre FTIR de cet échantillon est présenté à la Figure VI.157.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ab

so

rba

nce

Nombre d'onde (cm-1)

887

4000 3500 3000 25000,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

2973

3555

3524

3428

3281

2915

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ab

so

rba

nce


887

4000 3500 3000 25000,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

2973

3555

3524

3428

3281

2915

Figure VI.157 : Spectre FTIR de l’échantillon H75%

Le spectre FTIR de cet échantillon indique la présence des bandes de vibration

caractéristiques des ions phosphate en environnements apatitiques, à 471 cm-1 (ν2(PO4)), à

560/571/605 cm-1 (ν4(PO4)), à 960 cm-1 (ν1(PO4)) et à 1040/1089 cm-1 (ν3(PO4)). La

décomposition spectrale des bandes situées dans le domaine 400-800 cm-1 révèle également

une concentration non-négligeable d’ions HPO42- apatitiques. La présence de la bande FTIR

située à 887 cm-1, attribuée à la vibration de la liaison P-OH des ions HPO42-

(Eichert et al., 2008), confirme également la présence de ces espèces.

En revanche, la décomposition spectrale montre qu’aucun ion en environnements non-

apatitiques, ni même d’ions OH- apatitiques, ne sont détectés par spectroscopie FTIR.

L’absence d’environnements non-apatitiques est due au mode de synthèse (T = 100 °C) qui ne

favorise pas la formation de tels environnements hydratés. L’absence d’ions OH- peut, quant à

elle, être reliée à l’incorporation d’espèces, probablement oxygénées, dans les tunnels

apatitiques en remplacement des ions hydroxyde. L’absence d’ions OH- est également

observée par l’absence de la bande d’absorption caractéristique de ces ions à la position de

3570 cm-1.



397

L’encadré de la Figure VI.157 indique en revanche l’apparition de deux bandes aux

positions 3524 et 3555 cm-1 que l’on ne retrouve pas pour l’hydroxyapatite. La littérature ne fait

pas mention de ces bandes à notre connaissance. Peut être ces bandes d’absorption sont-elles

dues à des ions OH- résiduels dont la vibration est perturbée par des espèces oxygénées

localisées à proximité. Enfin, il est également possible d’observer une bande fine à 2973 cm-1,

qui n’a pas, à notre connaissance, été reportée dans la littérature et qui demanderait des

analyses complémentaires pour être attribuée (analyses que nous n’avons pas pu réaliser dans

ce travail faute de temps).

Nous venons de voir que l’hydrolyse du βTCP en apatite n’était possible que pour de très

importantes teneurs en peroxyde d’hydrogène (75 %) dans ces conditions expérimentales. Il ne

semble donc pas possible avec ces paramètres de synthèse ni de faire varier la teneur en ions

oxygénés incorporés à l’apatite, ni de pouvoir obtenir une référence non dopée. Rey indique

que la réaction d’hydrolyse du βTCP est réalisée par des mécanismes complexes où

interviennent 4 étapes principales (Rey, 1984) :

- 1) la dissolution partielle de la phase βTCP

- 2) l’augmentation du rapport Ca/P dans le milieu réactionnel

- 3) la formation de la phase apatitique

- 4) l’évolution de cette phase vers la stœchiométrie

Toutes ces étapes sont fortement influencées par les conditions de synthèse et

dépendent notamment de la température, du pH ou bien du temps de réaction. Nous avons

donc réalisé une série d’expériences visant à obtenir des apatites (non dopées) par hydrolyse

du βTCP en variant les conditions de synthèse en vue d’obtenir, dans un second temps, des

composés enrichis en espèces oxygénées dont il serait possible de faire varier la teneur. Ces

expérimentations font l’objet de la section suivante.

VI.1.2.3. Tentatives d’obtention d’apatite non dopée par hydrolyse du βTCP

Dans cette section, nous nous intéresserons donc à l’influence des conditions de

synthèse sur l’obtention d’une hydrolyse complète du βTCP en apatite.

Les paramètres de synthèse que nous avons fait varier afin de réaliser une hydrolyse

complète du βTCP sont le temps et la température de réaction ainsi que le pH du milieu

réactionnel. Les autres conditions expérimentales (volume de liquide et masse de solide) sont

restées identiques à celles décrites dans la section VI.1.2.1 et les paramètres ayant été

modifiés sont résumés dans le Tableau VI.79.



398

Référence de l'échantillon

Temps de réaction

Température de réaction

pH du milieu

H0%

(référence)1 jour 100 °C non modifié

H0%a 2 jours 100 °C non modifié

H0%b 3 jours 100 °C non modifié

H0%c 6 jours 100 °C non modifié

H0%d 1 jour 100 °C acidifié avec 50 µL d'HClO4

H0%e 2 jours 100 °C acidifié avec 50 µL d'HClO4

H0%f 2 jours 150 °C non modifié

Tableau VI.79 : Conditions de synthèse ayant été évaluées pour obtenir une hydrolyse complète du βTCP en apatite

Afin d’évaluer si l’hydrolyse du βTCP a eu lieu et si elle a été complète, une analyse par

diffraction des rayons X a été menée sur les échantillons ainsi préparés, dont les résultats sont

présentés sur la Figure VI.158. Les résultats indiquent qu’à 1, 2, 3 ou 6 jours de temps de

réaction à 100 þC, tous les échantillons ne sont composés que de βTCP, comme le montrent

les exemples de diffractogrames (Figure VI.158) des échantillons H0% et H0%c (1 et 6 jours de

réaction respectivement). Ainsi, l’augmentation du temps de réaction, même jusqu’à 6 jours, en

conservant une température de 100 þC, se révèle inefficace pour amorcer l’hydrolyse du βTCP.

Les données de DRX obtenues pour les échantillons dont la réaction a été conduite

après une acidification du milieu réactionnel par ajout de HClO4 avec un temps de réaction de

24 et 48 heures montrent des diffractogrammes caractéristiques de la phase cristalline βTCP et

aucune raie de diffraction attribuable à la structure apatitique ne peut être détectée. Ces

résultats sont illustrés avec l’exemple de l’échantillon dont le temps de réaction est de 48

heures présenté à la Figure VI.158. Notons toutefois que sur ce diagramme deux raies

additionnelles aux positions en 2 de 26,6 ° et à 30,4 vraisemblablement attribuables à la

présence de monétite (CaHPO4) sont observées. L’acidification du milieu de réaction n’a donc

pas permis non plus d’engendrer l’hydrolyse totale du βTCP en hydroxyapatite dans ces

conditions (100 °C avec 1 ou 2 jours de réaction).

Enfin, concernant l’échantillon dont la synthèse a été réalisée à la température de 150 °C

avec un temps de réaction de 2 jours, la diffraction des rayons X révèle un diffractogramme

composé uniquement des raies de l’apatite sans présence de βTCP résiduel (Figure VI.158). Il

apparaît donc que l’élévation de température à 150 þC, pendant 2 jours de réaction, permette

effectivement une hydrolyse complète du βTCP en apatite.



399

25 30 35 40 45 50

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

H0f

H0e

H0c

H0

TCP

Inte

nsité

(cp

s)

2 (degré) (Cu

)

HAP

Référencede

l'échantillon

30,426,6

Figure VI.158 : Diagrammes de diffraction des rayons X d’échantillons synthétisés par hydrolyse du βTCP à 100 °C avec un temps de réaction de 1 et 6 jours (échantillons H0 et

H0c), à 100 °C avec un temps de réaction de 2 jours et un pH acidifié avec HClO4 (échantillon H0e) et à 150 °C avec un temps de réaction de 2 jours (échantill H0f) en comparaison avec le βTCP initial et l’hydroxyapatite



400

Ainsi, parmi tous les paramètres de synthèse testés ici, seule une élévation de

température à 150 þC (avec un temps de réaction de 2 jours) a permis l’hydrolyse du βTCP en

HAP. Il apparaît donc possible, en partant de ces conditions de synthèse et avec ajout de

peroxyde d’hydrogène dans le milieu de réaction en différentes proportions, d’obtenir des

apatites contenant potentiellement des espèces oxygénées en teneurs variables. Il a été

reporté dans la littérature que le rapport solide/solution avait également une influence sur les

mécanismes d’hydrolyse du βTCP (Rey, 1984). Il aurait été intéressant d’évaluer ces

paramètres mais il n’a cependant pas été possible de mener ces expérimentations durant la

période de ce travail.

De manière parallèle à cette étude sur les apatites dont l’état de cristallinité était

relativement important, une série d’expérimentations a été réalisée en vue d’obtenir des

apatites nanocristallines biomimétiques enrichies en espèces oxygénées. Ces expérimentations

font l’objet du paragraphe suivant.

VI.1.3. Étude de la coprécipitation – Apatites nanocristallines peroxydées

Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons à la synthèse et à la caractérisation

physico-chimique d’apatites nanocristallines en présence de peroxyde d’hydrogène afin de

potentiellement les enrichir en espèces oxygénées et leur conférer d’éventuelles propriétés

antibactériennes.

VI.1.3.1. Synthèse

Pour réaliser ces synthèses d’apatites nanocristallines en présence de peroxyde

d’hydrogène, un protocole similaire à ceux décrits dans les chapitres précédents a été utilisé.

Trois échantillons ont été réalisés pour cette étude dont voici le détail du protocole de

synthèse :

Une solution A d’ions calcium est tout d’abord préparé par dissolution de nitrate de

calcium (Ca(NO3)2.4H2O) à la concentration de 0,3 mol/L dans une solution contenant à la fois

de l’eau désionisée et du peroxyde d’hydrogène en proportion variable. Les concentrations en

peroxyde d’hydrogène testées dans cette étude sont reportées dans le Tableau VI.80. Une

solution B d’ions phosphate est également préparée en dissolvant (NH4)2HPO4, pour atteindre

une concentration en ions phosphate de 0,6 mol/L, dans une solution d’eau désionisée et de

peroxyde d’hydrogène de concentration en peroxyde d’hydrogène identique à celle de la

solution A. Un volume de la solution A est ensuite rapidement versé dans un volume double de

solution B sous agitation. Le milieu de précipitation est ensuite laissé à maturer pendant 3 jours

à température ambiante avant d’être filtré. Le précipité est ensuite lavé à l’eau désionisée et

lyophilisé pendant 3 jours. La Figure VI.159 schématise ce protocole de synthèse.



401



Référencede

l'échantillon



c° initialeen H2O2

(mol/L)

3j-10%H2O2 10% 0,98

3j-25%H2O2 25% 2,46

3j-50%H2O2 50% 4,91



Référencede

l'échantillon



c° initialeen H2O2

(mol/L)

3j-10%H2O2 10% 0,98

3j-25%H2O2 25% 2,46

3j-50%H2O2 50% 4,91

Tableau VI.80 : Teneurs initiales en peroxyde d’hydrogène testées pour la synthèse d’apatites nanocristallines en

présence de H2O2

Co-précipitation Maturation3 jours, Tamb

LyophilisationFiltrationRinçage

Sol A

Sol B

Ca(NO3)2.4H2O + H2O + H2O2

(NH4)2HPO4 + H2O + H2O2

Co-précipitation Maturation3 jours, Tamb

LyophilisationFiltrationRinçage

Sol A

Sol B

Ca(NO3)2.4H2O + H2O + H2O2

(NH4)2HPO4 + H2O + H2O2

Figure VI.159 : Représentation schématique du protocole de synthèse d’apatites nanocristallines en présence de peroxyde d’hydrogène

VI.1.3.2. Caractérisations physico-chimiques

En premier lieu, la diffraction des rayons X a été utilisée pour caractériser les 3

échantillons dont la synthèse est décrite dans la section précédente. Les diagrammes obtenus

sont reportés sur la Figure VI.160.

Tous ces diffractogrammes indiquent que les échantillons synthétisés suivant le

protocole de synthèse des apatites nanocristallines en milieu peroxyde d’hydrogène présentent

une structure apatitique proche de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée sans

peroxyde d’hydrogène. Aucune phase secondaire ne peut être détectée par DRX dans ces

échantillons. Il est également possible d’observer une amélioration de la résolution des

diagrammes de DRX avec l’augmentation de la teneur en peroxyde d’hydrogène ajoutée



402

initialement lors de la synthèse, ce qui est particulièrement visible au niveau des raies (202) et

(312) (Figure VI.160). Les échantillons synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène ont

donc un meilleur état de cristallinité que des échantillons préparés dans les mêmes conditions

en absence de peroxyde d’hydrogène.

20 30 40 50 60 70 800

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

(20

2)

(31

2)

3j-50%H2O

2

3j-25%H2O

2

3j-10%H2O

2

Inte

nsité

(u

. a

.)

2 (degré) (Co

)

Non dopée

(00

2)

(30

0)

(31

0)

(40

0) (0

04

)

(50

0) Référence

del'échantillon

Figure VI.160 : Diagrammes de diffraction des rayons X des échantillons synthétisés par coprécipitation à température

ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène à différentes teneurs (10%, 25% et 50 % volumique) avec un temps de maturation de 3 jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée par coprécipitation en milieu eau

désionisée pure à température ambiante et maturée 3 jours

Les analyses par profile fitting réalisées sur les diffractogrammes de ces échantillons,

dont les résultats sont résumés dans le Tableau VI.81, révèlent que l’amélioration de l’état de

cristallinité est principalement due à une augmentation de la valeur de L(310) (modèle de

Scherrer) ou de L(h00) (modèle de Hosemann et Vogel). Ces valeurs augmentent

continuellement avec l’augmentation de la teneur initiale en peroxyde d’hydrogène, passant de

2,6 nm à 7,4 nm entre 0 et 50 % volumique de solution de peroxyde d’hydrogène, soit un

accroissement de près de 185 %. Cependant la longueur moyenne des cristallites (valeurs

L(00l) évaluées ici par les modèles de Scherrer ou de Hosemann et Vogel) ne varie pas

significativement (valeur proche de 16 nm suivant le modèle de Hosemann et Vogel).



403

Le paramètre de distorsion dans la direction [002], g002, tend à diminuer graduellement

avec l’augmentation de la teneur en peroxyde d’hydrogène : une baisse d’environ 15 % est

observée lorsque la teneur initiale en peroxyde d’hydrogène passe de 10 à 50 %

(Tableau VI.81). Bien que la valeur de g002 soit systématiquement plus grande pour les

échantillons synthétisés en présence de H2O2 que celle déterminée en absence de H2O2, sa

diminution avec l’augmentation de la teneur initiale de H2O2 peut en partie expliquer

l’amélioration de l’état de cristallinité des composés.

L (002 )

(nm)

L (310 )

(nm)

L (00 l )

(nm)

L (h 00 )

(nm)

Non dopée 22,0 ± 0,1 3,8 ± 0,1 16,2 ± 0,1 2,6 ± 0,1

3j-10%H2O2 20,1 ± 0,2 7,6 ± 0,1 16,5 ± 0,3 5,7 ± 0,2

3j-25%H2O2 19,8 ± 0,1 8,3 ± 0,1 15,8 ± 0,1 6,4 ± 0,1

3j-50%H2O2 20,3 ± 0,3 9,3 ± 0,1 15,9 ± 0,6 7,4 ± 0,3

Non dopée 0,0071 ± 0,0001 9,432 ± 0,006 6,870 ± 0,002 529,3 ± 0,8

3j-10%H2O2 0,0100 ± 0,0004 9,464 ± 0,002 6,865± 0,001 532,5 ± 0,2

3j-25%H2O2 0,0095 ± 0,0003 9,469 ± 0,002 6,866 ± 0,002 533,1 ± 0,2

3j-50%H2O2 0,0085 ± 0,0020 9,470 ± 0,002 6,864± 0,001 533,1 ± 0,2

Référencede l'échantillon


V maille (Å3)

Scherrer Hosemann & Vogel

g(002)

Paramètre de maille a

(Å)

Paramètre de maille c

(Å)

Tableau VI.81 : Résultats issus de profile fitting réalisés sur des diffractogrammes de rayons X ( Cu) d’apatites

nanocristallines synthétisées par coprécipitation à température ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène avec un temps de maturation de 3 jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée en absence de H2O2 et

maturée 3 jours

Enfin, l’analyse par profile fitting indique une augmentation significative du paramètre de

maille « a », qui passe de 9,432 Å à 9,470 Å, et une diminution en moindre proportion du

paramètre de maille « c », passant de 6,870 Å à 6,864 Å, lorsque la teneur initiale en H2O2

passe de 0 à 50 % respectivement. Cette variation des paramètres de maille engendre une

augmentation du volume de maille cristalline lorsque la synthèse est réalisée en présence de

H2O2 et ce dès 10 % en H2O2 (Tableau VI.81). Le volume de maille augmente rapidement aux

faibles teneurs en H2O2 incorporées lors de la synthèse (jusqu’à une concentration initiale en

solution de 2,46 mol/L) puis se stabilise à une valeur proche de 533 Å3 (Figure VI.161). Ces

données semblent attester d’une incorporation d’espèces chimiques (probablement des

espèces oxygénées) de grande taille dans le cœur apatitique des nanocristaux (en

comparaison avec celles présentes initialement dans les apatites nanocristallines synthétisées

en absence de peroxyde d’hydrogène) engendrant une dilatation de la maille cristalline. En



404

revanche au-delà d’un pourcentage volumique de solution de H2O2 de 25 %, le fait que le

volume de maille n’évolue plus peut signifier que la teneur de ces espèces présentes dans le

cœur apatitique a atteint un maximum et que « l’excédent » s’incorpore préférentiellement dans

les environnements non-apatitiques de surface des nanocristaux ou ne s’incorpore pas. De

plus, ces espèces semblent favoriser une croissance cristalline préférentielle dans une direction

perpendiculaire à l’axe c des cristaux (augmentation de la largeur moyenne des cristallites). La

présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu de précipitation de ces apatites

nanocristallines semble donc jouer le rôle d’accélérateur de croissance cristalline avec la

particularité d’un accroissement des dimensions réalisé en largeur/épaisseur des cristallites et

non pas en longueur.

0 1 2 3 4 5

528,5

529,0

529,5

530,0

530,5

531,0

531,5

532,0

532,5

533,0

533,5

Vo

lum

e d

e m

aill

e (

Å3)

Concentration de H2O

2 en solution (mol/L)

Figure VI.161 : Évolution du volume de maille cristalline en fonction de la concentration initiale en H2O2 introduite lors

de la synthèse

La microscopie électronique à balayage a été utilisée pour caractériser ces échantillons

et déceler une éventuelle évolution de la morphologie des particules (agglomérats de

nanocristaux). Les micrographies présentées à la Figure VI.162 ne révèlent aucune différence

sur les particules observées par MEB entre les échantillons d’apatites nanocristallines

synthétisées en présence ou en absence de peroxyde d’hydrogène. Aucune particule de

morphologie différente n’a non plus été observée.



405

Figure VI.162 : Micrographies MEB d’apatites nanocristallines a) de référence (synthétisé en absence de H2O2), ou synthétisées b) avec 10 %, c) avec 25 % et d) avec 50 % volumique de H2O2 et dont le temps de maturation est de 3

jours

Afin de potentiellement relier les précédents résultats à la teneur en peroxyde dans le

solide, des dosages chimiques ont été réalisés sur ces échantillons. Le titrage du peroxyde

d’hydrogène a été effectué par une méthode colorimétrique utilisant du permanganate de

potassium KMnO4 (Charlot, 1966). Cette méthode fait intervenir le couple oxydo-réducteur :

ions permanganate MnO42- colorés (violet) et ions manganèse Mn2+ incolores selon la réaction :

OHOMnHOHMnO 222

224 852652

Brièvement, pour réaliser ces dosages, les échantillons (sous forme de poudre) d’apatites

nanocristallines synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène sont, dans un premier

temps, dissous en utilisant de l’acide perchlorique concentré (HClO4). La solution obtenue est

alors titrée par ajout d’une solution de KMnO4 (à 0,02 mol/L) ; le point équivalent est alors

atteint lorsque la coloration violette persiste. Le volume de solution de KMnO4 est mesuré à ce

point afin de calculer la concentration en peroxyde d’hydrogène en solution et de remonter à

leur teneur dans le solide.



406

Les résultats de ces dosages effectués sur les échantillons 3j-10%H2O2, 3j-10%H2O2 et

3j-10%H2O2 sont reportés dans le Tableau VI.82.


Teneur en H2O2

dans le solide(mmol/100mg)

3j-10%H2O2 0,014

3j-25%H2O2 0,013

3j-50%H2O2 0,018

Tableau VI.82 : Résultats de dosage du peroxyde d’hydrogène sur les échantillons d’apatites nanocristallines synthétisés en présence de H2O2

Ces données témoignent tout d’abord de la présence (quantifiable) de peroxyde

d’hydrogène dans la composition des apatites nanocristallines. La teneur en peroxyde

d’hydrogène contenue dans le solide ne varie cependant pas significativement avec

l’augmentation de la concentration en H2O2 introduite dans le milieu de précipitation. Il faut

toutefois noter que la méthode de dosage employée ici ne permet de quantifier que le peroxyde

d’hydrogène (et les ions peroxyde) et non les autres composés peroxydés tels que les ions

superoxyde, ozonide,… Des analyses complémentaires, notamment de RPE (Résonnance

Paramagnétique Electronique), qu’il n’a pas été possible d’effectuer au cours ce travail pas

faute de temps, sont nécessaires pour pouvoir détecter et quantifier ces espèces.

Des analyses de spectroscopie vibrationnelle Raman et infrarouge ont été réalisées sur

ces échantillons d’apatites nanocristallines synthétisées en présence de peroxyde d’hydrogène

afin de potentiellement en apprendre davantage sur les espèces chimiques incorporées aux

nanocristaux.

En spectroscopie infrarouge, les spectres ne révèlent que les bandes caractéristiques

des apatites nanocristallines sans bandes d’absorption additionnelles lorsqu’est ajouté du

peroxyde d’hydrogène au milieu de précipitation (Figure VI.163). Bien que de faible intensité

pour l’échantillon non dopé, la bande relative à l’élongation des ions OH- à 3570 cm-1 n’est plus

détectée pour les composés synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène (Encadré de la

Figure VI.163).



407

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

50 % H2O

2

25 % H2O

2

10 % H2O

2

Ab

so

rba

nce


Non dopée

3700 3600 3500 3400 3300 32000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

3570

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

50 % H2O

2

25 % H2O

2

10 % H2O

2

Ab

so

rba

nce


Non dopée

3700 3600 3500 3400 3300 32000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

3570

Figure VI.163 : Spectres FTIR d’apatites nanocristallines synthétisées par coprécipitation à température ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène à différentes teneurs (10%, 25% et 50 % volumique) avec un temps de maturation de 3

jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée en absence de H2O2 et maturée 3 jours

Cette observation est soutenue par les résultats de décomposition spectrale réalisée

dans le domaine 400-800 cm-1 qui indique l’absence de bande à 631 cm-1 attribuée aux ions

OH- apatitiques pour tous les échantillons synthétisés en présence de H2O2 contrairement à

l’échantillon synthétisé sans (voir section II.2.1 du chapitre II). Ce phénomène pourrait être lié à

l’incorporation d’espèces chimiques en sites hydroxyde en remplacement des ions OH-, bien

que de telles espèces ne soient pas détectées par FTIR.



408

La décomposition spectrale révèle également une diminution de près de 50 % de la

teneur relative en ions HPO42- non-apatitiques lorsque la synthèse des apatites est réalisée en

présence de peroxyde d’hydrogène. La concentration en H2O2 initiale n’influence cependant

pas significativement la teneur relative en ions HPO42- non-apatitiques : le rapport des intensités

intégrées des bandes FTIR relatif aux ions HPO42- non-apatitiques est égal à 0,08 ± 0,02 ;

0,11 ± 0,01 et 0,08 ± 0,02 pour les échantillons 3j-10%H2O2, 3j-25%H2O2 et 3j-50%H2O2

respectivement. Il est possible de relier cette observation à l’effet accélérateur de croissance

cristalline du peroxyde d’hydrogène sur les apatites évoqué à la suite des résultats de DRX

décrit précédemment. En effet, au-delà de l’état de cristallinité, c’est peut-être l’état de

maturation qui est amélioré par la présence de peroxyde d’hydrogène, incluant également une

composition chimique plus proche de la stœchiométrie et contenant moins d’environnements

non-apatitiques. La diminution de la proportion d’environnements non-apatitiques pourrait alors

être à l’origine de la diminution de la teneur relative en ions HPO42- non-apatitiques observée

par FTIR.

En spectroscopie Raman, on retrouve les bandes caractéristiques des apatites

nanocristallines mais, à l’inverse des résultats obtenus par FITR, la présence de bandes

d’absorption supplémentaires est également observée, comme le montrent les résultats de la

Figure VI.164. Ces bandes supplémentaires forment 3 massifs distincts :

- un massif m1 dans la gamme spectrale 750-850 cm-1, constitué de 3 bandes situées à

793, 827 et 845cm-1

- un massif m2 dans la gamme spectrale 1080-1140 cm-1, constitué de 4 bandes

situées à 1096, 1103, 1114 et 1124cm-1

- et un massif m3 dans la gamme spectrale 2800-3100 cm-1, constitué de 3 bandes

situées à 2858, 2883 et 2940 cm-1.

Enfin, on peut noter la présence de deux bandes d’absorption larges à 881 et 910 cm-1.



409

200 400 600 800 1000 1200 3000 35000

2000

4000

6000

8000

10000

m3m2

3570

2940

2883

2858

1124

1114

1096 / 1103910

881845

827

50 % H2O

2

10 % H2O

2

Inte

nsité

(co

up

s)


Non dopée

793

m1

Figure VI.164 : Spectres Raman d’apatites nanocristallines synthétisées par coprécipitation à température ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène à différentes teneurs (10%

et 50 % volumique) avec un temps de maturation de 3 jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée par coprécipitation en milieu eau désionisée pure à température ambiante et maturée 3 jours (la bande à 960 cm-1 a été tronquée)



410

Peu d’informations sont disponibles dans la littérature sur la spectroscopie Raman des

apatites peroxydées ou oxygénées. On peut citer les travaux de thèse de Rey (Rey, 1984)

portant sur des apatites synthétisées en milieu peroxyde d’hydrogène (par coprécipitation à la

température de 80 þC ou par hydrolyse du βTCP). Les résultats de ces travaux indiquent que

ces composés apatitiques contiennent divers groupements peroxydés comme des ions

peroxyde O22-, superoxyde O2

-, des ions O32- et/ou O4

2- et des molécules H2O2, localisés dans

les tunnels du réseau. Rey réalisa des analyses par spectroscopie Raman sur ces échantillons

qui révélèrent des bandes d’absorption attribuables à ces espèces oxygénées dont voici

l’attribution donnée par l’auteur :

- une bande à 450 cm-1 attribuée à des édifices moléculaires oxygénés importants tel

O32- ou O4

2-

- une bande large et dissymétrique vers 800 cm-1 attribuée à une vibration O-O de

valence simple

- une bande fine à 1150 cm-1 attribuée aux ions superoxyde (O2-)

- une bande intense à 1552 cm-1 attribuée à de l’oxygène moléculaire (O2).

Dans notre étude et d’après les données présentées à la Figure VI.164, la présence des

bandes situées à 450 cm-1 (édifices moléculaires oxygénés importants) et à 1552 cm-1 (O2) n’a

pas été observée sur les spectres Raman des échantillons d’apatites nanocristallines

synthétisées en présence de peroxyde d’hydrogène. En revanche, les bandes du massif m1

situées entre 750 et 850 cm-1, observées dans ce travail, pourraient correspondre aux bandes

observées par Rey autour de 800 cm-1 attribuées à une vibration O-O de valence simple et/ou

celle observée par Zhao (Zhao et al., 2000) à 750 cm-1 qui a été attribué à la vibration de O22-.

De plus, les bandes du massif m2 comprises dans la gamme spectrale 1080-1140 cm-1

pourraient être reliées à la bande observée à 1150 cm-1 par Rey attribuée à la vibration des ions

superoxyde. La présence d’ions superoxyde peut également être attestée par la couleur

jaunâtre de la poudre des échantillons ayant été synthétisés en présence de peroxyde

d’hydrogène, comparée à la couleur blanche des échantillons synthétisés en absence de H2O2.

Des analyses complémentaires, notamment par RPE (Résonnance Paramagnétique

Électronique), sont nécessaires pour confirmer la présence de telles espèces dans nos

échantillons.

Restent les bandes du massif m3 situées entre 2800 et 3100 cm-1 qui ne peuvent être

liées à aucune bande décrite dans la littérature à notre connaissance.

A l’inverse de la spectroscopie infrarouge, la spectroscopie Raman permet de détecter la

présence d’ions OH- grâce à la bande d’absorption située à 3570 cm-1 qui est présente à la fois

pour les échantillons synthétisés en présence et en absence de peroxyde d’hydrogène. La

proximité dans le spectre du massif m3 avec cette bande à 3570 cm-1 pourrait en première

approximation faire penser à un déplacement de la bande OH- dû à la modification des



411

environnements locaux des ions OH- dans les tunnels avec la présence d’espèces oxygénées.

Cependant, Yu mentionne des bandes d’absorption Raman à 3600 et 3622 cm-1 liées à la

vibration d’ions OH- perturbés par des ions O22- (Yu et al., 2007). Ici de telles bandes n’ont pas

été observées.

Enfin, mentionnons la présence des bandes d’absorption situées à 881 et 910 cm-1, que

l’on distingue clairement pour les échantillons synthétisés en présence de H2O2. La position de

ces bandes est proche de celle observée pour des apatites nanocristallines synthétisées en

absence de H2O2, que nous avons reporté aux positions de 882 et 916 cm-1 respectivement

(voir section II.1.2.4.2 du chapitre II), cette dernière n’étant qu’un épaulement. La distinction

plus claire de ces deux bandes dans le cas des apatites synthétisées en présence de H2O2

pourrait n’être due qu’à une amélioration de la résolution des spectres liée à l’amélioration de

l’état de cristallinité observée lorsque la concentration de H2O2 en solution augmente.

Pour conclure, nous venons de voir qu’il était possible de synthétiser des apatites

nanocristallines en présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu réactionnel sans former

de phases secondaires et ce même à de fort taux de H2O2 (ici 50 %). La présence de peroxyde

d’hydrogène dans le milieu conduit cependant à des modifications physico-chimiques des

apatites nanocristallines ainsi précipitées. A mesure que le taux de H2O2 augmente en solution,

les composés ont un état de cristallinité qui s’améliore, ce qui est principalement dû à un

accroissement de leur largeur moyenne. Il a également été observé une dilatation du volume de

maille cristalline, ce qui suggère une incorporation d’espèces oxygénées dans le réseau

apatitique. Bien que des analyses complémentaires, que nous n’avons pu réaliser dans le cadre

de ce travail par faute de temps, soient nécessaires pour confirmer la présence de ces espèces

et les quantifier, la présence de bandes Raman supplémentaires à celles rencontrées pour les

apatites nanocristallines non dopées soutient cette hypothèse.

Dans le dernier paragraphe de cette section, nous nous intéresserons au premier test

antibactérien mené sur des apatites nanocristallines synthétisées en présence de peroxyde

d’hydrogène. Ce test a été réalisé sur une apatite nanocristalline synthétisée en présence d’un

milieu contenant 10 % volumique d’une solution de H2O2 à 110 volumes ayant pour temps de

maturation 1 jour à température ambiante et utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de

départ (référencée 1j-10%H2O2-Na). Une étape de pré-équilibrage a été réalisée sur ce

composé par lavage du précipité avec une solution de Na3PO4 à pH = 11 comme décrit

précédemment. Notre choix s’est porté sur ces conditions de synthèse (maturation 1 jour et

utilisation du Na2HPO4) afin d’obtenir des échantillons ayant un état de maturation faible étant

donc potentiellement plus réactifs. Dans la mesure où le sodium semble jouer le rôle d’inhibiteur

de croissance cristalline pour les apatites, il pourrait par ailleurs contrebalancer les effets

« accélérateurs » de maturation du peroxyde d’hydrogène. Une brève série d’analyses par

DRX, spectroscopie FTIR et Raman, dont les résultats sont discutés ci-après, a été réalisée sur

cet échantillon préalablement à son évaluation microbiologique.



412

L’analyse par DRX, dont le diagramme est reporté à l’annexe VI.1, ne détecte qu’une

seule phase cristalline : la phase d’apatite nanocristalline.

La spectroscopie infrarouge (dont le spectre est donné à l’annexe VI.2) ne révèle que les

bandes caractéristiques des apatites nanocristallines, à l’instar des résultats obtenus pour les

précédents échantillons. De même, la décomposition spectrale dans le domaine 400-800 cm-1

indique l’absence de bande OH- détectable (à 631 cm-1) et une diminution des ions HPO42- non-

apatitiques de près de 35 % lorsque la synthèse est réalisée en présence de peroxyde

d’hydrogène dans ces conditions (en comparaison avec un échantillon synthétisé en absence

de H2O2 maturé 1 jour en utilisant Na2HPO4). Une nouvelle fois, ces résultats peuvent être liés à

un effet « accélérateur » de maturation joué par H2O2 sur ces apatites synthétisées en présence

de sodium générant des composés dont l’état de maturation est plus développé et contenant

moins d’environnements non-apatitiques.

Une analyse par spectroscopie Raman a également été réalisée sur cet échantillon et le

spectre correspondant est reporté à la Figure VI.165 en comparaison avec un échantillon

d’apatite nanocristalline synthétisée en absence de peroxyde d’hydrogène (toujours en utilisant

Na2HPO4 avec 1 jour de maturation à température ambiante). Les données obtenues pour

l’échantillon synthétisé en présence de peroxyde d’hydrogène révèlent une nouvelle fois la

présence des massifs de bandes d’absorption m1, m2 et m3 dans les fenêtres spectrales 750-

850 cm-1, 1080-1140 cm-1 et 2800-3100 cm-1 respectivement (qui ont été reportées

précédemment sur la Figure VI.164)). La présence d’ions hydroxyde est également attestée par

la bande située à 3570 cm-1 (alors que le spectre FTIR ne présentait pas de bande détectable

attribuable aux ions OH-). Cependant, une diminution de son intensité peut clairement être

observée en comparaison avec l’échantillon synthétisé sans H2O2, ce qui peut être attribué à

l’incorporation d’espèces peroxydées en remplacement d’ions OH-. Enfin, un massif m4 de

bandes de faible intensité, dans le domaine 1250-1800 cm-1, peut également être discerné du

spectre Raman de cet échantillon. Si quelques bandes de ce massif semblent être observées

pour l’échantillon synthétisé sans H2O2 (notamment à 1452 et 1637 cm-1), il est possible de

discerner deux bandes d’absorption aux positions 1299 et 1500 cm-1 uniquement présentes sur

le spectre de l’échantillon synthétisé en présence de H2O2. Peut-être est-il possible de relier ces

bandes à celle observée par Rey à 1550 cm-1 qui a été attribuée à de l’oxygène moléculaire

(Rey, 1984). Des analyses complémentaires seraient nécessaires pour attribuer ces bandes

avec plus de précision.



413

300 600 900 1200 1500 3000 35000

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

nsité

(co

up

s)


m1

m2

m3

3570m

4

1452 1637

1299 1500

Figure VI.165 : Spectre Raman de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 10 % volumique de H2O2 avec un temps de maturation de 1 jour, en utilisant

Na2HPO4 comme sel de phosphate et ayant subie une étape de pré-équilibrage



414

En conclusion, nous venons de voir qu’il était possible de synthétiser une apatite

nanocristalline monophasée en présence de peroxyde d’hydrogène avec un état de maturation

relativement faible en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ et un temps de

maturation de 1 jour. C’est donc cet échantillon qui a été évalué dans la section suivante afin

d’explorer sa potentielle activité antibactérienne.

VI.1.4. Évaluation des propriétés antibactériennes

Comme évoqué dans la section précédente, un test visant à déterminer la potentielle

activité antibactérienne d’un échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée par coprécipitation

en présence d’un milieu contenant 10 % volumique d’une solution de peroxyde d’hydrogène à

110 volumes a été réalisé. Cette apatite a été synthétisée par coprécipitation en utilisant

Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ avec un temps de maturation en solution de 1

jour et à température ambiante. Le précipité a subi l’étape de pré-équilibrage par lavage avec

Na3PO4 à pH = 11. Pour réaliser les tests antibactériens suivants, l’échantillon a été mis sous

forme de pastilles d’un diamètre de 13 mm et de masse 150 mg par compression uniaxiale à

température ambiante. La souche bactérienne testée est S. aureus et la méthode utilisée pour

quantifier les bactéries en fin de test était la méthode « agar ». Le protocole expérimental de ce

test est identique à celui décrit dans la section II.4.4 du chapitre II et le test a été dupliqué. Les

résultats de ce test, exprimés en nombre de colonies formées par mL (cfu / mL) et en

comparaison avec un échantillon d’apatite nanocristalline non dopée maturée 1 jour (ne

présentant pas d’activité antibactérienne) sont reportés à la Figure VI.166.

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

non dopée 10 % H2O2

cfu

(1/m

l)

Test 1

Test 2

Non dopée 1j-10%H2O2-Na

Limite de

quantification

S. aureus

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

non dopée 10 % H2O2

cfu

(1/m

l)

Test 1

Test 2

Non dopée 1j-10%H2O2-Na

Limite de

quantification

S. aureus

Figure VI.166 : Résultats de tests sur plaque d’agar issus des tests microbiologiques sur souche de S. aureus après mise

en contact avec des pastilles d’apatite nanocristalline non dopée ou synthétisée avec 10 % volumique de H2O2 (en utilisant Na2HPO4 et maturées pendant 1 jour)



415

Les résultats de ces tests réalisés indiquent un nombre de colonies bactériennes

formées pour l’échantillon synthétisé avec 10 % de peroxyde d’hydrogène relativement proche

de la référence non dopée. Ce composé ne semble donc pas posséder de propriétés

antibactériennes notables vis-à-vis de S. aureus dans ces conditions. En perspective, des tests

complémentaires sont néanmoins nécessaires pour déterminer si la teneur ou la nature des

espèces oxygénées présentes dans l’échantillon ou leur mécanisme de libération est la cause

de cette non-activité.

VI.1.5. Conclusion

Dans cette première partie du chapitre IV concernant la synthèse d’apatites en présence

de peroxyde d’hydrogène, deux méthodes de synthèse ont été étudiées :

- L’hydrolyse du βTCP en présence de H2O2 dans le milieu réactionnel. Par cette

méthode, il a été observé que seules les réactions conduites avec des teneurs

élevées en peroxyde d’hydrogène (75 % volumique à 100 þC) ou des températures

élevées de réaction (150 þC) engendraient l’hydrolyse complète du βTCP en apatite.

- La coprécipitation d’un sel de Ca2+ et d’un sel de phosphate en milieu eau/peroxyde

d’hydrogène à température ambiante. Cette méthode a permis la formation d’apatites

nanocristallines monophasées dont une partie des ions OH- apparaît être remplacée

par des espèces peroxydées. La présence de peroxyde d’hydrogène dans la solution

de précipitation engendre des modifications physico-chimiques notamment à l’origine

de l’amélioration de la résolution des diagrammes de DRX (augmentation de la

largeur moyenne des cristallites) et l’apparition de bandes Raman additionnelles

(probablement due à la présence d’espèces peroxydées dans l’échantillon).

Un test microbiologique préliminaire mené sur un échantillon synthétisé par

coprécipitation en milieu eau/peroxyde d’hydrogène (à 90/10 % volumique) a été réalisé. Les

résultats du test ne révèlent pas d’activité antibactérienne notable dans ces conditions mais des

analyses complémentaires, à la fois physico-chimiques et microbiologiques, seront nécessaires

pour déterminer la nature et la quantité d’espèces peroxydées incorporées aux apatites et

explorer plus en détail leurs potentiels modes d’action.



416

VI.2. Étude de codopages

Dans cette seconde partie de ce chapitre VI, nous nous intéresserons aux premiers

essais de synthèse d’apatites nanocristallines codopées. Le codopage, qui dans le cas de cette

étude est un bidopage, correspond ici à l’incorporation simultanée de deux agents

potentiellement antibactériens parmi ceux testés dans les chapitres précédents. Le codopage

peut potentiellement présenter deux avantages :

- l’association de deux agents actifs peut conduire à un effet (dans notre cas

antibactérien) cumulé des deux agents (addition des effets de l’agent A et des effets

de l’agent B). Dans ce cas, il peut être intéressant de limiter la quantité de l’agent A,

dans le cas par exemple d’une cytotoxicité plus importante de cet agent, et de

compenser son activité avec l’agent B.

- l’association des deux agents peut éventuellement engendrer une activité supérieure

à celle attendue par l’addition des activités des 2 agents séparés. On parle alors de

synergie. Dans ce cas, des teneurs moindres en agents actifs peuvent être utilisées

lorsque les agents sont associés pour obtenir un effet similaire à ce qu’ils produiraient

si on les considérait individuellement.

Dans cette partie de chapitre, nous décrirons donc les synthèses préliminaires d’apatites

nanocristallines codopées avec diverses combinaisons entre les cations Ag+, Cu2+, ou Zn2+

et/ou les anions peroxydés. Les premières caractérisations physico-chimiques et

microbiologiques réalisées sur ces échantillons seront également présentées.

VI.2.1. Données bibliographiques

L’association de plusieurs ions antibactériens a d’abord été envisagée directement sous

la forme de sels dans des cultures bactériennes afin de déterminer l’activité de la combinaison

de ces ions. C’est ainsi qu’Elzanowska observa une brusque augmentation d’activité

antibactérienne d’une solution de peroxyde d’hydrogène (de concentration comprise entre 1 et

4 mM) avec l’ajout de chlorure de cuivre (CuCl2) en concentration micro-molaire (10 ou 15 µM)

sur des bactéries E. coli, P. aeruginosa et S. lactis (Elzanowska et al., 1995). Comme nous

l’avons évoqué dans le paragraphe précédent, l’action antibactérienne de H2O2 est en partie

corrélée à la présence simultanée d’ions de métaux de transition tels que le cuivre ou le fer qui

engendrent la formation de radicaux hydroxyde (HO.) via la réaction de Fenton (voir

section VI.1.1.2). L’augmentation de l’activité antibactérienne de H2O2 par ajout de cuivre ne

paraît donc pas surprenante. Cependant, le cuivre possède également sa propre activité

antibactérienne, comme nous l’avons vu dans le chapitre IV. L’évaluation du potentiel



417

antimicrobien individuel du peroxyde d’hydrogène d’un côté et du cuivre de l’autre montre que

l’activité antibactérienne d’un mélange cuivre/H2O2 dépasse la somme des activités des deux

espèces prises séparément (Harrison et al., 2008 ; Pedahzur et al., 1997). Il apparaît donc un

effet synergique lorsque H2O2 et le cuivre sont associés et évalués pour des mélanges

« simples » en solution. Mais cet effet synergique n’a pas seulement été observé entre H2O2 et

le cuivre, Pedahzur reporta également que l’association H2O2/Zn2+ et H2O2/Ag+ en solution

engendre une activité antibactérienne synergique (Pedahzur et al., 1995 ; Pedahzur et al., 1997). Ses résultats révèlent que le taux de synergie (différence entre l’activité des deux

espèces associées et la somme des activités individuelles des deux espèces) entre l’ion Ag+

(obtenu à partir du nitrate d’argent) et H2O2 (son étude portait plus spécifiquement sur ces deux

composés) est dépendant de la concentration des deux espèces et plus spécifiquement de

celle du peroxyde d’hydrogène. Plus la concentration en H2O2 est importante, plus le taux de

synergie est important. L’analyse de bactéries (de la souche E. coli) après mise en contact un

mélange « simple » Ag+/H2O2 indique néanmoins que l’activité antibactérienne de ce couple

n’est pas consécutive à une augmentation que la quantité de ROS (espèces oxygénées

réactives, voir section VI.1.1.2), supplémentaire à ce que génère H2O2 seul. Il semble que ce

soit plutôt des mécanismes liés à des dommages causés aux protéines, bien que les

mécanismes exacts de cette synergie ne soient pas élucidés. Deux mécanismes distincts

peuvent expliquer la synergie entre deux agents antibactériens (Pedahzur et al., 1997) :

- un mécanisme que l’on peut qualifier de « chimique », par lequel les interactions

chimiques entre les deux agents engendrent la formation d’espèces actives

responsables de l’augmentation de la toxicité.

- un mécanisme que l’on peut qualifier de « biologique », par lequel la bactérie

accumule les dommages cellulaires causés par l’un des agents, la rendant ainsi plus

susceptible à l’autre agent

Dans le cas de la synergie liée à l’association Ag+/H2O2 en solution, Pedahzur mentionne

plusieurs hypothèses de mécanismes d’action qui pourraient être impliquées (Pedahzur et al., 1997) :

- la stabilisation du H2O2 par l’argent, ralentissant ainsi sa décomposition en espèces

non toxiques (comme O2 ou H2O)

- l’interférence du peroxyde d’hydrogène sur les mécanismes d’évacuation des ions

argent ou de leur détoxification par la cellule

- l’interférence de l’argent sur l’activité des enzymes impliquées dans la neutralisation

des espèces oxygénées telle que la superoxyde dismutase (voir section VI.1.1.2)

Par ailleurs, la formation d’ions Ag2+ par oxydation des ions monovalents en présence d’H2O2

demeure également une option possible.



418

Enfin, l’observation d’effets synergiques entre des agents antibactériens n’est pas limitée

à l’association peroxyde d’hydrogène et cation métallique. Des effets similaires ont été décrits

lorsque des cations métalliques sont associés entre eux. Ainsi, les combinaisons Ag+/Cu2+,

Ag+/Zn2+ et Cu2+/Zn2+ (par simples mélanges d’ions en solution) se sont révélées présenter

également une activité antibactérienne synergique (Pedahzur et al., 1997 ; Lin et al., 1996) en

comparaison avec l’activité antibactérienne respective des ions. D’après les travaux de

Pedahzur (Pedahzur et al., 1997), il apparaît de plus que l’association impliquant l’ion Ag+ avec

un autre ion métallique engendre une des synergies les plus importantes parmi les diverses

associations qu’il a étudié à savoir Ag+/Cu2+, Ag+/Zn2+, Ag+/H2O2, Cu2+/H2O2, Zn2+/H2O2 ou

encore Cu2+/Zn2+. Lin émit l’hypothèse que la synergie engendrée par le couple Ag+/Cu2+ serait

due à des modes d’action antibactérienne complémentaires entre ces deux ions (Lin et al., 1996). En effet, le cuivre a une action plus spécifiquement ciblée sur les membranes et les

parois des bactéries (chapitre IV) alors que l’argent agit principalement sur la dénaturation des

protéines à l’intérieur de la bactérie (chapitre V). Le premier, en détruisant la protection externe

de la cellule, permettrait donc au second de pénétrer plus facilement et d’agir plus efficacement

au sein de la bactérie. Lin observa également que l’effet synergique entre l’ion cuivre et l’ion

argent était corrélé à la concentration en cuivre (Lin et al., 1996). Dans ses conditions

expérimentales (tests réalisés sur L. pneumophilia), la synergie n’apparaissait que lorsque la

concentration en cuivre était de 0,04 ppm (que la concentration en argent soit de 0,02 ou 0,04

ppm) alors que pour une concentration inférieure (ici 0,02 ppm) l’effet antibactérien n’était

qu’additif (que la concentration en argent soit de 0,02 ou 0,04 ppm). Il a par ailleurs été reporté

l’effet inverse, c'est-à-dire que l’ajout de cuivre à une solution d’argent engendrait une

diminution de l’effet antibactérien, probablement en raison de concentrations ou de disponibilité

des ions inadéquates (Ghandour et al., 1988).

Il apparaît donc qu’une synergie, dépendante de la concentration, est possible entre les

différentes espèces que nous avons étudiées dans ce travail (Ag+, Cu2+, Zn2+ et H2O2), du

moins lorsqu’elles sont directement ajoutées sous forme de sels dans les milieux de culture

bactériens. Cependant, peu d’études reportent le codopage de céramiques avec des ions

antibactériens. Il est néanmoins possible d’en citer certaines dont les résultats sont intéressants

dans le cadre de ce travail. Tout d’abord, Bright mentionne l’efficacité d’une zéolithe (alumino-

silicate) enrichie soit avec une association Ag+/Zn2+ soit avec Ag+/Cu2+ pour réduire

efficacement le développement d’une souche de S. aureus (Bright et al., 2002). A teneur en

argent constante, il observa que l’ajout supplémentaire d’ions Zn2+ ou Cu2+ n’engendrait pas de

diminution de l’activité antibactérienne de ce composé mais au contraire l’améliorait. C’est

également ce qu’observa Husheng lorsqu’il compara l’activité antibactérienne d’un matériau

silicique dopé en ions Ag+ et Zn2+ avec un même composé seulement dopé en ions Ag+ sur une

souche d’E. coli ou de S. faecalis (Husheng et al., 2008).



419

Certains auteurs ont également évoqué le codopage de céramiques phospho-calciques.

Matsumoto indique par exemple la faisabilité de l’enrichissement de phosphate tricalcique β

(βTCP) avec un mélange d’ions Ag+ et Zn2+ ou d’ions Ag+ et Cu2+ pour des applications

antibactériennes, dont la synthèse a été réalisée par voie solide/solide (Matsumoto et al., 2009).

Ses résultats révèlent que l’ajout de zinc ou de cuivre génère un ralentissement de la libération

des ions Ag+ (lié à une stabilisation de la structure cristalline, en comparaison avec un

échantillon de βTCP uniquement enrichi en argent) mais améliore l’activité antibactérienne sur

des souches E. coli ou S. aureus. Il observa également une sensibilité plus grande d’E. coli vis-

à-vis du couple Ag+/Cu2+ que du couple Ag+/Zn2+, alors que la prolifération de S. aureus est

inhibée de manière similaire par les deux couples. Il semble donc que la nature de la souche

bactérienne soit un facteur à prendre en compte pour l’efficacité d’un codopage antibactérien.

Deux auteurs ont, à notre connaissance, reporté le cas d’un codopage de phosphate de

calcium apatitique. L’un a étudié l’association Cu2+/Zn2+ (Li et al., 2006) et l’autre l’association

Ag+/Cu2+ (Yang et al., 2009). Le premier, Li (Li et al., 2006), réalisa la synthèse de son composé

par coprécipitation d’une phase apatitique non dopée dans un premier temps et vint enrichir le

précipité formé par ajout d’une solution de sulfate de cuivre et de zinc dans le milieu de

précipitation, qu’il laissa maturer pendant 1 jour à une température comprise entre 60 et 70þC.

L’échantillon obtenu des suites de cette synthèse est une apatite monophasée relativement

bien cristallisée dont les cristallites sont de taille nanométrique et contenant 4 % massique

d’ions Cu2+ et 0,75 % massique d’ions Zn2+. Une augmentation des paramètres de maille

cristalline a et c après enrichissement (en Cu2+/Zn2+) fait conclure les auteurs sur une

incorporation des deux ions au sein du réseau apatitique en remplacement des ions Ca2+. Enfin,

des tests (micro)biologiques révèlent que cette apatite enrichie en cuivre et en zinc présente de

bonnes propriétés antibactériennes sur E. coli sans être cytotoxique. Le second auteur

mentionné précédemment, Yang (Yang et al., 2009), réalisa une synthèse par coprécipitation

directe entre une solution contenant les cations Ca2+, Ag+ et Cu2+ (réalisée à partir des nitrates)

d’une part et une solution de (NH4)2HPO4 d’autre part à la température de 100 þC pendant

4 heures avant de laisser maturer pendant 24 heures. Bien qu’aucune indication sur la teneur

relative des différentes espèces ne soit donnée dans ce travail, il semble que ces conditions de

synthèse conduisent à la formation d’une phase secondaire d’oxyde d’argent. Les conditions de

synthèse apparaissent donc de première importance pour la synthèse d’apatites codopées. Il

nous a paru pertinent de mentionner ici l’existence de certaines phases cristallines rencontrées

dans la littérature contenant les ions mis en jeu lors la synthèse des apatites nanocristallines

codopées, que nous détaillerons par la suite, phases qui pourraient donc potentiellement se

former lors de la synthèse de nos composés.



420

Braithwaite reporte la synthèse d’un phosphate de zinc/cuivre, la zincolibethenite, de

formule CuZnPO4OH, de couleur bleu/vert, obtenu par coprécipitation d’une solution de sulfate

de zinc et de cuivre dans une solution de Na3PO4 sous reflux (Braithwaite et al., 2005). Il

mentionne que la formation de ce composé est généralement réalisée à pH = 4, mais que son

obtention à pH = 7 est possible malgré une vitesse de formation faible. Varma (Varma &

Dahiya, 1998) mentionne par ailleurs la formation d’hydroperoxyde de cuivre stable, de formule

générique CuO2H, lorsque du nitrate de cuivre est placé en solution aqueuse avec du peroxyde

d’hydrogène à pH = 5, suivant la réaction bilan :

3222223 422)(2 HNOHCuOOHOHNOCu

Remarquons que cette réaction conduit à la formation d’acide nitrique, susceptible d’acidifier le

milieu réactionnel. Enfin, notons que dans son ouvrage traitant des espèces peroxydées

(Vol’Nov, 1966), Vol’nov stipule que tous les métaux alcalins (tels que Na) peuvent former des

peroxydes (du type M2O2) bien que ces composés soient généralement obtenus à température

supérieure à 150 °C. Le calcium et le zinc peuvent également former des peroxydes, de formule

CaO2 ou ZnO2.0,5H2O respectivement, lorsqu’ils sont synthétisés en milieu ammoniaqué. En

revanche, l’auteur soutient que le cuivre et l’argent ne peuvent pas former de peroxydes stables

du type CuO2 ou Ag2O2 respectivement.

Au final, il apparaît possible de synthétiser des apatites codopées dont l’activité

antibactérienne pourrait être améliorée en comparaison avec des composés « monodopés ».

Nous présenterons donc dans les sections suivantes les premiers essais de synthèse d’apatites

nanocristallines codopées que nous avons réalisés dans le cadre de ce travail, suivis de leurs

caractérisations physico-chimiques et de l’évaluation microbiologique préliminaire réalisée sur

certains de ces composés.

VI.2.2. Synthèse

Pour réaliser la synthèse d’apatites nanocristallines codopées, le protocole de synthèse

de référence décrit dans le chapitre II (section II.1.1) a été choisi comme base. Pour ces

synthèses, seules la nature du sel de phosphate de départ, la nature et la proportion des ions

présents dans la solution « cationique » ou la présence éventuelle de peroxyde d’hydrogène ont

été des paramètres variables. Voici le protocole de synthèse suivi dans ces expériences :

Une solution « cationique » (solution A) est préparée en dissolvant, en proportion

variable, du nitrate de calcium (Ca(NO3)2.4H2O) avec du nitrate de cuivre (Cu(NO3)2.3H2O)

et/ou du nitrate de zinc (Zn(NO3)2.6H2O) et/ou du nitrate d’argent (AgNO3) dans de l’eau

désionisée pour obtenir une concentration en cations totaux de 0,3 mol/L. Les différentes

combinaisons en cations ainsi que les concentrations de chacun de ces ions sont reportées

dans le Tableau VI.83. Par ailleurs, une solution de phosphate (solution B) est également



421

préparée par dissolution de Na2HPO4 ou de (NH4)2HPO4 afin d’obtenir la concentration de

0,6 mol/L en ions phosphate. La nature des sels de phosphate utilisés pour chaque synthèse

est reportée dans le Tableau VI.83. Dans le cas des synthèses réalisées en présence de

peroxyde d’hydrogène, au lieu de dissoudre les différents sels (cationiques et anioniques) des

solutions A et B avec de l’eau désionisée pure, la dissolution a été réalisée avec une solution

H2O/H2O2 (obtenue par dilution d’une solution de H2O2 à 110 volumes) à la fois pour la

solution A et pour la solution B. Les synthèses réalisées dans ces conditions (en présence de

H2O2) sont également indiquées dans le Tableau VI.83.

Un volume de solution A est ensuite versé rapidement dans un volume double de

solution B sous agitation et à température ambiante pendant 5 minutes. Après arrêt de

l’agitation, le milieu de précipitation est laissé à maturer pendant 24 heures à température

ambiante avant d’être filtré sur Büchner. Le précipité est lavé avec une solution de Na3PO4 à

pH = 11 en premier lieu (étape de pré-équilibrage) puis avec de l’eau désionisée avant d’être

lyophilisé pendant 3 jours. Un schéma du protocole de synthèse suivi ici est représenté à la

Figure VI.167.

Co-précipitation Maturation1 jour, Tamb

LyophilisationFiltrationPré-équilibrage

Rinçage

Sol A

Sol B

Ca(NO3)2.4H2O + Cu(NO3)2.3H2O et/ou Zn(NO3)2.6H2O et/ou AgNO3dans H2O ou H2O/H2O2

(NH4)2HPO4 ou Na2HPO4dans H2O ou H2O/H2O2

Co-précipitation Maturation1 jour, Tamb

LyophilisationFiltrationPré-équilibrage

Rinçage

Sol A

Sol B

Ca(NO3)2.4H2O + Cu(NO3)2.3H2O et/ou Zn(NO3)2.6H2O et/ou AgNO3dans H2O ou H2O/H2O2

(NH4)2HPO4 ou Na2HPO4dans H2O ou H2O/H2O2

Figure VI.167 : Représentation schématique du protocole de synthèse d’apatites nanocristallines codopées



422


VolumeàOHdesolutiondeVolume )110(22** ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :

* pourcentage par rapport aux cations totaux contenus dans la solution A (le sodium n'est pas comptabilisé)

NP : Non présentNP : Non présent

Référencede

l'échantillon

c° en Ca2+

dans la solution A

(mol/L)

c° en Cu2+

dans la solution A

(mol/L)

c° en Zn2+

dans la solution A

(mol/L)

c° en Ag+

dans la solution A

(mol/L)

Teneur relativeinitiale

en cations(% molaire*)

% volumique**de solution de H2O2


Nature du sel de

phosphate

1j-5%Cu/5%Zn 0,265 0,015 0,015 NP 5% Cu2+

/ 5% Zn2+ NP Na2HPO4

1j-1%Cu/1%Ag 0,289 0,003 NP 0,003 1% Cu2+

/ 1% Ag+ NP Na2HPO4

1j-1%Zn/1%Ag 0,289 NP 0,003 0,003 1% Zn2+

/ 1% Ag+ NP Na2HPO4

1j-1%Cu/H2O2 0,292 0,003 NP NP 1% Cu2+ 10% Na2HPO4

1j-1%Zn/H2O2 0,292 NP 0,003 NP 1% Zn2+ 10% Na2HPO4

1j-1%Ag/H2O2 0,292 NP NP 0,003 1% Ag+ 10% (NH4)2HPO4

Tableau VI.83 : Nature et concentration initiale des sels et teneur en peroxyde d’hydrogène utilisés pour la synthèse des apatites nanocristallines codopées



423

VI.2.3. Caractérisations physico-chimiques

Dans cette section, nous présenterons les caractérisations physico-chimiques

préliminaires réalisées sur les échantillons dont le protocole de synthèse a été décrit dans la

section précédente.

Notons, en premier lieu, quelques observations visuelles particulières réalisées sur ces

échantillons :

- La poudre de l’échantillon 1j-5%Cu/5%Zn (synthétisé en présence de Cu2+ et Zn2+)

possède une couleur bleue caractéristique de la présence d’ions Cu2+, identique à

celle observée pour les échantillons « monodopés » avec Cu2+ décrits dans le

chapitre IV. Il semble donc qu’au moins l’élément cuivre soit présent dans cet

échantillon.

- La poudre de l’échantillon 1j-1%Cu/1%Ag possède quant à elle une couleur

bleue/verte différente de celle de l’échantillon 1j-5%Cu/5%Zn. Il semble qu’en plus de

la couleur bleue liée à la présence d’ions Cu2+, l’on soit en présence d’une autre

espèce colorée, probablement jaune (pour donner du vert au final) ce qui pourrait être

assimilé à la potentielle présence d’Ag3PO4 (de couleur jaune).

- La poudre de l’échantillon 1j-1%Ag/H2O2 possède une couleur jaune soutenue,

couleur qui est plus intense qu’un échantillon synthétisé uniquement avec du

peroxyde d’hydrogène (sans argent mais dans les mêmes conditions, voir

section VI.1.3) qui possède un couleur jaune pâle. Dans ce cas la couleur jaune

aurait potentiellement deux origines : la présence d’ions superoxyde et d’Ag3PO4.

- Enfin, lors de la préparation de la solution « cationique » pour la synthèse de

l’échantillon 1j-1%Cu/H2O2, contenant à la fois des cations Ca2+ et Cu2+ et du

peroxyde d’hydrogène, il a été observé une coloration en vert kaki de la solution

(avec l’éventuelle présence d’un précipité) et un dégagement gazeux. Étant en

présence d’espèces oxygénées, il est possible que ce dégagement gazeux ait été

une libération d’O2 issue d’une réaction entre le peroxyde d’hydrogène et le cuivre (le

calcium n’engendrant pas ce genre de phénomène). Or comme nous l’avons évoqué

dans la section VI.2.1, le nitrate de cuivre est connu pour réagir avec le peroxyde

d’hydrogène et former un composé de formule brute CuO2H (Varma & Dahiya, 1998)

mais la réaction de formation de cette espèce ne génère pas d’O2. Soit une réaction

différente se produit dans ces conditions, soit le dégagement gazeux est une réaction

secondaire à la formation du CuO2H. Aucune information relative à ce phénomène

n’a été reportée à notre connaissance. Au final, la poudre de l’échantillon

1j-1%Cu/H2O2 est également de couleur vert kaki. Afin d’approfondir ces

observations, une synthèse en présence uniquement d’ions Cu2+ et de peroxyde



424

d’hydrogène a été réalisée. Pour cela, 37,5 mL d’une solution de Cu(NO3)2.3H2O à

0,4 mol/L ont été préparés dans laquelle ont été versés 12,5 mL d’une solution de

H2O2 à 110 volumes (soit une concentration finale d’ions Cu2+ de 0,3 mol/L et une

teneur en H2O2 de 25 % volumique). Cette synthèse conduit à la formation d’un

précipité qui a été récupéré après 5 minutes de réaction par filtration. A noter que le

filtrat récupéré avait une couleur bleue caractéristique d’une solution contenant des

ions Cu2+. Le précipité a ensuite été lavé et lyophilisé pendant 3 jours. La poudre

finale possède une couleur marron foncé. Une analyse par DRX (Figure VI.168) et par

MEB (Figure VI.169) ont été réalisées et révèlent un composé cristallisé (relativement

faiblement) présentant une morphologie sous forme d’agglomérats microniques de

feuillets (d’environ 1 µm de longueur). Ces analyses n’ont cependant pas permis de

déterminer la nature de cette phase.

20 30 40 50 60 70 80 900

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Inte

nsité

(u

. a

.)

2 (degré) (Co

)

Figure VI.168 : Diagrammes de diffraction des rayons X du produit de réaction entre Cu(NO3)2.3H2O et H2O2

Figure VI.169 : Micrographies de microscopie électronique à balayage du produit de réaction entre Cu(NO3)2.3H2O et

H2O2



425

Pour déterminer l’éventuelle présence de phases secondaires, comme peuvent le

suggérer les observations visuelles, une analyse par diffraction des rayons X a été menée sur

les échantillons dont le protocole de synthèse est décrit dans la section précédente. Les

résultats de ces analyses sont reportés dans les Figure VI.170 et Figure VI.171 en comparaison

avec une apatite nanocristalline non dopée ayant pour temps de maturation 1 jour et

synthétisée en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ. La Figure VI.170 reporte

les diffractogrammes des échantillons codopés avec des cations uniquement (Cu2+ et/ou Zn2+

et/ou Ag+) et la Figure VI.171 reporte ceux codopés en présence de peroxyde d’hydrogène (avec

Cu2+, Zn2+ ou Ag+).

20 30 40 50 60 70 800

5000

10000

15000

20000

1j - 1%Zn/1%Ag

1j - 1%Cu/1%Ag

1j - 5%Cu/5%Zn

Inte

nsité

(u

. a

.)

2 (degré) (Co

)

Non dopée

Figure VI.170 : Diagrammes de diffraction des rayons X des échantillons codopés avec des cations Cu2+ et/ou Zn2+ et/ou

Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un temps de maturation de 1 jour en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non dopée synthétisée

dans les mêmes conditions



426

20 30 40 50 60 70 800

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

1j - 1%Ag/H2O

2

1j - 1%Zn/H2O

2

1j - 1%Cu/H2O

2

Inte

nsité

(u

. a

.)

2 (degré) (Co

)

Non dopée

Figure VI.171 : Diagrammes de diffraction des rayons X des échantillons codopés en présence de 10 % volumique de peroxyde d’hydrogène et avec Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un

temps de maturation de 1 jour en utilisant Na2HPO4 ou (NH4)2HPO4 comme sel de phosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non dopée synthétisée dans les mêmes conditions (en absence de peroxyde d’hydrogène)

Tous ces diffractogrammes n’indiquent la présence que des raies de diffraction d’une

apatite nanocristalline. Aucune phase secondaire n’a donc pu être détectée par DRX malgré la

couleur de la poudre de certains échantillons (comme les échantillons 1j-1%Cu/1%Ag,

1j-1%Ag/H2O2 ou 1j-1%Cu/H2O2). Ainsi, il est possible que, soit la présence de phases

secondaires amorphes ou en trop faibles teneurs ne peut être détectée par DRX, soit les

changements de couleur observés sur ces échantillons sont dus à des interactions entre les

ions Cu2+ et Ag+ pour l’échantillon 1j-1%Cu/1%Ag (aboutissant à une coloration bleu/vert) ou

entre Ag+ et des espèces peroxydées pour l’échantillon 1%Ag/H2O2 (aboutissant à une

coloration jaune vive).



427

Dans le cas de l’échantillon synthétisé en présence d’ions Cu2+ et de peroxyde

d’hydrogène (échantillon 1j-1%Cu/H2O2), la phase cristalline issue de la réaction entre Cu2+ et

H2O2 (Figure VI.168) peut être en trop faible quantité pour être détectée ou celle-ci n’est pas

stable à pH neutre. En effet, les conditions dans lesquelles se forment cette phase cristalline

sont des conditions acides (pH entre 2 et 3), que ce soit dans la solution A (voir section VI.2.2),

préparée lors de la synthèse de ces apatites codopées (contenant les ions Ca2+, Cu2+, NO3- et

H2O2), ou dans le milieu réactionnel de la synthèse avec Cu(NO3)2.3H2O et H2O2. Or lors de la

précipitation des apatites nanocristallines, le pH atteint une valeur d’environ 7,2 (milieu

tamponné par l’excès d’ions phosphate). Il est donc possible que la phase cristalline issue de la

réaction entre Cu2+ et H2O2 ne soit pas stable dans ces conditions et que seule l’apatite soit

présente en fin de réaction. Dans ce cas la couleur verte de la poudre de l’échantillon

1j-1%Cu/H2O2 pourrait être due à la fois à la présence d’ions Cu2+ (couleur bleue) et d’ions

superoxyde (couleur jaune).

Si l’on s’intéresse à l’état de cristallinité de ces échantillons, il est possible de remarquer

que la présence simultanée de cuivre et de zinc dans le milieu de précipitation conduit, comme

on pouvait s’y attendre, à des apatites dont l’état de cristallinité est plus faible qu’une apatite

non dopée (diffractogramme moins bien résolu, Figure VI.170). Cette observation n’est pas

surprenante dans la mesure où à la fois le cuivre et le zinc ont été qualifiés d’inhibiteurs de

croissance cristalline (chapitre III et IV). Pour les échantillons ayant été synthétisés en présence

d’ions Ag+ et Cu2+ ou d’ions Ag+ et Zn2+, aucune modification significative de la résolution des

diffractogrammes n’a été observée. Il est possible que les teneurs en cations dopants soient

trop faibles pour engendrer des modifications significatives de l’état de cristallinité. Pour les

échantillons synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène et d’un cation dopant (Cu2+,

Zn2+ ou Ag+), la résolution des diffractogrammes est systématiquement améliorée en

comparaison avec un échantillon non dopé. Il apparaît donc que l’effet « accélérateur » de

croissance cristalline du peroxyde d’hydrogène soit prépondérant sur l’effet « inhibiteur » des

ions Cu2+ ou Zn2+. La présence d’ions Ag+ (qui, seuls, ne modifient pas l’état de cristallinité des

apatites) ne semble pas altérer cet effet « accélérateur » de croissance cristalline de H2O2.

Afin d’approfondir ces résultats et de confirmer potentiellement certaines des hypothèses

que nous venons de formuler, une analyse par spectroscopie infrarouge a été réalisée sur les

échantillons dont le protocole de synthèse est décrit dans la section précédente. Les spectres

FTIR de ces échantillons, reportés aux annexes VI.3 et VI.4, ne révèlent que les bandes

d’absorption caractéristiques d’une apatite nanocristalline, sans présence de bandes

secondaires. Cette observation soutient l’hypothèse de l’absence de phases secondaires

comme le suggérait la DRX mais ne la confirme pas dans la mesure où les bandes d’absorption

des apatites nanocristallines sont larges et peuvent éventuellement masquer des bandes

secondaires.



428

Une décomposition spectrale dans le domaine 400-800 cm-1 a été réalisée sur ces

spectres FTIR. Les résultats de cette analyse suggèrent tout d’abord l’absence d’ions OH- dans

tous les échantillons. Ces résultats ne sont pas surprenants étant donné que le

« monodopage » (enrichissement des apatites avec une seule espèce dopante) conduisait aux

mêmes résultats avec ces conditions expérimentales (1 jour de maturation à température

ambiante en utilisant Na2HPO4 comme sel de départ) ou en présence de peroxyde d’hydrogène

(incorporation potentielle d’espèces peroxydées en remplacement des ions OH-). Au niveau des

ions HPO42- non-apatitiques, la décomposition spectrale en révèle une faible teneur relative

(inférieure à la teneur que l’on retrouve dans un échantillon non dopé) pour l’échantillon

synthétisé avec Cu2+ et Zn2+ (échantillon 1j-5%Cu/5%Zn), comme le montre la Figure VI.172.

Ces résultats concordent avec ceux obtenus pour les échantillons monodopés en cuivre ou en

zinc qui révélaient une diminution de la teneur en ions HPO42- non apatitiques avec

l’augmentation de la teneur en ions Cu2+ ou Zn2+ (voir chapitres III et IV). A ce niveau, le

codopage ne semble donc pas engendrer de conséquences particulières, seul un effet

cumulatif des actions des deux ions peut être observé. Une baisse de la teneur en ions HPO42-

non-apatitiques peut également être observée pour les échantillons 1j-1%Cu/1%Ag et

1j-1%Zn/1%Ag en comparaison avec l’échantillon non dopé (Figure VI.172). Cette évolution peut

également être reliée à la présence de Cu2+ ou Zn2+ mais étant en teneur moindre la diminution

n’atteint pas celle de l’échantillon 1j-5%Cu/5%Zn. Enfin, la décomposition spectrale révèle

également une diminution relativement identique de la teneur en ions HPO42- non-apatitiques

pour chaque échantillon codopé en présence de peroxyde d’hydrogène (Figure VI.172).

L’incorporation seule de peroxyde d’hydrogène dans le milieu de précipitation des apatites

nanocristallines générait une baisse de la teneur en ions HPO42- non-apatitiques, il est donc

possible que l’évolution observée ici soit en partie due à la présence de H2O2, en addition de

l’effet généré par les cations dopants. Au final, il ne semble pas apparaitre d’évolution

particulière liée au codopage en comparaison avec les monodopages correspondants.



429

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

HPO42- non-apatitiques

1j-5

%Cu/

5%Zn

1j-1

%Cu/

1%Ag

1j-1

%Zn/

1%Ag

1j-1

%Cu/

H 2O 2

1j-1

%Zn/

H 2O 2

1j-1

%Ag/

H 2O 2

Non

dop

ée

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ra

pp

ort

s d

es

air

es

in

tég

rée

s

HPO42- non-apatitiques

1j-5

%Cu/

5%Zn

1j-1

%Cu/

1%Ag

1j-1

%Zn/

1%Ag

1j-1

%Cu/

H 2O 2

1j-1

%Zn/

H 2O 2

1j-1

%Ag/

H 2O 2

Non

dop

ée

Figure VI.172 : Évolution des quantités relatives en ions HPO42-

non-apatitiques relevées par décomposition spectrale

FTIR pour des apatites nanocristallines codopées soit par voie cationique (avec Cu2+

et/ou Zn2+

et/ou Ag+) soit par

synthèse en présence de H2O2 et avec Cu2+

ou Zn2+

ou Ag+ (les références indiquées sont celles mentionnées dans le

Tableau VI.83)

En perspective de ce travail, il serait intéressant d’évaluer la teneur des différents ions

(Cu2+, Zn2+ et/ou Ag+) et des espèces oxygénées présentes dans les composés finaux afin de

confirmer le codopage effectif des apatites. Néanmoins nous avons vu dans cette section que la

présence de plusieurs espèces dopantes dans le milieu de réaction des apatites

nanocristallines n’engendrait pas la formation de phases secondaires détectables en DRX ou

en FTIR, et que des modifications chimiques s’apparentant aux effets individuels des différents

ions potentiellement incorporés semblaient se produire (résultats FTIR).

Dans la section suivante, nous présenterons les résultats préliminaires de l’évaluation

antibactérienne de tels échantillons d’apatites nanocristallines codopées.



430

VI.2.4. Évaluation des propriétés antibactériennes

Dans cette section nous nous intéresserons donc aux tests d’évaluation d’éventuelles

propriétés antibactériennes sur des apatites nanocristallines codopées synthétisées en

présence d’ions Cu2+, Zn2+ et/ou Ag+ et/ou de peroxyde d’hydrogène.

Concernant les échantillons évalués ici, les teneurs en cations dopants testées ont été

diminuées en comparaison avec les échantillons décrits dans la section précédente

(section VI.2.3), afin de se rapprocher des teneurs qui avait fourni des échantillons monodopés

non ou peu cytotoxiques. Ainsi, en suivant le protocole décrit dans la section VI.2.2, trois

échantillons synthétisés avec des teneurs initiales de 0,1 % molaire pour chaque cation

(pourcentage en cations totaux initialement introduits dans la solution « cationique » A) ont été

préparés avec les couples Cu2+/Zn2+, Cu2+/Ag+ et Zn2+/Ag+ (référencés respectivement 1j-

0,1%Cu/0,1%Zn, 1j-0,1%Cu/0,1%Ag et 1j-0,1%Zn/0,1%Cu). Des échantillons codopés avec du

peroxyde d’hydrogène et un cation dopant (Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+) ont également été testés ici.

Cependant, étant donné la formation d’un précipité lors de la préparation de la solution

« cationique » contenant Cu2+ et H2O2, une modification du protocole de synthèse a été réalisée

pour tous les échantillons codopés en présence de H2O2 (avec Cu2+, Zn2+ ou Ag+). En suivant

les étapes de préparations décrites dans la section VI.2.2, le H2O2 n’est ajouté qu’à la solution

« anionique » (la solution « cationique » n’étant préparée qu’avec de l’eau désionisée). La

solution A a donc été préparée avec une concentration en Ca2+ de 0,3272 mol/L et en cation

dopant (Cu2+, Zn2+ ou Ag+) de 0,0003 mol/L (soit 0,1 % molaire en cation dopant) dans 45 mL

d’eau désionisée. La solution B a été préparée avec 8,6 g de Na2HPO4 (pour les synthèses

avec Cu2+ et Zn2+) et 8,0 g de (NH4)2HPO4 (pour la synthèse avec Ag+), soit une concentration

en ions phosphate de 0,63 mol/L, avec 90 mL d’eau désionisée et 15 mL d’une solution de

peroxyde d’hydrogène à 110 volumes (soit 10 % volumique de la solution de H2O2 au final

après la coprécipitation). La solution A est ensuite versée dans la solution B et le reste de la

synthèse suit le protocole décrit dans la section VI.2.2 (1 jour de temps de maturation à

température ambiante et avec une étape de pré-équilibrage par lavage avec Na3PO4 à

pH = 11). Ces échantillons ont donc été synthétisés avec 0,1 % molaire de Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+

et 10 % volumique de H2O2 (référencés respectivement 1j-0,1%Cu/H2O2, 1j-0,1%Zn/H2O2 et

1j-0,1%Ag/H2O2). Le Tableau VI.84 résume les caractéristiques principales des échantillons

utilisés pour les tests microbiologiques.



431


VolumeàOHdesolutiondeVolume )110(22** ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :

* pourcentage par rapport aux cations totaux contenus dans la solution A (le sodium n'est pas comptabilisé)

NP : Non présentNP : Non présent

Référencede

l'échantillon

Teneur relativeinitiale

en cations(% molaire*)

% volumique**de solution de H2O2


Nature du sel de

phosphate

1j-0,1%Cu/0,1%Zn 0,1% Cu2+

/ 0,1% Zn2+ NP Na2HPO4

1j-0,1%Cu/0,1%Ag 0,1% Cu2+

/ 0,1% Ag+ NP Na2HPO4

1j-0,1%Zn/0,1%Ag 0,1% Zn2+

/ 0,1% Ag+ NP Na2HPO4

1j-0,1%Cu/H2O2 0,1% Cu2+ 10% Na2HPO4

1j-0,1%Zn/H2O2 0,1% Zn2+ 10% Na2HPO4

1j-0,1%Ag/H2O2 0,1% Ag+ 10% (NH4)2HPO4

Tableau VI.84 : Caractéristiques principales des échantillons codopés utilisés pour les tests microbiologiques

Pour ces tests, les échantillons ont été mis sous forme de pastilles d’un diamètre de

13 mm et de masse 150 mg par compression uniaxiale à température ambiante. La souche

bactérienne sélectionnée est S. aureus et la méthode utilisée pour quantifier les bactéries en fin

de test était la méthode « agar ». Le protocole expérimental de ce test est identique à celui

décrit dans la section II.4.4 du chapitre II et le test a été répété deux fois. Les résultats de ce

test, exprimés en nombre de colonies formées par mL (cfu / mL) et en comparaison avec un

échantillon d’apatite nanocristalline non dopée (maturée 1 jour) ne présentant pas d’activité

antibactérienne sont reportés à la Figure VI.173.



432

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

non dopée 1j-

0,1%Cu/0,1%Zn

1j-

0,1%Cu/0,1%Ag

1j-

0,1%Zn/0,1%Ag

1j-0,1%Cu/H2O2 1j-0,1%Zn/H2O2 1j-0,1%Ag/H2O2

cfu

(1/m

L)Test 1

Test 2

Limite de

quantification

1j-0

.1%

Cu/

0.1%

Zn1j-0

.1%

Cu/

0.1%

Ag

1j-0

.1%

Zn/0.

1%Ag

1j-0

.1%

Cu/

H 2O 2

1j-0

.1%

Zn/H 2

O 21j-0

.1%

Ag/

H 2O 2

Non

dop

ée

S. aureus

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

non dopée 1j-

0,1%Cu/0,1%Zn

1j-

0,1%Cu/0,1%Ag

1j-

0,1%Zn/0,1%Ag

1j-0,1%Cu/H2O2 1j-0,1%Zn/H2O2 1j-0,1%Ag/H2O2

cfu

(1/m

L)Test 1

Test 2

Limite de

quantification

1j-0

.1%

Cu/

0.1%

Zn1j-0

.1%

Cu/

0.1%

Ag

1j-0

.1%

Zn/0.

1%Ag

1j-0

.1%

Cu/

H 2O 2

1j-0

.1%

Zn/H 2

O 21j-0

.1%

Ag/

H 2O 2

Non

dop

ée

S. aureus

Figure VI.173 : Résultats de tests sur plaque d’agar issus de l’évaluation microbiologique sur S. aureus après mise en contact avec des pastilles d’apatite nanocristalline non dopée ou codopée avec Cu2+/Zn2+ ou Cu2+/Ag+ ou Zn2+/Ag+ ou

Cu2+/H2O2 ou Zn2+/H2O2 ou Ag+/H2O2 (les références indiquées sont celles mentionnées dans le Tableau VI.84)

Ces résultats révèlent tout d’abord que les tests réalisés sur les échantillons synthétisés

avec Cu/H2O2 ou Zn/H2O2 (échantillons 1j-0,1%Cu/H2O2 et 1j-0,1%Zn/H2O2) n’indiquent pas de

diminution significative de formation de colonies sur la plaque d’agar, en comparaison avec

l’échantillon non dopé qui ne présentait pas d’activité antibactérienne. Ces deux échantillons

(à ces teneurs en ions dopants) ne semblent donc pas posséder de propriétés antibactériennes.

Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus pour les échantillons monodopés puisqu’aux

mêmes teneurs initiales (0,1 % molaire en cuivre ou en zinc ou 10 % volumique de H2O2) sur

des apatites nanocristallines monodopées aucune activité antibactérienne n’avait été observée

(voir section III.3.2 du chapitre III, section IV.4.2 du chapitre IV et section VI.1.4 de ce chapitre).

Il ne semble donc pas y avoir, dans ces conditions de codopage, d’effets synergiques entre le

cuivre et le H2O2 ou entre le zinc et le H2O2.

En revanche, les résultats de la Figure VI.173 indiquent que tous les échantillons

contenant de l’argent (échantillons 1j-0,1%Cu/0,1%Ag, 1j-0,1%Zn/0,1%Ag et 1j-0,1%Ag/H2O2)

conduisent à une diminution significative de la formation de colonies de S. aureus en

comparaison avec l’échantillon non dopé (non antibactérien). Bien que quelques dizaines de

colonies aient été observées lors du test 1 pour les échantillons 1j-0,1%Cu/0,1%Ag et

1j-0,1%Zn/0,1%Ag (80 et 20 colonies formées par mL respectivement), ces données révèlent

que les échantillons synthétisés avec 0,1 % molaire d’Ag+ et une autre espèce dopante (Cu2+,



433

Zn2+ ou H2O2) possèdent des propriétés antibactériennes significatives. Cependant, l’échantillon

monodopé avec 0,1 % molaire d’ions Ag+ présentait également des propriétés antibactériennes

importantes (voir section V.4.2 du chapitre V) : il sera donc nécessaire d’effectuer des tests

complémentaires, en perspective de ce travail, pour déterminer si l’activité antibactérienne de

formulations impliquant la présence supplémentaire d’ions Cu2+ ou Zn2+ ou de H2O2 revêt un

caractère synergique et pourrait éventuellement permettre de réduire la quantité d’argent.

Enfin, concernant l’échantillon synthétisé avec Cu2+ et Zn2+ (échantillon

1j-0,1%Cu/0,1%Zn), les résultats du test 1 (Figure VI.173) indiquent un nombre de colonies de

S. aureus formées significativement inférieur à celui observé pour l’échantillon non dopée

attestant dans ce cas d’une activité antibactérienne de l’échantillon. En revanche, le test 2

(Figure VI.173) révèle un nombre de colonies formées pour l’échantillon 1j-0,1%Cu/0,1%Zn

relativement similaire à celui comptabilisé pour l’échantillon non dopé, se montrant donc ici

inefficace pour lutter contre S. aureus. Il apparaît cependant difficile d’expliquer une telle

variation sans analyses plus approfondies.

VI.2.5. Conclusion

Nous avons vu dans cette seconde partie de chapitre que la synthèse d’apatites

nanocristallines en présence de plusieurs espèces potentiellement antibactériennes (Cu2+, Zn2+,

Ag+ ou H2O2) apparaissait possible. Les codopages que nous avons testés ne semblent pas

engendrer de modifications physico-chimiques particulières sur la phase apatitique autres que

celles déjà observées individuellement pour chaque espèce dopante. En perspective, des

caractérisations physico-chimiques supplémentaires restent nécessaires pour quantifier chaque

espèce présente et évaluer leurs influences au sein des nanocristaux d’apatite. Des synthèses

additionnelles seront également nécessaires pour déterminer les teneurs maximales de chaque

espèce qu’il est possible d’incorporer aux apatites nanocristallines dans ces conditions de

codopage.

Des analyses complémentaires (d’évaluation de la cytotoxicité ainsi que d’autres tests

microbiologiques pour des teneurs croissantes en agents actifs) seront aussi nécessaires afin

de rechercher les concentrations optimales pour garantir à la fois une activité antibactérienne

effective et une cytotoxicité la plus faible possible. Néanmoins, les échantillons codopés en

présence d’ions Ag+ avec soit les ions Cu2+, Zn2+ ou avec H2O2 s’avèrent être de bons

candidats pour réaliser des biocéramiques à base d’apatites nanocristallines présentant une

activité antibactérienne avec possibilité de réduire éventuellement la teneur en ions Ag+

nécessaire.

Conclusion

générale

Conclusion générale

435

Ces travaux de thèse ont porté sur l’élaboration, la caractérisation physico-chimique, et

l’évaluation (micro-)biologique d’apatites nanocristallines phospho-calciques biomimétiques

enrichies en ions potentiellement antibactériens, parmi Zn2+, Cu2+, Ag+ ou des espèces

oxygénées de type peroxyde, destinées à fournir à terme des biocéramiques luttant contre les

infections post-opératoires en sites osseux. Tout au long de ce travail, nous nous sommes

attachés à préparer des systèmes apatitiques monophasés, et à déterminer l’effet de tels

dopages sur les caractéristiques physico-chimiques des apatites obtenues.

L’étude des systèmes non dopés a tout d’abord permis d’élaborer la « carte

d’identité » d’apatites nanocristallines biomimétiques de synthèse. Nous pouvons noter que le

faible état de cristallinité que présentent ces composés, au même titre que les apatites

biologiques composant le tissu osseux, est en lien avec les dimensions nanométriques des

cristaux les constituant, et avec un degré de désordre cristallin que nous avons tenté d’évaluer

à partir des données de diffraction des rayons X. La composition chimique globale révèle par

ailleurs la présence de lacunes en sites cationiques (Ca2+) et en sites « hydroxyde » (OH-) ainsi

que la présence d’ions hydrogénophosphate (HPO42-) en remplacement de certains ions

phosphate (PO43-). Les techniques de spectroscopies vibrationnelles (FTIR et Raman) ont par

ailleurs été exploitées afin de mettre en évidence, en lien avec des travaux antérieurs, la

présence d’environnements phospho-calciques non-apatitiques en surface des nanocristaux

d’apatite, puis d’en suivre l’évolution des quantités relatives en différentes espèces, apatitiques

et non-apatitiques.

L’analyse de l’influence des paramètres de synthèse a indiqué qu’ils jouent un rôle

majeur sur les caractéristiques physico-chimiques des apatites obtenues. Ainsi, l’augmentation

du temps de maturation en solution ou de la température de maturation engendre une

amélioration de l’état de maturation des apatites, comprenant une amélioration de l’état de

cristallinité, une composition chimique plus proche de la stœchiométrie et des environnements

non-apatitiques moins développés. D’un autre côté, un pH alcalin génère une carbonatation des

échantillons tandis qu’un pH acide engendre la formation de brushite (CaHPO4.2H2O). La

nature des contre-ions des sels utilisés lors de la synthèse détermine également certaines

caractéristiques des apatites nanocristallines précipitées. Si certains ions comme NH4+ ou NO3

-

ne semblent pas interagir avec le précipité formé, d’autres comme Na+ peuvent être incorporés

au composé. Dans la mesure où Na+ apparaît être un inhibiteur de croissance cristalline pour

les apatites, sa présence dans le milieu réactionnel ne doit donc pas être sous-estimée.


436

Toutes les informations collectées à partir des résultats obtenus en variant les

paramètres de synthèse montrent qu’il est important, lorsque la préparation de matériaux à

base d’apatites nanocristallines est envisagée, de prendre en compte l’influence de chaque paramètre de synthèse. Mais il s’avère également possible de moduler les caractéristiques

physico-chimiques des apatites nanocristallines en agissant sur ces paramètres pour les adapter aux conditions d’utilisation envisagées, comme par exemple pour une libération

contrôlée de principes actifs, pour obtenir des vitesses de dégradation in vitro ou in vivo

modulables,… De plus, ces données ont permis d’appréhender plus aisément les phénomènes

observés par la suite lors de l’incorporation des éléments dopants.

L’influence de certains post-traitements sur les caractéristiques physico-chimiques des

apatites nanocristallines non dopées a également été évaluée dans ce travail. Il apparaît

notamment que le mode de stockage de tels composés est un paramètre pouvant s’avérer

capital lorsque l’on envisage l’utilisation ou la commercialisation de ces biocéramiques. Un

stockage à température ambiante peut notamment générer une hydroxylation et une

décarbonatation progressive des échantillons alors qu’une conservation à basse température

(testée ici en congélateur à -18 þC) n’engendre pas d’évolution détectable. Dans ce contexte, il

n’apparaît pas surprenant d’observer des modifications physico-chimiques lors de traitements

thermiques même à des températures ≤ 100 þC). Une dénaturation partielle des

environnements non-apatitiques de surface semble être consécutive à ces traitements en

température. Outre la température, le taux d’humidité environnant se révèle également être un

paramètre particulièrement influant sur les mécanismes d’évolution des apatites. Dans la

mesure où le taux d’humidité régit certains phénomènes de gain ou de perte d’eau au sein des

échantillons, il apparaît vraisemblablement responsable des modifications physico-chimiques

observées dans ces conditions. La remise en suspension dans divers milieux aqueux

d’échantillons d’apatites nanocristallines non dopées et préalablement lyophilisés a été étudiée.

Il s’avère qu’une ré-immersion de tels composés lyophilisés génère non seulement la

réactivation mais également l’accélération des processus de maturation, et ce même en milieu

exempt de calcium ou de phosphate. Une étude sur la mise en forme de tels échantillons a

également été réalisée. Elle révèle qu’un pastillage par compression uniaxiale (par exemple à

80 MPa) à température ambiante est possible, probablement via des interactions se produisant

entre les couches hydratées non apatitiques de surface des nanocristaux d’apatites, sans pour

autant altérer les caractéristiques physico-chimiques des composés. Enfin, deux modes de

stérilisation (en voie sèche à 150 °C ou par plasma de H2O2) ont été testés et évalués pour leur

incidence sur les caractéristiques physico-chimiques des apatites nanocristallines. Ces

analyses montrent qu’il est préférable d’éviter les procédés impliquant des températures

« élevées » (typiquement > 100 °C) même sur des périodes de temps courtes. Dans tous les

cas, il sera préférable d’évaluer l’incidence physico-chimique potentielle de la méthode de

stérilisation sélectionnée.


437

Bien que ces composés apparaissent plutôt sensibles aux conditions dans lesquelles ils

sont utilisés (ré-immersion en solution, température,…), ils n’en restent pas moins prometteurs

quant à une utilisation en ingénierie tissulaire de l’os. En effet, les différentes modifications

physico-chimiques observées au cours de ces divers post-traitements sont tout de même

limitées et ne permettent pas de perdre les caractères nanocristallin, non-stœchiométrique,

hydraté et réactif (via une couche hydratée non-apatitique de surface) de telles apatites, dont

les caractéristiques physico-chimiques demeurent comparables à celles du minéral osseux,

contrairement au cas de l’hydroxyapatite stœchiométrique.

Il n’en demeure pas moins que cette étude met en exergue la nécessité de suivre et

contrôler les effets de chaque étape de synthèse ou de post-traitement réalisé sur de tels

composés apatitiques biomimétiques afin d’identifier / maîtriser toute modification physico-

chimique.

L’évaluation de tous ces paramètres (de synthèse et de post-traitement) réalisée sur les

échantillons d’apatites nanocristallines a permis de servir de base aux études sur les

échantillons dopés et d’appréhender plus aisément l’influence de l’incorporation des ions

dopants sur les caractéristiques physico-chimiques des composés.

L’étude des apatites nanocristallines synthétisées en présence d’ions Zn2+ ou d’ions Cu2+ a révélé que les deux ions agissaient de manière très similaire sur les mécanismes

de formation et de croissance des nanocristaux. Il s’avère qu’ils jouent un rôle d’inhibiteur de

croissance cristalline pour les apatites, voire d’inhibiteur de maturation suivant les conditions de

synthèse.

Ainsi, l’incorporation de teneurs en ions Zn2+ ou Cu2+ croissantes dans le milieu de

précipitation (pour des synthèses réalisées à température ambiante et à pH = 7,2 tamponné par

un excès d’ions phosphate apporté par (NH4)2HPO4) conduit à la formation d’apatites

nanocristallines enrichies en zinc ou en cuivre dont l’état de maturation diminue, c'est-à-dire

dont l’état de cristallinité baisse (dimensions des cristallites plus petites et désordre cristallin

plus important), la composition chimique s’écarte de la stœchiométrie et les environnements

non-apatitiques de surface des nanocristaux sont plus développés. Dans ces conditions de

synthèse, la teneur maximale en ions (zinc ou cuivre) qu’il est possible d’atteindre pour

conserver un système d’apatites nanocristallines monophasées est de l’ordre de 5 % molaire

(pourcentage par rapport aux cations totaux) mais dépend du temps de maturation en solution.

Au-delà, le zinc favorise la formation de phases secondaires de type NH4ZnPO4 et le cuivre

favorise la formation de brushite (CaHPO4.2H2O, potentiellement enrichie en cuivre).


438

L’augmentation de la température de maturation permet de favoriser la formation

d’apatites nanocristallines monophasées à des teneurs en zinc ou en cuivre supérieures à 5 %

molaire. Cependant, l’influence de la température sur les caractéristiques physico-chimiques

des apatites nanocristallines est importante et de faibles états de maturation ne sont pas

atteignables dans ces conditions.

Dans le cas du cuivre, un pH alcalin (pH = 8) permet également d’obtenir des teneurs en

ions Cu2+ incorporées supérieures, au moins jusqu’à 15 % molaire mais les mécanismes

d’incorporation des ions Cu2+ semblent différents dans ces conditions.

Le changement de la nature du contre-ion du sel de phosphate de départ utilisé lors de la

synthèse permet également d’atteindre des teneurs maximales en zinc ou en cuivre plus

importante que 5 % molaire. Ces teneurs sont de 17 et 10 % molaire respectivement pour le

zinc et le cuivre en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ. Il apparaît cependant

que la co-incorporation d’ions sodium et d’ions zinc ou cuivre dans ces conditions engendre des

modifications particulières (abaissement de l’état de cristallinité, diminution des teneurs en ions

OH- et HPO42- ainsi qu’augmentation du rapport « cations / phosphore ») au niveau des

caractéristiques physico-chimiques des apatites.

Différents tests ont également été réalisés pour obtenir des apatites nanocristallines dont

l’enrichissement en cuivre serait effectué préférentiellement en surface des nanocristaux dans

le but de potentiellement libérer les ions cuivre pendant les premiers moments suivant

l’intervention chirurgicale en site osseux tout en limitant la teneur en ions cuivre « étrangers ».

Deux méthodes ont alors été envisagées : une impliquant des échanges ioniques de surface

réalisée par immersion d’un échantillon d’apatite nanocristalline dans une solution contenant

des ions Cu2+ ; une autre pour laquelle les ions cuivre ont été ajoutés en cours de maturation

impliquant ainsi deux étapes successives de croissance des cristaux (la première en absence

de cuivre et la seconde avec). La première méthode, en raison de l’acidité des solutions de

cuivre, a nécessité des conditions expérimentales relativement contraignantes utilisant une

membrane de dialyse pour réguler les cinétiques d’échange entre les différentes espèces. Cette

méthode permet effectivement d’obtenir des échantillons d’apatites nanocristallines enrichies en

cuivre, cependant l’incorporation des ions cuivre ne semble pas être localisée uniquement en

surface des cristaux mais également affecter le cœur apatitique. La même observation peut être

faite pour les échantillons préparés selon la seconde méthode : bien que des teneurs finales en

cuivre importantes puissent être obtenues (15 % molaire) : il semble qu’une partie des ions

cuivre soit localisée dans des environnements plus profonds des nanocristaux (cœur

apatitique).


439

Les phénomènes observés pour les synthèses d’apatites nanocristallines réalisées en

présence de cuivre ou de zinc sont différents de ceux observés en présence d’argent. En

présence d’ions Ag+, la formation d’apatites nanocristallines monophasées a été obtenue pour

des teneurs allant jusqu’à 4 % molaire. Au-delà, une phase secondaire d’Ag3PO4 se forme.

Pour atteindre cette valeur de 4 %, la teneur en argent initialement introduite en solution lors de

la synthèse doit être supérieure mais dépend du temps de maturation en solution (plus le temps

de maturation est long, plus il y a d’argent incorporé dans les échantillons ; dans la limite de

4 % molaire dans le composé final). L’incorporation d’argent ne génère pas de modification

significative de l’état de maturation des apatites nanocristallines. En revanche, il est possible

d’observer, en fonction des conditions, une baisse des teneurs en ions OH- qui a été attribuée

au fait que l’ion Ag+ ne possède qu’une seule charge positive (comparée aux deux charges

positives de l’ion Ca2+).

Des conditions acides de synthèse (pH = 6.5) ou la présence d’ions Na+ dans le milieu

de réaction (utilisation de Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ) favorisent la formation

d’Ag3PO4 alors que des conditions basiques (pH = 8.5) permettent de conserver un système

composé d’apatite nanocristalline monophasée. La modification du pH de maturation ne semble

pas modifier les mécanismes d’incorporation des ions Ag+ dans le composé.

Des tests préliminaires d’obtention d’apatites nanocristallines en présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu de précipitation ont également été effectués. Ils révèlent

que l’obtention d’apatites nanocristallines monophasées est possible, même à des

concentrations en H2O2 importantes en solution. La présence de H2O2 dans le milieu

réactionnel engendre cependant une amélioration de l’état de cristallinité de l’apatite,

principalement due à l’élargissement des cristallites dans les directions (hk0). Des espèces

chimiques peroxydées telles que les ions O22-, voire O2

-, O32- ou O4

2-, semblent être présents

dans les échantillons au niveau des tunnels apatitiques en remplacement des ions OH-. Des

systèmes apatitiques bien cristallisés ont également été préparés en milieu eau / peroxyde

d’hydrogène. De tels systèmes ont été synthétisés par hydrolyse du βTCP en présence de H2O2

dans le milieu réactionnel. Cependant, il s’avère que dans ces conditions, l’hydrolyse complète

du βTCP en apatite ne se produit que pour de fortes teneurs en H2O2 (75 % volumique) ou à

des températures relativement élevées (150 °C).

Enfin, une première série d’expérimentations impliquant l’incorporation simultanée (codopage) de deux agents ayant des propriétés potentiellement antibactériennes, parmi Zn2+, Cu2+, Ag+ ou les composés peroxydés, a été menée. Une nouvelle fois, l’obtention

d’apatites nanocristallines monophasées a été possible et les modifications physico-chimiques

engendrées par ces conditions de synthèse semblent résulter de l’effet cumulé de chaque

agent incorporé.


440

Divers tests préliminaires de libération d’ions en conditions statiques ou dynamiques

ont été réalisés au cours de ce travail, pour les systèmes enrichis en cuivre ou en argent qui se

sont avérés présenter des effets antibactériens significatifs. Si les quantités d’ions cuivre

apparaissent difficilement détectables à partir des techniques de dosages utilisées, la libération

effective d’ions argent a pu être déterminée à partir de ces tests, révélant des concentrations en

argent libérées, en milieu aqueux « simple », de l’ordre de 1 à 3 % des teneurs initialement

présentes dans le solide. Des tests de libération de tels ions à partir d’apatites dopées

immergées dans des milieux plus complexes (fluides biologiques simulés, milieux de culture

cellulaires…) devront compléter cette étude préliminaire.

Afin d’évaluer l’éventuelle toxicité des biocéramiques synthétisées dans ce travail vis-à-

vis de cellules ostéogéniques, des tests de cytotoxicité (réalisés en collaboration avec l’institut

Fraunhofer IGB de Stuttgart, Allemagne) et de résorption ostéoclastique (expérimentations

réalisées au cours d’un séjour à l’IGFL de Lyon) ont été menés. La mise en contact de cellules

de type ostéoblaste (cellules de la ligné CAL-72) avec des échantillons d’apatites

nanocristallines n’a pas révélée d’altération du développement cellulaire, nous permettant de

déterminer les limites de cytotoxicité pour les différents systèmes étudiés (typiquement menant

à une teneur en ion cuivre ou argent de l’ordre de 0,5 % molaire par rapport aux cations, le zinc

ne s’étant pas avéré conférer une cytotoxicité détectable aux échantillons). En revanche, il est

important de prendre en compte la potentielle acidification des milieux de culture lorsque des

échantillons d’apatites nanocristallines biomimétiques sont immergés, afin d’éviter d’altérer les

résultats des tests biologiques. Une étude sur le pré-équilibrage des échantillons a donc été

menée dans ce travail de thèse afin de limiter ces phénomènes d’acidification. La méthode

choisie au final consiste à employer, lors de la synthèse des apatites nanocristallines, une

solution basique de Na3PO4 (à pH = 11) au moment de la filtration avant l’étape de rinçage.

Des études préliminaires destinées à évaluer la capacité de cellules ostéoclastes à

résorber différentes matrices minérales phosphocalciques (apatites nanocristallines, HAP et

βTCP) ont également été menées. Les premiers résultats indiquent que l’activité cellulaire de résorption des ostéoclastes semble être maintenue sur des échantillons d’apatites nanocristallines, à l’instar des échantillons de βTCP, alors qu’elle n’est pas observée sur des

échantillons d’HAP. Les apatites nanocristallines pourraient donc être utilisées comme

biomatériau résorbable pour des applications osseuses.

Enfin, la capacité des apatites nanocristallines à lutter contre le développement de micro-organismes fréquemment impliqués lors d’infections nosocomiales en site osseux a été

évaluée (en collaboration avec l’institut Fraunhofer IGB à Stuttgart). Les principales souches

bactériennes étudiées dans ce travail ont été S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, et

S. epidermidis. Une souche de A. denticolens a également été testée, mais plus

ponctuellement.


441

Nos résultats révèlent que les apatites nanocristallines phospho-calciques non dopées

ne possèdent pas de propriétés antibactériennes intrinsèques détectables. L’ajout de zinc ne

semble pas non plus permettre à ces apatites de réduire le développement des bactéries, tout

au moins dans les conditions de tests utilisées dans ce travail. En revanche, lorsque du cuivre

ou de l’argent sont incorporés à ces apatites, les tests se montrent plus concluants et une activité antimicrobienne à pu être observé après mise en contact du matériau avec les micro-organismes et ce même à de faibles taux en ions dopants (cuivre, argent). Il faut

toutefois noter que les conditions de pré-traitement (pré-équilibrage) des échantillons s’avère

être un facteur à ne pas négliger. Par ailleurs, une variation d’activité antibactérienne a été

notée en fonction de la nature de la souche bactérienne. Cette constatation peut ouvrir des

perspectives pour évoluer vers une médecine plus « à la carte » visant à adapter la composition

du biomatériau implanté (et donc la nature et la dose d’agent ionique antibactérien incorporé)

en fonction du type de chirurgie (orthopédie, maxillo-faciale…), du site d’implantation, des

conditions opératoires, voire du passé infectieux du patient. Au final, les échantillons d’apatites nanocristallines enrichies en argent semblent en particulier fournir un système antibactérien « robuste » et efficace pour les applications visées. Les échantillons dopés au cuivre ont

également montré certaines propriétés antimicrobiennes significatives, et des tests

complémentaires seront nécessaires pour identifier plus spécifiquement les modes d’action et

les limitations de l’utilisation de cet ion dans une visée antibactérienne associée à des apatites

nanocristallines.

En recoupant les données obtenues avec les tests de cytotoxicité et les tests

antibactériens, il apparaît qu’une apatite nanocristalline synthétisée avec une teneur en argent de 0,2 % molaire puisse présenter les propriétés optimales (sur la base de ce travail de thèse) pour les applications visées résultantes d’un compromis entre une faible toxicité vis-à-vis des cellules ostéogéniques et une activité antibactérienne notoire en lien avec les infections nosocomiales en sites osseux post-opératoires.

Ce travail a donc permis de trouver des pistes viables pour la réalisation de biomatériaux

de comblement osseux à caractéristiques antibactériennes intrinsèques, et de comparer les

différentes approches entre elles.

En perspective à court terme des résultats présentés dans ce manuscrit, des tests in vivo sont sur le point d’être réalisés sur un modèle de rat (calvaria) avec des

échantillons d’apatites nanocristallines enrichies en argent (avec une teneur de 0,2 %), afin en

particulier d’en étudier le potentiel ostéoconducteur.

Annexes

Annexes

443

Annexe II.1 : Spectres FTIR d’apatites nanocristallines à temps de maturation en solution croissant, compris entre 20 min et 20 jours

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

20 jours

6 jours

3 jours

1 jour

15 heures

6 heures

Ab

so

rba

nce


20 minutes

Temps de

maturation

Annexe II.2 : Composition du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

Components Concentration (mg/L)

Concentration (mmol/L)

Glycine 30 0,4

L-Arginine hydrochloride 84 0,398

L-Cystine 2 HCl 63 0,201

L-Glutamine 580 3,97

L-Histidine hydrochloride-H2O 42 0,2

L-Isoleucine 105 0,802

L-Leucine 105 0,802

L-Lysine hydrochloride 146 0,798

L-Methionine 30 0,201

L-Phenylalanine 66 0,4

L-Serine 42 0,4

L-Threonine 95 0,798

L-Tryptophan 16 0,0784

L-Tyrosine 72 0,398

L-Valine 94 0,803

Choline chloride 4 0,0286

D-Calcium pantothenate 4 0,00839

Folic Acid 4 0,00907

Niacinamide 4 0,0328

Pyridoxine hydrochloride 4 0,0196

Riboflavin 0,4 0,00106

Thiamine hydrochloride 4 0,0119

i-Inositol 7,2 0,04

Calcium Chloride (CaCl2.2H2O) 264 1,8

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3.9H2O) 0,1 0,000248

Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) 200 0,813

Potassium Chloride (KCl) 400 5,33

Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 3700 44,05

Sodium Chloride (NaCl) 6400 110,34

Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4.2H2O) 141 0,916

D-Glucose (Dextrose) 4500 25

Phenol Red 15 0,0399

Reference : Dulbecco, R. and Freeman, G. (1959) Virology 8:396.

Acides Aminés

Vitamines

Sels Inorganiques

Autres Composés

Annexes

445

Annexe II.3 : Protocole de test au rouge neutre (tests de cytotoxicité) en utilisant les kits de coloration Xenometrics

Les tests au rouge neutre sur les cellules ostéogéniques CAL-72 pour l’évaluation de la

cytotoxicité ont été réalisés en utilisant des kits de coloration cellulaire « In cytotox NR » de

marque Xenometrics.

Ces kits se composent de 4 solutions :

- Solution NR I = solution de lavage

- Solution NR II = solution de coloration (rouge neutre)

- Solution NR III = solution de fixation

- Solution NR IV = solution de solubilisation

Après incubation des cellules pendant 48 heures à 37 °C avec 5 % de CO2 sur plaque de

culture 96 puits, le milieu de culture est enlevé et la coloration des cellules se déroule comme

suit :

- Lavage des cellules avec la solution NR I (200 µL par puits)

- Coloration des cellules avec la solution NR II diluée à 1 :50 (100 µL par puits) pendant

3 heures à 37 °C

- Elimination du surnageant

- Fixation des cellules avec la solution NR III (100 µL par puits) pendant 5 minutes

- Élimination de la solution de fixation

- Ajout de la solution NR IV (200 µL par puits) et obtention d’une suspension colorée

- Analyse de la suspension par spectrophotométrie à 540 nm

Annexes

446

Annexe II.4 : Protocole de préparation et de mise en culture des ostéoclastes

Pour évaluer l’activité ostéoclastique vis-à-vis de différents matériaux phosphocalciques

dont des apatites nanocristallines, une étude préliminaire a été réalisée à l’IGFL (Institut de

Génomique Fonctionnelle de Lyon) dans les locaux de l’ENS de Lyon en collaboration avec des

chercheurs du département de Biologie cellulaire et physiologie osseuse. Pour étudier des

ostéoclastes, la préparation et la culture des cellules doivent être réalisées juste avant le début

des tests en raison de la durée de vie relativement courte de ces cellules (environ 48 heures).

Des cellules précurseurs sont extraites de la moelle osseuse chez la souris puis incuber avec

les facteurs nécessaires (cytokines) à la différenciation/prolifération/fusion des cellules

précurseurs en ostéoclastes. Le protocole d’extraction et de préparation est le suivant :

- Extraire les tibias et les fémurs des deux pattes arrière de la souris (coupe au niveau de

l’articulation de la hanche et du pied, en enlevant un maximum de tissus mous) puis

les conserver dans du PBS (tampon phosphate salin pour Phosphate Buffer Saline)

- Récupérer la moelle osseuse des os extraits à l’aide d’une seringue contenant du milieu

de culture (αMEM + antibiotiques + sérum bovin + albumine)

- Dissocier les cellules de la moelle dans le milieu en aspirant puis expulsant plusieurs

fois (flush) la solution récupérée (moelle + milieu de culture) avec la seringue

- Centrifuger la solution à 1500 tr/min pendant 5 minutes (un culot rouge foncé se forme)

- Écarter le surnageant puis rajouter du milieu culture (+ flush)

- Filtrer la solution sur une grille de 100 µm

- Préparer une solution LSM (pour Lymphocyte Separation Medium) pour servir de milieu

gradient

- Ajouter délicatement la solution contenant la moelle et le milieu de culture au milieu

gradient sans qu’ils se mélangent

- Centrifuger à 2500 tr/min pendant 20 minutes (avec un départ et un ralentissement lent)

- Récupérer l’anneau blanc de globules blancs qui s’est formé

- Mettre les globules blancs dans du milieu de culture

- Centrifuger à 1500 tr/min pendant 5 minutes puis écarter le surnageant

- Ajouter 1 mL de milieu de culture supplémenté des cytokines M-CSF et RANKL

- Compter les cellules (sur grille de Malassez)

- Répartir 3,5.105 cellules par puits dans une boîte de 6 puits

- Mettre à incuber à l’étuve à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 3 à 4 jours (en surveillant

régulièrement l’avancement de la différenciation/prolifération/fusion des cellules)

Annexes

447

Annexe III.1 : Protocole de dosage des ions NH+ par la méthode du phénate

Principe

Les ions ammonium réagissent en milieu basique avec le phénol pour donner un composé bleu, l’indophénol. La réaction est catalysée par la présence de nitroprussiate [Fe(CN)5NO]2-. Le dosage se fait par spectrophotométrie visible à 635nm.

Préparation des réactifs

- Réactif 1 : Dissoudre environ 5 g de phénol (C6H6O) + 3 mg de nitroprussiate de sodium (Na2[Fe(CN)5NO]) dans 100 mL d’eau distillée. Attention cette préparation ne semble pas stable à long terme (plusieurs semaines). - Réactif 2 : Dissoudre 5 g de soude (NaOH) dans 250 mL d’eau distillée puis ajouter 1,25 mL d’hypochlorite de sodium (NaOCl) à 3 N (= environ 14%).

Réalisation de la courbe d’étalonnage

Allumer le spectrophotomètre à la longueur d’onde de 635 nm. Préparer un bain marie à 40 °C environ. Préparer une solution mère S0 à 4.10-4 mol/L en ions NH4+ à partir de (NH4)2HPO4 et d’eau distillée. Préparer ensuite 5 solutions filles S1, S2, S3, S4 et S5 dans des fioles de 10 mL avec :

- Pour S1 : Prendre 0,5 mL de la solution S0 + 0,9 mL du réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2. Compléter à l’eau désionisée. (cS1 = 2.10-5M en NH4+)

- Pour S2 : Prendre 1 mL de la solution S0 + 0,9 mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2. Compléter à l’eau désionisée. (cS2 = 4.10-5M en NH4+)

- Pour S3 : Prendre 2.5 mL de la solution S0 + 0,9 mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2. Compléter à l’eau désionisée. (cS3 = 1.10-4M en NH4+)

- Pour S4 : Prendre 4 mL de la solution S0 + 0,9mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2. Compléter à l’eau désionisée. (cS4 = 1.6.10-4M en NH4+)

- Pour S5 : Prendre 5 mL de la solution S0 + 0,9 mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2. Compléter à l’eau désionisée. (cS5 = 2.10-4M en NH4+)

Placer les solutions filles au bain marie pendant 30 minutes environ. Puis laisser refroidir. Mesurer l’absorbance (Abs) de chaque solution fille à la longueur d’onde de 635 nm, et tracer la droite Abs = f (cþ NH4+) pour obtenir la courbe d’étalonnage.

Annexes

448

Analyse des échantillons

Préparer une solution mère à partir de 100 mg de poudre de l’échantillon (dissout avec 1 mL d’HClO4) dans 100mL. Prélever 0,5 mL de solution mère + 0,9 mL du réactif 1 + 0,9 mL du réactif 2 pour les mettre dans une fiole de 10 mL complétée à l’eau distillée. Placer, ensuite, l’échantillon à analyser au bain-marie pendant 30 minutes environ puis laisser refroidir. Mesurer l’absorbance des échantillons et les comparer à la droite d’étalonnage pour trouver leurs concentrations en NH4+.

Annexe III.2 : Micrographies MEB des échantillons a) 3j-67%Zn et b) 3j-100%Zn (synthétisés avec (NH4)2HPO4 avec 3 jours de maturation et en présence de 67 et 100 % molaire de zinc)

10 µm

Phase NH4ZnPO4

10 µm

Phase φ1a)

10 µm10 µm10 µm

Phase NH4ZnPO4

10 µm10 µm10 µm

Phase φ1a)a)

20 µm 2 µm

b)

20 µm20 µm20 µm 2 µm2 µm2 µm

b)b)

Annexes

449

Annexe III.3 : Spectres FTIR des échantillons synthétisés avec (NH4)2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence de teneurs initiales en zinc croissantes et à des temps de maturation de a) 20 minutes, b) 3 jours et c) 20 jours

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0j-100%Zn

Ab

so

rba

nce


0j-1%Zn

0j-5%Zn

0j-10%Zn

0j-67%Zn

Maturation 20 minutesa)

Référencede

l'échantillon

Annexes

450

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

3j-100%Zn

Ab

so

rba

nce


3j-10%Zn

3j-67%Zn

Maturation 3 joursb)

Référencede

l'échantillon

3j-5%Zn

3j-1%Zn

Annexes

451

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

20j-1%Zn

20j-5%Zn

20j-10%Zn

20j-67%Zn

Ab

so

rba

nce


Maturation 20 joursc)

Référencede

l'échantillon

Annexes

452

Annexe III.4 : Spectres FTIR des échantillons synthétisés avec Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence de teneurs initiales en zinc croissantes et à des temps de maturation de a) 1 jour, b) 3 jours et c) 20 jours

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

1j-20%Zn-Na

1j-15%Zn-Na

1j-10%Zn-Na

1j-5%Zn-Na

1j-1%Zn-Na

Ab

so

rba

nce


Non dopée

Maturation 1 jour

Référencede

l'échantillon

a)

Annexes

453

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Non dopée

3j-1%Zn-Na

3j-5%Zn-Na

3j-10%Zn-Na

3j-17%Zn-Na

3j-25%Zn-Na

3j-50%Zn-Na

3j-67%Zn-Na

Ab

so

rba

nce


Maturation 3 joursb)Référence

del'échantillon

3j-100%Zn-Na

Annexes

454

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

20j-17%Zn-Na

20j-10%Zn-Na

20j-5%Zn-Na

Ab

so

rba

nce


c) Maturation 20 jours

Référencede

l'échantillon

20j-1%Zn-Na

Non dopée

Annexes

455

Annexe III.5 : Spectres FTIR des échantillons synthétisés avec Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence d’une teneur initiale en zinc de 5% et à des temps de maturation croissant

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0j-5%Zn-Na

1j-5%Zn-Na

3j-5%Zn-Na

6j-5%Zn-Na

Ab

so

rba

nce


Synthétisées avec 5 % molaire de zinc

Référencede

l'échantillon

20j-5%Zn-Na

Annexes

456

Annexe III.6 : Spectres Raman des échantillons synthétisés avec Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence de teneurs initiales en zinc de 0, 5 et 10 % molaire et à des temps de maturation de a) 3 jours et b) 20 jours

500 1000 1500 3000 36000

500

1000

1500

2000

2500In

ten

sité

(co

up

s)


3j-10%Zn-Na

3j-5%Zn-Na

Maturation 3 jours

Référencede

l'échantillon

Non dopée

a)

Annexes

457

500 1000 1500 3000 36000

500

1000

1500

2000

2500

20j-10%Zn-Na

20j-5%Zn-Na

Inte

nsité

(co

up

s)


Maturation 20 jours

Référencede

l'échantillon

Non dopée

b)

Annexes

458

Annexe IV.1 : Spectres FTIR des apatites nanocristallines synthétisées en présence de 5 % molaire en cuivre, en utilisant Na2HPO4 (à température ambiante et pH = 7,2) et avec des temps de maturation croissant compris entre 20 minutes et 20 jours

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

20j-5%Cu-Na

6j-5%Cu-Na

3j-5%Cu-Na

1j-5%Cu-Na

Ab

so

rba

nce


0j-5%Cu-Na

Référencede

l'échantillon

Teneur initiale en cuivre de 5 % molaire

Synthèse avec Na2HPO

4

Annexes

459

Annexe IV.2 : Diagrammes DRX de l’hydroxysulfate de cuivre (Cu4(OH)6SO4, Brochantite) et de l’hydroxynitrate de cuivre (Cu4(OH)6(NO3)2, Gerhardtite)

10 20 30 40 50 60 70 80 900

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Cu4(OH)

6(NO

3)

2

Gerhardtite, monoclinique, P21/m

Inte

nsité

(u

. a

.)

2 (degré) (Co

)

Cu4(OH)

6SO

4

Brochantite, monoclinique, P21/c

Annexes

460

Annexe IV.3 : Spectres FTIR de l’hydroxysulfate de cuivre (Cu4(OH)6SO4, Brochantite) et de l’hydroxynitrate de cuivre (Cu4(OH)6(NO3)2, Gerhardtite)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Cu4(OH)

6(NO

3)

2A

bso

rba

nce


Cu4(OH)

6SO

4

Annexes

461

Annexe V.1: Protocole de dosage des ions Ag+ par une méthode spectrophotométrique utilisant des kits de dosage de marque HACH

Les kits de réactif (DR2010 de marque HACH) se composent de 3 réactifs distincts

conditionnés dans des sachets pré-dosés :

- Le réactif 1 (poudre) contenant notamment de l’acide citrique et du borate de

potassium

- Le réactif 2 (liquide) contenant notamment du 1-méthyl-2-pyrrolidinone

- Le réactif 3 (poudre) contenant du thiosulfate de sodium

Ces kits permettent de doser des concentrations en argent comprises entre 0,02 et 0,70 mg/L (soit entre 0,2.10-6 et 6,5.10-6 mol/L) et peuvent être utilisés en présence de divers

ions tels que les ions calcium, cuivre, zinc, nickel, aluminium, cadmium, chlorure, fer,

manganèse, magnésium,…

Le volume minimum de solution à doser doit être de 50 mL et son pH compris entre 9 et 10. Il est possible d’ajuster le pH avec une solution de soude (NaOH) ou éventuellement

avec de l’acide nitrique (HNO3). Attention, il ne faut pas utiliser de pHmètre directement dans la

solution à doser pour éviter d’éventuelles pollutions.

La longueur d’onde utilisée pour le spectrophotomètre est de 560 nm.

Le protocole de dosage est le suivant :

Dans un premier temps préparer des solutions étalons à partir de nitrate d’argent à des

concentrations en Ag+ de 0,25.10-6, 0,5.10-6, 1.10-6 et 5.10-6 mol/L dans de l’eau ultrapure dont

le pH a été amené à une valeur entre 9 et 10 avec une solution de NaOH 0,01 mol/L (avec un

volume minimum de 50 mL). Faire de même avec une solution exempte d’ions Ag+. Vérifier le

pH final des solutions et l’ajuster si nécessaire (prendre en compte la dilution).

Préparer la solution contenant les ions Ag+ à quantifier et vérifier /ajuster le pH (volume

minimum 50 mL).

Dans un bécher bien sec, verser le contenu d’une capsule de réactif 1 (en évitant d’en

répandre sur les parois) puis verser le contenu d’une capsule de réactif 2 de sorte à mouiller toute la poudre du réactif 1 avec le réactif 2. Ajouter à cela 50 mL de solution à doser (solutions étalons ou solution inconnue) à l’aide d’une pipette ou d’une balance (le volume ou la

masse de solution doivent être déterminés exactement). Agiter et vérifier que tout le réactif 1 est

bien dissout de manière homogène. La solution se colore et possède une couleur comprise

entre l’orange et le violet suivant la teneur en Ag+.

Annexes

462

Dans un second bécher, prélever 25 mL de la solution précédemment préparée (celle

contenant les réactifs 1 et 2 et la solution à doser) puis y ajouter le contenu d’un sachet de

réactif 3. La solution se décolore (elle conserve néanmoins une couleur proche du jaune).

Conserver les 25 mL restants de la solution à doser (contenant les réactifs 1 et 2 et la solution

à doser). Attendre 2 minutes.

Utiliser cette dernière solution (contenant le réactif 3) pour réaliser le « blanc » (absorbance =

0) de l’échantillon (attention il faut faire ce blanc pour chaque solution à doser) au

spectrophotomètre à la longueur d’onde de 560 nm. Mesurer ensuite l’absorbance des 25 mL

de la solution à doser (contenant les réactifs 1 et 2 et la solution à doser).

A partir des valeurs obtenues avec les solutions étalons réaliser une droite d’étalonnage

(Absorbance = f(concentration en Ag+)) qui servira à déterminer la concentration en argent des

solutions inconnues.

Annexes

463

Annexe V.2: Spectre FTIR de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 5 % molaire d’argent avec un temps de maturation en solution de 20 minutes et à pH = 8 (par ajut d’NH4OH 1M)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8A

bso

rba

nce


Annexes

464

Annexe V.3 : Spectres XPS (+ semi-quantification des différents éléments) des échantillons d’Ag3PO4 synthétisés avec a) NaH2PO4.2H2O, b) Na2HPO4.12H2O ou c) Na3PO4.12H2O et d) comparatif de ces spectres avec celui de l’argent

métallique

Ag3PO4 synthétisé avec NaH2PO4.2H2O

Élément Position du pic(eV)

Largeur à mi-hauteur

(eV)

% atomique de l'élément

P (2p) 132,89 2,20 13,20

C (1s) 284,65 1,53 21,32

Ag (3d5/2) 367,94 1,20 26,10

O (1s) 530,65 1,61 38,38

a) Ag3PO4 synthétisé avec NaH2PO4.2H2O



(eV)


P (2p) 132,89 2,20 13,20

C (1s) 284,65 1,53 21,32

Ag (3d5/2) 367,94 1,20 26,10

O (1s) 530,65 1,61 38,38

a)



(eV)


P (2p) 132,91 2,28 12,96

Cl (2p) 198,41 1,08 0,84

C (1s) 284,77 1,63 18,64

Ag (3d5/2) 367,94 1,14 27,78

O (1s) 530,68 1,51 39,78

Ag3PO4 synthétisé avec Na2HPO4.12H2Ob)



(eV)


P (2p) 132,91 2,28 12,96

Cl (2p) 198,41 1,08 0,84

C (1s) 284,77 1,63 18,64

Ag (3d5/2) 367,94 1,14 27,78

O (1s) 530,68 1,51 39,78

Ag3PO4 synthétisé avec Na2HPO4.12H2Ob)

Annexes

465



(eV)


P (2p) 132,68 1,91 12,76

C (1s) 284,69 1,44 17,46

Ag (3d5/2) 367,92 1,27 35,37

O (1s) 530,51 1,31 34,40

Ag3PO4 synthétisé avec Na3PO4.12H2Oc)



(eV)


P (2p) 132,68 1,91 12,76

C (1s) 284,69 1,44 17,46

Ag (3d5/2) 367,92 1,27 35,37

O (1s) 530,51 1,31 34,40

Ag3PO4 synthétisé avec Na3PO4.12H2Oc)

Échantillon d’Ag0

(métallique)

Échantillon d’Ag3PO4synthétisé avec Na3PO4.12H2O

Échantillons d’Ag3PO4synthétisés

avec Na2HPO4.12H2O (spectre bleu)ou avec NaH2PO4.2H2O (spectre vert)

d)


(métallique)





(métallique)




d)

Annexes

466

Annexe VI.1 : Diagramme DRX de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 10 % volumique de H2O2 avec un temps de maturation de 1 jour, en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate et ayant subie une étape de pré-équilibrage

20 30 40 50 60 70 800

2000

4000

6000

8000

10000

12000In

ten

sité

(u

. a

.)

2 (degré) (Co

)

Synthétisée avec 10 % volumique de H2O

2

avec un temps de maturation de 1 jour

en utilisant Na2HPO

4

Annexes

467

Annexe VI.2 : Spectre FTIR de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 10 % volumique de H2O2 avec un temps de maturation de 1 jour, en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate et ayant subie une étape de pré-équilibrage

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Ab

so

rba

nce


Synthétisée avec 10 % volumique de H2O

2

avec un temps de maturation de 1 jour

en utilisant Na2HPO

4

Annexes

468

Annexe VI.3 : Spectres FTIR des échantillons des échantillons codopés avec des cations Cu2+ et/ou Zn2+ et/ou Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un temps de maturation de 1 jour en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non dopée synthétisée dans les mêmes

conditions.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

1j-1%Ag/H2O

2

1j-1%Zn/H2O

2

Ab

so

rba

nce


1j-1%Cu/H2O

2

Codopage par des cations

Annexes

469

Annexe VI.4 : Spectres FTIR des échantillons codopés en présence de 10 % volumique de peroxyde d’hydrogène et avec Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un temps de maturation de 1 jour en utilisant Na2HPO4 ou (NH4)2HPO4 hosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non

dopée synthétisée dans les mêmes conditions (en absence de peroxyde d’hydrogène).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1j-1%Zn/1%Ag

1j-1%Cu/1%Ag

Ab

so

rba

nce


1j-5%Cu/5%Zn

Codopage H2O

2/cation

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Résumé

Les infections nosocomiales post-opératoires en sites osseux posent un problème majeur de santé publique. L’utilisation de biocéramiques bioactives et résorbables qui présenteraient des propriétés antibactériennes apparaît comme une des solutions les plus prometteuses pour lutter contre l’invasion de micro-organismes au niveau du site opératoire. Les apatites nanocristallines biomimétiques se révèlent être des candidats de choix pour ces applications en raison de leur similitude avec le minéral osseux et de leur forte réactivité de surface. Cependant, elles ne possèdent pas de propriétés antibactériennes intrinsèques, ce qui peut potentiellement être amené par un dopage ionique approprié.

Dans ce contexte, ce travail traite de la synthèse et de la caractérisation physico-chimique d’apatites biomimétiques enrichies avec des cations zinc (Zn

2+), cuivre (Cu

2+) ou argent (Ag

+) ou avec des anions oxygénés de type

peroxydes qui présenteraient ces facultés antimicrobiennes ; puis sur l’évaluation préliminaire de leurs propriétés (micro)biologiques. Dans un premier temps, l’étude de systèmes apatitiques non dopés a indiqué qu’à l’instar du minéral osseux les apatites nanocristallines présentaient des cristaux de dimensions nanométriques dont la composition chimique s’éloignait de la stœchiométrie et exposant des environnements ioniques non-apatitiques hydratés en surface des nanocristaux. L’influence des paramètres de synthèse a été évaluée et révèle que le temps de maturation, la température, le pH et la nature des sels de phosphate impactent significativement les caractéristiques physico-chimiques de ces composés. Nous montrons également que les conditions de post-traitement (ré-immersion, traitement thermique, mise en forme) peuvent aussi modifier significativement les caractéristiques finales des biocéramiques. Dans un second temps, ce travail a révélé que l’enrichissement d’apatites nanocristallines avec des ions Zn

2+, Cu

2+, Ag

+

ou des espèces oxygénées était possible – avec des taux de dopage limites qui ont été évalués – mais générait des modifications physico-chimiques notables en particulier en termes d’état de cristallinité et de teneur en environnements chimiques non-apatitiques. Le zinc et le cuivre engendrent des effets similaires et semblent agir en tant qu’inhibiteur de croissance cristalline. L’argent, bien que monovalent, ne modifie pas significativement les processus de formation et de croissance des nanocristaux d’apatites. En revanche, la présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu réactionnel conduit à la formation d’apatite dont l’état de cristallinité est augmenté. Le choix de paramètres de synthèse adéquats, influençant notablement les mécanismes d’incorporation des ions, s’est avéré déterminant pour l’obtention d’apatites nanocristallines monophasées et dopées.

Des tests biologiques préliminaires ont été réalisés pour évaluer la cytotoxicité de ces composés et le comportement de cellules ostéogéniques (de types ostéoblastes et ostéoclastes). L’évaluation d’éventuelles propriétés antibactériennes a également fait l’objet de ce travail, dans le cadre d’une collaboration internationale. Parmi les formulations présentant des propriétés antibactériennes mesurées, les apatites biomimétiques enrichies en argent apparaissent au vu de ce travail comme les candidats les plus prometteurs pour conférer l’effet antibactérien nécessaire aux applications visées.

Abstract

Hospital acquired infections in osseous sites are a major issue of public health. The use of bioactive and resorbable bioceramics that present antibacterial properties appears as one of the most promising solution against micro-organisms invasion of the surgical site. Biomimetic nanocrystalline apatites belong to the choice candidates for those applications thanks to their similarities with the bone mineral and their high surface reactivity. Nevertheless, they don’t possess intrinsic antibacterial capacity, property that can be reached by a suitable ionic enrichment.

In this context, this work deals with the synthesis and the physico-chemical characterization of such biomimetic nanocrystalline apatites doped with zinc (Zn

2+), copper (Cu

2+) or silver (Ag

+) cations or with oxygenated anions like

peroxides that would present antibacterial activity; then their (micro-)biological properties have also been studied. As a first part, study of apatitic non-doped systems shows that, as well as bone mineral, nanocrystalline apatites exhibit nano-sized crystals which chemical composition depart from stoichiometry and possess hydrated non-apatitic environments on their surface. The influence of synthesis parameters has been studied and reveals that maturation time in solution, temperature, pH or the nature of starting phosphate salts impact significantly the physico-chemical characteristics of those compounds. We also point out that post-treatment conditions (re-immersion, thermal treatment, forming) can significantly modify final characteristics of those bioceramics. As a second part, this work reveals that nanocrystalline apatites enrichment with Zn

2+, Cu

2+, Ag

+ or oxygenated species

seem to be possible – with maximal doping rates that were evaluated – but generate significant physico-chemical modifications, especially in terms of crystallinity state or non-apatitic chemical environments content. Zinc and copper act on a similar way on apatite compound and exhibit a crystal growth inhibitory role. Silver, even with a single positive charge, don’t modify significantly the formation and the growth mechanisms of apatites nanocrystals. On the opposite, hydrogen peroxide presence in the synthesis media generates the formation of apatites which crystallinity state is improved. All of those results suggest that synthesis parameters are determining to obtain doped nanocrystalline apatites and that they influence notably the incorporation mechanisms of ions.

Finally, preliminary biological tests have been realized in order to evaluate the cytotoxicity and the behavior of osteogenic cells (osteoblast and osteoclast type) in contact with those compounds. The evaluation of potential antibacterial properties is also discussed in this work as part of an international collaboration. Among formulations that exhibit measured antibacterial activity, silver doped biomimetic apatites appear as the most promising candidates to confer antibacterialness necessary for the envisaged applications.

Documents

Élaboration et caractérisation de biomatériaux osseux innovants à