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ELECTROFORESISRecombinant DNA and Biotechnology
Kreuzer, Massey
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSAEl método estándar para separar fragmentos
de ADN es la electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacárido como el agar o la pectina que se disuelve en agua hirviendo y se va solidificando mientras se enfría.
En la electroforesis, el ADN se aplica a un bloque de agarosa gelificado al cual se le va a aplicar corriente eléctrica.
Gracias a que el ADN está cargado negativamente, migra a través del gel hacia el electrodo positivo.
Bajo condiciones normales, los grupos fosfato en el esqueleto del ADN están cargados negativamente.
Por regla general, los opuestos se atraen, de esta manera el ADN se ve atraído por cualquier cosa que esté cargada positivamente.
Y este principio se utiliza en la electroforesis.
La tasa de migración del ADN depende del tamaño del fragmento.
Mientras es más pequeño, migra más rápido a través del gel.
La tasa de migración de fragmentos lineales es inversamente proporcional al log 10 de sus pesos moleculares.
Esta tasa de migración, también se ve afectada por la forma de la molécula de ADN.
Las moléculas circulares (plásmidos) migran de diferente manera que los fragmentos lineales del mismo peso molecular.
Otro parámetro importante en la electroforesis, es la concentración de la agarosa en el gel.
Mientras la concentración es mayor, más se retarda el movimiento de todos los fragmentos de ADN.
Es por esto, que es mejor usar concentraciones relativamente altas de agarosa para separar y ver fragmentos pequeños.
Algunos ejemplos de concentraciones de agarosa y los tamaños de ADN que pueden separar eficientemente se presentan a continuación:
% Agarosa Tasa de separación de fragmentos lineales (kb)
0.3 60 - 5
0.6 20 – 1
0.9 7 – 0.5
1.5 4 – 0.2
2.0 3 – 0.1
Los geles de agarosa se preparan y se corren en una buffer.
La buffer es necesaria porque durante la electroforesis se generan iones que convierten el ánodo en alcalino y al cátodo en ácido.
Si el gel es accidentalmente preparado y corrido en agua, las bandas de ADN se van a ver mal.
Una buffer es la mezcla, ya sea de un ácido débil con su sal o una base débil con su sal.
La buffer de electroforesis más común está hecha de la base débil Tris y su sal hecha añadiendo ácido bórico.
También se añade un quelador de metales como el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).
La buffer resultante se llama TBE por Tris-Borato-EDTA.
Otras buffer utilizadas son TAE (Tris-Acetato-EDTA) y TPE (Tris-Fosfato-EDTA).
El voltaje que se aplica al gel afecta la rapidez con la que el ADN migra.
Mientras es más alto el voltaje, es más rápida la migración por el gel.
Sin embargo, los geles que corren a altos voltajes no separan los fragmentos de ADN tan eficientemente como los corridos a bajos voltajes.
Para una buena separación, los geles deben correrse a no más de 10V/cm de largo del gel.
PREPARACIÓN DE UN GEL
TEÑIDO DEL GELPara hacer los fragmentos de ADN visibles
luego de la electroforesis, éstos se deben teñir.
Uno de los tintes usados es el bromuro de etidio.
Esta sustancia se intercala en el ADN y sirve como un marcador de ácidos nucleicos.
INTERCALADO DEL BROMURO DE ETIDIO
Una vez que el bromuro de etidio se une al ADN, éste fluorece bajo luz ultravioleta (UV).
Bajo esta luz emite una luz rojo-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN.
Es un tinte sensible pero tiene varios efectos negativos para la salud humana.
Como el bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un poderoso efecto mutagénico y, posiblemente puede ser cancerígeno o teratógeno.
Otra sustancia que se utiliza para teñir los geles es el SYBR Green.
Es un agente intercalante utilizado en la tinción de ADN para el análisis por electroforesis de productos de PCR.
Esta molécula se introduce en la estructura secundaria de la doble hélice del ADN y se acopla energéticamente a los ácidos nucleicos que lo forman.
El SYBR Green representa una alternativa como tinte al bromuro de etidio.
ELECTOFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
El otro material usado en la electroforesis de ADN es la poliacrilamida.
La poliacrilamida forma una malla más compacta que la agarosa.
Por esta razón, los geles de poliacrilamida pueden separar moléculas más pequeñas.
La poliacrilamida tiene un poder más alto de resolución, es decir, el gel de poliacrilamida puede separar dos moléculas cuyo peso molecular es muy parecido.
Se la utiliza para análisis forenses, en los cuales es crítico determinar si es que dos fragmentos de ADN son exactamente del mismo tamaño.
También se la utiliza para electroforesis de proteínas.
La poliacrilamida es un polímero de la acrilamida.
Para hacer un gel de poliacrilamida, se disuelve la acrilamida en buffer junto con el agente entrecruzador (cross-linking) bisacrilamida.
Se añaden catalizadores para comenzar la polimerización (ión persulfato como persulfato de amonio).
La mezcla líquida es rápidamente vertida en un espacio delgado entre dos vidrios o platos plásticos.
Los geles de poliacrilamida que se usan para separar ADN usualmente se hacen y corren en TBE, al igual que los geles de agarosa.
El químico urea, puede ser añadido al gel para mantener al ADN en cadena simple.
Esto puede ser útil en varias aplicaciones como por ejemplo la secuenciación de ADN.
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Las proteínas normalmente son separadas en geles de poliacrilamida porque son moléculas mucho más pequeñas que los fragmentos de ADN comúnmente separados en agarosa.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico.
La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa.
Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración.
La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
