Electroforesi de proteïnes en gel de poliacrilamida. SDS-PAGE.

1. OBJECTIUS - Conèixer la tècnica d’electroforesi de proteïnes.

- Aprendre a preparar gels d’electroforesi.

- Aprendre a calcular la quantitat de proteïna a carregar.

- Visualitzar el gel d’electroforesi amb blau de Comassie.

2. FONAMENT TEÒRIC. ELECTROFORESI DE PROTEINES. SDS-PAGE. El 1937 Tiselius va introduir en el camp de la bioquímica la tècnica electroforètica, des de llavors fins ara s’ha anat incrementant el poder de resolució d’aquesta. Els mètodes de separació electroforètica es basen en l’aplicació d’un camp elèctric a través d’un suport insoluble i porós però que és permeable a una dissolució tamponada. L’electroforesi en gels de poliacrilamida (PAGE) és una tècnica emprada per a separar i visualitzar proteïnes i també DNA i RNA de baix pes molecular. Shapiro, Viñuela i Maizel al 1967 van demostrar que el pes molecular de moltes proteïnes es pot determinar per la mesura de la seva mobilitat en un gel de poliacrilamida que conté com a detergent aniònic dodecilsulfat de sodi (SDS). Les cadenes polipeptídiques de les proteïnes perden l'estructura quan s'escalfen durant 5 minuts a 100 °C, a pH neutre, en 1%SDS i 0,1 M de mercaptoetanol. Els ponts disulfur es trenquen per l'acció d'un agent reductor com el mercaptoetanol que s'unirà a les cisteïnes, i els complexes formats per les subunitats de proteïna i el SDS adquireixen una configuració de bastó. Les proteïnes sotmeses a aquest tractament es comporten com si tinguessin una forma semblant i una relació càrrega-massa idèntica. Això és degut a que la quantitat de SDS unida a la proteïna per unitat de pes és constant (1,4 g de SDS /g de proteïna). La càrrega ve doncs determinada pel SDS més que per la càrrega intrínseca de la proteïna. Ja que els complexes SDS-proteïna tindran la mateixa relació càrrega-massa, la mobilitat electroforètica de cada proteïna vindrà determinada pel número d'enllaços peptídics de la molècula; és a dir la mobilitat serà proporcional al pes molecular. El gel actua com un tamís a través del qual han de passar les molècules, les més petites trobaran més fàcilment el camí pels porus del gel: la mobilitat és més gran a mida que disminueix el pes molecular de les proteïnes Segons el marge de pesos moleculars a estudiar cal utilitzar gels de malla diferent. En els gels de poliacrilamida la variació del grau d'entrecreuament es pot aconseguir fent variar la concentració inicial d'acrilamida. Aquí es mostren les concentracions d'acrilamida (%) a emprar en funció dels pesos moleculars (expressats en kilodalton -kDa-): % Acrilamida Pm proteïna kDa . La lisozima, també anomenada muramidasa, és un enzim de 14,4 kilodalton que danya les cèl·lules bacterianes catalitzant la hidròlisi de les unions beta 1,4 entre els residus d'àcid N-acetilmuràmic i N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicà 7,5 30-150 kDa 10 15-80 15 < 15 Els gels de SDS-poliacrilamida normalment es fan polimeritzar en dues parts. El gel superior o stacking gel i el gel inferior o gel de separació. El gel superior conté una proporció d'acrilamida més baixa que el gel de separació i es prepara amb un tampó a força iònica també més baixa i a diferent pH. La grandària de malla més gran en el gel superior fa que les molècules trobin menys impediment, i d'altra banda una força iònica inferior implica més resistència elèctrica i per tant un camp elèctric (V/cm) més elevat com a conseqüència les molècules es mouran més ràpidament que en gel de separació. La migració ràpida a través del gel superior originarà una acumulació de material en la intersecció entre el gel superior i el de separació de manera que les diferent proteïnes que composen la mostra entraran successivament en el gel de separació concentrades en un espai molt petit, el que dóna lloc a bandes molt fines, incrementant-ne la resolució.

Un cop preparats el gels per part de l’alumnat convé que adquireixin destresa en la càrrega de mostra en els pouets. Per tant es poden fer assajos de càrrega de 25 μL de tampó d’aplicació de les mostres abans de carregar les proteïnes de debò. En els gels de poliacrilamida correrem una barreja de proteïnes pretenyides de pes molecular conegut que ens serviran de referència de l’estat de l’electroforesi, així com les 6 diferents mostres analitzades pel mètode de Bradford en la pràctica anterior (5 de lisozima i 1 d’ovoalbumina). Per a calcular la quantitat de proteïna a carregar, cal comptar un mínim de 0,5 μg de proteïna purificada i 1 μg de barreja de proteïnes. Un cop corregut el gel es visualitzen les proteïnes amb la dissolució de tinció amb Coomassie.

3. REACTIUS - MATERIALS – EPI’s Font d’alimentació. Cubetes d’electroforesi. Guies per a la preparació dels gels. Pintes Micropipetes i puntes. Eppendorfs Bany termostático a 100ºC Tubs Falcon 50 ml Safates plàstic per a la tinció del gel. Matrassos aforats Solució d’acrilamida bisacrilamida al 40% Tris 1,5 M (pH 8,8) Tris 0,5 M (pH 6,8)

Solució al 10% de SDS Persulfat d’amoni TEMED Tampó d’elució. (tris, glicina, SDS) Tampó de càrrega (tris, SDS, blau de bromofenol) 2-mercaptoetanol Solució de tinció (Blau de Comassie, metanol, àcid acètic) Solució de destenyit (metanol, àcid acètic) Aigua per injectables. Barreja proteïnes pretenyides (BioRad) n-butanol

L’acrilamida és neurotòxica, la solució al 40% disminueix en gran mesura els perills, però convé sempre treballar amb guants. Un cop polimeritzada no presenta cap perill. Cal treballar en vitrina quan es manipuli el mercaptoetanol, és tòxic i no molt agradable al olfacte.

4. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL Preparació de les dissolucions: 1.- Tampó d’elució TE 10x pH. 8,3 (1 litre) S’ha de fer 1x 100mL/1L. 10x ja feta Tris base 30,3 g Glicina 144,2 g SDS 10 g Enrasar amb aigua Millipore (o destil·lada fins arribar a 1 litre). No cal ajustar el pH. En el moment del seu ús es prepara la solució 1x i el pH ja estarà ajustat. 2.- Solució de tinció (500mL). Preparar en vitrina gasos. 1,25 g de blau brillant de Coomassie R-250 en balança granataria 225 ml de metanol en proveta 50 ml d’àcid acètic (concentrat acetic glacial purísim pm=60,05g) Enrasar a 500 ml amb aigua Millipore o destil·lada. 3.- Solució de destenyit. (0,5 litres). Preparar en vitrina de gasos. 150 ml de metanol 50 ml d’acètic. Enrasar a 500 ml amb aigua Millipore o destil·lada 4.- Tris 1,5 M pH 8,8 (100 ml) 18,15 g de Tris 80 ml d’aigua destil·lada Ajustar el pH fins a 8,8 amb HCl 6N. Aforar a 100 ml amb aigua destil·lada. 5.- Tris 0,5 M pH 6,8 (100 ml) 6,0 g de Tris 80 ml d’aigua destil·lada

Ajustar el pH fins a 6,8 amb HCl 6N. Aforar a 100 ml amb aigua destil·lada. 6.- SDS al 10% (25 ml) (ja preparat) 7.- Blau de bromofenol al 1% (50 ml). (Compte: Guants!!) (ja preparat) En etanol 8.- Tampó de càrrega. (10 ml) Es pot preparar en tub Falco de plàstic Tris HCl 0,5 M pH 6,8 1 ml (ja preparat) Glicerina 2 ml SDS al 10% 2 ml Blau de bromofenol al 1% 0,4 ml (amb micropipeta) H2O destil·lada 5,6 ml En el moment de fer servir, prendre 1 ml de la solució i afegir 20 μL de 2-mercaptoetanol (vitrina) 9.- Persulfat d’amoni al 10% (APS) (10 ml) en aigua. Preparar en el moment de fer servir Preparació del gel d’acrilamida. Preparar les guies per a la preparació dels gels. Assegurar que els vidres estiguin ben nets. Si cal rentar amb etanol. Posar-hi la pinta i fer-hi una marca en el vidre aproximadament 1 cm per sota la pinta. Retirar la pinta. Preparar els gels de separació i el stacking gel o gel d’apilament. 1.- Gel de separació. (Per a un gel al 10%)

10 ml (1 gel) 20 ml (2 gels) 30 ml(3 gels) es fa aquest últim H2O 4,82 ml 9,6 ml 11,42mL Acrilamida al 40% 2,48 4,95 7,43 mL Tris 1,5 M (pH 8,8) 2,5 ml 5 ml 7,5 mL 10% SDS 0,1 ml 0,2 ml 0,3 mL Temed 10 μL 20 μL 30 μL 10% APS 0,1 ml 0,2 ml 0,3 mL Afegir el TEMED i especialment l’APS al final. Immediatament agitar i afegir amb l’ajut d’una pipeta Pasteur la solució entre els vidres fins a la marca que havíem fet abans. Deixar la resta en el tub Falcon com control de la polimerització de l’acrilamida. Afegir butanol amb molta cura per cada un dels extrems de manera que es formi una pel·lícula de 2 mm (l’oxigen atmosfèric inhibeix la polimerització). Deixar polimeritzar el gel uns 15 o 20 minuts. Quan el gel polimeritza la interfase gel butanol queda ben definida. Un cop polimeritzat es decanta el butanol i s’assequen les gotes que queden amb paper de filtre, passar aigua destil·lada i assecar bé. 2.- Gel d’apilament. Stacking gel.

5 ml (1 gel) Aquest 10 ml (2 gels)

H2O 3,6 ml 7,2 ml Acrilamida al 40% 0,62 1,24 Tris 0,5 M (pH 6,8) 0,63 ml 1,26 ml 10% SDS 75 μL 0,15 ml Temed 7,5 μL 15 μL 10% APS 75 μL 0,15 ml Afegir el TEMED i especialment l’APS al final. Immediatament agitar i afegir amb l’ajut d’una pipeta Pasteur. Es col·loca la pinta per a formar les butxaques i es deixa polimeritzar uns altres 20minuts. Un cop polimeritzat el gel, retirar la pinta cap amunt, anant amb compte. Convé rentar els pouets amb aigua amb una xeringa i una agulla. Assaig de deposició de les mostres.

Un o dos dels gels preparats el farem servir perquè l’alumnat vaig adquirint destresa. Es pren 1 ml del tampó de càrrega (sense mercaptoetanol que fa molt mala olor) i es diposita en un Eppendorf. Cada alumne dipositarà amb micropipeta 20 μL de tampó en un pouet. És molt important que no hi hagi contaminacions creuades i que la mostra d’un pouet no vagi a un altre. Càrrega de les mostres i posta en marxa de l’electroforesi. Posar un bany d’aigua a escalfar a 100ºC A partir dels resultats de la pràctica anterior, calculeu el volum necessari per tenir 1 μg de proteïna del cru de lisozima i dels tubs 1 i 2, i 0,5 μg dels tubs 3 i 4 i de ovoalbúmina. Es poden carregar com a màxim 25 (30 en mans expertes) μL per pouet,

Proteïna Cru lisozima

Tub 1 lisozima

Tub 2 lisozima

Tub 3 lisozima

Tub 4 lisozima

Ovoalbúmina

Concentració μg/mL

- - - - - -

Volum a carregar

7 μL 7 μL 7 μL 14 μL 14 μL -

Acabar de preparar el tampó de càrrega. En vitrina afegir 20 μL de mercaptoetanol a 1 ml de tampó de carrega dipositat en un Eppendorf. Agitar amb Vortex. Preparar les mostres. Dipositar en Eppendorfs els volums de mostra que necessitem en cada cas. Afegir 7 μL del tampó de càrrega. Amb una agulla fer un forat a l’Eppendorf a la part superior (sinó esclatarà). Agitar amb Vortex i deixar-ho 3 minuts a 100ºC per desnaturalitzar la proteïna. Es col·loca el gel en les cubetes d’electroforesi. S’omple el dipòsit interior amb tampó d’elució TE 1X (100 ml de tampó 10x amb 900 ml d’aigua destil·lada) per comprovar que no te pèrdues i després el dipòsit exterior. Es retira la pinta i es carreguen les mostres. En el primer pouet 20 μL de la solució barreja de proteïnes pretenyides. En els següents les mostres. Molta cura en evitar contaminacions creuades. Cal anotar clarament que s’hi ha dipositat en cada pouet. Es connecta l’ànode (born vermell) de la font d’alimentació a la cubeta interior i el càtode (born negre) al dipòsit inferior. Es fan córrer les mostres, inicialment a un voltatge de 100 volts, per passar quan comencin a córrer a 120-130 volts. Aturar l’electroforesi quan el blau de bromofenol s’acosti a l’extrem inferior del gel (45 minuts aprox). Apagar font d’alimentació. Tinció de l’electroforesi. Desconnectada la font d’alimentació, es treu el tampó de la cubeta i es desmunta el sandvitx, separant amb molta cura les plaques de vidre del gel amb una espàtula de plàstic. Es pot retallar la part corresponent al gel d’apilament, però aleshores és necessari marcar clarament la disposició de les mostres fent un petit tall a l’extrem superior dret. El gel es tenyeix deixant-lo durant 1 hora submergit en la dissolució de tinció. S’elimina després el colorant amb la solució de destenyit (cal canviar-la diversos cops). El resultat final es pot fotografiar. 5. GESTIÓ DELS RESIDUS Els tampons d’elució es poden reutilitzar, es dipositen en una ampolla etiquetada com a tampó brut i es pot usar per al dipòsit inferior (no per la cubeta interior) . Les solucions de tinció i destenyit emprades aniran es dipositaran per a la seva gestió (dissolucions aquoses orgàniques)

6. RESULTATS

A partir dels valors dels pesos moleculars de l’escala de proteïnes fer una estimació del pes molecular de la lisozima i de l’ovoalbumina.

Lactoferrina 97,4 KDa

Albúmina 66,2 KDa

α Caseína 45 KDa

Ovoalbúmina 35 KDa

β Caseína 31 KDa

β Lactoglobulina 21,5 KDa

Lisozima 14,4 KDa

Quines proteïnes es reconeixen en el cru de lisozima i en el tub 1 i 2?

Cru:

Albúmina 66,2 KDa Ovoalbúmina 35 KDa

Lisozima 14,4 KDa

Tub 1:

Albúmina 66,2 KDa Ovoalbúmina 35 KDa

Tubs 2

Albúmina 66,2 KDa Ovoalbúmina 35 KDa

El nostre gel:

7. CONCLUSIONS. Comenta les teves conclusions en relació als objectius de la pràctica i altres coneixements que hagis pogut adquirir. Hauríem d’haver posat mes proteïnes ja que no s’ha marcat del tot definit. Podem observar presencia de ovoalbúmina i lisozima a part d’altres proteïnes de l’ou. En el cru i el primer tub observem la lisozima. En els dos següents ja no apareix. Pel que hem aconseguit que quedi retinguda en la columna en la pràctica anterior.

8. QUESTIONS.

- Què és una proteïna desnaturalitzada?

Es diu que una proteïna està desnaturalitzada quan la seva estructura tridimensional (espacial) es veu alterada per algun motiu (calor, agents químics, etc.). Una proteïna desnaturalitzada té propietats diferents de la mateixa proteïna en estat natiu. Ho veiem quan escalfem l'ou: la clara, que era líquida i transparent, es torna sòlida i blanca a causa de la desnaturalització de l'ovoalbúmina

- Quines proteïnes migren abans en l’electroforesi?

Les de menor massa.

Les majors son retardades i es mouen més lentament a través del gel.

- Si volguéssim fer córrer proteïnes grans (per exemple 100 kDa) quines variacions hauríem de fer en el gel

de separació? La mida del porus pot ser ajustat per optimitzar la separació de la mostra d'interès. Així, gels amb un percentatge alt d'acrilamida (10-15% T) són òptims per a la separació de proteïnes de mida petita (menors de 50KDa), mentre que gels de percentatges menors (<10% T) són els indicats per a la separació de proteïnes grans. Generalment la relació utilitzada entre acrilamida i bisacrilamida és 37,5:1. Anoteu frases R i S a la llibreta i a l’informe. BISACRILAMIDA

TRIS

SDS

PERSULFAT D’AMONI

TEMED

GLICINA

BLAU DE BROMOFENOL

2-MERCAPTOETANOL

BLAU DE COMASSIE

METANOL

ÀCID ACÈTIC

METANOL

N-BUTANOL

9. BIBLIOGRAFIA Internet Ensayos Biotecnologicos. A. Rubio i altres. Pag 181-185 (2010) Curs Formació Assaigs Biotecnològic. Departament de Bioquímica i Departament Genètica i Microbiologia UAB (2009)