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Electroforesis Método de laboratorio
en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (ácidos nucleicos, proteínas) según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Técnicas
• Northern blot: separación de moléculas de ARN transferencia a una matriz se fija
• Southern blot: separación de moléculas de ADN transferencia a una matriz se fija
• Western blot: separación de proteínas transferencia a una matriz se adhiere anticuerpo específico se fija
Procedimiento General A) Cultivo tisular
B) Lisado celular y obtención de proteínas. C) Electroforesis en gel de poliacrilamida . D) Transferencia de las proteínas a un papel de nitrocelulosa. E) Incubación del papel con suero del paciente. F) Si existen anticuerpos para el Antígeno en el suero, éstos se unirán fuertemente a las proteínas transferidas al papel y se detectarán como bandas oscuras (f).
Procedimiento General
Los anticuerpos primarios pueden detectarse a través de dos métodos:1) Usando proteína A o proteína G2) Con la participación de un segundo anticuerpo
Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que se aislan de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.
Anticuerpos secundarios:
-Anticuerpos anti-anticuerpos
-Anticuerpos monoclonales
-Fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de los anticuerpos puros
Ensayo de transferencia Western para VIH
Es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detección in vitro de anticuerpos frente a los virus de VIH-1 y VIH-2, en suero o plasma humanos.
Es más especifico para la detección de VIH en plasma o suero.
Se utiliza electroforesis y electrotransferencia para la adhesión de antígeno vírico del VIH-1.
Péptido sintético específico contra VIH-2.
Control interno para reducir el riesgo de falsos negativos.
Principios quimicos y biologicos
Componentes del kit
• Tiras de nitrocelulosa• Control no reactivo• Control reactivo fuerte• Control reactivo debil• Tampón de blotting concentrado (10x)• Tampon de lavado concentrado (20X)• Conjugado• Sustrato• Polvo de blotting
Control de Calidad Debe cumplir con las siguientes
condiciones:Control no reactivo: no bandas específicas
de VIH1 u VIH2. la banda control debe ser visible.
Control reactivo fuerte: todas las bandas de peso molecular que corresponda deben ser visibles.
Control reactivo débil: medida de sensibilidad del kit. Las bandas del control de suero deben ser visibles.
Interpretación de los resultados
• Tiras deben estar completamente secas.
• Se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tira de control de ensayo con los controles No reactivo, Reactivo Fuerte y Reactivo Débil.
• Algunos antígenos derivan de las mismas proteínas precursoras y pueden tener epitopos superpuestos.
Verificar que la banda de control del suero sea visible
Identificacion del peso molecular de cada banda de la tira de analisis utilizando como guia las tiras de control reactivo Fuerte, Debil o ambos.
Interpretacion de las tiras de analisis según las autoridades pertinentes.
PMENV GEN Antígeno Descripción
Gp 160 ENV Forma polimerica de la gp41
Ancha y difusa de glucoproteina
Gp 120 ENV Membrana externa
Difusa de glucoproteina
p66 POL Transcriptasa inversa
Banda discreta
p55 GAG Proteina precursora
Banda discreta
p51 POL Transcriptasa inversa
Banda discreta justo por debajo de p55
p39 GAG Fragmento de p55 Banda discreta
gp41 ENV Transmembrana Difusa de glucoproteina
p31 POL Endonucleasa Doblete
p24 GAG Proteína central (core)
Banda ancha
p17 GAG Proteína central (core)
Banda ancha
Todas las bandas deben ser detectadas e interpretarse como Negativo, Positivo o Dudoso.
Patron Interpretacion
Ninguna banda virica especifica presente
Negativo
Deteccion de anticuerpos p17 unicamente
Negativo
Deteccion de dos ENV y GAG o POL VIH-1 positivo
Deteccion de dos ENV y GAG o POL y banda especifica de VIH-2 visible
VIH-1 positivo con VIH-2 señalado
Cualquier banda virica especifica presente, pero el patro no cumple con los patrones de positivo
Dudoso
Cualquier banda virica especifica presente ,pero el patron no cumple los criterios para positivo con una banda especifica de IH-2 visible
Dudoso con VIH-2 señalado