Electroforesis de AgarosaJosé A. Cardé, PhDLab Biol 3306-GenéticaUniversidad de Puerto Rico-Aguadilla

Objetivos

Luego de haber completado el ejercicio, los estudiantes estarán capacitados para: 

1. Distinguir entre una electroforesis utilizando geles de poliacrilamida y una electroforesis utilizando geles de agarosa.

2. Explicar los diferentes parámetros que influyen en la separación de los fragmentos de DNA.

3. Preparar un gel de agarosa y separar fragmentos de DNA en el mismo.

4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de DNA productos de la digestión con endonucleasas de restricción.

Introducción

Separación y análisis de macromoléculas(Proteínas, ADN/ARN) en una matriz gelatinosa al aplicarles un campo eléctrico

ELECTROFORESIS:

Moléc. + cátodo (-)Moléc. - ánodo (+)

ELECTROFORESIS – CSHL-DNLC

Animación

ánodocátodoSOPORTE

+-

Arne Tiselius1937

(Nobel 1948)

Factores que afectan la moVilidad

1 Campo eléctricoDiferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500

V)Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica.

- depende de V y de R.- Resistencia: determinada por el soporte.

2 Muestra Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la

moléculaTamaño: debido al poro de la matriz.Forma: forma globular vs lineal: avanza más.

Factores que afectan la mobilidad

3 Amortiguador- pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculasgeneralmente es ligeramente básico moléculas -- Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera

4 Soporte o Matriz- Adsorción- Porosidad molecular

- inversamente proporcional a la concentración

Matrices ElectroforéticasCaracterísticas: Gel poroso (tridimensional interno). Tiene que permitir el paso de moléculas. NO puede estar cargado.

no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa.

* poro >>> proteínas.* separación sólo por CARGA

Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo):

Electroforesis de proteínas

Electroforesis de DNA/RNA

restrictivo (grupo II): acrilamida* poros = proteínas* separación por CARGA y TAMAÑO

restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa* poros = moléculas de DNA/RNA* separación sólo por TAMAÑO

Matriz del gel

PAGE – Gel de Poliacrilamida:Proteinas 0 ácidos Nucleicos

Electroforesis vertical

Ventajas:* Gran poder de resolución por CARGA y por TAMAÑO.* Químicamente inertes.* Transparentes (densitograma).* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura).* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.

Soporte: (restrictivo) * Geles de Agarosa moléculas grandes (0.1-60 kpb)* Geles de Poliacrilamida moléculas pequeñas (6-2000 pb)

Aplicaciones:

Separar proteínasDeterminar peso molecular de una

proteína

Separar proteínas en función de su pI

Ver si hay una proteína en concreto

SDS-PAGE

Western Blot

Electroenfoque

Gel de Agarosa – ácidos Nucleicos

Soporte: (restrictivo) * Geles de Agarosa moléculas grandes (0.1-60 kpb)* Geles de Poliacrilamida moléculas pequeñas (6-2000 pb)

Electroforesis horizontal (agarosa)

Separación por TAMAÑO

Densidad de carga igual para todas las moléculas por los grupos PO4-

Buena separación, pobre resolución

Geles de AgarosaAplicaciones:

Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o RNA.

Determinar tamaño de un fragmento de DNA.

Separación de cromosomas enterosSecuenciación de DNA.

Identificación de regiones de unión a proteínas.

Detectar la presencia de un gen (o secuencia específica de DNA) en una muestra.

Determinar si se expresa un gen específico

Geles poliacrilamida

Geles de agarosa

Southern Blot

Northern Blot

Geles de AgarosaElectroforesis horizontal

muestra (-)

+ -

Campo eléctrico (V)

1. Preparar el gel.2. Aplicación de la muestra.3. Electroforesis.4. Detección por tinción con Bromuro de Etidio (BrEt): se intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia.

Southern Blot* Interacción DNA-DNA (complementación).* Detectar en una mezcla de DNAs una secuencia de DNA específica (muy sensible).* Detectar la presencia de un gen, etc.

1. Electroforesis en geles de agarosa

moléculasde DNA

2. Transferencia a membrana

moléculasde DNA

3. Hibridación con la sonda radioactiva

DNAinterés…ATTGCA…

…TAACGT…

Sondade DNA

32P

e-

4. ReveladoDNA interés

32P

Gel Agarosa Southern BLOT

Todas los DNA

DNAde interés

5. Resultado

Northern Blot* Interacción RNA-DNA (hibridación).* Detectar en una mezcla de RNAs una secuencia de RNA específica (muy sensible).* Expresión génica.1. Electroforesis en geles de agarosa

moléculasde RNA

2. Transferencia a membrana

moléculasde RNA

3. Hibridación con la sonda radioactiva

RNAinterés…AUUGCA…

…TAACGT…

Sondade DNA

32P

e-

4. Revelado

RNA interés

32P

Gel Agarosa Northern BLOT

Todas los DNA

RNAde interés

Resultado

Determinación de Peso Molecular

Marcadores de peso molecular:

* Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular.

* Por comparación y extrapolación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.

Peso Molecular: Como determinarlo?

- Es necesario correr, junto a las muestras de interés un marcador molecular estándar.

- Este posee de 5 a 10 fragmentos de DNA a los cuales se les conoce el peso molecular.

- Existe una relación lineal entre el logaritmo del

- peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel.

- Se crea una curva estándar con distancia de migración en X y el log10 del peso molecular de los fragmentos de DNA en Y

- Usando esa curva extrapolar el peso molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.

Para crear la curva estándar es necesario: 

1)   Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del marcador hasta cada una de las bandas observadas en el marcador. Estos van en el eje de X.

2)   Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos de DNA que se encuentran en el marcador estándar. Estos van en el eje de Y.

3) Unir los puntos con un “best fit line”

4)   Utilizar la distancia recorrida por las muestras desconocidas y extrapolar a la línea recta, determinar el log 10 del peso y buscar el log inverso para determinar tamaño en bp.

Gel de Agarosa: Peso Molecular

Preparacion de GelPreparación del gel de agarosa al 1%

1.Pesar 0.5-0.8 g de agarosa y colocarlos en un matraz de 200 2.Añadir 50-80 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X), se verá turbia.3.Cubrir el matraz con un pedazo de papel de aluminio (o “saran wrap”) para evitar la evaporación al calentar. 4.Calentar la mezcla hasta que se disuelva la agarosa (hornillas, microondas), se verá transparente.5. Remover el matraz y dejarlo enfriar hasta ~ 65 ºC. 6.Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml).

Preparación de la camara y la Gel

1. Limpiar y secar el molde y la cámara para la gel.

2.Sellar molde para la gel con cinta adhesiva, o según recomienda el fabricante. Asegurarse que este bien bien sellada

3.Verter la agarosa (previamente derretida, ahora tibia) en el molde de electroforesis previamente preparado.

4.Añadir 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Colocar el peine.

5.Esperar 15-20 min a que se solidifique, colocarla en la cámara de amortiguador.

6.Remover el peine y los sellos.

7.Añadir buffer de corrida (TBE/TAE) hasta cubrir los pozos completamente.

Preparación de MuestraPreparación de la Muestra

1.Coloque 20 µl de la muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. 2.Añada la cantidad predeterminada de de amortiguador de la muestra (“loading buffer”) al mismo tubo.3. Coloque 10 µl de la muestra del DNA sin cortar con las endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. Añada la cantidad predeterminada de amortiguador de la muestra.4.Coloque 5-7 µl de DNA estándar.5.Sedimente las mezclas centrifugando por 30 segundos.6.Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las muestras en el gel.

Servir muestras y corrida

1. Usando pipetas de 2-10 o de 10-100 servir las muestras en el orden predeterminado1. Moléculas estándar en carriles

estratégicos2. Muestras desconocidas en carriles

correspondientes2. Colocar la tapa del tanque de

electroforesis y conectarla a la caja de electricidad. Verificar que los polos estén correctamente conectados.  Encender la caja.

3. Correr la electroforesis a 50-80 V por 40- 75 minutos.

Observación de Resultados1. Apagar la caja de electricidad.

1. Remover la gel cuidadosamente

3. Observarla sobre lámpara luz ultravioleta, fotografiarla.

3. Utilizando una regla, medir las bandas para luego preparar la curva de log10 del peso molecular vs distancia.

3. Descartar buffer y la gel de acuerdo a las medidas correspondientes.

preguntas1. Que es resolución? Como se mejora en

una gel?2. Como se cambia el tamaño del poro en

una gel?3. Cuales son los componentes del buffer

de corrida? Su importancia?4. Cuales son los componentes del buffer

de muestra? Su importancia?5. Cual es el uso del los marcadores

estándar de peso molecular?6. En que se parecen y en que difieren el

Southern Blot del Northern Blot? Que pregunta de investigación contesta cada uno?

ReferenciasAlberts, et, al., (2014). Essential Cell Biology, 3rd Ed, Garland Science Publishing. New York.

Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.

Electrophoresis at DNA Learning Center, Cold Spring Harbor Laboratory (Animation)

Agarose Gel Electrophoresis of DNA at Colorado State University

Agarose Gel Electrophoresis of Plasmid DNA at Addgene

Agarose Gel Electrophoresis (PDF)

Agarose Gel Electrophoresis in You Tube by BioRad Laboratories