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Universidad de Oviedo

Licenciatura de Bioquímica

METODOLOGIA Y EXPERIMENTACION BIOQUIMICA I

ELECTROFORESIS Y DETECCION DE BIOMOLECULAS.

Día 1. Aspectos generales de la electroforesis. Preparación de disoluciones.

Día 2. Electroforesis de proteínas en acetato de celulosa.

Día 3. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas.

Día 4. Electroforesis en poliacrilamida con SDS.

Día 5. Detección general de proteínas tras PAGE.

Día 6. Sistemas de inmunodetección: Western, RIA y ELISA.

Día 7. Isoelectroenfoque.

Dia 8. Electroforesis bidimensional.

Día 9. Inmunoelectroforesis cuantitativa.

Día 10. Electroforesis de DNA en geles de agarosa.

Día 11. Detección específica de ácidos nucleicos. Análisis Southern.

Día 12. Detección específica de ácidos nucleicos. Análisis Southern.

Bibliografía: - Cooper, TG. Instrumentos y Técnicas de Bioquímica. Ed. Reverté, Madrid 1984. - Dunn, MJ. Gel electrophoresis: proteins. BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford 1993. - Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Ed. Reverté, Madrid 1981. - García Segura, JM y otros. Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica. Ed. Síntesis, Madrid 1996. ISBN 84-7738-429-0. - Hames, BD & Rickwood D, eds. Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach (2ª ed). IRL Press, Oxford & New York, 1990. - Westermeir, R. Electrophoresis in practice. John Wiley and Sons, 1997. NOTA: Para el desarrollo de las prácticas es necesario llevar bata de laboratorio y guantes de goma o vinilo.

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Día 1. INTRODUCCION. ASPECTOS GENERALES TEORICOS Y PRACTICOS.

Muchas biomoléculas, como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos o ácidos

nucleicos, poseen grupos ionizables, y por lo tanto a determinados pHs aparecen como partículas cargadas positiva o negativamente; iones o macroiones, al fin y al cabo. Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución, las moléculas de soluto con carga neta positiva (cationes) se desplazan hacia el cátodo y las moléculas con carga neta negativa (aniones) se desplazan hacia el ánodo. Este desplazamiento se denomina electroforesis. Es una técnica de separación de las más usadas en Bioquímica, en la que las partículas cargadas se separan por su diferente velocidad de migración. La electroforesis fue descrita como método bioquímico de separación por Tiselius a mediados de 1930. El equipamiento mínimo requerido para la separación electroforética de biomoléculas es relativamente simple, y consta básicamente de dos componentes: una fuente de

alimentación que proporciona el campo eléctrico, y un equipo de electroforesis, en el que se debe ubicar entre dos electrodos el medio a través del cual migran las partículas cargadas. La electroforesis se desarrolla en un tampón que ejerce dos funciones: i) lleva la carga eléctrica, y ii) determina por su pH la carga neta de las moléculas que se separan y, por tanto, la dirección de la migración electroforética de las mismas. Así, la migración de las partículas es dependiente del pH

del medio, ya que su carga neta depende del pH: carga negativa si el pI es menor que el pH y carga positiva si el pI es mayor que el pH.

Aunque inicialmente la electroforesis se desarrollaba de modo libre en solución, la inestabilidad del aparato, el calentamiento, las corrientes de convección y la difusión de las moléculas limitaban enormemente la utilidad de la técnica. Para evitar estas limitaciones se introdujeron soportes sólidos inertes, como el papel o las membranas de acetato de celulosa, que producen separaciones más nítidas al evitar las corrientes de convección que se producen por el calentamiento durante la electroforesis libre. Se han usado muchos medios soporte, que se pueden clasificar en dos tipos: - Tipo I (no restrictivos): son los que se utilizan principalmente para evitar la convección y minimizar la difusión, como papel, acetato de celulosa y agar. De la misma forma que ocurre en la electroforesis libre, la separación se basa en la densidad de carga (relación carga/masa) de las moléculas al pH de trabajo. - Tipo II (restrictivos): son los que, además de evitar la convección y minimizar la difusión, tienen una estructura porosa tal que, si el tamaño de las moléculas a separar es del mismo orden que el tamaño del poro, causan un efecto de tamiz molecular. Entre ellos están los geles de almidón, agarosa y poliacrilamida. Las moléculas con menor tamaño pasarán por los poros del gel más

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fácilmente que aquéllas con tamaño mayor, y la separación de las moléculas dependerá, entonces, de la densidad de carga y del tamaño y la forma de la molécula. Modificando las concentraciones de los componentes o monómeros que forman el gel, pueden conseguirse (dentro de unos márgenes) diferentes porosidades. Así, p.e., dos proteínas con igual densidad de carga pero distinto tamaño probablemente no podrán ser separadas mediante electroforesis en papel, mientras que, si la diferencia de tamaño es suficiente, podrán ser separadas en geles de poliacrilamida. Los geles de agar suelen tener hoy en día aplicaciones muy específicas, como algunos tipos de inmunoelectroforesis. Los de almidón son una red tridimensional formada por almidón parcialmente hidrolizado y no se puede controlar demasiado su tamaño de poro, por lo que actualmente son poco usados. La agarosa es un polímero de poligalactosa, cuyos geles tienen un tamaño de poro muy grande que sí se puede controlar variando la concentración. Se utilizan para separar moléculas de tamaño mayor a 200 kDa, por lo que se aplican principalmente para la separación de ácidos nucleicos o proteínas muy grandes. La poliacrilamida es el soporte más versátil y manejable, y se utiliza principalmente para separar proteínas. Aunque acetato de celulosa, almidón o agar todavía se emplean para algunas aplicaciones, actualmente la mayoría de los geles utilizados en electroforesis son de agarosa o poliacrilamida. Aspectos teóricos generales. Para poder entender la teoría de electroforesis se analizará el desplazamiento de una partícula cargada en un campo eléctrico. Al aplicar una diferencia de potencial o voltaje V, entre dos electrodos, se genera un gradiente de potencial o campo eléctrico E, que es el voltaje dividido por la distancia entre los electrodos, y se mide en voltios/cm.

E = V / d

En el momento en que se aplica el campo eléctrico, impulsando el movimiento está la acción de la fuerza eléctrica F ejercida por el campo eléctrico sobre la partícula, que hará que ésta se acelere, y que dependerá del campo eléctrico y de su carga neta, q: F = E q Tan pronto como la partícula empieza a moverse por la acción de la fuerza eléctrica y adquiere una velocidad v, se manifiesta una fuerza de fricción o fuerza viscosa Fv que se opone al movimiento y que está generada por la fricción que ejerce el entorno sobre la partícula, siendo mayor a mayor velocidad. Fv = - f v El coeficiente de fricción f depende del tamaño y forma de la molécula, de la porosidad del medio en el que se realiza la electroforesis y de la viscosidad del tampón. Si se asume que la partícula es esférica se puede aplicar la ley de Stokes y entonces el coeficiente de fricción se define como: f = 6 r , siendo r el radio de la partícula y la viscosidad del medio. Entonces: Fv = 6 r v

Las moléculas grandes o asimétricas encuentran más resistencia de fricción que las pequeñas o compactas, y por tanto tienen coeficientes de fricción mayores. Para el caso general de partículas no esféricas se puede sustuir el valor del radio por el del denominado radio de Stokes (R), definido como el radio de una partícula esférica hipotética de iguales propiedades hidrodinámicas que la partícula considerada. Al cociente R/r se le conoce como relación friccional; para una molécula completamente esférica vale 1. Cuanto más se aleje la forma de la molécula de la esfericidad mayor es su valor. Para proteínas globulares tiene valores entre 1,1 y 1,5, y para el fibrinógeno, muy alargado, 2,34.

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Cuando se activa el campo eléctrico, la molécula se acelera rápidamente hasta alcanzar una

velocidad en la que estas fuerzas se equilibran: debido a que la fuerza de fricción es proporcional a la velocidad de migración de la partícula, ésta se acelerará hasta que Fv se iguale con F. A partir de ese momento la fuerza neta sobre la partícula será nula y se alcanzará un estado estacionario en el que la partícula se moverá a una velocidad constante determinada por el equilibrio de las fuerzas: Fv = F f v = E q 6 r v = E q v = E q / f

Podemos reformular esta ecuación como v / E = q / f para expresar la velocidad del

movimiento por unidad de fuerza de campo, v / E. Este cociente se denomina movilidad

electroforética (μ , U) de la molécula, y depende directamente de su carga e inversamente del coeficiente de fricción f. μ = v / E = q / f = q / 6 r Si consideramos varias partículas cargadas, y dado que la viscosidad está dada por el medio externo común, la movilidad electroforética depende de q y r, es decir de la relación carga/masa,

del tamaño y de la forma que presente cada una. - Partículas con diferente relación carga/masa podrán moverse con diferente velocidad durante el desarrollo electroforético y, si la diferencia es suficiente, se separarán. - Por otra parte, si tienen igual relación carga/masa pero distinto tamaño o distinta forma, y por tanto distinto coeficiente de fricción, también podrán separarse. Dado que las distintas biomoléculas de una muestra pueden diferir en uno o varios de esos aspectos, su comportamiento en un campo eléctrico proporciona una buena manera de separarlos. En la práctica, por lo general nos interesará que la separación se produzca principalmente por sólo

uno de los dos criterios, para facilitar la interpretación de los resultados. Así pues, el resultado de una electroforesis depende de diferentes factores y es necesario conocerlos para lograr la máxima resolución. A continuación se describen algunos parámetros del sistema que pueden ser variados para optimizar la separación: 1. Campo eléctrico. Es lo que posibilita que haya electroforesis. A su vez, como gradiente de potencial que es, depende de diferentes parámetros, cuya incidencia hay que analizar. Diferencia de potencial entre electrodos, V. Se mide en voltios y es lo que define el campo

eléctrico o gradiente de potencial E = V/d, que es la diferencia de potencial entre electrodos referida a la distancia entre éstos (en volts/cm). La fuerza sobre un ión con carga q es F = E q y por tanto la velocidad de migración es proporcional a V q / d: un aumento en el gradiente de potencial aumenta proporcionalmente la velocidad de migración. Las electroforesis realizadas a 10-500 voltios se suelen considerar de bajo voltaje (la gran mayoría), siendo de alto voltaje las que se llevan a cabo entre 500 y 10.000 voltios. Intensidad, i. Está relacionada con el factor anterior por la ley de Ohm (V = i R). Cuando se aplica una diferencia de potencial entre los electrodos, se genera una corriente (medida en coulombs/seg o amperios; habitualmente 5-50 mA) cuya magnitud está determinada por la resistencia R del medio y es proporcional al voltaje. Cuantifica el flujo de carga eléctrica y por tanto es lo que, en última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas. La distancia migrada por los iones será proporcional a la corriente aplicada y al tiempo. El aumento del voltaje aumentará la carga total por segundo que converge al electrodo. La corriente es conducida en la solución entre los electrodos principalmente por los iones del tampón y en una pequeña proporción por los iones de la muestra. Resistencia, R. Se mide en ohmios. Cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad electroforética, puesto que la intensidad será menor. La resistencia depende de la naturaleza del soporte, de sus dimensiones (anchura, longitud, sección) y de la concentración del tampón de electroforesis. Por tanto, si se someten dos soportes de diferentes características a la

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misma diferencia de potencial, la intensidad que circule por cada uno de ellos puede ser distinta. Temperatura. El paso de una corriente eléctrica produce calor (debido al efecto Joule). Este efecto será mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, pues puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte, e incluso al equipo electroforético, si la temperatura se eleva en demasía. Por ello en algunos casos es necesario un sistema de refrigeración en las cubetas. 2. Muestra. La movilidad electroforética (o la velocidad de migración) de una molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga, y disminuye según aumenta su tamaño y cuanto más se aleja su forma de la esférica. La magnitud de la carga es en general dependiente del pH y por tanto dependiente del sistema de tampones utilizado. Cuanto mayor es el tamaño, mayor es la fricción de la molécula en el medio y menor es su carga por unidad de superficie, factor que multiplicado por el valor del campo daría el de la fuerza que actúa sobre la molécula. Respecto a la forma, las moleculas globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas o con formas más irregulares, ya que la esfera presenta la mínima superficie a igualdad de volumen o masa. Por ello moléculas del mismo tamaño y carga, pero de distinta forma, pueden tener distinta movilidad electroforética U, y ser separables por electroforesis. 3. Tampón. En toda electroforesis es necesario un tampón con una fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso. Durante la electroforesis se produce hidrólisis del agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en la del cátodo, por lo que los entornos se harían más ácido o más básico respectivamente, y un tampón es esencial para compensarlos. Su composición no debe afectar a las moléculas a separar, aunque en algunos casos se aproveche la unión de alguno de sus iones para producir una mejor separación. En todo caso, el pH es la característica del tampón que debe ser controlada más cuidadosamente, puesto que determina la carga de la muestra. Por otra parte, la fuerza iónica condiciona la U de las sustancias a separar, pues influye en su esfera de solvatación y en la conductividad del sistema. Además, la fuerza iónica determina la anchura de la nube iónica que rodea las moléculas cargadas: cuanto mayor es la fuerza iónica, más estrechas son las bandas de

separación. Sin embargo, una fuerza iónica elevada produce un mayor calentamiento y la posible desnaturalización de las sustancias que van a separarse, de forma que hay que llegar a una solución de compromiso. Por ello se usan tampones con fuerzas iónicas moderadas (50-100 mM). Por último, hay que señalar que hay dos sistemas generales de electroforesis, atendiendo a la distribución del tampón: sistemas de tampón continuo, cuando se emplea un único tampón en el proceso, y sistemas discontinuos, cuando se usan al menos dos tampones diferentes, en cuanto a pH y composición (ver SDS-PAGE). 4. Soporte. La presencia del soporte hace que éste pueda dar lugar a una serie de fenómenos, ajenos a la electroforesis en sí, pero en algunos casos de transcendencia para el resultado del proceso. Tales fenómenos son los siguientes: Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los soportes, observado principalmente en geles de almidón, agarosa y poliacrilamida. El movimiento de las moléculas por el soporte es frenado al tener que pasar a través de los poros, y es más o menos fácil en función de su tamaño respecto al de éstos. Cuanto más tupida es la red de fibras, menores son los poros. Dependiendo del tamaño de las moléculas a separar se debe seleccionar el tipo de gel y tamaño de poro adecuado para que exista un efecto tamiz del soporte. De esta manera, el soporte

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actúa como un cedazo que separa o tamiza las moléculas en función de su tamaño. Adsorción. Es una retención inespecífica de las moléculas de la muestra sobre el soporte. Tiene un efecto negativo sobre la resolución, ensanchando las bandas de migración. Electroendósmosis. Es un fenómeno que se da en algunos soportes (p.e. el agar), en los que aparecen cargas negativas debidas a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolución iónica. Surge así un potencial de Helmholtz sobre la superficie del soporte, y los iones del tampón se orientan según dicho potencial. Al aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga, pero en su migración se encuentran con un flujo de cationes desplazándose sobre la superficie del soporte, y otro de aniones haciéndolo por el centro de los poros. Tal flujo orientado se denomina flujo electroendosmótico, y va en contra de la resolución electroforética, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan al enfrentarse a una corriente de iones orientada en sentido contrario. Sin embargo, ese flujo mejora la resolución en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis capilar. Aspectos generales a nivel práctico.

A la hora de realizar una separación electroforética hay que tomar una serie de decisiones sobre las condiciones de la misma respecto a la forma física del gel, uso de condiciones nativas o desnaturalizantes, sistema continuo o discontinuo, concentración del gel, pH y concentración salina, etc. Todos estos aspectos, y algunos otros, van a condicionar la separación (distancia entre bandas) y la resolución (que está afectada por la anchura de las bandas) que consiga la electroforesis. Uno de los factores que más influye en estos parámetros es el tamizado molecular, relacionado con la concentración del gel. Aunque haya unos rangos orientativos tamaño-concentración, ésta se elige de manera empírica hasta lograr un análisis adecuado de los componentes de la mezcla: deben ensayarse distintos % de poliacrilamida o agarosa para decidir el más adecuado.

Tras preparar el soporte correspondiente, hay que ponerlo en contacto con los electrodos a través del tampón (sin hacer pasar la corriente todavía). En el caso de los geles de agar o agarosa, el tampón está embebido en el soporte. En el caso del papel o del acetato de celulosa, es necesario humedecer el soporte para que sea conductor, para lo que se impregna de tampón de electroforesis de forma simultánea por ambos extremos, de forma que se desplace por capilaridad hacia la zona donde está aplicada la muestra.

La primera etapa del proceso electroforético es la aplicación de la muestra. Con ligeras variantes en los distintos soportes ésta se puede efectuar de forma puntual o longitudinalmente. La aplicación puntual permite analizar varias muestras simultáneamente, mientras que en la longitudinal se aplica una sola muestra pero en mayor cantidad. La muestra se aplica disuelta en el tampón de electroforesis, del que está impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios de la cubeta. Se deposita en una pequeña zona, lo más estrecha posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se conoce cuál va a ser la dirección de desplazamiento), de modo perpendicular a la dirección del campo eléctrico.

Debe evitarse la proximidad de los bordes del soporte, donde el campo eléctrico no es homogéneo y se distorsionan las bandas según avanzan. Para acetato de celulosa, el volumen aplicado suele ser inferior a 10 μl, y si se requieren volúmenes mayores pueden hacerse aplicaciones sucesivas en la misma zona, secando después de cada una de ellas. En todos los casos, la zona de aplicación debe ser lo más estrecha posible, pues así aumenta la resolución, al evitarse solapamientos entre bandas que migren en posiciones cercanas. Debe considerarse que las bandas separadas siempre son más anchas que la zona de aplicación inicial, debido a la difusión.

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Una vez aplicada la muestra debe verificarse que el sistema muestra continuidad al paso de la corriente eléctrica. Al aplicar una diferencia de potencial comienza la electroforesis, y cada componente de la muestra migrará hacia uno u otro polo en función de su carga. La electroforesis finalizará cuando se haya producido la máxima separación de los componentes de la muestra, sin sobrepasar los límites del soporte: en caso contrario, acabarían mezclados con el tampón de la cubeta. Para evitar esto se usan los marcadores electroforéticos, que son moléculas coloreadas de elevada U (gran relación carga/masa), superior a la de cualquier componente de la muestra, y se aplican con ella, yendo habitualmente incluídos en el tampón de muestra. Su desplazamiento se puede observar por ser coloreados, y cuando alcanzan el extremo del soporte se da por finalizada la electroforesis. De esta manera se tiene la certeza de que ningún componente de la muestra ha abandonado el soporte. Entre los marcadores más utilizados se encuentran el azul de bromofenol, el xylene cyanol y la dinitrofenil-lisina.

Cuando las moléculas se han desplazado durante un período de tiempo suficiente, para conocer el resultado del proceso se procede a la etapa de tinción. El soporte se retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contenga una disolución de un colorante que se una exclusivamente a los componentes de la muestra. En el caso de los ácidos nucleicos se suele usar bromuro de etidio, un agente fluorescente que se intercala en las cadenas. En el caso de las proteínas, como colorantes de tinción son muy usados el Negro Amido y el Azul de Coomassie, que permiten detectar cantidades de proteína en torno a 1 μg o superiores, aunque hay otros métodos que permiten mayor sensibilidad (ver práctica de Detección de proteínas).

Hay tipos especiales de electroforesis que no veremos en estas prácticas. Entre ellas está la electroforesis capilar, una técnica más reciente, rápida y sensible que la electroforesis en gel. Se basa en la utilización de tubos capilares con diámetros internos del orden de 50-100 μm y 20-60 cm de largo. Debido a que la resistencia es grande, dada la pequeña sección de los capilares, es posible aplicar gradientes de voltaje bastante altos sin que la corriente se incremente demasiado, lo que hace que la separación sea rápida. Debido a que la capilaridad impide la mezcla por convección no es necesario utilizar soporte, aunque a veces se incorpora un soporte poroso para generar el efecto tamiz molecular. La detección se realiza por absorbancia UV o fluorescencia, a medida que los componentes pasan por un punto determinado en el capilar. La sensibilidad es de femtomoles (10-

15) con detección UV y zeptomoles (10-21) con detección fluorescente. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, en los secuenciadores automáticos de DNA.

Otra técnica especial es la electroforesis en campo pulsante, que utiliza aparatos con un diseño de electrodos más complejo de lo normal y aplica campos eléctricos de polaridad cambiante, para conseguir separar grandes fragmentos (habitualmente cromosómicos) de DNA.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Preparación de disoluciones.

- Acrilamida:bisacrilamida (30:0,8%). 500 ml (Filtrar y proteger de la luz. Neurotóxico) - SDS (sodium dodecyl sulphate) 10%. 200 ml - Tampón Tris-HCl 1,5 M pH 8,8. 100 ml - Tampón Tris-HCl 0,5 M pH 6,8. 100 ml - Tampón de reservorios (10x) Tris 248 mM, glicina 1,92 M. 1 litro - TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0. 100 ml - TAE (20x): Tris 0,8 M, acetato sódico 0,4 M, EDTA 40 mM, acético para pH 7,2. 500 ml - SSC (20x): NaCl 3 M, citrato sódico 0,3 M, pH 7,0. 1 litro - Solución de tinción: azul de Coomassie 0,25%, metanol 45%, ac. acético 10%. 500 ml - Solución de destinción: metanol 20%, ac. acético 10%. 1 litro

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Día 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN ACETATO DE CELULOSA. Las proteínas pueden ser consideradas como polianfolitos débiles y presentan carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su pI, por lo que tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración en el campo eléctrico es proporcional a la relación entre la carga de la proteína y su masa; cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Las cargas derivan de los aminoácidos con grupos laterales ionizables, que incluyen los básicos de arginina, lisina e histidina, los ácidos de los ácidos glutámico y aspártico y las cadenas laterales de tirosina y cisteína. Las modificaciones post-traduccionales como fosforilación y glicosilación también aportan carga a las proteínas (casi siempre negativa), y en menor medida los grupos amino y carboxilo terminal. Debido a que estos grupos presentan diferentes grados de ionización, la carga neta de las proteínas es muy dependiente del pH del medio.

La electroforesis en acetato de celulosa es similar a la realizada en papel, y suele emplearse para separar mezclas de moléculas relativamente pequeñas principalmente en base a sus diferencias en carga. Así, se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. El tamaño de las proteínas es mucho menor que el de los poros del soporte, por lo que la separación depende sólo de la densidad de carga, es decir de la relación carga/masa al pH considerado. El soporte consiste en finas tiras de acetato de celulosa y tiene las ventajas de presentar una adsorción mínima (lo que evita la formación de colas y se traduce en una nítida separación de las bandas), de necesitarse cantidades mínimas de muestra y de permitir una separación muy rápida. Otras ventajas son que las tiras pueden hacerse transparentes, o que se pueden disolver para recuperar los componentes separados, y que presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos. Entre sus desventajas figuran que captan poca agua y que son más susceptibles a la evaporación que el papel. Son también más susceptibles al flujo electroendosmótico. Electroforesis de las proteínas del suero.

La composición normal del suero humano es de un 90% de agua y un 10% de solutos. De éstas un 10% son sales inorgánicas, un 20% pequeños nutrientes y metabolitos, y un 70% proteínas séricas. A su vez, dentro de éstas, la albúmina suele suponer un 55-60%, las - globulinas un 10-15%, las -globulinas un 5-15% y las -globulinas un 15-30%.

Las proteínas de suero se separan

habitualmente mediante e. en acetato de celulosa. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9 (albúmina) y 7,4 ( -globulinas), por lo que al realizar la electroforesis con un tampón de pH 8,6, todas tendrán carga negativa. La albúmina, al tener el punto isoeléctrico más alejado del pH, tiene más carga negativa y avanza más rápido, quedando más cerca del polo positivo que las -globulinas, que migran muy poco por ser el pH próximo a su pI. Las restantes proteínas séricas quedan situadas entre estas dos.

En el suero de rata la distribución de bandas es diferente, separándose sólo las - y -globulinas, la albúmina y una banda proteica de mayor movilidad electroforética que la albúmina, denominada prealbúmina.

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En esta práctica se pretende llevar a cabo la separación electroforética de las proteínas del suero, obteniéndose normalmente cinco fracciones con carga neta negativa decreciente: albúmina,

1-globulinas, 2-globulinas, -globulinas y -globulinas. Esta técnica es muy utilizada en Bioquímica Clínica para medir cambios ocurridos en las proteínas séricas causados por diversas enfermedades (hiper- -globulinemia: aumento en toda la zona ; cirrosis etílica: aumento en bloque de - y -globulinas; afecciones reumáticas: aumento de 2- y -globulinas, etc). También separaremos las fracciones proteicas de sueros de distintas especies animales y haremos un estudio comparativo de su composición. Finalmente, someteremos a electroforesis una mezcla de proteínas purificadas de distintos pI y Pmol, para comparar su movilidad en acetato de celulosa con la observada en otros sistemas electroforéticos que usaremos.

Los aparatos requeridos para la electroforesis en acetato de celulosa son dos: una fuente de corriente continua y una cubeta de electroforesis, la cual consta de los dos electrodos, los recipientes para la disolución tampón, un soporte para el medio electroforético y una tapadera aislante.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Electroforesis.

- Sumergir las tiras de acetato de celulosa (Cellogel) en un exceso (aprox. 150 ml para 3 tiras) de tampón veronal sódico 0,04 M pH 8,6 durante 10-15 min. - Rellenar los reservorios del tanque electroforético con tampón, asegurándose de alcanzar el mismo nivel en los dos compartimentos.

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- Sacar cada tira de acetato de celulosa con pinzas (no tocar con los dedos) y colocarla entre dos hojas de papel de filtro para absorber el exceso de tampón, pero con cuidado de que no lleguen a secarse por completo. - Colocar rápidamente la tira (evitando que se seque) sobre el puente soporte y ajustarla con las horquillas. Las tiras deben quedar encajadas exactamente sobre las marcas laterales del soporte, de tal manera que la esquina cortada de las mismas quede hacia la derecha y abajo, tal y como se indica en el puente. - Introducir el puente con las tiras en la cubeta. Asegurarse de que los extremos de la tira quedan sumergidos en el tampón. - Aplicar cada muestra (unos 2 μl) con una micropipeta a 1 cm de distancia del borde de la tira en el lado catódico (polo negativo: negro). - Colocar la tapa de seguridad. Conectar el tanque electroforético a la fuente de corriente eléctrica y seleccionar una diferencia de potencial de 200 V, dejando correr la electroforesis durante 35-60 min. - Transcurrido el tiempo adecuado, apagar la fuente de corriente.

Tinción. - Introducir las tiras en la disolución del colorante (0,5 g de Negro Amido + 45 ml de agua

destilada + 10 ml de ácido acético glacial) durante 5-10 min. - Lavar las tiras de Cellogel en un volumen abundante de la disolución transparentadora

(mezcla de A + B preparada recientemente) hasta que se observen bien las bandas de proteína (azules) sobre un fondo blanco. Disolucion A: 870 ml metanol + 30 ml ciclohexanona Disolución B: 100 ml ac. acético glacial

- Una vez que el fondo de las tiras quede completamente blanco, sacarlas de la disolución transparentadora, extendiéndolas a continuación sobre una placa de vidrio (eliminar las burbujas de aire con ayuda de una pipeta usada a modo de rodillo).

- Introducir la placa con las tiras en una estufa a 70°C durante 3 min para completar el desteñido. También se puede realizar a temp. ambiente durante 1 hora.

- Dejar enfriar a temp. ambiente antes de separar las tiras de la placa. Si se desea cuantificar el resultado, se puede hacer una lectura fotodensitométrica a 620 nm.

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Día 3. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES NATIVAS.

La electroforesis de proteínas en geles hechos de una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) es sin duda una de las técnicas más ampliamente usadas para estudiar mezclas complejas de proteínas y en menor medida de fragmentos pequeños de DNA. La PAGE es un método fácil, rápido y económico a nivel de muestra, pues para la detección de las proteínas se requieren sólo cantidades del orden de

g o inferior. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes,

transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica. Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero acrilamida (CH2=CH-CO-NH2) y el co-monómero bifuncional de entrecruzamiento N,N’-metilén-bisacrilamida. La polimerización de monómeros de acrilamida genera largas cadenas, y el entrecruzamiento de éstas por la bisacrilamida, que reacciona con los grupos funcionales libres en los extremos de las cadenas, proporciona la estructura tridimensional.

La reacción de polimerización de acrilamida es iniciada con persulfato de amonio (PSA) y N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED); ésta actúa catalizando la formación de radicales libres de persulfato, que a su vez inician la polimerización. El aumento de la concentración de TEMED y PSA aumenta la velocidad de polimerización, mientras que a pH ácido y en algunas técnicas como el isoelectroenfoque, en el que la presencia de zonas ácidas pude impedir la disociación del persulfato, se emplea ribofavina fotoactivada y TEMED. Por otra parte, las soluciones de acrilamida se suelen desgasificar antes de usar, pues el oxígeno es un inhibidor de la polimerización y además durante la polimerización se libera calor, que puede provocar la formación de burbujas en el seno del gel.

La porosidad del gel (y su rango de separación) la determinan las proporciones relativas y totales de acrilamida y bisacrilamida, siendo menor el poro cuanto mayor sea la relación bisacrilamida/acrilamida que se usa y cuanto mayor sea el porcentaje total de ambas. Variando las concentraciones de la primera y la segunda, se consiguen geles de poliacrilamida con un amplio rango de tamaño de poro, dentro del cual se puede escoger para optimizar la separación de los componentes de la muestra de interés. Habitualmente los geles se denominan en función del % de acrilamida+bisacrilamida (%T) que contienen, y la mayoría de las proteínas se separan bien en el rango del 5 a 12%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.

Los geles de poliacrilamida se describen por las nomenclaturas %T y C,

%T = (A+B) / V x 100 % y C = B / (A+B) x 100 % Donde A y B son las cantidades de acrilamida y bisacrilamida, respectivamente, expresadas en gramos. V fue definido originalmente como el volumen de tampón agregado pero por razones prácticas generalmente se considera como el volumen de solución gelificante. A nivel práctico, en el laboratorio se suele usar más la electroforesis en poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, porque permite la separación de las proteínas sólo en función de su Pmol. Sin embargo, su uso en condiciones nativas o no desnaturalizantes proporciona la gran ventaja de poder hacer ensayos de actividad de las proteínas tras su separación. En condiciones nativas, la concentración óptima del gel que usemos en una separación se ve

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determinada por el tamaño y la carga de las proteínas que estemos estudiando. En su estructura nativa una proteína tendrá una determinada relación carga/masa y migrará en un campo eléctrico a una velocidad proporcional a esa relación. Como se comentó anteriormente, la carga de las proteínas depende de su pI y del pH del medio, y el tamaño de su Pmol. La separación electroforética puede realizarse a cualquier pH entre 3 y 11, que es el rango de estabilidad de la poliacrilamida, lo que permite un amplio margen para seleccionar las condiciones experimentales adecuadas (pH, fuerza iónica, características del soporte, voltaje, tiempo de corrido) para conseguir la separación de moléculas con diferente relación carga/masa, tamaño o forma. Si el medio en que se realiza la electroforesis es un gel con tamaño de poro adecuado, además de la relación carga/masa deberá tenerse en cuenta el efecto tamiz aportado por el gel, que atañe al tamaño y forma de la molécula, la cual depende de cómo se pliega la cadena polipeptídica (estructuras secundaria y terciaria). Debido a sus diferentes formas, una proteína globular (con forma semejante a una esfera, que presenta la mínima superficie a igualdad de volumen o masa), una proteína fibrosa (con forma alargada), o proteínas con formas mucho más complejas, todas con el mismo Pmol, tendrán radios o diámetros hidrodinámicos diferentes, sufrirán de forma diferente el efecto de tamizado molecular, y podrán separarse bajo las condiciones adecuadas.

Debido al efecto de tamizado del gel, la movilidad de las proteínas es inferior a la que cabría

esperar según v = E q / f. Esto puede verse reflejado en gráficas en las que se representan para cada proteína los log de los Rf respecto a los porcentajes de acrilamida. El Rf es la distancia migrada por cada banda partido por la distancia migrada por el frente, y es una estimación de la movilidad

electroforética relativa: Ur = μ = Rf = v / E = q / f

Generalmente, una gráfica de log μ ó Rf frente al

porcentaje del monómero es lineal; esto se denomina una representación de Ferguson. La movilidad límite que se extrapola cuando el porcentaje de gel se acerca a cero (el valor de la ordenada en el origen) se denomina movilidad

libre y se correlaciona con su densidad de carga, que a su vez depende del pI y del pH. Las pendientes de las rectas obtenidas para varias proteínas analizadas en geles de varios porcentajes de acrilamida se correlacionan con el tamaño y la forma de las proteínas, puesto que reflejan la dificultad de éstas cuando pasan a través del entramado molecular del gel: a mayor tamaño y/o forma menos esférica (mayor radio o diámetro hidrodinámico), más pendiente.

Aunque este análisis permite estudiar varios parámetros que afectan a la movilidad electroforética, a nivel práctico está sobre todo indicado para la comparación mutua de dos o más proteínas globulares, con objeto de optimizar las condiciones de separación respecto a su masa y densidad de carga.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. En esta práctica vamos a utilizar seis geles con 5, 6, 8, 10, 12 y 15 % de acrilamida para

estudiar el comportamiento electroforético en condiciones nativas de varias proteínas con distintos pI y Pmol. De los resultados obtenidos tras la tinción de los geles podemos extraer conclusiones sobre los Pmol y las densidades de carga de las proteínas analizadas.

Para esta práctica se han elegido ocho proteínas con distinto Pmol y pI. Para preparar las muestras se mezclan tres volúmenes del problema con un volumen de tampón de la muestra. (ejemplo: 7,5 μl de proteína + 2,5 μl de tampón de muestra). Las muestras ya preparadas contienen aproximadamente 0,2-1,0 μg/μl de proteína en tampón de muestra. En este caso la muestra no se hierve antes de cargar en los geles, a diferencia de la SDS-PAGE. Las muestras deben contener una cantidad baja de sales, para lo que las hemos desalado con columnas especiales.

Materiales y reactivos.

- Aparatos de electroforesis vertical. - Agarosa al 1% fundida. - Acrilamida : N,N'-metilen bisacrilamida 30:0,8%. - Tris-HCl 1,5 M pH 8,8. - Tampón de reservorios (x10): Tris 248 mM, glicina 1,92 M (diluir 10 veces con agua). - Tampón de muestra (x4): Tris-HCl 0,25 M pH 8,8, glicerol 35%, azul de bromofenol 0,05%. - TEMED: N,N,N,'N-tetrametilendiamina. - Persulfato amónico (PSA) al 10 %. - Sol. de tinción: azul de Coomassie 0,25%; metanol 45% y ac. acético 10%. - Sol. de destinción: metanol 20% y ac. acético 7,5%.

Preparación de los geles. Limpiar los cristales con agua y jabón, sin usar estropajo, con agua destilada y luego con

alcohol. Ensamblarlos, utilizando los espaciadores de metacrilato. Sujetar el molde o casete con las pinzas metálicas. Sellar los bordes con agarosa fundida. Para conseguir los distintos % de acrilamida realizar las siguientes mezclas: 5% 6% 8% 10% 12% 15% Agua 5,6 ml 5,3 ml 4,7 ml 4,0 ml 3,3 ml 2,3 ml Tampón 8,8 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Acrilamida/Bis 1,7 ml 2,0 ml 2,6 ml 3,4 ml 4,0 ml 5,0 ml TEMED 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl

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Para polimerizar los geles añadir 100 μl de PSA 10%, mezclar la solución invirtiendo el tubo un par de veces y echar caso toda la mezcla dentro de los moldes puestos verticalmente. Usando guantes, introducir el peine con cuidado, ya que expulsará acrilamida. No deben quedar burbujas en contacto con la acrilamida, pues el oxígeno inhibe la reacción de polimerización.

Electroforesis. Una vez polimerizado el gel, quitar las pinzas del molde, extraer el espaciador inferior y

acoplar el molde al tanque de electroforesis, de forma que el vidrio con la muesca quede orientado hacia el reservorio superior. Sujetar el molde al tanque poniendo una pinza a cada lado en la parte superior, sobre el contacto de goma. Rellenar el reservorio superior del tanque con el tampón de los reservorios (diluído diez veces) hasta que el líquido entre en los pocillos de las muestras, y comprobar que no hay fugas en la zona de contacto. Llenar el reservorio inferior y eliminar la burbuja de aire que suele quedar atrapada en la parte inferior del gel. Conectar los cables eléctricos entre el tanque y la fuente de alimentación. Cargar 10 μl de muestra (unos 2-10 μg) por pocillo, procurando seguir el mismo orden correlativo en los geles de todos los grupos a fin de hacer más sencillo el análisis posterior.

Aplicar la corriente eléctrica. Normalmente se utilizan 100-150 V/gel, hasta que el marcador de frente llegue al extremo inferior del gel.

Tinción. Finalizada la electroforesis, extraer los geles desarmando con cuidado el molde: hacer marcas identificativas de concentración y posición en cada uno de los geles.

OJO: Cortar los geles por la línea del frente de azul de bromofenol. Esto se hace para poder calcular luego el Rf, ya que en el proceso de tinción/destinción el

frente se pierde, y además los geles encogen ligeramente. Una vez procesados todos los geles, introducirlos en solución de teñido y dejar en agitación a 55°C durante 10 min. Posteriormente, lavar los geles con agua y desteñir a 55°C con solución de destinción y trocitos de esponja hasta que el fondo quede suficientemente claro para visualizar las bandas de cada proteína.

Análisis mediante gráficas de Ferguson: Para estimar los Rf de las proteínas, medir la distancia que migra cada banda y dividirla por la migración del colorante (el frente) en el gel. Para cada proteína debe construirse una gráfica semilogarítmica representando en ordenadas el log decimal de los valores de Rf (lg Ur) en los distintos geles y en abscisas el % de acrilamida (T) empleado en cada caso. Kr es la pendiente de la recta para cada proteína, y Y0 la movilidad electroforética para T = 0%.

lg Ur = lg Yo – Kr T

Representar en una gráfica lineal los valores de Pmol de las proteínas frente a los de las pendientes de la representación de Ferguson. En este caso, la línea (más o menos recta) que refleja la correlación que se obtiene no pasa por el origen, y se suele observar en un rango entre los 40 y 400 kDa.

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Día 4. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS.

Aunque el uso de representaciones de Ferguson para el análisis de la movilidad electroforética de una proteína en condiciones nativas permite obtener conclusiones respecto a la carga y la masa de la misma, el proceso es complejo por necesitar geles de varias concentraciones y poco exacto por no proporcionar medidas absolutas y precisas. En todo caso, es imposible obtener tales datos usando un único gel en condiciones nativas. Sin embargo, en las electroforesis en

poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) se puede establecer una relación clara entre los Pmol de las proteínas y sus movilidades electroforéticas, ya que los complejos proteína-SDS se separan estrictamente según su tamaño.

Algunos compuestos químicos, llamados agentes desnaturalizantes, hacen que las proteínas pierdan su estructura nativa, ya que producen el desplegamiento o desnaturalización de la proteína, que pierde la organización tridimensional característica de su funcionalidad biológica. Aunque hay un gran número de agentes desnaturalizantes de proteínas, con PAGE se utilizan fundamentalmente urea o clorhidrato de guanidina, así como detergentes iónicos fuertemente positivos o negativos.

La urea interfiere con las interacciones hidrofóbicas de las proteínas, produciendo la desnaturalización de muchas a elevadas concentraciones (4-8 M). La PAGE en urea tiene dos aplicaciones principales para el análisis de proteínas: una es la separación de algunas proteínas peculiares, como las histonas (muy básicas) y otras proteínas nucleares y ribosomales (muy insolubles y con gran tendencia a agregar), y la otra el análisis conformacional de proteínas mediante geles con un gradiente transversal de urea. Por otra parte, se usan geles de acrilamida/urea para la secuenciación de ácidos nucleicos por el método clásico.

Los detergentes afectan a la estructura nativa de las proteínas y a las interacciones con otras moléculas (proteínas, lípidos, etc), por lo que son muy usados para su solubilización y disociación. Las interacciones hidrofóbicas en las proteínas son sustituídas por interacciones detergente-proteína, con lo que se pierde también el resto de las interacciones débiles, y se desnaturalizan. Existen tres tipos principales de detergentes, en función de su capacidad desnaturalizante y su carga. Los detergentes no iónicos, como el Tritón X-100 y el octilglucósido, y los detergentes anfóteros, como el CHAPS, son débilmente desnaturalizantes y no alteran la carga de las proteínas a las que se unen; se pueden utilizar en geles con urea y en algunos casos en el electroenfoque. Entre los detergentes iónicos, los catiónicos se usan para la separación de proteínas muy ácidas o muy básicas, y los aniónicos son de uso más generalizado y carácter fuertemente desnaturalizante. Entre ellos, el lauril sulfato sódico o SDS (sodium dodecyl sulfate) es el detergente de mayor uso, y la SDS-PAGE es el sistema de electroforesis más utilizado.

El SDS interacciona con la mayoría de las proteínas, formando complejos con características comunes. En [SDS] > 8 mM las proteínas unen una proporción fija de 1,4 g de SDS por g de proteína, lo que equivale a la unión de una molécula de SDS por cada dos residuos aminoacídicos. Como cada una proporciona una carga negativa (del grupo SO4

-), las cargas propias de las proteínas quedan enmascaradas o anuladas y los complejos proteína-SDS están cargados negativamente de forma uniforme. Así, estos complejos se comportan como polianiones que tienen la misma densidad de carga (carga/masa), que además tiene un valor muy alto. Las proteínas pierden su estructura tridimensional completamente, adoptando una forma desenrollada de varilla (o salchicha) semirrígida: hidrodinámicamente todos se comportan como elipsoides extendidos de unos 2 nm de grosor, y sólo difieren en su longitud, acorde con el tamaño de cada proteína. Debe tenerse en cuenta que este método de separación, al desnaturalizar las proteínas, hace que pierdan su actividad biológica. Existen algunas proteínas con estabilidad poco común que mantienen su actividad en presencia de SDS, y otras que pueden recuperarla al cambiar este detergente fuerte por otro más débil.

El SDS se une a lo largo de las cadenas polipeptídicas desenrolladas formando series de micelas esféricas de unos 6 nm. En esta estructura tipo collar de los complejos proteína-SDS el

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esqueleto y las cadenas polares del polipéptido interaccionan con los grupos sulfato de la superficie de la micela, mientras que la cadenas hidrocarbonadas del SDS y las cadenas hidrofóbicas del polipéptido están en el interior de la misma. Parece que los aminoácidos básicos juegan un papel fundamental en la unión del detergente.

Debido a que todos los complejos proteína-SDS tendrán la misma densidad de carga y forma similar, en una electroforesis en solución libre (sin la presencia de soporte poroso), migrarían con la misma velocidad y por lo tanto no se separarían. Cuando la electroforesis se realiza en geles de poliacrilamida con la porosidad adecuada para generar el efecto de tamiz molecular, la separación a través del gel ocurre exclusivamente en función del Pmol. Los complejos con mayor tamaño presentarán más resistencia a pasar por los poros del gel y migrarán más lentamente que los de menor tamaño. Cuanto menor sea la masa mayor será la distancia de migración en el gel, y viceversa: existe una relación inversa entre el log del Pmol y la Ur.

Si se representan los valores de log Pmol frente a Ur de un conjunto de proteínas, se obtiene una relación lineal. Puede utilizarse entonces un conjunto de proteínas de Pmol conocido y someterlo a SDS-PAGE en el mismo gel en el que se analicen las proteínas cuyo Pmol se desea conocer, de forma que se aseguren iguales condiciones para todas. Es importante señalar que la relación lineal entre log Pmol

y Ur se mantiene en un intervalo limitado de Pmol para cada concentración dada de acrilamida (%T). De forma estimativa, en geles del 15%, la relación vale para el intervalo entre 12 y 45 kDa, en geles del 10% entre 15 y 70 kDa, y en geles del 5% entre 25 y 200 kDa. El rango de tamaños de poro está entre 0,5-500 nm, dependiendo de la composición de la matriz.

Por otra parte, en algunas proteínas hay puentes disulfuro (diS), que son enlaces covalentes

formados por la oxidación de dos grupos –SH de cadenas laterales de Cys. Estos enlaces pueden establecerse entre residuos de la misma cadena polipeptídica (intracatenarios), o bien de distintas cadenas polipeptídicas (intercatenarios) en algunos casos de proteínas con estructura cuaternaria. Los enlaces diS se pueden romper mediante tratamiento con agentes reductores como el -mercaptoetanol ( -ME) o el ditiotreitol (DTT). Así, la SDS-PAGE puede realizarse en condiciones reductoras o no reductoras, dependiendo de si se tratan las muestras o no con -ME o DTT. La ausencia de reductores se traduce en que, si las proteínas poseen puentes diS intracatenarios, el SDS sólo producirá una desorganización parcial de la estructura, ya que no afecta a los enlaces covalentes. Si son dos o más cadenas unidas por puentes diS intercatenarios, en presencia de SDS pero sin tratamiento reductor quedarán más o menos desplegadas en función de la posición de los disulfuros, pero juntas. La combinación de agentes desnaturalizantes y reductores es la que se emplea para conseguir las condiciones de desnaturalización total a las que se refiere esta práctica.

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En resumen, 1) la gran mayoría de las proteínas es soluble en SDS; 2) si también se tratan con agentes reductores, sólo quedan cadenas polipeptídicas individuales totalmente desnaturalizadas; 3) todos los complejos proteína-SDS tienen carga negativa y migran en el mismo sentido; 4) además su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo es y las electroforesis son muy rápidas; 5) la separación depende de un único parámetro físico-químico como el Pmol, que se puede calcular; 6) los complejos proteína/SDS se tiñen fácilmente. Así, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas. Hay proteínas con un comportamiento anómalo en SDS-PAGE, como las glicoproteínas, las lipoproteínas y otras. La parte no proteica, que puede ser una porción importante de la masa total, no une SDS y puede además impedir su acceso al resto de la proteína. Eso hace que la relación carga/tamaño y la Ur de sus complejos sea menor, con lo que se comportan como si tuvieran un Pmol mayor, de forma que pueden ser sobrestimados hasta en un 30%. También se observa un comportamiento anormal en proteínas muy básicas o muy ácidas, cuya carga intrínseca no queda totalmente enmascarada por el SDS en el primer caso, o bien éste no se une en zonas de carga

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elevada en el segundo. Así, las proteínas muy ácidas (con alta carga negativa) como la pepsina, papaína y glucosa oxidasa unen cantidades mucho menores de SDS. En el caso de proteínas muy básicas (con carga positiva muy alta) como las histonas, una cantidad significativa de las cargas pertenecientes al SDS unido está balanceada por las cargas propias de la proteína, lo que hace difícil la estimación de su Pmol. El empleo de geles con gradientes lineales de poliacrilamida evita, en parte, esos inconvenientes, por razones no del todo explicadas.

Geles en gradiente. Además de esta aplicación, el uso de geles de poliacrilamida con un gradiente creciente de concentración, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño de poro, puede tener otras ventajas sobre el uso de geles de concentración uniforme. Generalmente los gradientes, lineales o cóncavos, se establecen en rangos ubicados entre los límites del 3 y el 30% de acrilamida, dependiendo el rango concreto a emplear del tamaño de las proteínas a separar. En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza una zona donde el tamaño de poro impide el avance; una vez se alcanza el límite de poro no se produce una migración apreciable, aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas, pues las concentra en regiones muy estrechas. Otra es que incrementa el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel, comparado con uno de concentración fija. En estos gradientes, la relación lineal se establece entre el log Pmol y el log %T. Los geles en gradiente se polimerizan a partir de un formador de gradientes; una de las precauciones que se suele adoptar es la inclusión de glicerol o sacarosa en la solución de polimerización para aumentar la densidad de las soluciones y evitar mezclas en el proceso de preparación.

Sistemas discontinuos. La PAGE se puede realizar empleando sistemas de uno o más tampones, hablándose de sistemas de tampón continuos o discontinuos. En los sistemas discontinuos (más empleados) la zona del primer tampón provoca la acumulación de todas las proteínas de la muestra cargada en el pocillo, y así se asegura su entrada simultánea con el frente electroforético a la zona del segundo tampón. Estos sistemas son especialmente adecuados para analizar muestras diluídas sin perder resolución, y se suelen usar habitualmente.

El primer gel es el de empaquetamiento o stacking, con mayor tamaño de poro (menor porcentaje de acrilamida) y pH más ácido que el segundo gel, que es el que realmente separa las proteínas, a partir del momento en el que el frente de migración alcanza el límite del segundo tampón. La concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el gel de empaquetamiento. El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en el hecho de que los iones glicinato, poco cargados negativamente por estar a pH 6,7 (en el depósito de tampón superior; ver figura adjunta) tienen una movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínas-SDS, que a su vez tienen menor movilidad que los iones Cl- del tampón de carga y del gel de stacking. Cuando se conecta la diferencia de potencial todas las especies han de migrar a la misma velocidad para mantener el circuito eléctrico.

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Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Cl- si hay una región de field strenght, que es inversamente proporcional a la conductividad, que es a su vez proporcional a la concentración. El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que [Cl-] > [proteína-SDS] > [glicinato]. Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS, las tres se concentran en una banda muy delgada entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato. Cuando el glicinato alcanza el borde del gel de separación adquiere una mayor carga en el nuevo medio, con un pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento la interfase entre el glicinato y el Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS, que se desplazarán a su propia velocidad. En la figura se muestran secuencialmente la situación (a) al principio de la electroforesis, (b) durante el proceso de empaquetamiento y (c) durante la separación en el gel resolutivo.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. En la práctica de hoy vamos a realizar varias SDS-PAGE en distintos % de acrilamida. Con

ellas observaremos cómo distintas concentraciones de acrilamida discriminan en distintos rangos de tamaño molecular, y calcularemos el Pmol aparente de las proteínas que ya analizamos mediante electroforesis nativa.

Las muestras deben contener una cantidad baja de sales (si es necesario hay que dializar, precipitar, etc.). Para preparar las muestras se mezclan tres volúmenes del problema con un volumen de tampón de la muestra. (ejemplo: 7,5 μl de muestra + 2,5 μl de tampón de muestra). La mezcla se incuba durante 3-5 min a 95°C. Para poder determinar los Pmol es necesario incluir en la electroforesis una muestra que contenga proteínas patrón con tamaños conocidos, de forma que se pueda dibujar una recta patrón que relacione tamaño con migración.

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Materiales y reactivos: - Aparatos de electroforesis vertical. - Agarosa al 1% fundida. - Acrilamida : N,N'-metilen bisacrilamida 30:0,8%. - Tampón Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 y tampón Tris-HCl 1,5 M pH 8,8. - SDS 10%. - Tampón de reservorios (10x): Tris 248 mM, glicina 1,92 M, SDS 1%. - Tampón de muestra (4x): Tris-HCl 0,25 M pH 6,8; SDS 8%; -mercaptoetanol 2,5%; glicerol 35%; azul de bromofenol 0,05%. - TEMED y persulfato amónico al 10%. - Solución de tinción y solución de destinción.

Preparación de los geles. Limpiar los cristales con alcohol utilizando un papel y ensamblarlos, utilizando los espaciadores de metacrilato. Sujetar el molde con las pinzas metálicas y sellar los bordes con agarosa fundida. Como vamos a preparar geles discontinuos, señalar con un rotulador el que va a ser el límite entre el gel analítico y el de empaquetamiento. Para ello se coloca el peine de las muestras y se pone una marca con rotulador a unos 0,5 cm de distancia del extremo inferior de los dientes.

Añadir en un tubo de ensayo (de 12 ml) los volúmenes de las soluciones que se indican:

Solución 5% 6% 8% 10% 12% 15% Empaq. Agua 5,63 ml 5,3 ml 4,63 ml 3,97 ml 3,3 ml 2,3 ml 3,0 ml Tamp. 8,8 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml ----- Tamp. 6,8 ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1,25 ml SDS 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,05 ml Acrilamida 1,67 ml 2,0 ml 2,67 ml 3,33 ml 4,0 ml 5,0 ml 0,6 ml TEMED 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,01 ml

Para iniciar la polimerización añadir 100 μl de PSA (50 μl para el gel de empaquetamiento), mezclar invirtiendo el tubo un par de veces y echar la mezcla inmediatamente en el molde del gel llegando hasta la altura de la marca hecha previamente para el gel de empaquetamiento. Después, añadir cuidadosamente (p.e. con una P200) a lo largo de la parte superior del gel una capa de aproximadamente 1-2 mm de agua para facilitar la polimerización en ausencia de oxígeno.

Mientras polimeriza, se va preparando la mezcla del gel de empaquetamiento, a excepción del TEMED y el PSA. Una vez polimerizado el gel analítico, se lava su superficie, se añade TEMED y PSA a la mezcla gel de empaquetamiento, se rellena con ésta el espacio libre del molde hasta el borde superior y se pone el peine con el que se crean los pocillos para las muestras.

Electroforesis. Quitar las pinzas del molde del gel, extraer el espaciador inferior y acoplar el molde con el

gel sobre el tanque de electroforesis, procurando que el vidrio con la muesca quede mirando hacia el reservorio superior. Sujetar el molde al tanque poniendo una pinza a cada lado en la parte superior a la altura del contacto de goma. Preparar 250 ml del tampón de los reservorios diluyendo la preparación concentrada 10 veces. Llenar el reservorio superior del tanque, hasta que el tampón entre en los pocillos de las muestras, y verificar que no hay pérdidas a través de la zona de contacto. Rellenar luego el reservorio inferior con tampón y eliminar la burbuja de aire que queda atrapada en la parte inferior del gel. Conectar los cables eléctricos entre el tanque de electroforesis y la fuente de alimentación.

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Cargar 10 μl de muestra por pocillo, no olvidando incluir la muestra patrón de Pmol. Aplicar la corriente eléctrica. Normalmente se utilizan 100 V/gel, hasta que el marcador de frente azul de bromofenol llegue al extremo inferior del gel.

Tinción. Finalizada la electroforesis, se quita el molde del tanque, y se separan los vidrios que contienen el gel. Se corta el gel de empaquetamiento y se deposita el gel analítico en la solución colorante durante 20 min. a 55°C. Después se devuelve el colorante a la botella, se lava rápidamente el gel con agua y se añade solución decolorante y trocitos de esponja. Para el desteñido, el gel se incuba a 55°C hasta que el fondo se aclare y permita ver las bandas de proteína. Si la solución decolorante se pone muy azul es necesario eliminarla y cambiarla por otra para acelerar el proceso.

Cálculo de tamaños y comparación de datos. Medir la migración a partir del comienzo del gel analítico para cada una de las bandas de la mezcla de marcadores y las proteínas analizadas.

Representar en una gráfica semilogarítmica el Pmol de los marcadores frente a su migración y establecer una recta patrón. Usando en cada caso la recta patrón con rango más adecuado a la movilidad de cada proteína, calcular el Pmol aproximado de las proteínas analizadas.

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Día 5. DETECCIÓN GENERAL DE PROTEÍNAS TRAS PAGE. TINCIONES CON COOMASSIE, PLATA Y FLUORESCENTES. Para conocer la composición proteica o determinar el grado de pureza de una proteína en una muestra, el abordaje más frecuente es separar ésta en un gel de SDS-PAGE y visualizarlo, para lo que se necesario elegir un sistema de tinción o detección. El perfil de proteína total se puede determinar con los métodos colorimétricos del Azul de Coomassie y la tinción de plata, y cada vez más con tinciones fluorescentes. Algunas de éstas permiten la detección de las proteínas modificadas postraduccionalmente por fosforilación o glicosilación, y suelen permitir la detección posterior con una tinción general. La elección del método y protocolo depende del rigor, rango y linearidad de detección que se desee, así como de los medios disponibles y los posibles procedimientos analíticos subsiguientes, como espectrometría de masas o secuenciación peptídica, que excluyen algunos métodos. Aunque la mayor parte de los métodos usados implica la fijación (y desnaturalización) de las proteínas, también hay métodos que no implican fijación y que permiten desarrollar análisis Western tras la tinción. Con carácter general, los sistemas de detección deben estar basados en la buena práctica de laboratorio: limpieza, manipulaciones cuidadosas y atención al detalle. En general, los protocolos estándar de tinción requieren varios procesos secuenciales, algunos con más de un paso y algunos con lavados intermedios con agua o tampón. Son pasos comunes: 1. El gel se fija con alcohol y ácido para precipitar e inmovilizar las proteínas en la posición en la que se encuentren en el gel, y para eliminar SDS, tampones u otros compuestos que pueden interferir. Para ello se utilizan ácidos (p.e. tricloroacético, sulfosalicílico o acético) en los que las proteínas son insolubles. 2. El gel se tiñe sumergiéndolo en una solución de colorante o con reactivos de deposición de plata. El proceso de tinción suele hacerse en agitación y es de duración variable (desde media a varias horas) en función de la naturaleza y el espesor del soporte. En el caso de la poliacrilamida se puede aplicar calor y poner una fuerte agitación, lo que reduce notablemente el tiempo de tinción. 3. Se reduce el background mediante algún sistema para desteñir o eliminar el exceso de colorante el gel o parar la reacción de desarrollo de color. En el primer caso se decanta la solución de teñido y se sumerge el soporte en una de desteñido, habitualmente la misma pero sin el colorante. Así, el colorante que no se ha unido a las moléculas de la muestra difunde libremente desde el soporte (incluyéndose a menudo en la mezcla de destinción materiales que lo secuestran), de forma que sólo quedan coloreados los complejos de las proteínas unidas al colorante.

Cada molécula cargada de la mezcla se habrá desplazado una distancia determinada hacia el ánodo o hacia el cátodo, dependiendo de su carga y dimensiones, y aparecerá como una mancha coloreada en el soporte en la nueva posición. Normalmente las manchas suelen identificarse comparándolas con una mezcla de patrones conocidos que han corrido en el mismo soporte. Los protocolos de tinción de geles pueden variar incluso dentro de la misma formulación, dependiendo de las consideraciones temporales y rigor de detección que se desee. En general se desea rapidez con resultados razonables, y protocolos de tinción que eviten al máximo ácidos fuertes, solventes orgánicos y metales pesados, debido a los problemas asociados a su uso y eliminación. A menudo existen versiones rápidas de los protocolos, en general basados en acortamiento de los tiempos de fijación, tinción y destinción, y/o aceleración por calentamiento en un baño de agua o un microondas. En general, el sistema de tinción con Coomassie es el más usado para deteccción general de proteínas debido a la posibilidad de inspección visual, facilidad de uso y familiaridad entre los usuarios. La tinción con plata es el método colorimétrico alternativo para una mayor sensibilidad de detección, aunque es más complicado y largo, y no es compatible con el uso posterior de las bandas de proteína recortadas del gel para espectrometría de masas, que es el grupo de técnicas más usadas en Proteómica. Los colorantes fluorescentes son rápidos y compatibles, pero son más caros y requieren el uso de equipamiento especial.

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Tinción con Azul de Coomassie. El colorante más utilizado para proteínas en PAGE, es el Azul de Coomassie, Coomassie

Brilliant Blue o CBB. El CBB R-250 (usado habitualmente) y su derivado dimetilado CBB G-250 (usado en la variante coloidal) son colorantes trifenilmetano disulfonados que tiñen las bandas de proteínas de color azul brillante. En medio ácido se unen a ellas mediante interacciones electrostáticas con aminoácidos protonados (Lys, Arg e His) y por asociaciones hidrofóbicas con los residuos aromáticos. La tinción con CBB es simple

pero presenta baja sensibilidad, pudiéndose detectar hasta 0,3-1 μg de proteína por banda, y es cuantitativa (presenta respuesta lineal) hasta 15-20 μg. El colorante no se une a la poliacrilamida con alta afinidad, pero penetra en la matriz del gel y se une con baja afinidad, por lo que se necesita un paso de distinción, a no ser que sea una formulación coloidal. Las tinciones con CBB permiten bastante flexibilidad en los pasos de fijación, tinción y destinción. Se emplean habitualmente en soluciones de metanol o isopropanol con acético, dando como resultado bandas azules de proteína precipitada sobre un fondo transparente tras teñir y desteñir el gel. Como la solución colorante lleva ácido y alcohol que precipitan y fijan las proteínas, a menudo se omite el paso específico de fijación. Al no unirse covalentemente, la tinción es reversible y los colorantes no interfieren con los procesos subsiguientes de espectrometría de masas con bandas de proteína recortadas de los geles. Para teñir geles de isoelectroenfoque y electroforesis bidimensional se recomienda eliminar previamente los anfolitos mediante inclusión de ácido tricloroacético en el colorante y la destinción en ácido acético. Una variante más sensible de esta tinción es la denominada tinción de Coomassie coloidal, que utiliza CBB G-250 diluído en una solución coloidal. El colorante no entra a la matriz del gel, mientras que se une específicamente a las bandas de proteína, proporcionando una tinción de bajo background con cuantificación fiable y una sensibilidad de detección proteica de hasta 10-20 ng, superior al sistema estándar de CBB R-250. Al no producir un fondo demasiado intenso, el gel se puede desteñir fácilmente utilizando agua destilada a 45-55oC. Aunque es más larga que la estándar,

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esta tinción es muy interesante porque tiene alta sensibilidad, y sigue siendo compatible con el análisis proteómico posterior. El Amido Black es un colorante orgánico menos usado que permite teñir proteínas con una sensibilidad tres veces menor que la tinción con CBB. Es apropiado para teñir proteínas electrotransferidas a membranas de PVDF o nitrocelulosa. Tinción con sales de plata. La tinción con plata, considerado como el estándar por el que se miden otros métodos de tinción ultrasensibles, es la metodología más compleja y variable de tinción de proteínas. La base de la detección es la reducción por formaldehído de iones plata Ag+ (invisibles) unidos a la proteína a plata metálica Ag0 (visible) y, en menor medida y en algunos protocolos, deposición de sulfuro de plata. El mecanismo de la reducción no ha sido dilucidado, aunque es conocido que participan las cadenas laterales de aminoácidos como Cys, Lys o Met, y que hay una diferencia en el potencial redox entre las regiones ocupadas por las proteínas y el resto del gel, lo que induce la reducción de Ag+, dando una imagen en positivo. Los pasos generales de los procesos de tinción con plata son: 1. fijación con ácido y alcohol, 2. sensibilización con agentes que aumentan la unión de plata o reducen el background (como sulfonatos aromáticos, glutaraldehído o agentes sulfurantes), 3. impregnación con iones plata invisibles, 4. revelado por reducción de los iones a plata metálica visible, y 5. parada del revelado para detener el desarrollo del background. Los protocolos se distinguen en base a los agentes suministradores de plata y las condiciones de revelado correspondientes. Los métodos alcalinos usan complejos diamínicos de plata (formados con (NH)4OH) como agente suministrador de plata en un ambiente básico, con revelado en una solución ácida de formaldehído; los métodos ácidos usan como suministrador nitrato de plata levemente ácido con revelado en una solución básica de formaldehído. Los métodos ácidos son más usados debido a su menor coste y su mejor control del desarrollo del background. Un método alternativo más breve (30 min) utiliza una sola disolución ácida y la energía de la luz para producir la reducción, pero tiene menor sensibilidad. Cuando se efectúa una tinción de plata conviene realizar una precipitación previa de las proteínas, lo que permite eliminar otros compuestos (Gly, detergentes) que pueden unirse a los iones Ag+ dando un fondo coloreado inespecífico.

La principal ventaja de la tinción con plata es que permite detectar hasta 2-5 ng de proteína por banda, lo que supone una sensibilidad unas 100 veces superior a la del CBB. Entre las desventajas se encuentran que es un método laborioso, lento y costoso, que la respuesta es poco reproducible, que el rango linear de medida de estos sistemas es pobre, que el gel difícilmente queda con un fondo incoloro, y que no todas las proteínas se tiñen, mientras que tiñe lipo y polisacáridos y ácidos nucleicos. Los problemas de cuantificación se deben a la compleja naturaleza del paso de desarrollo de color y a diferencias entre proteínas en cuanto a sensibilidad a la señal de plata. Así, las intensidades de marcaje de una banda o spot pueden variar hasta un 20% entre dos corridos diferentes de la misma muestra, mientras que cantidades iguales de proteínas diferentes pueden no teñirse con igual intensidad. Algunas proteínas, especialmente las que poseen pocas Cys, se tiñen muy débilmente o nada. Esta variabilidad se da en menor medida cuando la PAGE se realiza en condiciones desnaturalizantes.

Aunque la tinción es perfectamente utilizable para el sistema de SDS-PAGE de una dimensión para la detección de bandas con poca proteína, es más frecuente usarla con sistemas de 2D-PAGE, en los que las cantidades de proteína de los spots suelen ser bastante menores. La espectrometría de masas tras la tinción de plata es problemática debido a la modificación de las proteínas por el glutaraldehído de los pasos de fijación y sensibilización. Hay protocolos compatibles que omiten el glutaraldehído, lo que reduce la sensibilidad.

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La tinción con plata produce bandas de color marrón grisáceo oscuro con la mayoría de las proteínas. Variando ligeramente las condiciones de tinción pueden generarse colores particulares: azul para las lipoproteínas, amarillo para algunas glicoproteínas, etc. Esto proporciona una información adicional, pero no son métodos generales ni estrictamente reproducibles. Una ventaja notable es que puede hacerse sobre geles previamente teñidos con Coomassie, y la doble tinción es aún más sensible.

Tinciones reversas. Hay métodos de tinción que usan cationes metálicos para visualizar rápidamente las proteínas tras SDS-PAGE sin usar agentes fijadores ni colorantes. Las tinciones reversas producen un background semiopaco en la superficie del gel, mientras que las proteínas se detectan como zonas transparentes al ver los geles sobre fondo negro o con transiluminación. La tinción es muy rápida (5-15 min), y se suele preservar la actividad biológica de las proteínas. Los más usados son el KCl, CuCl y ZnCl2. La tinción reversa con Zn2+ usa la capacidad de las proteínas y complejos proteína-SDS para unir y secuestrar Zn2+ en un medio en el que la reacción de precipitación entre el imidazol y el ión produce ZnIm2, que crea un background opaco que contrasta con las zonas transparentes que tienen proteína-SDS-Zn2+. Al no usar fijación, la técnica permite análisis subsiguientes como ensayos biológicos o enzimáticos de las bandas, y es compatible con los métodos de microsecuenciación y espectrometría de masas.

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Marcado con moléculas fluorescentes. Se han desarrollado métodos, de sensibilidad comparable a la tinción con plata, en los que las proteínas son marcadas con compuestos fluorescentes o fluoróforos que se unen específicamente a ellas, y las bandas proteicas son detectadas mediante escaneo de los geles expuestos a radiación UV o de una longitud de onda capaz de excitar los fluoróforos. Las medidas de emisión de luz son intrínsecamente más sensibles que las de absorbancia de luz, ya que la absorción está limitada por el coeficiente de extinción molar del complejo coloreado. Así, los métodos de tinción fluorescentes pueden combinar sensibilidades de detección que rivalizan con la tinción de plata con protocolos sencillos similares a los del CBB o el Zn2+, y ofrecen linearidad de cuantificación en rangos 10-100 veces superiores a los de los métodos colorimétricos. Sin embargo, este tipo de tinción se utiliza mucho menos que las previamente descritas, quizás por su precio y porque su uso requiere disponer de sistemas especiales de iluminación y adquisición de datos: una fuente de luz de excitación monocromática, filtración óptica selectiva para separar la luz de emisión de la de excitación, y un sistema de detección. Muchos fluoróforos permiten también la inspección visual, aunque con menor sensibilidad. Cualquier compuesto fluorescente sufre algún grado de fotodestrucción como consecuencia de su exposición a la luz. Por ello, aunque la mayoría de los desarrollados comercialmente para detección son relativamente fotoestables, es conveniente proteger los geles de la luz ambiental antes de obtener sus imágenes. Para la detección de proteínas en SDS-PAGE o 2D-PAGE la unión de los fluoróforos puede ser antes de la electroforesis, por modificación covalente previa de las proteínas con ellos (como en la técnica DIGE 2D), o bien después, por interacción electrostática directa de los fluoróforos con las proteínas (de forma similar al CBB), o por intercalación de los fluoróforos en las micelas de SDS unidas a las proteínas. Los colorantes fluorescentes que no implican marcaje covalente de las muestras pueden mostrar un aumento significativo en fluorescencia cuando se unen a las bandas de proteína, o bien ser intrínsecamente fluorescentes y unirse selectivamente a las bandas de proteínas y no a la matriz del gel, aunque hay casos en que se dan ambas características. En estos casos el proceso suele ser simple, implicando un único paso de tinción y a menudo sin destinción, por lo que se suele completar en 30-60 min. Al no ser covalentes, estas tinciones son compatibles con posibles procesos posteriores de espectrometría de masas. En las últimas décadas se han desarrollado numerosos procedimientos para el marcaje fluorescente de proteínas en geles o membranas mediante interacción no covalente, usando fluoróforos como fluorescamina, isotiocianato de fluoresceína, monobromobimano, MDPF, cloruro de dansilo y otros. Algunos fluoróforos como ANS, bis-ANS, Red Nile o los SYPRO Orange, Red y Tangerine son virtualmente no fluorescentes en solución acuosa, pero se hacen fluorescentes en solventes no polares o tras su asociación con complejos SDS-proteína. El SDS se une a las proteínas con una estequiometría casi constante, lo que sugiere que una cuantificación proteica basada en una interacción con el detergente debería ser más fiable que una basada solamente en interacciones con grupos específicos, como las aminas primarias. De este grupo actualmente se usan colorantes tipo SYPRO, excepcionales porque producen sensibilidades de detección comparables a las del CBB coloidal o la tinción rápida de plata. SYPRO es un nombre comercial que incluye varios productos de tinción de proteína total con distintas naturalezas químicas y distintos límites de detección y rangos lineares de cuantificación. Los colorantes SYPRO Orange, Red y Tangerine tienen una sensibilidad en torno a 4-10 ng/banda. Los colorantes SYPRO Ruby y Rose pertenecen a una nueva familia de complejos luminiscentes de

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metales de transición y permiten detección fluorescente de proteínas tras SDS-PAGE, 2D-PAGE, IEF y electrotransferencia. Los fluoróforos se unen a las proteínas por un mecanismo similar al del CBB y son tan sensibles como las mejores tinciones de plata, superando a éstas en términos de linearidad de respuesta y de compatibilidad con procesos de Proteómica. El SYPRO Ruby es un colorante que contiene rutenio, cuyo límite de detección está en torno a 1 ng/mm2, con unos tres órdenes de magnitud de respuesta lineal, y cuya fluorescencia se mantiene (en oscuridad) durante algunas semanas. El colorante Deep Purple es de naturaleza distinta (está basado en la molécula natural Epiconnone) y proporciona una sensibilidad similar o algo mejor que la del SYPRO Ruby, pero su fotoestabilidad es unas tres veces menor. Los agentes más usados en tinción fluorescente son:

Rangos: Ultravioleta 250-400 nm Azul 400-500 nm Amarillo/naranja 550-580 nm Rojo 580-650 nm Infrarrojo cercano 650-850 nm

Sin embargo, sólo unos pocos procedimientos para marcar proteínas con fluoróforos se han aplicado con éxito a muestras de proteínas previamente a su separación por 2D-PAGE. El desarrollo de colorantes fluorescentes como el propil Cy3 y el metil Cy5 basados en succinimidil esters de cianina para el marcaje covalente de las aminas primarias de las proteínas previamente a la electroforesis ha sido la base la electroforesis bidimensional diferencial fluorescente o DIGE 2D, una tecnología proteómica muy importante que veremos con la electroforesis bidimensional. El sistema DIGE permite comparar varias muestras mediante marcaje de cada una con distintos fluoróforos tipo cianina que se unen covalentemente a las Lys. Tras los marcajes, las muestras se mezclan y analizan en un único gel bidimensional, obteniendo las imágenes fluorescentes a las diferentes longitudes de onda características de los fluoróforos. También existen tinciones fluorescentes para proteínas con modificaciones covalentes postraduccionales, como la línea ProQ, cuyos colorantes se han diseñado para teñir a fosfoproteínas o a glicoproteínas. La fosforilación reversible de proteínas en residuos aminoacídicos específicos es un sistema fundamental de señalización celular. Los sistemas de tinción de fosfoproteínas consisten en moléculas formadas por grupos que unen fosfato unidos covalentemente a fluoróforos, y el sistema de detección se basa en la unión selectiva y no covalente a los residuos fosforilados, sin aumento de la fluorescencia con la asociación. Al haber pocos fosfatos por polipéptido la sensibilidad de la detección de proteínas es alta, pero no tanto como la de los mejores sistemas de tinción fluorescente de proteína general. Tras la tinción de fosfoproteínas el gel debe teñirse con un sistema de detección de proteína total.

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Por otra parte, la glicosilación es la modificación postraduccional más frecuente de las proteínas eucariotas. Los oligosacáridos están unidos a cadenas laterales de Asn (N-glicosilación) o a residuos hidroxili de Ser o Thr (O-glicosilación). Las tinciones usan sistemas basados en la oxidación por periodato de grupos glicol adyacentes, seguida porconjugación mediante un mecanismo de base de Schiff a una hidrazida fluorescente. Revelado específico de enzimas. Esta técnica no corresponde a la detección general de proteínas, pero se incluye aquí por su semejanza metodológica. La técnica de zimografía o análisis enzimático en gel consiste en ensayar la actividad enzimática directamente en el gel, o bien recortar y eluir las bandas proteicas ya separadas y entonces ensayar la actividad enzimática en solución. En el primer caso, tras la separación electroforética el gel se pone en contacto con una solución apropiada del sustrato o un soporte impregnado con el mismo. La acción enzimática sobre un sustrato adecuado genera un producto con color, luminiscencia o fluorescencia. Transcurrido el tiempo de reacción adecuado se detecta el producto de la reacción enzimática en el propio gel o en el soporte impregnado. Mediante este tipo de revelado es posible identificar las bandas que presentan actividad enzimática del total de bandas proteicas obtenidas en una separación.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. En esta práctica vamos a comparar la capacidad de detección y la linearidad de la respuesta

de las tinciones con azul de Coomassie y sales de plata, y del ensayo Western. Para ello haremos geles por triplicado, y en cada uno de ellos cargaremos y someteremos a SDS-PAGE distintas cantidades de una preparación purificada de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o de extractos de células que la expresen. De los geles duplicados, uno será teñido con Coomassie, el otro con plata, y el tercero será electrotransferido a una membrana Hybond C y procesado para ensayo Western con anticuerpos anti-GAPDH. Finalmente compararemos los resultados obtenidos con los tres métodos.

Ensayo Western. Materiales y reactivos.

- Materiales habituales para SDS-PAGE. Papel Whatman 3MM. - GAPDH purificada, y extracto de células que expresen GAPDH. - Membrana de nitrocelulosa reforzada Hybond C (0,45 μm tamaño de poro). - Tanque de transferencia. - Tampón de transferencia (10x): glicina 1,92 M, Tris 0,248 M pH 8,8. Preparar 800 ml del TAMPON DILUÍDO: 80ml de tampón (10x), 160 ml de metanol y 560 ml de agua. - Teñido reversible: rojo Ponceau S 0,01% en ácido acético 0,1%. - Tampón PBS pH 7,5: KH2PO4 1,5 mM; Na2HPO4 8,1 mM; NaCl 0,14 M; KCl 2,7 mM. - Solución de lavado (PT): Tween 20 0,1% en PBS (1 litro). - Solución de bloqueo: leche desnatada en polvo 5% en PT (50 ml). - Anticuerpo anti-GAPDH. - Anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón o conejo) con actividad peroxidasa. - Sistema de revelado por quimioluminiscencia (Pierce).

Procedimiento: 1. Preparar seis geles de SDS-PAGE al 10%. Cargar las cantidades adecuadas de GAPDH y extracto celular, y correr la electroforesis. Aproximadamente, para los geles de Coomassie queremos de 0,1 a 20 μg y para los de tinción de plata y western de 0,05 ng a 5 μg de GAPDH. 2. Cuando se haya completado la electroforesis en SDS-PAGE, separar las placas de vidrio y eliminar el gel de empaquetamiento. Equilibrar el gel con tampón de transferencia a temperatura ambiente durante 30 min.

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3. Ensamblar el sandwich de transferencia sobre una bandeja utilizando un casette de plástico del equipo de transferencia disponiendo los distintos elementos del sandwich sobre la cara negra del casette como sigue:

- un estropajo impregnado de tampón de transferencia. - un filtro 3MM del mismo tamaño que el gel remojado en tampón. - el gel de electroforesis. - una membrana de nitrocelulosa Hybond C del mismo tamaño que el gel, remojada en tampón. Eliminar las posibles burbujas de aire atrapadas entre el gel y la nitrocelulosa rodando un tubo de ensayo o una pipeta encima de la membrana. - un filtro 3MM del mismo tamaño que el gel remojado en tampón. - un estropajo impregnado de tampón de transferencia.

4. Finalizado este proceso, se cierra el casete y se dispone en el equipo de transferencia teniendo cuidado de que los colores blanco y negro de los distintos elementos coincidan (la parte blanca ha de quedar cerca del polo positivo). 5. Llenar el tanque de transferencia conteniendo los casetes de los geles y el sistema de refrigeración (un recipiente con hielo) con el tampón de transferencia y añadir una barra agitadora pequeña en el interior. Colocar todo el sistema sobre un agitador magnético y conectar a la fuente de alimentación. Realizar la transferencia aplicando una diferencia de potencial de 100V durante 1h. 6. Finalizada la transferencia, abrir el casete de transferencia, sacar el filtro de nitrocelulosa e incubarlo durante 5 min en la solución colorante conteniendo rojo Ponceau. Una vez teñidas las proteínas, marcar con un lápiz la posición de los marcadores de peso molecular. También se puede fotografiar o fotocopiar la membrana teñida. Colocar la membrana en la cubeta y lavarla con agua destilada. 7. Incubar en solución de bloqueo durante 1 hora a temp. ambiente en agitación. 8. Incubar con anticuerpo anti-GAPDH diluído 1:500 a 1:1000 en solución de bloqueo, durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Para asegurar la unión del Ac, es conveniente dejar incubando toda la noche a 4°C en agitación. 9. Lavar breve y repetidamente (4-5 cambios) con la solución PT. 10. Incubar con el anticuerpo secundario 1:5000 en sol. de bloqueo durante 1 hora a temp. ambiente. 11. Lavar repetidamente (4-5 cambios) con la sol. PT. 12. Incubar con la mezcla quimioluminiscente de revelado (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 13. Exponer una placa de autorradiografia (en un casete) a la membrana durante 1-5 min. Revelar y hacer una segunda exposición de más o menos tiempo en función del resultado.

Tinciones con azul de Coomassie y sales de plata. La tinción con azul de Coomassie se hace como en las prácticas 3 y 4. Para la tinción con

sales de plata se sigue el protocolo de PageSilver de la casa Fermentas que se adjunta.

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Dia 6. SISTEMAS DE INMUNODETECCION: WESTERN, RIA Y ELISA. Inmunodetección, ensayo Western o Western blotting.

En 1975, Edwin Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar DNAs separados previamente por electroforesis; se desarrolló así el Southern blot, usando el nombre del descubridor como epónimo (por ello esta técnica y sus derivadas se escriben con mayúscula). Así, el término Western blot se usa por analogía a los sistemas de transferencia y detección de DNA (Southern blot) y RNA (Northern blot). El término blotting hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección para su análisis. Este proceso es necesario ya que es imposible realizar la detección de las macromoléculas dentro de la matriz del gel, mientras que en la membrana se encuentran accesibles al estar adheridas a su superficie.

El Western blot es una técnica analítica desarrollada en el laboratorio de George Stark en la Universidad de Stanford, usada para detectar una o más proteínas específicas en una muestra determinada (habitualmente una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular) gracias a sus determinantes antigénicos, mediante el uso de anticuerpos poli o monoclonales, por lo que también es conocida por el término de immunoblot, o bien por el español de inmunodetección. Esta técnica es hoy en día imprescindible en Biología Molecular, Bioquímica, Biotecnología o Inmunología. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra miles de proteínas diferentes.

En primer lugar las muestras a analizar se someten a una electroforesis en gel para separar las proteínas atendiendo al criterio que se desee: Pmol, pI, carga/masa..., aunque habitualmente es por su Pmol mediante SDS-PAGE. Luego son transferidas desde el gel a una membrana adsorbente: el resultado es una copia en la membrana de la distribución de las bandas proteicas tras el desarrollo electroforético. Finalmente, se busca la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella, detectando la unión Ag-Ac por actividad enzimática, fluorescencia... De esta forma se puede estudiar la presencia de una proteína dada en una o varias muestras complejas, y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.

Las membranas son más manejables y flexibles que el gel original donde se separan las proteínas, y se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica, es decir, unen todas las proteínas con idéntica afinidad. Además de permitir la detección por anticuerpos, todas ellas permiten la tinción mediante cualquier método general para proteínas. Generalmente se usa una membrana de nitrocelulosa, difluoruro de polivinilideno (PVDF) o nylon. Se cree que las proteínas se unen a las membranas de nitrocelulosa mediante interacciones hidrofóbicas, y a las de PVDF mediante interacciones hidrofóbicas y de dipolos. Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF y dan menos problemas de unión inespecífica, pero tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y son poco reutilizables. Las membranas de PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes a los daños durante su uso y son muy reutilizables: se pueden quitar los anticuerpos (stripping) y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos antes de que el ruido de fondo sea tan grande que impida continuar con los experimentos. En nuestro caso usaremos la marca comercial Hybond-C extra, que es nitrocelulosa con un soporte inerte que le da consistencia.

Transferencia. La transferencia de las proteínas a la membrana puede realizarse por difusión, por vacío o

por electrotransferencia. - Difusión simple. Se ponen en contacto las superficies del gel y la membrana y, sobre ésta,

se dispone un taco de papeles de filtro. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las proteínas desde el gel a la membrana, donde quedarán retenidas. Este protocolo no es muy eficiente, porque la cantidad de proteína transferida a la membrana es muy baja.

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- Transferencia al vacío. En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de secado de geles, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa.

- Electrotransferencia. Este método se basa en el uso de una corriente eléctrica establecida en un tanque de transferencia lleno de tampón, para llevar las proteínas desde el gel a la membrana. En el tanque se dispone un sandwich con capas de papel de filtro y en su interior el gel del lado del cátodo y la membrana del lado del ánodo, y se aplica la corriente eléctrica. Las proteínas del gel están cargadas negativamente y se desplazan hacia el polo positivo, quedando atrapadas por la membrana. Esta es la técnica más usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere.

La eficiencia de los procesos de transferencia puede evaluarse mediante un sistema de tinción reversible de proteínas (tinción de Ponceau).

Bloqueo. Puesto que las membranas unen proteínas, es preciso bloquear los lugares de unión que han

quedado libres tras la transferencia para impedir que los anticuerpos que se vayan a usar par la detección se adhieran a ellos de manera inespecífica. Con este propósito se incuba extensivamente la membrana con una solución que contenga agentes bloqueantes, normalmente proteínas (BSA, caseína, gelatina, leche en polvo etc.) y/o un detergente no iónico (Tween 20 o Triton X-100), que se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las proteínas transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos. Tras el bloqueo se incuba la membrana con una disolución de anticuerpo primario, en presencia de agentes bloqueantes, habitualmente durante una noche entera. Se suele incubar a 4oC o temperatura ambiente; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones más específicas.

Detección. En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína,

habitualmente gracias a un segundo anticuerpo que reconoce los anticuerpos específicos contra ella, y que está acoplado a sistemas de color, bioluminiscencia, fluorescencia u otros métodos.

Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario suele ser una preparación de Ig de un animal diferente, dirigidas contra la fracción Fc de las Ig de la especie del anticuerpo primario y, por tanto, será el mismo en todos los ensayos de este tipo. Varios de estos anticuerpos se unirán a esa región concreta de cada Ig primaria, amplificando la señal. Los anticuerpos secundarios anti-ratón, anti-

cabra, anti-conejo…, son aquéllos capaces de reconocer los anticuerpos primarios desarrollados en esas especies. Es el anticuerpo secundario el que lleva unido el sistema de detección, y el producto conjugado está comercializado; es decir, no es necesaria una conjugación particular para cada ensayo en concreto. Para la detección suelen estar unidos a marcadores fluorescentes o radiactivos,

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a enzimas reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, o bien a moléculas como la biotina a las que se unen proteínas como la avidina o la estreptavidina, que a su vez llevan unida una enzima reporter.

En lugar de anticuerpo secundario también pueden emplearse proteínas que se unen directa y específicamente a los anticuerpos primarios, como las proteínas bacterianas A y G que reconocen los fragmentos Fc comunes de las IgG de gran número de especies animales. A su vez, estas proteínas pueden marcarse con enzimas o con moléculas detectables. Aunque el sistema general de detección en dos pasos está más extendido por su versatilidad, en ocasiones el sistema de detección va acoplado directamente al anticuerpo primario.

Tras el lavado de los anticuerpos no unidos, se procede a la detección de aquéllos que sí se han unido al anticuerpo primario unido a su vez a la proteína de interés.

- La detección colorimétrica consiste en la incubación del Western blot con un sustrato soluble que es transformado en un producto insoluble por la enzima reporter unida al anticuerpo secundario, quedando una mancha allí donde esté la proteína de interés. Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidación del 4-cloronaftol en presencia de peróxido de hidrógeno.

- La detección quimioluminiscente requiere la incubación de la membrana con un sustrato, que emitirá luminiscencia al ser expuesto al enzima reporter que trae unido el anticuerpo secundario. Así la peroxidasa cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno, y la fosfatasa alcalina cataliza la defosforilación del adamantil-1-2-dioxetano fosfato. La luz emitida es captada por una película fotográfica dispuesta sobre la membrana o bien por una cámara CCD, que toma una imagen digital del Western blot.

- En la detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación de éstos con radiación de la longitud de onda adecuada, lo que les provoca la emisión de fluorescencia que es detectada por un fotosensor, como una cámara CCD equipada con los filtros de emisión apropiados. La fluorescencia es considerada uno de los métodos de análisis más sensibles.

- Alternativamente se puede marcar radiactivamente el anticuerpo primario o secundario. Se realiza una autorradiografía colocando una película fotográfica contra el Western blot, de forma que aparecen en ella regiones oscuras que corresponden a las bandas de la proteína de interés. El alto precio y los riesgos de este sistema han provocado su desuso en los últimos tiempos. - Otra técnica, conocida como Golden blot, consiste en la detección de los anticuerpos primarios con proteína A unida a partículas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, allí donde está la proteína. La sensibilidad del método puede incrementarse con una tinción fotoquímica de plata. Se consigue así una sensibilidad comparable a la de las técnicas radiactivas. Para determinados procesos experimentales o diagnósticos se precisa la detección o la cuantificación de una molécula en muestras biológicas en solución. Dado que muchas moléculas de interés biológico se encuentran en concentraciones fisiológicas muy bajas (hasta 10-10 M), no pueden cuantificarse mediante métodos estándar. Además, suelen estar rodeadas de cantidades excesivas de sustancias químicamente relacionadas, que pueden interferir con las técnicas analíticas. Sin embargo, para medirlas se pueden usar anticuerpos como reactivos analíticos altamente específicos en procedimientos inmunoquímicos, que son técnicas de detección de alta sensibilidad y capacidad de discriminación, tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas. Estos procesos de inmunodetección son el RIA y el ELISA y, a diferencia del Western, no precisan de una separación electroforética previa de la muestra. Así se pueden detectar hasta picogramos de

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antígeno incluso en presencia de una gran cantidad de sustancias químicamente semejantes, siempre que no interfieran con la reacción antígeno-anticuerpo.

Los antígenos de estos ensayos pueden ser proteínas generales o bien sustancias biológicas como hormonas peptídicas, prostaglandinas, esteroides, nucleótidos cíclicos o fármacos, siempre y cuando puedan prepararse anticuerpos contra ellos. Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas, bien directamente o conjugadas a otra, ya que un hapteno (molécula pequeña que no dispara respuesta inmune por sí sola) combinado con un coadyuvante como el BSA da respuesta inmune al ser introducido en otra especie, apareciendo anticuerpos contra él.

Radioinmunoensayo, Radioimmunoanálisis o RIA. El RIA (Radioimmunoassay) es una técnica desarrollada en los años 1960 por Berson y

Yalow, que combina la especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) con la sensibilidad de la detección radioisotópica. Se basa en la formación específica de complejos Ag-Ac, en los cuales uno de los reactivos, marcado radiactivamente, se utiliza directa o indirectamente para la medición cuantitativa del reactivo no marcado. Para el marcaje se han utilizado varios isótopos productores de radiaciones y , aunque el más utilizado es I125.

La base del RIA consiste en la inhibición competitiva de la unión de un Ag* marcado radioactivamente a su Ac específico por parte del Ag no marcado, formándose los complejos Ag*Ac o AgAc.

Ac + Ag* + Ag Ag*-Ac + Ag-Ac El proceso obedece a la ley de acción de masas y

además la distribución del Ag* dentro del Ag total es indiscriminable por medio del Ac. Así, manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac, al aumentar el Ag aumentan los niveles de Ag-Ac y disminuyen los de Ag*-Ac, y por tanto menos radiactividad queda unida a la cantidad fija de Ac. Esto permite relacionar la radiactividad unida con la cantidad de Ag presente. Para generar una curva estándar o patrón, que relacione la reducción de la radiactividad unida con la cantidad de Ag presente en una muestra problema, se hace una competición incubando las mismas cantidades del Ac y el Ag* con cantidades crecientes conocidas del Ag.

Para medir la radiactividad de los complejos Ag*-Ac es necesario separar el Ag* unido del no unido, con objeto de que la radiactividad contada proceda tan sólo del Ag* unido. Esta separación puede hacerse precipitando los complejos Ag-Ac, ya sea con un antisuero generado contra el Ac utilizado, o con Proteína A o Proteína G. En otros casos se fija el Ag o el Ac a una fase sólida y los complejos quedan retenidos en ella.

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El sistema explicado corresponde al llamado RIA directo, aunque hay otras variantes: - RIA directo. Se obtienen Ac específicos contra la molécula/Ag a medir. Se marca el Ag

radiactivamente. Se añaden Ac y Ag* en cantidades fijas y conocidas y la muestra problema con el Ag a medir. Se precipitan los complejos formados y se elimina el Ag* no unido. Se mide la radiactividad en la muestra problema y se interpola el valor obtenido en la curva patrón.

- RIA de inhibición. Se usa cuando no se puede marcar el Ag y se usan Ac* marcados. Se inmoviliza una cantidad constante de Ag en un soporte sólido. Se añade una cantidad constante de Ac* marcado y el Ag a medir. En este paso se establece una competencia por la unión del Ac* al Ag fijo al soporte o al Ag de la muestra problema. Se eliminan el Ac* no inmovilizado y el Ag soluble. Se determina la cantidad de Ac* que se ha inmovilizado mediante una curva patrón.

- RIA de sandwich. Se necesitan dos Ac distintos capaces de unirse a la vez al Ag. Se inmoviliza una cantidad fija y abundante del Ac1 (no marcado) en un soporte sólido. Se añade la muestra problema de Ag, que queda inmovilizado sobre el Ac1. Se añade Ac2* (marcado), que se une a otro epítopo del Ag. Se elimina el Ac2* no unido. Se determina la cantidad de Ac2* unido a partir de una curva patrón.

Enzimoinmunoensayos (ELISA). Actualmente el RIA ha sido prácticamente reemplazado por el ELISA, que es el acrónimo

de la técnica de inmunoensayo Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. Se basa en la detección de un Ag mediante su interacción con un Ac, previa inmovilización de uno de ellos sobre una fase sólida, y gracias a una reacción cuyo producto puede ser medido espectrofotométricamente, catalizada por un enzima reporter unido al Ac o al Ag. Esencialmente, se trata de la misma metodología que la empleada en RIA, aunque en el ELISA se mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Normalmente el Ag es inmovilizado sobre la fase sólida y el Ac está marcado con el enzima, pero en algunas variantes se inmovilizan los Ac o es el Ag el marcado. Los enzimas reporter más usados son peroxidasa y fosfatasa alcalina.

El método tiene grandes aplicaciones en todos aquellos campos en los que se precisa la cuantificación de productos mediante Ac: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de Ac en isotipos, búsqueda de Ac monoclonales, etc. Sus ventajas son facilidad de realización, ausencia de manejo radiactivo, bajos costes, y alta sensibilidad. Su realización es simple gracias al uso de la fase sólida, que posibilita una separación fácil de las fracciones retenida y libre. Además es versátil, ya que permite diferentes variantes y métodos de detección y amplificación de la señal (luminiscentes, fluorescentes, cascadas enzimáticas...). Se puede efectuar con Ac policlonales o monoclonales, pero los segundos dan resultados más fiables.

Las fases de un ensayo ELISA son: 1. Conjugación del Ac o del Ag con el enzima. El Ac marcado se emplea en los ensayos directos, indirectos, sandwich, y sus variantes, y el Ag marcado se emplea en ensayos de competición de Ag; 2. Unión del Ag (o del Ac) a la fase sólida, habitualmente un pocillo de placa ELISA; 3. Formación de los inmunocomplejos, que varían en función del tipo de ELISA que se realice. En cada paso se realiza un lavado para eliminar las moléculas no fijadas en ellos; 4. Revelado por adición del sustrato enzimático, medida de la densidad óptica y cálculo de la cantidad de Ag según la curva patrón.

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De forma análoga al RIA, se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA. A

continuación se describen los más comunes. - ELISA directo. Las muestras que contienen el Ag diana deben adsorberse e inmovilizarse

en la superficie de una fase sólida, de forma que las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones de interés. Luego se añade el Ac específico unido al enzima reporter. A mayor cantidad de Ag presente en la muestra, más Ac marcado se unirá a él en la fase sólida, y mayor intensidad de coloración tras añadir el sustrato. El ELISA directo no se suele utilizar mucho por la dificultad que entraña la conjugación de cada Ac específico con el enzima.

- ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior, de forma que las muestras conteniendo el Ag se deben adsorber a la fase sólida. El sistema de detección emplea dos Ac: uno primario contra el Ag, y otro secundario que reconoce al primario y que está marcado con el enzima. Tras la formación de los complejos Ag-Ac1-Ac2*, la cantidad de enzima presente y la intensidad de la coloración serán proporcionales a la cantidad original de Ag presente en la muestra problema.

Este es un ensayo muy empleado, pues tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión varios Ac2 por cada Ac1, y porque un mismo Ac2 marcado permite cuantificar una gran cantidad de Ag diferentes, ya que está dirigido contra la región Fc constante de la especie en la que se desarrolló el Ac1 y será el mismo en todos los ensayos con Ac de esa especie, además de estar disponible comercialmente. Es decir, no es necesaria una conjugación particular del Ac con el enzima para cada ensayo en concreto, como ocurría en el ELISA directo.

Como el ELISA indirecto se utiliza para detectar la presencia de Ac, es la base de pruebas para infecciones variadas, porque puede detectar la presencia de Ac que reconocen una proteína antigénica (o más) del agente infeccioso. La proteína se adsorbe en el fondo de un pocillo, y el suero del paciente se añade a ese pocillo revestido. Solamente los pacientes infectados tendrán en su suero Ac capaces de unirse a esa proteína y darán reacción coloreada. Un abordaje similar se puede hacer para detectar la producción de Ac monoclonales en un proceso de clonaje de hibridomas.

- ELISA sandwich. Se recubre el pocillo con un primer Ac anti-Ag. Después se aplica la muestra problema en la que se encuentra el Ag, que será retenido en el pocillo. Después se aplica una solución con un segundo Ac anti-Ag marcado con el enzima reporter. Así pues cada molécula de Ag estará unida a un Ac en que lo retiene en la fase sólida y a un segundo Ac marcado. Este ensayo tiene una gran especificidad por la unión del Ag a un primer Ac específico, y alta sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo Ac.

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- ELISA de competición de antígeno. En este caso la molécula que se marca con un enzima reporter es el Ag, y es el Ac el que se une a la fase sólida. A continuación el Ac fijado se incuba con la muestra conteniendo el Ag a medir en presencia de una cantidad fija de Ag marcado. A mayor presencia de Ag libre menor unión del Ag marcado y menor intensidad de color. Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos, o sus divisiones en filas de 8. Las placas son de polestireno u otro plástico tratado para aumentar la facilidad y capacidad de adsorción de moléculas. Tienen fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar en la propia placa las medidas de densidad óptica de cada uno de los pocillos en espectrofotómetros especiales llamados lectores ELISA. A diferencia de los espectrofotómetros convencionales, con capacidad de leer todas las de un rango del espectro, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas , las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos utilizados más comúnmente.

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Día 7. ISOELECTROENFOQUE. Existe otra técnica de electroforesis en gel, que permite separar las moléculas únicamente según sus características de carga. El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica de equilibrio, de alta resolución de proteínas u otras moléculas anfóteras como aminoácidos, que permite además definir uno de sus parámetros, el pH isoeléctrico o pI, que es el valor de pH al que una molécula tiene carga neta cero. Esta técnica puede definirse como una electroforesis desarrollada en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente continuo de pH, y se basa en el desplazamiento de las moléculas en el mismo. La región del ánodo (+) es ácida y la del cátodo (-) es alcalina, y se debe establecer entre ambas un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su pI dentro de ese rango. La técnica del IEF se adapta tanto al uso analítico como al preparativo y se puede desarrollar en distintos soportes físicos, como geles de poliacrilamida o de agarosa, membranas de acetato de celulosa, y también gradientes de concentración de sustancias inertes. Una de las posibilidades, para purificar cantidades grandes de proteína en base a su pI, es utilizar una columna de IEF preparativo en gradiente de glicerol. Estos se llevan a cabo a voltajes muy altos, de hasta 8000 V en su fase final, y en condiciones fuertemente desnaturalizantes (p.e. 8M urea), para obtener la máxima resolución y los resultados más limpios y reproducibles. Otra posibilidad es realizar un IEF

analítico en geles de acrilamida, un grupo de técnicas abundantemente tratadas en la bibliografía. Muchas de ellas se basan en el empleo de geles verticales que requieren el uso de diferentes tampones para el cátodo y el ánodo, elevados potenciales y tiempos de separación prolongados, pero en nuestro caso usaremos un sistema ultrafino de poliacrilamida, de procedimiento mucho más simple.

Los grupos ionizables de las proteínas captan o liberan protones de acuerdo con el pH en el que estén en cada momento, de modo que la carga eléctrica global de cada una dependerá del pH del entorno. Cuando una mezcla de proteínas es introducida en un gel con gradiente de pH, las moléculas que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su pI estarán cargadas positivamente y migrarán hacia el cátodo, y las que se encuentran en regiones con pH superior a su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. A medida que las moléculas se van acercando a su pI irán perdiendo carga eléctrica neta. La migración les conducirá a una región donde el pH coincidirá con su pI, tendrán una carga neta nula (forma zwitterion) y se detendrán; de esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde el pH coincide con su pI. Se dice que entonces las proteínas se han

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focalizado o enfocado, ya que todas las moléculas inicialmente dispersas a lo largo del gradiente de pH se han concentrado en el punto que corresponde a su pI; de ahí el nombre de isoelectroenfoque o

isoelectric focusing. Por tanto, es una técnica de equilibrio y para el resultado final no importa el

sitio de aplicación de las muestras ni el tiempo de desarrollo (por encima de un mínimo). Desde sus inicios a finales de los años 70 los gradientes de pH utilizados en IEF son

generados mediante una mezcla compleja de pequeños polímeros (Pmol 300-1000) llamados anfolitos (carrier ampholytes), que son ácidos poliamino-carboxílicos alifáticos sintéticos y pueden actuar como ácidos o bases, con fuerte capacidad tamponante cerca de su pI. Estos compuestos son comercializados en mezclas que cubren un rango preestablecido de pH y pueden separarse posteriormente de las proteínas purificadas mediante simple diálisis. Existen dos protocolos principales para sintetizar anfolitos: la reacción de diferentes oligoaminas (tetra-, penta-, y hexaminas) con ácido acrílico, y la copolimerización de aminas, aminoácidos y dipéptidos con epiclorhidrina. Estos procedimientos generan mezclas que contienen cientos o miles de especies anfóteras con valores de pI distribuídos en todo el rango de pH. Las preparaciones de anfolitos, disponibles comercialmente, pueden cubrir el rango de pH 2,5-11, pero en la práctica el proceso del IEF está limitado al rango de pH 3,5-10. Inicialmente, los anfolitos se distribuyen al azar por todo el gel. Cuando se aplica un campo eléctrico, las moléculas de anfolito comenzarán a migrar rápidamente hacia uno u otro de los electrodos, dependiendo de su pI y carga neta. Por ejemplo, las especies de anfolito más ácidas (con el menor pI) tendrán la mayor carga negativa y migrarán hacia el ánodo hasta que la carga neta sea cero, donde se concentrarán en una zona estrecha. De esta forma todas las moléculas de anfolito, independientemente de su posición inicial, migrarán hasta el punto donde su carga neta sea cero. Debido a que cada uno de los anfolitos tiene alta capacidad tamponante, el pH del medio que los rodea es igual a su propio pI. Cuando se completa este proceso de reordenación se alcanza un estado estacionario, generándose un gradiente de pH continuo a lo largo del gel, sobre el cual se van orientando las proteínas. Las moléculas a separar deben tener su pI dentro del rango, por lo que el gradiente de pH varía usualmente entre amplios márgenes, aunque también se pueden utilizar intervalos más estrechos para aumentar la resolución. Ello puede permitir un gran poder de resolución para conseguir separar moléculas con diferencias muy pequeñas de pI, dando lugar a bandas bien diferenciadas de proteínas acumuladas. Como ya apuntamos, en esta técnica el punto de aplicación no es crítico, pues las moléculas siempre se desplazarán hacia la región de su pI. La capacidad de resolución es de diferencias de pI de hasta 0,01-0,02 unidades de pH (usando mezclas de anfolitos de rango pequeño) gracias a que las bandas de proteína son muy nítidas debido al efecto de enfocado. El IEF también puede usarse para determinar el pI de una molécula determinada, ya que se puede conocer el pH de cada punto del gel. Tras un corrido de IEF el gradiente de pH en el gel puede ser medido tanto utilizando un electrodo con membrana para superficies como cortando el gel en pequeños intervalos, eluyendo las muestras de cada trozo y midiendo su pH. Otra alternativa es usar una mezcla de proteínas estándar de pI conocidos para calibrar el gradiente de pH alcanzado durante el IEF, de forma que se puede establecer una relación directa entre el pI de las proteínas y su posición respecto al ánodo o al cátodo. Así, conociendo los pI de determinadas proteínas marcadoras, se puede dibujar una recta patrón que permite calcular el pI de proteínas desconocidas a partir de su migración respecto a uno de los electrodos.

La presencia de sales en las muestras puede interferir en los procesos de IEF, por lo que deben reducirse tanto como sea posible. Las sales provocan un aumento en la conductividad, y el

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enfoque de las proteínas no puede llevarse a cabo hasta que sus iones se hayan desplazado hasta los extremos de las tiras. Cuando hay mucha concentración de sales hay regiones en las que las proteínas no se enfocan, ocasionando distorsiones horizontales en los geles finales. Dependiendo de las condiciones de trabajo, la concentración aceptable puede variar desde menos de 10 mM hasta 50 mM. Para evitar estos problemas, las proteínas usadas suelen ser previamente desaladas mediante diálisis o centrifugación en microcolumnas ad hoc.

IEF analítico en gel ultrafino de poliacrilamida. En esta técnica de IEF se emplea la poliacrilamida como soporte para el establecimiento del

gradiente de pH. Al igual que en el IEF preparativo, se usa una mezcla de anfolitos que se distribuyen por el gel formando un gradiente continuo de pH, más ácido hacia el ánodo. Simultáneamente, las proteínas van migrando a través del gel en función de su carga hasta alcanzar una región de equilibrio en la que el pH sea igual a su pI, y se detienen allí. En esta práctica vamos a emplear un sistema desarrollado por la compañía Bio-Rad. Las innovaciones más importantes del sistema son: 1) el empleo de geles de poliacrilamida ultrafinos de 0,4 mm de grosor, frente a los convencionales de 1-1,5 mm; 2) el campo eléctrico se genera mediante el contacto directo de los electrodos con el gel, evitando el uso de tampones; 3) el potencial se aumenta de forma escalonada a lo largo de la separación en vez de mantenerse constante, y 4) el gel se dispone en horizontal y boca abajo durante la separación. Las ventajas que aporta esta técnica radican en su rapidez (90 min), comodidad (temperatura ambiente, instrumentación sencilla) y sensibilidad (2-3 μg de proteína por banda). Esta última característica limita la técnica a un uso estrictamente analítico, de forma que es adecuado para determinar el pI de una proteína o garantizar la pureza de una muestra, pero no para su purificación.

Con este sistema analizaremos las proteínas cuya movilidad ya hemos estudiado previamente mediante electroforesis en acetato de celulosa o PAGE. Una vez separadas, la detección de las proteínas se realiza mediante la tinción del gel con azul de Coomassie y croceína escarlata y la posterior destinción.

Para determinar el pI de una o varias proteínas, se cargan en una calle paralela una mezcla de proteínas marcadoras con pI conocidos, con los que se elabora una recta patrón representando el pI (ordenadas) frente a la distancia de migración respecto al cátodo (abscisas). A partir de esta recta interpolaremos el valor del pI de la proteína a analizar.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Materiales y reactivos.

- Bandeja para la polimerización del gel, film de polimerización y vidrio. - Equipo de isoelectroenfoque Mini IEF Cell, fuente de alimentación, lámpara. - Acrilamida 24,25% y N,N’-metilen bisacrilamida 0,75% en agua. - Glicerol 87%. - Anfolitas Pharmalyte 3-11. - Riboflavina al 0,1%, persulfato amónico al 10% y TEMED. - Columnas de desalación: Protein desalting spin column (Pierce). - Muestras de proteínas problema y patrones de pIs conocidos.

Preparación del gel.

- Preparación del soporte de polimerización: empleamos una bandeja, un film de polimerización y una placa de vidrio. El film posee dos superficies diferentes; una hidrófoba, a través de la cual se adhiere al vidrio, de forma que queda hacia el exterior la superficie tratada hidrófila, que permite la polimerización de la acrilamida sobre ella. Se añaden unas gotas de agua a la superficie del vidrio para conseguir la adhesión de la superficie hidrófoba (es importante retirar el exceso de agua), y se

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coloca el conjunto sobre la bandeja de polimerización con la superficie tratada hacia abajo. Así, el molde del gel será el volumen limitado por esta superficie y por la de la bandeja.

- Preparar la siguiente mezcla de polimerización:

H2O 3,45 ml Acrilamida 25% 1,0 ml Glicerol 87% 0,29 ml Anfolitos al 40% 250 μl

- Desgasificar la mezcla de polimerización conectando el tubo a una bomba de vacío durante 5 min. Preparar en ese tiempo la mezcla de catálisis: Riboflavina 50 μl PSA 50 μl TEMED 10 μl - Una vez desgasificada, añadimos la mezcla de catálisis a la de polimerización, mezclando ambas mediante una leve agitación para evitar introducir aire. Utilizando una pipeta de 5 ml, introducimos la mezcla de polimerización en el molde previamente preparado. Dejamos polimerizar el gel durante una hora, colocándolo cerca de una fuente de luz.

Electroforesis. - Aplicación de la muestra: separamos con cuidado el gel de la superficie de la bandeja de polimerización y lo colocamos con la acrilamida hacia arriba. Las muestras de proteínas problema o patrón se introducen en el gel por difusión, usando para ello unas tarjetas especiales en cuyas perforaciones depositaremos aquéllas, esperando unos 5 min. para que difundan al interior. - Separación electroforética: una vez introducidas las muestras, colocamos el conjunto en la cubeta de electroforesis con el gel hacia abajo en contacto directo con los electrodos de grafito (previamente humedecidos). La aplicación del potencial se hace de manera escalonada: 15 min a 100 V 15 min a 200 V 60 min a 450 V - Fijación: se trata el gel durante 15 min con solución de fijación para precipitar y fijar las proteínas en el gel y ayudar a eliminar los anfolitos. - Tinción: para la detección de las proteínas teñimos durante 1 hora con solución de tinción y posteriormente eliminamos el fondo con solución de destinción, ambos procesos en agitación suave y a temperatura ambiente. Una vez desteñido el gel, se escanea y se mide la migración de las bandas de los marcadores respecto a uno de los elctrodos, representándolas frente a los valores de pI.

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Día 8. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL.

La electroforesis bidimensional se basa en separar los componentes de una mezcla (casi siempre de proteínas) según dos propiedades moleculares, e implica una sucesión de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones), realizadas sobre una misma muestra para conseguir el máximo de resolución posible mediante técnicas electroforéticas. En la primera de ellas se separan los componentes de la muestra según un criterio y en la segunda según un parámetro distinto al anterior. Así, por ejemplo, la primera dimensión puede llevarse a cabo en condiciones no reductoras y la segunda en condiciones reductoras para determinar la presencia de puentes disulfuro en las proteínas; o bien las proteínas ribosomales, que se separan en un gel discontinuo en la primera dimensión seguido por otro continuo en la segunda, ambos en presencia de urea; o las histonas, que se separan entre sí en geles con urea y ácido en la primera dimensión, y utilizando Tritón/ácido/urea en la segunda.

El procedimiento de electroforesis bidimensional más usado, conocido como 2D-PAGE, se basa en la combinación de los dos tipos de electroforesis más resolutivos, que son el IEF y la SDS-PAGE. En condiciones óptimas, cada uno de ellos por separado permite separar mezclas complejas de proteínas y resolver hasta 100 bandas diferentes correspondientes a proteínas con niveles de expresión apreciables. Sin embargo, cada vez es más necesario analizar con mucha mayor precisión muestras de gran complejidad, como extractos celulares o tisulares en los que se desea estudiar una o múltiples proteínas con bajos niveles de expresión. La precisión deseada para estos niveles de complejidad no puede conseguirse por ninguno de los procedimientos electroforéticos que se desarrollan en una sola dimensión. Además, en cualquiera de estos procedimientos la separación se basa en una única propiedad fisicoquímica (como el tamaño o la carga). En consecuencia, por ejemplo, si se realizó un SDS-PAGE, cada banda obtenida tras la separación contendrá todas las proteínas de la muestra con Pmol igual o muy parecido, que no necesariamente serán una misma proteína. Así, en 2D-PAGE la separación en una dimensión se hace según el pI mediante IEF y en la otra según el Pmol mediante SDS-PAGE; aunque nada lo impone, por razones técnicas lo habitual es que el IEF sea la primera dimensión. El IEF puede realizarse en tubo o en tira, y normalmente se emplean gradientes de pH expandidos. Una vez terminado, se trata la tira de gel con el tampón de muestra de la SDS-PAGE y se coloca en la parte superior del segundo gel para que entren las muestras directamente.

Debido a la complejidad química de los anfolitos, asociada a la variabilidad entre preparaciones, a la inestabilidad temporal de los gradientes generados, y a la fragilidad de los geles, los gradientes de anfolitos han sido sustituídos ventajosamente por los immobilized pH

gradients o IPG. Los IPG son tiras de IEF prefabricadas comercialmente que se presentan en una gran variedad de rangos de pH, desde los más amplios hasta gradientes de una unidad de pH o menos. Son generados por la copolimerización junto con acrilamida y bisacrilamida de un gradiente de una serie de monómeros de acrilamida derivados con grupos tamponantes ácidos o básicos, llamados acrylamido

buffers, que tienen la estructura general CH2=CH-CO-NH-R, donde R contiene tanto grupos carboxilo como aminos terciarios. A diferencia de los anfolitos, son compuestos sencillos y bien caracterizados, y su fijación covalente a la matriz impide la distorsión del gradiente. La matriz es polimerizada entre láminas de plástico que le dan resistencia mecánica, y tras la polimerización el gel se deseca y se corta en tiras (de unos 3 mm) que se guardan congeladas a -20ºC. Otras ventajas de los IPG son su relativa tolerancia a la presencia de sales en la muestra durante el IEF, su mayor

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capacidad de carga, la capacidad de crear virtualmente cualquier gradiente de pH (incluso de menos de una unidad de pH), la reproducibilidad de los gradientes, y su disponibilidad comercial. Los IPG se utilizan habitualmente para la primera dimensión de la 2D-PAGE. Tras separar las muestras en las tiras de IEF, se tratan con tampón de muestra y se cargan en la parte superior de geles normales de SDS-PAGE, corriéndose a continuación la segunda dimensión. Finalizada ésta se procede a la tinción como se ha descrito para geles de SDS-PAGE. En el gel ya teñido, las proteínas separadas aparecen como manchas o puntos (spots) y no como bandas, ya que proceden de las bandas de la primera dimensión que se han aplicado perpendicularmente a la segunda y han pasado por el gel de empaquetamiento.

El resultado de todo esto es una gran versatilidad y reproducibilidad. La 2D-PAGE puede considerarse como un criterio

de pureza positivo por su gran poder de resolución, aceptándose en general que la aparición de una sola mancha indica una muestra homogénea: es difícil que dos polipéptidos coincidan absolutamente en tamaño y pI, aunque la capacidad de observación de tales diferencias depende lógicamente de los rangos de pI y tamaño analizados.

Tras 2D-PAGE las proteínas pueden ser detectadas por varios métodos que ya vimos en la práctica de Detección de proteínas. Los más utilizados para 2D-PAGE son el Coomassie Blue normal o su variante coloidal de mayor sensibilidad, o bien la tinción con plata, de mayor sensibilidad. Las ventajas del Coomassie respecto a la plata son su simplicidad técnica y su respuesta más estequiométrica, que lo hacen más apropiado para la comparación de muestras por análisis densitométrico, ya que la plata presenta una respuesta con saturación y el rango lineal es más estrecho. Además, la tinción con Coomassie es compatible con el uso posterior de los spots proteicos para análisis proteómico. En todo caso, los procesos de tinción para 2D-PAGE han de ser llevados con mucha más limpieza y cuidado de lo habitual, y siempre necesitan de pasos de fijación para la elimiación de las anfolitas, que unen el CBB e interfieren con la plata.

También existen colorantes fluorescentes con una sensibilidad comparable a la de la plata y un extenso rango lineal, óptimos para estudios cuantitativos y comparativos, aunque mucho más caros. Como vimos, hay colorantes fluorescentes que se usan para teñir los geles tras la electroforesis mediante uniones no covalentes a las proteínas, y otros que se usan para

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marcar covalentemente las proteínas antes de la electroforesis. Los segundos permiten hacer análisis tipo DIGE 2D, usando dos o más colorantes fluorescentes para marcar muestras que se quieren comparar, y cuyos perfiles de fluorescencia se analizan por superposición usando sistemas adecuados de imagen.

El sistema DIGE 2D permite comparar varias muestras mediante electroforesis bidimensional mediante marcaje de cada una con distintos fluoróforos tipo cianina que se unen covalentemente a los grupos amina primarios de las Lys y el extremo N. Los succinimidil esters de los colorantes propil Cy3 y metil Cy5 se usan para premarcar dos muestras de proteína diferentes que se desean comparar, antes de correr ambas en el mismo gel de 2D-PAGE. Esto permite que ambas corran en idénticas condiciones electroforéticas, y que las imágenes generadas a las longitudes de onda correspondientes a cada colorante puedan ser superpuestas y comparadas. Debido a que las proteínas son modificadas covalentemente en las Lys, que aportan cargan positiva, su carga y masa se verá afectada, por lo que los colorantes han sido diseñados para que se regenere la carga positiva perdida y las modificaciones de masa sean equivalentes en las proteínas marcadas con ambos.

Cualquier célula, tejido u organismo puede expresar millares de proteínas diferentes simultáneamente. Para entender sus propiedades es importante saber qué proteínas expresa y cómo el patrón de expresión cambia en respuesta a factores fisiológicos como desarrollo, diferenciación o acción hormonal, al ambiente, o en procesos patológicos. La Proteómica es el estudio del proteoma que, por analogía con el término genoma, se define como el conjunto de todas las proteínas expresadas por una célula, tejido u organismo en unas condiciones determinadas. Los análisis proteómicos se centran en su identificación, cuantificación, localización, modificaciones, interacciones y actividades. Por ejemplo, pueden detectarse variantes de las proteínas (p.e. formas fosforiladas) mediante la comparación de las posiciones y las intensidades de las bandas en geles de preparaciones similares.

El número estimado de genes codificantes de proteínas del genoma humano es de entre

20000 y 25000. Dado que en muchos casos pueden obtenerse varios productos proteicos de un solo gen, el número de proteínas distintas presentes en el ser humano puede estar entre 40000 y 70000. En un solo electroforetograma bidimensional pueden observarse hasta 5000 proteínas, por lo que la 2D-PAGE es una herramienta valiosa en análisis proteómico. No obstante, algunas proteínas son

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difíciles de identificar y analizar por estas técnicas debido a su baja abundancia, solubilidad, carga molecular o muy baja masa molecular. Por ejemplo, las proteínas integrales de membrana son muy hidrofóbicas y no son solubles en los disolventes para IEF.

Uno de los mayores problemas de la 2D-PAGE para aplicaciones de Proteómica es el análisis y comparación de mezclas muy complejas de proteínas. Esto puede hacerse por comparación a simple vista, pero se hace cada vez más con ayuda de programas de análisis densitométrico de las imágenes digitalizadas de los geles (mapas bidimensionales). Actualmente existen bases de datos con numerosos geles 2D-PAGE de referencia correspondientes a tipos celulares, organismos y tejidos, como http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html, que identifican varias de sus proteínas constituyentes. Estos sistemas son capaces además de comparar patrones de respuesta de manchas polipeptídicas, buscando diferencias cualitativas y/o cuantitativas entre los patrones de manchas de dos (o más) geles para detectar su aparición o desaparición o cambios en su intensidad, en respuesta a una señal o en procesos patológicos.

Las bandas proteicas individuales pueden cortarse de un gel teñido (con un bisturí o robot), la proteína se trata con proteasa (a menudo tripsina) en el propio gel, y los péptidos obtenidos se eluyen para su identificación por espectrometría de masas.

Espectrometría de masas (EM). Es una técnica en la que las moléculas se evaporan y luego se bombardean con un haz de

electrones de energía elevada haciendo que se fragmenten en forma de cationes. Al entra en el espectrómetro los fragmentos ionizados pasan a través de un fuerte campo magnético que los separa de acuerdo con su cociente masa/carga (m/z). Cada clase de molécula se identifica por el patrón de fragmentos que se genera, siendo único cada patrón de huellas.

Como las proteínas no se evaporan, en su lugar se digieren y luego se disuelven en un disolvente volátil y se pulverizan en la cámara de vacío del espectrómetro de masas. El haz de electrones ioniza esos fragmentos peptídicos y los péptidos cargados positivamente pasan a través del campo magnético. Las huellas de masas de los péptidos que se producen se comparan posteriormente con la información de la fragmentación de las bases de datos de las proteínas. Aunque la EM es muy exacta y automática, no suele ser suficiente para investigar todas las proteínas de una muestra. Para mejorar la identificación de las proteínas se ha desarrollado la EM tándem (EM/EM), un método en el que se unen en tándem dos espectrómetros de masas. En esta técnica los fragmentos de oligopéptido que se producen en el primer EM se transfieren posteriormente al segundo EM, donde se fragmentan más y se analizan. La EM/EM se utiliza para secuenciar rápidamente las proteínas. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

En nuestro caso, usaremos tiras de IPG Immobiline Dry Strip pH 3-11 (Amersham) para realizar la primera dimensión en el análisis de las muestras de interés. Estas tiras tienen un aparataje específico y unos procedimientos optimizados (entre los que se incluyen la desalación de las muestras para una mejor separación en los IPG) para mejorar la reproducibilidad y con ella las comparaciones entre distintas muestras.

Analizaremos dos extractos de las mismas células, uno tratado y otro no con un agente determinado. Tras correr la primera dimensión en el sistema especial diseñado para ellas, cargaremos las tiras de IPG en la parte superior de geles Miniprotean y correremos la segunda dimensión. Tras la tinción con azul de Coomassie compararemos dos muestras para tratar de encontrar las diferencias entre ellas a nivel de spots de polipéptidos que aparezcan, desaparezcan o cambien de movilidad.

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DÍA 9. INMUNOELECTROFORESIS CUANTITATIVA. Las técnicas electroforéticas pueden aplicarse al estudio de la interacción antígeno-anticuerpo en diferentes modalidades, que permiten realizar observaciones cualitativas o cuantitativas de este proceso. Existen muchas variantes de las técnicas de inmunoelectroforesis (inmunoEF) como las que resumidamente se enumeran:

- InmunoEF (convencional): combina una separación electroforética y una inmunodifusión, y se suele usar para detectar antígenos (Ag) en una mezcla compleja.

- InmunoEF cuantitativa (rocket): consiste en un análisis electroforético del Ag a valorar en un gel que contiene un anticuerpo (Ac) específico. Se suele usar para cuantificar Ag, y es la que haremos.

- InmunoEF cruzada: consiste en realizar una separación electroforética del antígeno (generalmente una mezcla compleja), seguida por una segunda electroforesis en un ángulo de 90° respecto a la primera dentro de un gel que contiene un antisuero específico.

- InmunoEF bidimensional: es aquella en la que sobre los fragmentos de Ag separados inicialmente se realiza un segundo proceso electroforético en un medio que contiene Ac y en una dirección perpendicular a la primera electroforesis.

- Contra-inmunoEF o electro-inmunodifusión: la inmunoprecipitación ocurre cuando el Ag que está en el cátodo se hace migrar en un campo eléctrico a través de un medio en determinadas condiciones de pH contra una corriente de Ac que migran desde el ánodo como resultado de un flujo electro-endosmótico.

La inmunoEF convencional es una técnica eminentemente cualitativa, que se desarrolla en condiciones nativas, y es especialmente apropiada para el análisis de líquidos fisiológicos y extractos celulares. Permite identificar sustancias en mezclas muy complejas, aun estando presentes en muy baja concentración, pero requiere que tales sustancias sean inmunogénicas y depende de los antisueros utilizados, por lo que es difícil de estandarizar.

Se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ag (o proteínas) por electroforesis en gel. En general el soporte físico de estas electroforesis es agar o agarosa a concentraciones alrededor del 1%. En estas condiciones el tamizado molecular de las proteínas es mínimo y la separación tiene lugar preferentemente en función de su carga. Terminada la electroforesis, las proteínas son sometidas a antisueros poli o monoespecíficos, aplicados en el gel en un canal paralelo al eje de migración. Por inmunodifusión doble (en cámara húmeda) llegan a encontrarse los Ag y Ac, apareciendo cada complejo Ag-Ac visible en forma de un arco elíptico específico de precipitina. Los arcos de precipitación tienen una forma y posición que dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína, y pueden ser estudiados por comparación con un sistema estándar.

Los complejos sólo se producen cuando ambos componentes se hallan en lo que se conoce como relación de equivalencia. Estas no son idénticas para todas los proteínas presentes en una muestra, por lo que deben determinarse, en experimentos preliminares, las cantidades idóneas del antisuero y de la muestra, así como las distancias entre el pocillo (de aplicación de la muestra) y la trinchera. Si la distancia es muy pequeña, la difusión del Ag (proteínas) es rápida y puede no formarse el precipitado. Si la distancia es mayor, la posibilidad de formación del precipitado también lo es, pero hay que emplear mayor cantidad de antisuero y el proceso se alarga. Así, se elige la distancia entre el pocillo y la trinchera que permita obtener el máximo número de bandas de precipitación. Una vez formadas éstas, el gel puede lavarse para eliminar las proteínas que no están inmunoprecipitadas, y posteriormente teñirse, p.e. con azul de Coomassie.

Cada proteína de la muestra es capaz de producir una banda de precipitación independiente, por lo que es posible identificar el número de constituyentes de la muestra que son reconocidos por los Ac presentes en el antisuero. Puede haber más, que no sean detectadas por el antisuero empleado o que no hayan alcanzado la relación Ag-Ac adecuada. Hay que tener presente que con distintos antisueros se pueden identificar distintos componentes de una misma muestra. La gran especificidad

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y sensibilidad de las reacciones de precipitación permite diferenciar sustancias con movilidades electroforéticas idénticas, y detectar componentes que se encuentren en concentraciones muy bajas. Así, las 5-6 fracciones clásicas que se observan al analizar las proteínas del suero humano por electroforesis en agar o acetato de celulosa, se convierten en más de 30 bandas de precipitación independientes tras una inmunoEF.

La elevada resolución de la inmunoEF proviene de las características de las bandas de

precipitación. Estas son impermeables sólo a las dos sustancias que la forman (la proteína o Ag y su correspondiente Ac), pero son permeables a las otras sustancias (otras proteínas y otros Ac) presentes en el gel. Por eso, proteínas diferentes pueden formar bandas de precipitación que se crucen, lo cual permite distinguir entre una multitud de proteínas antigénicamente diferentes, aunque tengan movilidades electroforéticas idénticas. Es muy improbable que ocurra la superposición o confluencia de bandas. Dos bandas de precipitación no pueden superponerse, a menos que las generen dos sustancias con idéntica movilidad electroforética (que depende de la relación carga/masa) e idéntica velocidad de difusión (que depende inversamente del tamaño molecular), y, además, cuyas relaciones de equivalencia sean tales que las líneas de precipitación se formen en el mismo sitio. La probabilidad de que todo esto coincida, siendo proteínas diferentes, es mínima.

La inmunoEF cuantitativa permite la cuantificación de Ag, por lo que ocasionalmente se le llama electro-inmunoensayo. Distintas cantidades del Ag se depositan en unos pocillos realizados sobre un gel de agarosa que contiene el Ac específico. Al aplicar un campo eléctrico, el Ag entra al gel y avanza por el mismo. Cuando el Ag alcanza la concentración de equivalencia ocurre una inmunoprecipitación formándose unas bandas insolubles de precipitina (complejos Ag-Ac) que adquieren forma puntiaguda o de cohete (de ahí el término inglés rocket que se le da a esta técnica). Los complejos sólo se producen cuando ambos componentes se encuentran en la relación de

equivalencia característica de cada Ag-Ac, pero no por encima ni por debajo de ella. Como la concentración de Ac es constante en el gel, la altura a la que se forma la banda de precipitina dependerá de que el Ag alcance (por dilución, a medida que avanza) la concentración necesaria para dar la relación de equivalencia. Para cantidades menores de Ag, se encontrará antes que para cantidades mayores, de forma que los perfiles de cohete de precipitina serán menores para muestras con menor cantidad de Ag. Por el contrario, a mayor concentración de Ac en el gel, menor área de los cohetes de precipitina. La cantidad de Ag es proporcional al área del cohete, y si los pocillos son pequeños y el proceso se deja llegar a su conclusión, a su altura. De esa manera se pueden usar cantidades conocidas de un Ag dado para medir su presencia en una o más muestras desconocidas.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Materiales y reactivos. - equipo de electroforesis - Agarosa al 1% en tampón de pH 8,6 - placas de vidrio de 10x10 cm - anticuerpos anti-GAPDH. - papel 3MM (dos tiras de 7x12cm) - antígeno (extracto conteniendo GAPDH) - micropipetas - tampón de electroforesis pH 8,6 - sacabocados - soluciones de tinción y destinción 1. Disponer una placa de vidrio de 10x10 cm sobre una superficie plana. A fin de mejorar la adherencia de la agarosa, es recomendable usar placas impregnadas la víspera con una capa de 20 ml de agar al 0,5%, que se deja secar en una estufa a 37°C hasta el momento de ser usadas. 2. Preparar 50 ml de tampón con agarosa al 1%, fundirla en un microondas y dejarla enfriar hasta que se pueda tocar el recipiente con la mano (aprox. 45°C). 3. Poner en el fondo de dos tubos Falcon 30 y 60 μl del anticuerpo, añadir encima de cada uno 25 ml de la agarosa fundida, y mezclar suavemente. Extender cada disolución agarosa-antisuero sobre una placa de vidrio, de manera que queden uniformemente distribuídas. 4. Una vez solidificada la agarosa, hacer con el sacabocados unos diez pocillos que disten al menos 1 cm de uno de los bordes de la placa. 5. Colocar la placa sobre el soporte del tanque de electroforesis, de modo que los pocillos queden hacia el polo negativo (negro). 6. Añadir tampón a los reservorios del tanque. Mojar las tiras de papel 3MM en el tampón y colocarlas sobre los extremos del gel de modo que el otro lado del papel quede sumergido en el tampón de electroforesis (puente salino). 7. Depositar distintas cantidades de antígeno (p.e. de 0,1 a 5 μg de GAPDH) y en 30 μl de tampón de electroforesis con azul de bromofenol. 8. Aplicar una corriente de 50-100 mA y dejar durante al menos 2 horas, con refrigeración y recirculación del tampón de los electrodos. 9. Transcurrido el tiempo de desarrollo de la electroforesis, lavar someramente el gel con agua destilada en una cubeta. 10. Poner encima del gel una hoja de papel 3MM y una pila de papel de filtro presionada por un peso durante 2 horas, para que se deshidrate el gel. Acabar de secarlo en una estufa a 37°C hasta el día siguiente. 11. Colocar la placa en una cubeta de plástico, y teñir el gel seco durante unos minutos con azul de Coomassie R 0,25%, metanol 45%, ácido acético 10%. 12. Desteñir con metanol 7,5% y ácido acético 10% en agua (dos cambios, unos 30 min cada uno), hasta que se visualicen las bandas de precipitación. Comparar los tamaño de las bandas de precipitación con las cantidades de antígeno utilizadas.

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Día 10. ELECTROFORESIS DE DNA EN GELES DE AGAROSA.

La agarosa es un polisacárido lineal con un Pmol medio de 12.000, formado por repeticiones de agarobiosa, que a su vez consiste en unidades alternas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. Los geles se forman calentando la agarosa en un tampón acuoso y a continuación dejando enfriar la solución resultante. La formación y propiedades del gel se deben al establecimiento de puentes de H entre las cadenas de agarosa, y el tamaño de poro se controla variando su concentración. En general, los geles de agarosa ofrecen un tamaño de poro considerable, de manera que no son adecuados para la separación por tamaño de la mayoría de las proteínas (que suelen tener un Pmol menor de 100.000) pero sí de macromoléculas mayores como los ácidos nucleicos (1 kb de DNA tiene un Pmol de 620.000). Así, la electroforesis en geles de agarosa es el método de elección para separar y analizar fragmentos de DNA o RNA.

Los polielectrolitos como el DNA (o moléculas como la polilisina) tienen una unidad de carga en cada residuo, de modo que cada molécula tiene una carga proporcional a su longitud o su Pmol. Puesto que la densidad de carga (negativa) por unidad de longitud es igual en todas las moléculas de DNA debido a la presencia de los grupos fosfato (pKa = 2,12), las diferencias de movilidad entre ellas serán debidas exclusivamente a su tamaño. En una primera aproximación, un macroión cuya carga es proporcional a su longitud tiene una movilidad libre casi independiente de su tamaño, pero el coeficiente de

fricción f también aumenta con la longitud molecular. Al separar una mezcla de esta clase de

moléculas en una electroforesis desarrollada en un soporte tipo gel, el efecto de tamizado molecular determina las movilidades relativas de las moléculas de forma proporcional a la longitud o al Pmol, para cualquier concentración de gel con tamaño de poro adecuado. La movilidad relativa es, aproximadamente, una función lineal inversa del logaritmo de la longitud o del Pmol: a mayor tamaño menor movilidad, porque el efecto de tamizado se manifiesta más. Esto significa que, mediante la electroforesis en gel, podemos separar perfectamente dichas moléculas basándonos sólo en su tamaño.

La migración de los ácidos nucleicos en los geles de agarosa depende de cuatro parámetros

principales: - Tamaño del DNA o RNA: la movilidad electroforética es inversamente proporcional al log

decimal de la longitud o del Pmol de la cadena. - Concentración de agarosa: hay una relación inversa entre el log de la movilidad

electroforética y la concentración de agarosa. El porcentaje de agarosa a utilizar dependerá del tamaño de las moléculas a separar; en la práctica, los más usados están entre el 0,7 y el 1%, que proporcionan buena resolución entre 0,5 y 10 kb.

- Campo eléctrico, E = V/d: a voltajes bajos la velocidad de migración del DNA es proporcional a la diferencia de potencial, pero a voltajes elevados el DNA de alto peso molecular migra a mayor velocidad de la esperada. Por ello la capacidad de separación decrece al aumentar el voltaje en exceso. Las condiciones óptimas de separación son de 5 V/cm.

- Conformación: las moléculas de DNA circular (como los plásmidos) pueden estar en estado lineal (abierto) o circular (cerrado), que a su vez puede estar relajado o superenrollado. Esos estados se traducen en distintos grados de compactación del DNA, que a su vez presentan distintas movilidades electroforéticas.

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En las estructuras de DNA circulares o cerradas se forman topoisómeros, que se diferencian entre sí por presentar distinto nivel de superenrollamiento (distinto número de enlace). Como consecuencia de éste hay un cambio en estructura terciaria, que lleva a un mayor grado de compactación y densidad, menor superficie y mayor velocidad de migración en campo eléctrico. Así pues, las diferencias de superenrollamiento pueden detectarse mediante electroforesis en gel, ya que las formas superhelicoidales más compactas se desplazarán con mayor rapidez que las más relajadas. La acción progresiva del enzima topoisomerasa va desplazando la conformación de las primeras a las segundas. Así pues, la electroforesis en gel nos permite separar los topoisómeros de un determinado DNA.

La electroforesis en gel de agarosa produce buenas resoluciones en períodos de tiempo

cortos. Se realiza en geles horizontales sumergidos o submarinos, totalmente inmersos en tampón. A las muestras se les añade un tampón que contiene un agente densificante (como el glicerol), que permite a la muestra caer al fondo del pocillo, y un colorante (como el azul de bromofenol o el xylene cyanol) que permite ver la muestra durante la aplicación y que actúa como marcador del frente de la electroforesis a lo largo de ésta.

Mientras que para la electroforesis de dsDNA se utilizan condiciones nativas, para la de RNA (cadena única) se incluyen agentes desnaturalizantes. La electroforesis en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes se usa sobre todo para el análisis de mRNA, que se transfiere posteriormente a membranas para su detección (Northern blotting), y también para la separación de fragmentos de ssDNA. Los ácidos nucleicos de cadena sencilla adoptan estructuras secundarias y terciarias, que están mantenidas esencialmente por apareamientos parciales entre bases complementarias de la misma u otra cadena. Tanto para lograr una buena separación de las cadenas monocatenarias como para calcular los tamaños con fiabilidad, es necesario que las moléculas estén completamente desnaturalizadas. Los agentes desnaturalizantes convierten las moléculas en cadenas individuales, más o menos lineales, porque eliminan las estructuras secundarias que afectarían a su movilidad. Entre estos agentes están la temperatura, los pH extremos, y diversos agentes químicos; el utilizar uno u otro depende del soporte y del ácido nucleico. En este caso, los que rompen los puentes de H (urea, formamida) no pueden utilizarse porque afectan a la agarosa, cuyas fibras se mantienen mediante esos enlaces. Para el DNA se utilizan condiciones alcalinas, pero el RNA puede hidrolizarse a pH básico. En tal caso se usa

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formaldehído, hidróxido de metil mercurio o glioxal (compuestos tóxicos y volátiles), que interaccionan con los átomos de hidrógeno de las bases, impidiendo su apareamiento.

En esas condiciones se puede correlacionar mejor la movilidad electroforética con el tamaño de las moléculas que se están estudiando: en ausencia de estructuras secundarias, la movilidad de los fragmentos de DNA o de RNA es inversamente proporcional al log de su tamaño (Pmol o longitud). Normalmente, en una o más calles del gel se colocan patrones de tamaño conocido, y gracias a ellos se pueden deducir los de moléculas problema mediante una recta patrón. Una vez finalizada la electroforesis, hay dos maneras fundamentales para detectar y visualizar loas ácidos nucleicos: bien usando compuestos fluorescentes que se unen a ellos, o bien por tinción con plata, particularmente adecuada para geles de poliacrilamida. La detección con el compuesto fluorescente bromuro de etidio (EtBr) es el método habitual para visualizar los ácidos nucleicos en los geles de agarosa, y permite detectar bandas conteniendo hasta 10 ng de DNA a simple vista, o hasta 0,01 ng con sistemas avanzados de análisis de imagen. Otros compuestos fluorescentes (SYBR Green, TOTO-1, YOYO-1) son capaces de detectar hasta 50-60 pg/banda de DNA o RNA, aunque son bastante más caros.

El EtBr tiene un rendimiento cuántico bajo en medios acuosos (polares), pero se incrementa notablemente en entornos hidrofóbicos, lo que sucede cuando se intercala en el DNA. Para ver las bandas de DNA es necesario tratar el gel durante unos 15-20 min con EtBr (0,5-1 μg/ml), e iluminarlo luego con radiación UV, que es absorbida por la sonda y que emite a 590 nm. Puede utilizarse radiación de 254 nm, que es absorbida por el DNA y transferida al EtBr, o de 302 ó 366 nm, que es absorbida directamente por la sonda fluorescente. Se suele usar la de 302, que da más intensidad que la de 366, pero produce menos roturas en el DNA que la de 254. Además del EtBr se pueden usar otros colorantes catiónicos aromáticos planares, como la naranja de acridina o la proflavina que se unen al dsDNA por intercalación entre los pares de bases. El ssDNA y el RNA también estimulan la fluorescencia del ión etidio, pero en menor medida que el dsDNA.

Como las bandas de DNA o RNA sólo son visibles mientras se están iluminando, es necesario fotografiar o captar la imagen para tener los resultados de forma permanente, por lo que habitualmente los transiluminadores de luz UV están acoplados a sistemas de captación de imágenes. Estas imágenes suelen tener muy buen contraste porque la agarosa es transparente y apenas da fondo con el EtBr, que en todo caso se puede mejorar por lavado. Por otra parte, los geles pueden ser usados con fines preparativos, puesto que la porción de gel que contiene el fragmento o banda de interés puede ser recortada y el DNA extraído de la agarosa. Hay que señalar que el EtBr es un compuesto mutagénico y todas las manipulaciones con los geles y tampones que lo contengan deben hacerse con guantes.

Puesto que el EtBr se une en múltiples puntos uniformemente a lo largo de una molécula, cuanto más corta sea ésta menos intensa será la tinción. Así, tras una digestión enzimática, dos o más fragmentos procedentes de uno mayor estarán en cantidades equimolares, pero al ser separados en un gel los fragmentos mayores se tiñen más intensamente. Como la intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de DNA o RNA presente, se pueden hacer cálculos aproximativos por comparación (o más exactos midiendo la intensidad de las bandas por densitometría) sabiendo la cantidad total de ácido nucleico y los tamaños y proporciones relativas de los fragmentos observados.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Materiales y reactivos.

- Tanque de electroforesis horizontal de inmersión. Bandeja y peine de muestras. - Tampón TAE (Tris 40 mM, acetato sódico 20 mM, EDTA 1 mM pH 7,2). - Plásmido TR2 sin digerir y digerido con enzimas de restricción, preparado para cargar en el gel (lleva un tampón de carga con glicerol y azul de bromofenol). - Marcadores de tamaño de DNA: Markers III y Markers VI (Roche) - Bromuro de etidio (10 mg/ml) ¡PRECAUCIÓN! Es un compuesto CANCERIGENO por lo que hay que usar guantes cuando se manipulen los geles. - Transiluminador de luz UV. Sistema de fotografía. 1. Colocar el peine de muestras cerca de uno de los extremos la bandeja del gel y asegurarse que el extremo inferior de los dientes queda a 1-2 mm de la superficie. 2. Cerrar la bandeja en sus extremos con cinta adhesiva y colocar el peine. 3. Pesar la agarosa necesaria para preparar 40 ml de gel. Se harán geles al 0,6%; 0,7%; 0,9%; 1,1%; 1,4 % y 2,0%. Poner dentro de un matraz 40 ml del tampón TAE y añadir la agarosa correspondiente. Fundir utilizando el microondas. 4. Una vez solidificado el gel, retirar con cuidado el peine de las muestras. Quitar la cinta que cierra los extremos del gel y poner la bandeja en el tanque de electroforesis, de forma que los pocillos de las muestras queden más cerca del polo negativo (borne negro). 5. Añadir el tampón TAE hasta que cubra el gel y aplicar 10 μl de cada muestra en un orden predeterminado:

1) Markers III (0.5 μg) 2) Plásmido sin digerir. 3) Plásmido digerido con EcoRV: 5397 pb. 4) Plásmido digerido con Xho I: 2915, 2482 pb. 5) Plásmido digerido con EcoRI (determinar los tamaños de los fragmentos) 6) Markers VI (0,5 μg). Poner la tapa del tanque, conectar a la fuente de alimentación y aplicar un voltaje de 100

voltios durante 1 a 2 horas. Seguir el avance del frente de azul de bromofenol. 6. Teñir los geles en una bandeja de agua a la que se añaden unos 40 μl de bromuro de etidio 10 mg/ml en agitación durante 10 min. Desteñir en agua durante otros 10 min. Hacer una fotografía del gel utilizando un transiluminador de luz UV.

Analizar los resultados, comparándolos con los de los demás grupos. Representar en una gráfica semilogarítmica el tamaño de los fragmentos (en pb o en kpb) frente a la distancia recorrida (en cm), y determinar los tamaños de los fragmentos obtenidos con EcoRI en base a la distancia recorrida. Representar en otra gráfica semilogarítmica las rectas patrón obtenidas para las concentraciones de 0,6%, 1,1% y 2,0% de agarosa.

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Días 11 y 12. DETECCIÓN ESPECÍFICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS. MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN: SOUTHERN Y OTROS. MARCAJE DE SONDAS.

El análisis de la presencia de ácidos nucleicos con secuencias específicas (genes, cDNAs, mRNAs, etc) en una muestra biológica tiene múltiples aplicaciones en Biología Molecular y Celular, Genética, Medicina y otras disciplinas: clonación de genes, búsqueda de genes homólogos, estudio de patrones de expresión, estudios de asociación a fenotipos o enfermedades, u otras posibilidades. Para estudiar estos aspectos se requieren métodos de detección específicos y sensibles. Las sondas de DNA y RNA satisfacen estos requisitos gracias a la ventaja que les confiere una propiedad fundamental de las dobles hélices: mediante la formación de los pares de bases de Watson-Crick entre G-C y A-T o A-U, una cadena puede aparearse exclusivamente con otra de secuencia complementaria.

Las dos cadenas de un dsDNA se mantienen juntas por enlaces de H relativamente débiles que pueden romperse por calentamiento o por exposición a pH extremos o a agentes desnaturalizantes. Si el proceso es invertido con lentitud (descenso de la temperatura, o vuelta a pH neutro), las cadenas complementarias volverán a formar fácilmente las hélices dobles. Este proceso se denomina hibridación o renaturalización, y es consecuencia de la formación de los enlaces de H entre las bases, pudiéndose producir entre cualquiera de dos cadenas simples (DNA/DNA, RNA/RNA o RNA/DNA) siempre y cuando sean complementarias. Así, la capacidad fundamental de una molécula de ácido nucleico de cadena simple para formar una doble hélice solamente con una molécula complementaria a ella, proporciona una técnica valiosa para detectar fragmentos de DNA y RNA. Para ello se usan respectivamente las técnicas de Southern blotting y Northern

blotting. Transferencia Southern o Southern blot.

Hacia 1975 Edwin Southern desarrolló una técnica para transferir fragmentos de DNA desde un gel de agarosa (tras su separación electroforética) a una membrana para su posterior análisis, ya que éste es impracticable en los geles por su fragilidad y la difusión de las bandas. Esta técnica se ha convertido en una herramienta indispensable en Biología Molecular, por ejemplo para clonación de DNA, detección de secuencias en un DNA genómico, cálculo del número de copias de una determinada secuencia, o estudio de RFLPs relacionados con aspectos fenotípicos o estados patológicos.

La transferencia se suele realizar mediante acción capilar, tras la desnaturalización alcalina de los fragmentos. El líquido asociado al gel de agarosa, en el que está el DNA, es arrastrado y excluído del gel y con él los fragmentos de DNA desnaturalizado, que quedan unidos a la membrana. En la práctica, el gel se coloca sobre papel absorbente o una esponja, y sobre la parte superior del gel se adhiere una membrana de nitrocelulosa o nylon; sobre ella se pone a su vez más papel absorbente. El papel o la esponja de debajo del gel se mantiene húmedo con una disolución salina concentrada, que por capilaridad fluye hacia arriba a través del gel, la membrana y las capas superiores de papel absorbente. El DNA es eluído/arrastrado del gel por ese flujo ascendente hasta la membrana situada directamente encima, donde queda retenido: la posición del DNA unido a la

membrana es exactamente la misma que tenía en el gel de agarosa. Los fragmentos no deben ser muy grandes para que la transferencia sea efectiva: tamaños mayores de 15-20 kpb deben ser troceados previamente en el gel mediante tratamiento con radiación UV o ácido. También se puede realizar la transferencia mediante sistemas de vacío, más rápidos que los de capilaridad, o electroforéticamente.

Una vez en la membrana, el DNA se fija a ella mediante calentamiento (80ºC) o aplicación de radiación UV. La unión a las membranas (con carga positiva) de las cadenas de DNA monocatenario ocurre preferentemente a través del esqueleto de azúcar-fosfato (con carga negativa) de la molécula, quedando libres y expuestas las bases nitrogenadas, a las que se pueden unir las bases de secuencias complementarias. Esto permite localizar e identificar una secuencia de interés

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en los fragmentos transferidos, incubando la membrana con una sonda marcada (y desnaturalizada) de secuencia complementaria.

Las regiones de la membrana no ocupadas por el DNA transferido deben bloquearse o saturarse para evitar que la sonda se una inespecíficamente a ellas y produzca señales de fondo con el sistema de detección posterior. Para ello la membrana se prehibrida con una disolución que contiene sustancias de elevada masa molecular, como Ficoll, PVP o BSA, además de abundante DNA heterólogo (bacteriano, timo de ternera, esperma de salmón…). Comparadas con las de nylon, las membranas de nitrocelulosa dan mejor resolución, son más baratas y presentan menos unión inespecífica de la sonda, que además se elimina mejor por lavado. Por su parte, las de nylon tienen más consistencia (las de nitrocelulosa son muy frágiles) y mayor capacidad de unión de DNA, pudiendo ser utilizadas para hibridaciones sucesivas. En general son más usadas las de nylon.

Para la hibridación se usan dos sistemas. En uno, la membrana se introduce en una bolsa de plástico hermética, que contiene una solución de hibridación con la sonda y los agentes bloqueantes inespecíficos, y la temperatura se controla por inmersión en un baño termostatizado. En el otro se usan hornos de hibridación, en los que las membranas se adhieren a la pared de botellas que contienen la solución de hibridación. La rotación de las botellas, dispuestas horizontalmente en el horno, asegura el contacto continuo y uniforme de la solución y la membrana. Una vez producida la hibridación, se ha de proceder a la detección de los fragmentos marcados mediante sistemas radiactivos, luminiscentes, fluorescentes o cromogénicos. Actualmente se usan más los tres últimos, que tienen una sensibilidad similar a los primeros y evitan los inconvenientes de la utilización de radiactividad.

Gracias a la potencia de estos marcajes se puede detectar la presencia de secuencias específicas de DNA dentro de mezclas muy complejas de fragmentos provinientes de genomas complejos, aunque estén en cantidades tan bajas como una copia del gen de interés por genoma o menos de una millonésima parte del total del DNA existente en un gel (< 0,1 pg de DNA en 10 μg de DNA total). Así, una secuencia única de 1000 pb, presente en el genoma humano (1 parte en 3 millones) puede ser detectada por este método.

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Sondas de ácidos nucleicos.

Las sondas (probe en inglés) son moléculas de DNA monocatenario (o bicatenario desnaturalizado) o de RNA, normalmente entre 20 y 1000 nucleótidos de longitud, que se utilizan para detectar por hibridación moléculas de ácidos nucleicos que contienen una secuencia complementaria, revelando así su presencia y posición. Pueden obtenerse por métodos enzimáticos (fragmentos de restricción de cDNAs o genes, PCR,…) o ser sintetizadas químicamente, ya que los sintetizadores de oligonucleótidos permiten obtener secuencias determinadas hasta una longitud de varios cientos.

No es necesario que la sonda contenga toda la secuencia complementaria a la del ácido nucleico diana. Habitualmente las sondas corresponden a sólo una parte de la secuencia diana, y la homología o complementariedad entre ellas puede ser total o parcial, de forma que el grado de homología determina la fuerza de unión. La hibridación es muy dependiente de las condiciones experimentales, y particularmente de la temperatura y de la presencia de agentes desnaturalizantes como la formamida. Además afectan a la eficiencia y especificidad de hibridación la fuerza iónica, viscosidad, longitud del dúplex, pares de bases desapareados y composición en bases.

Tras la hibridación la membrana se lava para eliminar el exceso de sonda y la unida inespecíficamente y así evitar la aparición de señales de fondo. En general, tanto para la mezcla de hibridación como para los lavados posteriores, se usan condiciones de alta astringencia (alta temperatura, baja fuerza iónica) cuando se quiere potenciar la unión más específica de la sonda, y de baja astringencia (baja temperatura, alta fuerza iónica) cuando se quiere favorecer la unión de la sonda a secuencias con menor homología.

Las sondas se pueden marcar con isótopos radiactivos (habitualmente con 32P unido a un nucleótido), o bien con marcajes no radiactivos basados en moléculas específicas de fácil detección acopladas a nucleótidos, como biotina, fluoresceína o digoxigenina. La molécula extra produce directamente una señal (p.e., la fluoresceína u otros fluoróforos) o bien es reconocida por proteínas (la biotina es reconocida por la avidina o la estreptavidina, y la fluoresceína y la digoxigenina se reconocen con anticuerpos específicos), a las que se les ha unido una enzima reporter como la peroxidasa que se acopla a un sistema de detección cromogénico, quimioluminiscente o fluorescente. Las películas de rayos X pueden detectar tanto las señales radiactivas como las luminiscentes, y actualmente se usan más las segundas para evitar los problemas del uso de radiactividad. Respecto a los procedimientos de incorporación de los nucleótidos marcados al DNA, pueden obtenerse sondas marcadas mediante desplazamiento de una mella o rotura en una de las cadenas del dsDNA. El desplazamiento de mella implica la hidrólisis enzimática al azar de un enlace fosfodiéster en una de las cadenas del DNA por la DNasa I. Un segundo enzima, la DNA polimerasa I de E. coli, hidroliza la cadena de nucleótidos desde cada mella con su actividad exonucleolítica 5’-3’, y rellena los huecos con su actividad DNA polimerasa. La reacción de la polimerasa se lleva normalmente a cabo en presencia de un dNTP marcado en posición con 32P o con una molécula detectable, y tres dNTPs no marcados. Otro método utilizado para marcar sondas de DNA es el cebado al azar, que tiene ciertas ventajas respecto al anterior. El uso de cebadores al azar requiere tan sólo 25 ng de DNA, en contraposición a los 1-2 μg usados en el desplazamiento de mella, y produce sondas de mayor longitud con marcajes específicos 10 veces superiores. El dsDNA se desnaturaliza y luego se hibrida con una mezcla de hexanucleótidos al azar, que contienen todas las secuencias posibles. Los

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hexanucleótidos hibridados sirven de cebadores para la síntesis del DNA mediante una DNA polimerasa como el fragmento Klenow de la DNA pol I, en presencia de uno o más dNTPs marcados. Por otra parte, se pueden obtener sondas de RNA marcadas mediante transcripción in vitro de secuencias de DNA. Para ello el DNA molde ha de clonarse en 3’ respecto a un promotor que pueda ser reconocido por una RNA polimerasa apropiada, para lo que existen vectores adecuados. Las sondas de RNA (ribosondas o riboprobes) presentan ventajas e inconvenientes sobre las sondas de DNA. Por una parte, el molde puede estar disponible en cantidad muy limitada, pudiéndose transcribir cantidades relativamente grandes de RNA. Por otra parte, las sondas de dsDNA han de desnaturalizarse antes de la hibridación con el ácido nucleico diana, y la rehibridación consigo mismo compite con esa hibridación. Esta competición no se da con las sondas de RNA, que son de cadena sencilla y sólo hibridan con las moléculas diana complementarias de DNA o RNA. Además aguantan mejor los procesos de lavado en alta astringencia, dando menos ruido de fondo. Los dos inconvenientes más notables son que hay que clonar la sonda en el vector desde el que se transcribe, y que el RNA se degrada mucho más fácilmente que el DNA debido a la presencia de RNasas, provenientes de la propia muestra o del ambiente. Este problema se puede solventar trabajando en condiciones libres de RNasas, mediante esterilización adecuada de los materiales, y usando el agente DEPC y/o inhibidores de RNasas.

Transferencia Northen o Northern blot. Para la comprensión de la regulación génica en relación con los patrones de expresión

celulares, tisulares o de desarrollo, y su regulación por hormonas u otros factores, es fundamental el análisis de la presencia y abundancia de los mRNAs correspondientes en muestras de RNA total, mediante técnicas como el Northern blot, la hibridación sobre microarrays o la RT-PCR (que no veremos aquí).

La transferencia Northern es una variante de la técnica de Southern desarrollada hacia 1977, que permite la detección de los mRNA de una muestra con una sensibilidad semejante a la descrita para el DNA. El método permite la evaluación de la abundancia relativa y la determinación del tamaño de un mRNA en una muestra biológica, así como la identificación de transcritos procedentes de splicing alternativo, y/o la presencia de transcritos de familias multigénicas. Comparado con la detección por RT-PCR, el análisis Northern tiene menor sensibilidad pero mayor especificidad, lo que permite reducir los resultados falsos positivos.

La tecnología de la transferencia y la hibridación Northern son similares a lo descrito para el DNA en la técnica Southern, teniendo en cuenta que el mRNA es de cadena simple, por lo que no es necesario desnaturalizarlo. Así, se prepara el RNA celular total y se separa por tamaño en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes, con la posterior transferencia y fijación a una membrana, la hibridación con la sonda específica marcada, y la detección de los híbridos DNA-RNA.

Los geles se pueden teñir con EtBr antes de la transferencia para observar la cantidad y calidad del RNA. Cuando se separa RNA total, al teñir el gel se ven dos bandas muy prominentes,

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que corresponden a los rRNAs 28 S ( 5 kb) y 18 S ( 2 kb) y constituyen la mayor parte del RNA celular. Cuando el mRNA del gen de interés es de baja expresión, en lugar de usar RNA total se usan preparaciones enriquecidas en mRNAs mediante su purificación por cromatografía de afinidad con oligo(dT) celulosa, que une los RNAs que tienen cola de poli(A), eliminándose de la muestra los rRNAs y los tRNAs. Un problema muy frecuente en los análisis Northern es la degradación de la muestra por RNasas, pero se puede solventar trabajando en condiciones libres de RNasas.

Hibridación sobre micromatrices/microarrays de DNA. Una de las posibilidades de los análisis mediante hibridación de ácidos nucleicos es

determinar, en una población celular o un tejido, exactamente qué genes se trancriben a mRNA y cuáles no. Durante mucho tiempo solamente se pudo estudiar la expresión de los genes de uno en uno mediante análisis Northern, pero las micromatrices o microarrays de DNA permiten que los productos de RNA de muchos genes se estudien al mismo tiempo. Así es posible medir cambios en los niveles de expresión en muchos genes a la vez cuando las células crecen, se dividen o responden a factores externos o internos, gracias a lo cual se pueden estudiar los patrones de expresión génicos complejos que subyacen en la fisiología celular. También pueden ser usadas para procesos como detectar SNPs o splicing alternativos, o caracterizar genomas mutantes. Los datos de microarrays suelen ser consistentes con los obtenidos por Northern, aunque a veces esta técnica permite detectar pequeños cambios en expresión génica que los microarrays no pueden.

Un microarray es un dispositivo tecnológico de carácter múltiple consistente en series ordenadas de miles de puntos microscópicos o spots, cada uno conteniendo picomoles de una secuencia sonda de DNA fijada al sustrato, correspondiente a un gen cuya presencia se quiere medir en una o más muestras. Cada sonda suele ser un fragmento pequeño del gen obtenido a partir de clones de cDNA o genómicos, o bien por PCR o síntesis de oligonucleótidos. Para la preparación de microarrays estándar, las sondas son fijadas a una superficie sólida, habitualmente vidrio o un chip de silicona, mediante unión covalente a una matriz activada químicamente, gracias a tecnologías de impresión, fotolitografía o electroquímica. Aunque se pueden preparar en el laboratorio, hoy en día se suelen usar comerciales, con amplias colecciones de genes para perfiles celulares o tisulares determinados.

Para analizar de forma simultánea la expresión en unas células o tejido a estudiar de los múltiples genes representados en las sondas de un microarray, se hibrida con una muestra diana conteniendo una mezcla de cDNAs, obtenida por copia a partir de los mRNAs de las células que se están estudiando. El cDNA es mucho más fácil de manipular que el RNA original, y en el proceso de copia se marca con un sistema de detección fluorescente o luminiscente. Tras la hibridación en condiciones de alta astringencia la micromatriz se lava para eliminar las moléculas de sonda que no se unieron específicamente.

Finalmente se identifican las posiciones en las que los cDNAs marcados han hibridado con los fragmentos de DNA de la sonda múltiple, mediante el uso de un microscopio que posee un escáner láser automatizado. Mediante la ubicación de las posiciones de la matriz se pueden identificar los genes específicos cuyo cDNA se depositó originalmente en esas localizaciones. La intensidad de la fluorescencia en cada posición o spot se correlaciona con la abundancia del cDNA marcado correspondiente a ese gen en la sonda múltiple, y por tanto con los niveles de su mRNA en la muestra que se analiza. En los experimentos de microarrays son muy importantes aspectos previos y posteriores, como el diseño experimental y los métodos de análisis de los datos, así como varios spots que actúan como controles de hibridación positivos o negativos.

En los microarrays de un canal o un color se obtienen datos de intensidad para cada sonda o grupo de sondas, indicando un nivel relativo de hibridación con la diana marcada. Sin embargo, no

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indican los niveles de abundancia de un gen sino abundancia relativa en comparación con otras muestras o condiciones que se hayan procesado en el mismo experimento. Los procesos de copia, amplificación, marcaje e hibridación generan tanta variabilidad para los distintos mRNAs, que las comparaciones entre distintos genes no son fiables.

Los microarrays de dos canales o dos colores se hibridan con cDNAs preparados a partir de dos muestras a comparar (p.e. tejido enfermo frente a sano), y que son marcados con diferentes fluoróforos. Las dos muestras se mezclan e hibridan a un único microarray, que es escaneado para visualizar la fluorescencia de los dos fluoróforos. Usando los controles adecuados, se pueden analizar las intensidades relativas de cada uno para determinar los genes cuya expresión aumenta y disminuye.

Hibridación in situ. Cuando se extraen de las células tanto los genes como los RNAs se pierde una gran cantidad de información potencial respecto a su ubicación subcelular o a su presencia específica en células determinadas. Por esta razón, se han desarrollado técnicas por medio de las cuales se utilizan sondas para localizar ácidos nucleicos con secuencias específicas mientras están todavía en su lugar original. Este procedimiento se denomina hibridación in situ, y se usa para localizar secuencias de DNA en cromosomas o de mRNA en secciones de tejidos, mediante hibridación con sondas marcadas. La inmunohistoquímica es una técnica complementaria pero distinta, ya que detecta con anticuerpos proteínas específicas en secciones tisulares. Para desarrollar estás técnicas es siempre necesario un equipo de microscopía acoplado a uno de imagen.

La hibridación in situ es la única técnica que permite determinar qué células de una muestra expresan un gen determinado mediante el uso de una sonda específica, por lo que se emplea para revelar la distribución de los patrones de expresión génica en las células que forman tejidos u órganos. Es posible determinar el momento, el nivel y el sitio de expresión de un gen en un tejido a través del análisis de su mRNA en un corte tisular.

En este método el RNA no es extraído de las células ni sometido a separación electroforética. El tejido se fija, se secciona y se monta en

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portas de microscopía. Las proteínas son digeridas con proteinasa K para aumentar la accesibilidad de la sonda marcada hasta el mRNA buscado. La sonda se deja hibridar con la secuencia diana y luego se lava el exceso. Algunas condiciones de la solución de hibridación, como la temperatura o la concentración de sal y/o detergente se pueden manipular para eliminar las uniones inespecíficas y a secuencias con homología parcial. La técnica permite también el uso de dos o más sondas con distintos marcajes, lo que permite la detección simultánea de varios transcritos. Finalmente, los cortes tisulares son analizados mediante los sistemas de detección mencionados, y con ayuda de sistemas de microscopía e imagen. Con este método se lograron grandes avances en el conocimiento de los elementos claves del desarrollo embrionario, al hacer visibles muchos cambios en los patrones de expresión génica que se producen en las células del embrión.

Para el estudio de la estructura de los cromosomas y de la ubicación en ellos de secuencias o genes específicos, se hibridan sondas marcadas con los cromosomas enteros, previamente desnaturalizados por calor o tratamiento químico para separar las dos cadenas del DNA. Cuando el procedimiento se hace con fluorescencia de llama FISH (fluorescent in situ hybridization), que es el más habitual hoy en día. Este tipo de experimento revela la posición de un gen a lo largo de un cromosoma entero (lo que permite trabajar en mapeo génico, deleciones, inserciones, translocaciones, etc), y también se usa para estudiar las estructuras plegadas de los cromosomas y sus posiciones dentro del núcleo y la célula. Se pueden usar simultáneamente sondas marcadas con distintos fluoróforos, lo que permite estudiar simultáneamente la ubicación de varias secuencias diana. Dot blot. Un dot blot es una simplificación aplicable a los métodos de Southern, Northern o Western. En ella las moléculas a detectar no son separadas previamente por electroforesis, sino que la mezcla conteniendo esas moléculas se aplica directamente a la membrana como un punto o dot, tras lo cual se realiza la detección con sondas de nucleótidos (para DNA o RNA) o de anticuerpos (para proteínas). La técnica permite un ahorro de tiempo considerable, ya que se evitan los procesos de electroforesis y transferencia de las moléculas. Sin embargo, no ofrece información sobre el tamaño de la biomolécula detectada, y si se detectan dos o más moléculas de distinto tamaño aparecerán como un único punto. Por esta misma razón hay que optimizar mucho las condiciones de unión de la sonda, para evitar uniones inespecíficas a otros componentes de la muestra que serían imposibles de distinguir de las uniones específicas. Así, los dot blots se usan sólo para confirmar la presencia o ausencia de una o más biomoléculas cuyas condiciones de unión a la sonda ya estén establecidas.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. - Cada grupo debe preparar cinco digestiones con 5-10 μg de cada uno de los siguientes DNA genómicos con 2,5 μl de uno de los enzimas de restricción, en un volumen total de 25 μl. Se incuba toda la noche a 37°C. - DNA genómico de hombre, rata, hámster, Xenopus y Drosophila. - Cortado con Eco RI, Bam HI, Hind III, Pst I, Xho I - Otro grupo prepara digestiones del plásmido pGEM-T/actina con el enzima Eco RI. Se preparan cinco digestiones con 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg y 10 pg del plásmido, con 1 μl del enzima, en un volumen total de 15 μl. Se incuba toda la noche a 37°C. - Cada grupo prepara gel de agarosa al 0,8% en TAE. - A cada muestra se le añade el volumen correspondiente de tampón de carga (5x).

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- Se cargan las muestras en cada gel, incluyendo 10 μl de Markers III en la calle 1. Se corren los geles a 80 V durante dos horas. - Tras correr, los geles se tiñen con EtBr y luego se fotografían con una regla al lado de los marcadores de tamaño. - Tratar los geles con HCl 10 mM durante 10 min en agitación. - Lavar los geles con agua destilada durante 5 min. - Tratar los geles con 500 ml de solución de desnaturalización (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) durante 20 min. Repetir el proceso. - Lavar los geles con agua destilada durante 5 min. - Tratar los geles con 500 ml de solución de neutralización (1,5 M NaCl, 1 M Tris pH 8,0) durante 20 min. Repetir el proceso. - Durante los lavados, cortar una membrana Hybond para cada gel del tamaño de éste. Sumergir unos minutos en agua destilada y luego impregnarlo en SSC (10x). - Cortar 10 piezas de papel Whatman 3MM del tamaño del gel. Impregnar 6 en SSC (10x). - Cortar abundante papel absorbente de un tamaño similar al del gel. - Montar el sistema de transferencia:

Añadir de 0,5 a 1 litro de SSC (10x) a un recipiente abierto y empapar una esponja. Sobre ella colocar 4 piezas de Whatman 3MM empapadas. Encima colocar el gel, evitando la formación de burbujas. Adherir la membrana Hybond sobre el gel y quitar con cuidado las burbujas. Poner encima de la membrana dos piezas de Whatman 3 MM empapadas. Poner encima las otras 4 piezas de Whatman secas y el papel absorbente. Añadir un peso ( 0,5 kg) encima del sistema de transferencia. Dejarlo transfiriendo toda la noche.

- Retirar el papel mojado de encima de las membranas. Marcar en cada membrana la posición de los pocillos del gel con un bolígrafo y hacer alguna marca más para identificación. - Fijar el DNA a la membrana (crosslinking) mediante tratamiento con luz UV. - Meter en una botella de hibridación con mezcla de hibridación y prehibridar a 42°C 1 hora. - Hibridar añadir la sonda de cDNA marcada con biotina e hibridar toda la noche a 42°C.

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