Electroforesis de proteínas

Introducción generalIntroducción general

● La electroforesis es un método de separación basado La electroforesis es un método de separación basado en la tasa diferencial de migración de especies en la tasa diferencial de migración de especies cargadas al estar en un campo eléctrico de DCcargadas al estar en un campo eléctrico de DC

● La tasa de migraciónLa tasa de migración– Depende de la carga y del tamañoDepende de la carga y del tamaño– La separación se basa en explotar las diferencias en las La separación se basa en explotar las diferencias en las

proporciones carga-tamañoproporciones carga-tamaño

● Una serie de métodos muy eficientes y que dan altas Una serie de métodos muy eficientes y que dan altas resolucionesresoluciones

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Principios y teoría de la electroforesisPrincipios y teoría de la electroforesis

● Requerimientos básicosRequerimientos básicos– Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer

de corrida)de corrida)

– Poder aplicar un campo eléctrricoPoder aplicar un campo eléctrrico

– Especies cargadas positivamente, que se moverán Especies cargadas positivamente, que se moverán hacia el cátodohacia el cátodo

– Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el ánodoánodo

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Principios y teoría de la electroforesisPrincipios y teoría de la electroforesis

● Requerimientos básicosRequerimientos básicos– Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer

de corrida)de corrida)

– Poder aplicar un campo eléctrricoPoder aplicar un campo eléctrrico

– Especies cargadas positivamente, que se moverán Especies cargadas positivamente, que se moverán hacia el cátodohacia el cátodo

– Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el ánodoánodo

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Dos técnicas básicasDos técnicas básicas

1. Las moléculas están en solución libre: capilares de 1. Las moléculas están en solución libre: capilares de calibre pequeñocalibre pequeño

2. Están en una matriz no conductora (agarosa, gel 2. Están en una matriz no conductora (agarosa, gel de poliacrilamida “PAGE”)de poliacrilamida “PAGE”)

– El calentamiento por corriente es mínimoEl calentamiento por corriente es mínimo

– El efecto de criba (coladera) del gel permite separar El efecto de criba (coladera) del gel permite separar especies que tengan la misma proporción de carag especies que tengan la misma proporción de carag contra tamaño, si tienen diferentes tamañoscontra tamaño, si tienen diferentes tamaños

● La eficiencia de esta técnica depende deLa eficiencia de esta técnica depende de– La mobilidad electroforéticaLa mobilidad electroforética

– El flujo electroosmótico del “bulto” de la solución El flujo electroosmótico del “bulto” de la solución (EOF)(EOF)

– El calentamiento debido a la resistencia (o El calentamiento debido a la resistencia (o “Calentamiento Joule”) “Calentamiento Joule”)

μ ep

La movilidad electroforéticaLa movilidad electroforética

● F ef=q×E

F fr=6×π×η×r×ν ep (la fuerza de la fricción)

η=viscosidad r=radio ν ep : velocidad de migración electroforética

F ef=F fr

(La fuerza electroforética, donde q=carga E=campo eléctrico )

ν ep=q×E

6×π×η×r×ν epμ ep=

ν epE

= q6×π×η×r

=const× qr

μ ep : mobilidad electroforética

v= Eqƒ

La velocidad del movimiento está definida por la ecuación:

Dónde E es la fuerza del campo eléctrico, q es la carga neta de la molécula,f es el coeficiente friccional:

ƒ=6πηΥRadio de la molécula(tamaño)

Coeficiente de viscosidad

Por lo tanto f depende de la viscosidadDel buffer, que depende de la porosidadde la matriz, y del tamaño de la molécula

v= Eqƒ

La velocidad del movimiento está definida por la ecuación:

Dónde E es la fuerza del campo eléctrico, q es la carga neta de la molécula,f es el coeficiente friccional:

ƒ=6πηΥRadio de la molécula(tamaño)

Coeficiente de viscosidad

Por lo tanto f depende de la viscosidadDel buffer, que depende de la porosidadde la matriz, y del tamaño de la molécula

El calentamiento por resistencia (u “óhmico” o “de Joule”)

La ley de Ohm relaciona el voltaje V, con la corriente I y la resistencia R:

I=VR

Podríamos pensar que incrementar la corriente aumentando el voltaje daría más mobilidad y que hacer experimentos a mayor volatje es mejorPero la potencia que se genera es

W=I 2R

Al aumentar la potencia puede aumentar la producción de calor, lo que conllevaConvección (y eso provoca una mala separación de las proteínas), una dismi-nución en la viscosidad del medio (y por lo tanto, mayor corriente y aún más calor)

El flujo electroosmótico (EOF)El flujo electroosmótico (EOF)● Su efecto es más importante en electroforesis de capilarSu efecto es más importante en electroforesis de capilar

● El EOF se refiere a la migración del “bulto” del líquido hacia El EOF se refiere a la migración del “bulto” del líquido hacia el cátodoel cátodo

● Orígen: se forma una doble capaOrígen: se forma una doble capa

Electroforesis en gelElectroforesis en gel● La matriz es un hidrogel que no sea eléctricamente conductivo y que La matriz es un hidrogel que no sea eléctricamente conductivo y que

contenga buffercontenga buffer

– Agarosa (aplicaciones con aa. Nucléicos)Agarosa (aplicaciones con aa. Nucléicos)

– PoliacrilamidaPoliacrilamida● Ventajas:Ventajas:

– El gel poroso actúa como cribaEl gel poroso actúa como criba

– ... y limita la difusión de las moléculas de muestra... y limita la difusión de las moléculas de muestra

– Se suprime el EOFSe suprime el EOF

– Se suprime el calentamiento resistivoSe suprime el calentamiento resistivo● DesventajasDesventajas

– Lento, talachudo y difícilmente automatizableLento, talachudo y difícilmente automatizable

Electroforesis en gelElectroforesis en gel● Técnicas:Técnicas:

– Electroforesis en gel nativo: los analitos se Electroforesis en gel nativo: los analitos se separan de acuerdo a diferencias en movilidad separan de acuerdo a diferencias en movilidad aparenteaparente

– En la electroforesis en gel de poliacrilamida y En la electroforesis en gel de poliacrilamida y diodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) la diodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) la separación es por tamañoseparación es por tamaño

– Isoelectroenfoque (IEF)Isoelectroenfoque (IEF)– Electroforesis en geles bidimensionales (2D-GE)Electroforesis en geles bidimensionales (2D-GE)

Los medios para preparar gelesLos medios para preparar geles● AgarosaAgarosa● Gel de poliacrilamidaGel de poliacrilamida

– Copolimerización de la acrilamida y la N,N'-Copolimerización de la acrilamida y la N,N'-metilen-bisacrilamidametilen-bisacrilamida

– Iniciadores de la reacción: TEMED Iniciadores de la reacción: TEMED (tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio(tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio

Los medios para preparar gelesLos medios para preparar geles● Animación gel desnaturalizante: http://lifesciences.envmed.rochester.edu/media.html

http://www.youtube.com/watch?v=8Io0pN5XGqI

● Gel de poliacrilamidaGel de poliacrilamida

– Copolimerización de la acrilamida y la N,N'-Copolimerización de la acrilamida y la N,N'-metilen-bisacrilamidametilen-bisacrilamida

– Iniciadores de la reacción: TEMED Iniciadores de la reacción: TEMED (tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio(tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio

– Hay un efecto de criba: el tamaño del poro Hay un efecto de criba: el tamaño del poro depende de la [gel] (5 a 20%)depende de la [gel] (5 a 20%)

– Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una carga uniformemente negativaproteínas de una carga uniformemente negativa

– ...y mercaptoetanol para reducir los puentes ...y mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro disulfuro

Los medios para preparar gelesLos medios para preparar geles● Gel de poliacrilamidaGel de poliacrilamida

– Hay un efecto de criba: el tamaño del poro depende de la [gel] (5 a 20%)Hay un efecto de criba: el tamaño del poro depende de la [gel] (5 a 20%)

– Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una carga uniformemente negativacarga uniformemente negativa

– ...y mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro ...y mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro

Los medios para preparar gelesLos medios para preparar geles● El efecto del ion cloro y el ion glicina: permiten que las proteínas se amontonen El efecto del ion cloro y el ion glicina: permiten que las proteínas se amontonen

en la parte inferior del gel de empacamiento y todas empiecen a entrar en el gel en la parte inferior del gel de empacamiento y todas empiecen a entrar en el gel separador prácticamente al mismo tiempo separador prácticamente al mismo tiempo

Preparación de la muestra de proteína

Preparación de las soluciones del gel empacador y el gel separador

Vertido de las soluciones de geles en el molde

Cargando las muestras