Electroforeza în gel de poliacrilamidă

SCOP

Electroforeza în gel de poliacrilamidă este folosită în special pentru controlul

expresiei proteinelor de interes în bacterii.

DESCRIERE

Pentru aceasta, proba (sau suspensia bacteriana), este dizolvată in

20-50 μl tampon de proba (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 20% glicerol, 2% SDS, 5%

2-β-mercaptoetanol, 0.001% albastru de bromfenol. Proteinele sunt supuse

electroforezei pe un gel de concentra ie de 7.5 -15%. ț

CONDITII PREALABILE

SDS - PAGE SoluţiiSoluţie stoc acrilamidă (30%T 2.7%C))

Acrilamidă 30 gBisacrilamidă 0.8 gSe aduce la 100 ml cu a.d., se filtrează prin 0.2µm, se păstrează la +4

C la întuneric.Tampon de migrare X10 (0.25M Tris, pH 8.3, 1% SDS, 1.92M Glicina)

Tris 30.2 gGlicină 144 gSDS 10 g

Se aduce la 1 l cu a.d., se reglează pH 8.3Se diluează de 10 ori înainte de utilizareTampon pt. denaturare probe (sample buffer - 0.05M Tris, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 2 mM EDTA)

X5 X2Tris/HCl 1M pH 6.8 2.5 ml 1 mlSDS 10% 1 ml 4 mlGlicerol 5 ml 2 mlEDTA 0.1 M 1 ml 0.4 mlAlbastru de bromfenol 0.5 mg 0.2 mgSe aduce la 10 ml cu a.d.

Se păstrează la congelator.Extemporaneu : 450 µl TEX2 + 50 µl/ml 2-β-mercaptoetanol,

Soluţie de colorare (50% metanol, 0.2% Coomassie Blue)Coomassie Blue R250 2 gMetanol 500 mlA.d. 500 ml

Electroforeza in gel de poliacrilamida – pagina 1 din 3

Se dizolvă colorantul în metanol, se adaugă apa. Se păstrează la temp. camerei.Pentru colorare : 45 ml soluţie de colorare + 5 ml acid acetic; se colorează 5-10 min.Soluţie de decolorare I (30% metanol, 7.5% acid acetic)

Metanol 300 mlAcid acetic 75 mlA.d. 625 ml

Soluţie de decolorare II (7.5 % acid acetic)Acid acetic 75 mlA.d. 925 ml

Montarea plăcilor• se curăţă plăcile de sticlă, distan ierele şi plăcile albe cu detergent. Se ț

clătesc bine cu apă şi apoi cu un amestec apă/alcool (1/1). Se terge bine șfiecare placă cu serveţele care nu lasă scame.

• pe suportul pentru geluri se pun :▪ placa de sticlă cu distan iereț▪ placa de sticlă▪ se strânge totul cu cle ti verziș▪ ce montează în suportul de turnare.

Prepararea gelului de migrare

• se toarnă soluţia de gel, preparată conform tabelului, cu paharul, pînă la semn (aprox. 1/3 din placă);

• se toarnă peste fiecare gel câte 250 µl – 1ml apa distilata ca să se asigure orizontalitatea şi polimerizarea gelului;

se lasă să polimerizeze circa 2 ore (sau peste noapte)• se scot gelurile polimerizate, se cură ă de resturile de gel din exterior, se ț

spală cu apă şi se păstrează la frigider în tampon de migrare;

Prepararea gelului de concentrare (stacking)

• se montează placa de gel, spălata şi tearsă bine în aparatul de șelectroforeză

• se pune tampon de migrare 1x în cuva de jos• se prepară gelul de concentrare conform tabelului• se pune repede peste gelul de migrare cu o pipetă automată de 1 ml, pînă la

marginea plăcii de sticlă• se pune pieptenele i se lasă să polimerizeze (aprox. 20 min.)ș• se marchează pozi ia din ilor cu un markerț ț• se scoate pieptenele i se cură ă fiecare godeu cu hârtie de filtruș ț• se toarnă tampon în cuva • se depun probele

Migrare• Se închide cuva de electroforeză• Se face legătura la generator

Electroforeza in gel de poliacrilamida – pagina 2 din 3

• Se fixează parametrii : 20 mA per placă (voltaj max.; 250 V• Se dă drumul la migrare cca. 2 ore• Se opre te generatorulș• Se scot cle tiiș• Se pune placa pe hârtie de filtru, se scot distan ierele (dacă sunt separate) , ț

se desfac plăcile cu o spatulă, se ia gelul de migrare şi se pune la colorat 5-10 min.

• se aruncă solu ia de colorat, se spală gelul cu apă şi se pune solu ia de ț țdecolorare I; dacă gelul se păstrează mai multă vreme, se folose te solu ie ș țde decolorare II.

Pregătire probe • Se ia volumul de probă care con ine cantitatea dorită de proteină (30 - 40 µgț

per godeu) dat nu mai mult 10 µg pe bandă• Dacă concentra ia este suficienta se adaugă direct tamponul de proba, dacă ț

nu se fac pa ii următoriș▪ se diluează la 1 ml cu a.d.▪ se adaugă 50 µl solu ie 0.15% deoxicolat de Na; se incubează 15 min ț

la temp. camerei.▪ se adaugă 50 µl solu ie 72% TCA; se incubează 10 min la temp. ț

camerei.▪ se centrifugă 10 min la 10 000 g.▪ se înlătură supernatantul şi se spală de 2 ori cu 0,5 ml acetonă rece

(centrifugare cîte 5 min la 10 000 g).• Se dizolvă pp. în tampon de probă 2X sau 5X (cu 100 mM DTT sau 5%

2-β-mercaptoetanol).• Se fierb probele 5 min.

Inportant• Spălarea cu acetonă trebuie făcută cu grijă. Altfel probele pot fi prea acide.• Cantitatea de proteină nu trebuie să fie prea mare. Cantităţile mari nu mai

pot fi diluate în tampon de probă.

Electroforeza in gel de poliacrilamida – pagina 3 din 3

% 7.50% 7.50% 7.50% 7.50% 7.50% 7.50% % 15.00% 15.00% 15.00% 15.00% 15.00% 15.00%

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50

1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00

H2O 2.42 4.85 7.27 9.69 12.11 14.54 H2O 1.17 2.35 3.52 4.69 5.86 7.0450 100 150 200 250 300 50 100 150 200 250 30025 50 75 100 125 150 25 50 75 100 125 1502.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0

TOTAL 5 10 15 20 25 30 TOTAL 5 10 15 20 25 30

% 10.00% 10.00% 10.00% 10.00% 10.00% 10.00% % 17.50% 17.50% 17.50% 17.50% 17.50% 17.50%1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50

1.67 3.33 5.00 6.67 8.33 10.00 2.92 5.83 8.75 11.67 14.58 17.50H2O 2.01 4.01 6.02 8.02 10.03 12.04 H2O 0.76 1.51 2.27 3.02 3.78 4.54

50 100 150 200 250 300 50 100 150 200 250 30025 50 75 100 125 150 25 50 75 100 125 1502.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0

TOTAL 5 10 15 20 25 30 TOTAL 5 10 15 20 25 30

% 12.50% 12.50% 12.50% 12.50% 12.50% 12.50% % 20.00% 20.00% 20.00% 20.00% 20.00% 20.00%1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50

2.08 4.17 6.25 8.33 10.42 12.50 3.33 6.67 10.00 13.33 16.67 20.00

H2O 1.59 3.18 4.77 6.36 7.95 9.54 H2O 0.34 0.68 1.02 1.36 1.70 2.0450 100 150 200 250 300 50 100 150 200 250 30025 50 75 100 125 150 25 50 75 100 125 1502.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0

TOTAL 5 10 15 20 25 30 TOTAL 5 10 15 20 25 30

Concentraţia reactivilor pentru SDS-PAGE – gel separare (Tampoane standard)

Numarul de geluri Numarul de geluri

1.5M TrisHCl pH 8.8 1.5M TrisHCl pH 8.8

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

10% SDS (µl) 10% SDS (µl)10% APS (µl) 10% APS (µl)TEMED (µl) TEMED (µl)

Numarul de geluri Numarul de geluri

1.5M TrisHCl pH 8.8 1.5M TrisHCl pH 8.8

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

10% SDS (µl) 10% SDS (µl)10% APS (µl) 10% APS (µl)TEMED (µl) TEMED (µl)

Numarul de geluri Numarul de geluri

1.5M TrisHCl pH 8.8 1.5M TrisHCl pH 8.8

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

10% SDS (µl) 10% SDS (µl)10% APS (µl) 10% APS (µl)TEMED (µl) TEMED (µl)

* Zonele gri sunt iniţiatorii de polimerizare Se adaugă după amestecarea completa a celorlalţi reactivi* Înainte iniţierii polimerizării amestecul pate fi degazat

% 3.00% 3.00% 3.00% 3.00% 3.00% 3.00%

1 2 3 4 5 6

0.75 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

0.30 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20H2O 1.90 2.54 3.80 5.07 6.34 7.61

30 40 60 80 100 120

15 20 30 40 50 603 4 6 8 10 12

TOTAL 3 4 6 8 10 12

% 4.00% 4.00% 4.00% 4.00% 4.00% 4.00%1 2 3 4 5 6

0.75 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

0.40 0.53 0.80 1.07 1.33 1.60H2O 1.80 2.40 3.60 4.81 6.01 7.21

30 40 60 80 100 120

15 20 30 40 50 603 4 6 8 10 12

TOTAL 3 4 6 8 10 12

% 5.00% 5.00% 5.00% 5.00% 5.00% 5.00%1 2 3 4 5 6

0.75 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

0.50 0.67 1.00 1.33 1.67 2.00

H2O 1.70 2.27 3.40 4.54 5.67 6.8130 40 60 80 100 12015 20 30 40 50 60

3 4 6 8 10 12TOTAL 3 4 6 8 10 12

Concentraţia reactivilor pentru SDS-PAGE – gel concentrare (Tampoane standard)

Numărul de geluri

0.5M TrisHCl pH 6.8

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

10% SDS (µl)10% APS (µl)TEMED (µl)

Numărul de geluri

0.5M TrisHCl pH 6.8

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

10% SDS (µl)10% APS (µl)TEMED (µl)

Numărul de geluri

0.5M TrisHCl pH 6.8

30% Acrilamida 0.8% bis acrilamida

10% SDS (µl)10% APS (µl)TEMED (µl)

* Zonele gri sunt iniţiatorii de polimerizare Se adaugă după amestecarea completa a celorlalţi reactivi* Înainte iniţierii polimerizării amestecul pate fi degazat

Loc pentru note

Electroforeza în gel de poliacrilamidă

ACTORI

Soluţie stoc acrilamidă (30%T 2.7%C))

Acrilamidă (C3H5NO) Policrilamidă

Bisacrilamidă

TEMED (Tetrametil etilen diamina)

APS (persulfat de amoniu)

Tampon de migrare X10 (0.25M Tris, pH 8.3, 1% SDS, 1.92M Glicina)

Tris (Tris – hidroxi amino etan)

Glicină

SDS Sodium dodecyl sulfate