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Elementi trasponibili
Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all’altro del cromosoma
Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c’è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore
sito donatore sito accettore
GATCACTAGT
sito bersaglio
ripetizioni dirette del sito bersaglio
GATCACTAGT
GATCACTAGT
Gli elementi IS
Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione.
Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi
TrasposasiIR IR
IS2, IS3, IS4, IS5
InsAIR IR
InsB
768 bp
IS1210 bp 273 bp E.coli 3-12
Shigella 30-40Serratia 2{
lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bplunghezza media IR: 10-25 bp
altri geniIR IR IR IR
sequenza IS sequenza IS
Trasposoni composti
trasposone lunghezza modulo marcatori genetici(bp) terminale
Tn3 4957 AmpTn501 8200 HgTn951 16500 Utilizzazione lattosioTn5 5700 IS50 KcTn9 2500 IS1 CmTn10 9300 IS10 TetTn1681 2061 IS1 Enterotossina stabile
al calore
IS
trasposizione in un sito adiacente
Origine dei trasposoni composti
IS
1 o più geni batterici
GGGTTTCCAAA CCCAAAGGTTT
GGGTTTCCAA AC CCAAAGGTTT
Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito bersaglio di un
trasposone
La trasposasi induce tagli sfalsati nel sito bersaglio
Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito bersaglio di un
trasposone
G GGTTTCCAA GGTTTCCAA AC CCAAAGGTT CCAAAGGTT T
inserzione del trasposone
riempimento delle interruzioni
GGGTTTCCAA AC CCAAAGGTTT
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Inattivazione del gene bersaglio
promotore DNA
mRNA
proteina
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Inattivazione del gene bersaglio
promotore DNA
mRNA
proteina assente o tronca
gene 1P gene 2 gene 3
mRNApolicistronico
P
Nel caso di trasposizione in un operone si osserva un effetto “polare”
Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto la trascrizione è bloccata dall’ elemento trasponibile
Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni
Attivazione di geni silenti
promotoredebole
DNA
gene non trascritto o scarsamente trascritto
gene altamente trascritto
promotoreforte
Elementi trasponibili hanno spesso promotori direzionati verso l’esterno
I trasposoni svolgono un ruolo importante nel movimento dei geni per la resistenza agli antibiotici e altri geni da un genoma a un plasmide e viceversa
L’odissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella
promotoredebole
Il ceppo iniziale di Klebsiella era poco resistente ai beta-lattamici poichè il gene ampC era scarsamente trascritto
ampC
Il gene ampC di K. pneumoniae codifica per una -lattamasi
L’odissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella
ampC
Sotto la selezione degli antibiotici il gene ampC ha acquisito due sequenze IS con il risultato di essere maggiormente trascritto conferendo un livello di resistenza clinicamente significativo
promotoreforte
IS IS
Il risultante trasposone è stato capace di muovere ampC in un plasmide coniugativo, oggi diffuso a molti ceppi di Klebsiella
Quello che un tempo era un gene di resistenza clinicamente irrilevante è diventato il terrore degli ospedali – tutto grazie alle IS
X
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
delezione
X
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
inversione
a d
a
d
a d
b c
b
c
c b
Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni
fusione di repliconi
formazione del cointegrato
sequenza ripetuta invertita di 38 bp
tnpA
trasposasi
tnpR bla
resolvasi b-lattamasi
sito di risoluzione delcointegrato
il trasposone Tn3
Un virus trasponibile: il batteriofago Mu
E’ un virus temperato
In seguito ad infezione, il suo DNA si integra in siti distribuiti casualmente sul cromosoma
Tra i batteri lisogeni si osservano mutanti dovuti all’inattivazione per integrazione del profago
Si replica mediante trasposizione (una nuova copia del DNA virale è inserita in un punto diverso del cromosoma batterico)
Come i trasposoni è in grado di promuovere riarrangiamenti del materiale genetico (delezioni, inversioni, fusione di repliconi ecc.)
A Bc
immunità
integrazionereplicazione
geni della testa e della coda
regione Ginvertibile
La mappa genetica del fago Mu
C
Il plasmide di resistenza R1
IS3
IS3
IS2
inc, reporiT
A
L
E
B
C
F
HG
S D I
F
J
K
94 Kb
Gli elementi trasponibili sono responsabili dell’integrazione del fattore F
L’adattamento dei batteri
Strategie di adattamento
mutazione regolazione dell’espressione genica
regolazione della trascrizione
regolazione della traduzione
regolazione post-traduzionale
trasferimento genicoorizzontale
T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T96
regione -35 regione -10
RNA polimerasi e inizio della trascrizione
RNA polimerasi
Complesso proteico di 480.000 D costituito da 5 subunità:2’
Nucleo enzimatico Fattore sigma
Il nucleo enzimatico ha la capacità di sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non è in grado di iniziare la trascrizione al sito corretto.Il fattore sigma è responsabile del corretto riconoscimento del promotore. Viene rilasciato appena inizia la trascrizione.
2’
Fattori sigma alternativi e regolazione globale dell’espressione
genica
Subunità sigma Geni trascrittiSegnalein E. coli
s 70 maggior parte dei geni
s 32 geni heat-shock temperatura elevata
s 55 geni regolati dall’azoto carenza di
ammonio
s 38 geni da stress ossidativi agente ossidanteOgni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.
La sporulazione in Bacillus subtilis e i fattori sigma
alternativiLa sporulazione rappresenta un drastico cambiamento dello stile di vita del batterio
La transizione da una fase all’altra si realizza attraverso cambiamenti globali dell’espressione genica mediati da fattori sigma alternativi
Subunità sigma Geni trascritti
s 43 fase vegetativa
s 32 inizio sporulazione
s 29 inizio sporulazione (fase II)
gp28 sporulazione intermedia
gp33-34 fasi finali della sporulazione
regione ricca in GC
serie di U
Terminazione Rho-indipendente
5’-A-A-A-G-C-C-G-C-C-G-N-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-G-C-U-U-U-U-U-U-U-3’
la polimerasi continua la trascrizione
terminatore
la polimerasi termina la trascrizione
Terminazione Rho-dipendente
L’operone lac
Z Y AO
lacZ: -galattosidasilacY: -galattoside permeasilacA: -galattoside transacetilasi
Geni strutturali
mRNA policistronicoregolazione coordinata: tutti i geni si esprimono all’unisono
P
Il gene regolatore lacI codifica per la proteina regolatrice (repressore)
I
mRNA
DNA
proteine
Induzione: sintesi di enzimi in risposta alla comparsa di un substrato specifico
Cellule di E. coli, in assenza di lattosio, contengono poche molecole di -galattosidasi (<5)
lattosio
glucosio galattosio
In presenza di lattosio , nel giro di pochi minuti, vengono sintetizzate fino a 5000 molecole di -galattosidasi (5-10% delle proteine totali)La molecola che causa la produzione dell’enzima capace di metabolizzarla è chiamata induttore
La capacità di agire da induttore è altamente specifica. Molecole strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della -galattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa caratteristica è chiamata induttore gratuito (IPTG) Se l’induttore è rimosso la sintesi degli enzimi si blocca
Z Y AOPI
Il repressore previene la trascrizione legandosi a una sequenza di DNA chiamata operatore.
repressore
RNApolimerasi
L’operone lac è sottoposto a regolazione negativa
In presenza della proteina regolatrice è bloccata la trascrizione dei geni strutturali. La proteina regolatrice prende il nome di repressore
In che modo l’operone lac risponde all’induttore?
Z Y AOPI
induttore
Il repressore ha due siti di legame: un sito per il legame all’operatore e il secondo per il legame dell’induttore
Quando il repressore lega l’induttore subisce una modificazione conformazionale che porta ad una diminuita affinità per il sito operatore (esempio di controllo allosterico)
Z Y AOPI
repressore
Mutazioni a carico dell’operatore
Mutazioni nel gene O (Oc) portano all’espressione costitutiva dei geni strutturali: vengono trascritti in assenza dell’induttoreCostitutivi sono gli enzimi il cui livello è costante in tutte le condizioni di crescita
Mutazioni nel gene I (Ic), a carico del sito di riconoscimento dell’operatore, portano all’espressione costitutiva dei geni strutturali
Z Y AOPI
Mutazioni a carico del repressore
repressore
Mutazioni nel gene I (IS), a carico del sito di riconoscimento dell’induttore, sono responsabili della super-repressione: i geni strutturali non vengono più indotti in presenza dell’induttore
Z Y AOPI
Mutazioni a carico del repressore
repressore
induttore
Un altro sistema di regolazione negativa:la tossina di Corynebacterium diphtheriae
La tossina viene prodotta quando il livello di ferro nella gola è basso
geni per la tossinaOP
gene regolatore
repressore
trascrizione e produzione della tossina
repressore ferro
La molecola effettrice (il ferro) non è un induttore bensì un co-repressore
Un sistema in cui la molecola effettrice coopera con il repressore per bloccare la trascrizione è definito reprimibile
B151
La regolazione positiva dell’espressione genica
Nel controllo positivo, la proteina regolatrice promuove il legame della RNA-polimerasi al promotore
RNApolimerasiattivatore
gene1 gene2 gene3
gene regolatore
P
“activator binding site”
induttoreinduttore
L’attivatore non si lega al DNA in assenza dell’induttore
trascrizione
P
P
ABS
ABS
trascrizione
P
ABS
P = promotoreABS = activator binding site
Il regulone
Il regulone è l’insieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway
Il regulone del maltosio è sotto controllo positivo
gene1 gene2 gene3
gene regolatore
P
“activator binding site”
maltosioattivatore +maltosio
Gene o operonelocalizzazionearg A 60 minarg B-C-E-H 88 minarg D 72.5 minarg F 6 minarg G 68 min
Il regulone per la biosintesi dell’arginina
Esempio di regulone sottoposto a controllo negativo: tutti i geni per la catena biosintetica dell’arginina sono regolati da un repressore
Sistemi di controllo globale dell’espressione genica
Un batterio può regolare molti geni diversi simultaneamente in risposta a cambiamenti ambientali. Spesso più operoni o reguloni diversi possono essere attivati o disattivati
Il regulone è l’insieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway
Se geni e operoni appartengono a pathway differenti si parla di moduloni
ESEMPI: regolazione mediante fattori sigma alternativirisposta SOSrepressione da catabolita
Fattori sigma alternativi e regolazione globale dell’espressione
genica
Subunità sigma Geni trascrittiSegnalein E. coli
s 70 maggior parte dei geni
s 32 geni heat-shock temperatura elevata
s 55 geni regolati dall’azoto carenza di
ammonio
s 38 geni da stress ossidativi agente ossidanteOgni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.
Repressione da catabolita
Quando un batterio cresce in un mezzo contenente glucosio come risorsa di energia, la sintesi di enzimi catabolici non correlati viene inibita
In presenza di diverse fonti di energia, il batterio sceglie per prima quella più facilmente utilizzabile
Gli enzimi per il catabolismo del glucosio sono costitutivi
Circa 300 geni di E. coli sono regolati mediante repressione da catabolita
La crescita diauxica
0 1 2 3 4
Tempo (ore)
esaurimento del glucosio
induzione galattosidasi
utili
zzaz
ione
del g
luco
sio
utilizz
azione
del lat
tosio
Densi
tà b
att
eri
ca
Crescita in un terreno contenente glucosio e lattosio
il glucosio inibisce la sintesi di -galattosidasi
durante la fase di latenza viene espresso l’operone lac e sintetizzata -galattosidasiIl tasso di crescita può variare
H
OH
O Adenina
OHH
O
CH2
H
O
HO-P=O
ATP
Adenilato ciclasi
AMP ciclico
Il glucosio inibisce l’attività dell’adenilato ciclasi e il livello di cAMP
La molecola effettrice della repressione da catabolita è AMP ciclico
Z Y AOPI
CAP binding site
cAMP
CAP CAP attiva
Ognuno degli operoni che CAP controlla è anche sotto il controllo di una proteina regolatrice
specifica
L’operone lac è regolato positivamente da CAP
L’attenuazione della trascrizione
OPtrpRtrpDtrpE trpC trpB trpB
L’operone triptofano
L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpR
Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione
repressoreinattivo
triptofano
repressoreattivo
L’attenuazione della trascrizione
OPtrpRtrpDtrpE trpC trpB trpB
L’operone triptofano
peptide leader (14AA) attenuatore
1 2 3 4
codoni trp
leader
162 nt
mRNA
1 2 3 4
1 2 3 4
UUUUUUU
1
2 3
4
Attenuatore(terminatore della
trascrizione)
mRNA
Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, quest’ultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi
1 2 3 4 mRNA
peptide leader
AUG UGA
Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli l’appaiamento con il segmento 3
3 4
1 2AUG UGA
2 3
La polimerasi continua
2
34
La polimerasi terminala trascrizione
2
34
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi
1 2 3 4 mRNA
peptide leader
AUG UGA
Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento 3
2 3
41AUG UGA
Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica.
Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dell’attenuatore.
La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operani insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte.
Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi
Prescott pag. 262
Rbs = “ribosome binding site” (Shine-Dalgarno) 5’-AGGAGG-3’
Regolazione traduzionale
Operone per le tossine batteriche
Due geni di un singolo operone possono essere tradotti in quantità diverse
La proteina A entra nella cellula e provoca il dannoLa proteina B si lega al bersaglio (cellula umana)
Regolazione post-trascrizionale mediante RNA antisenso
L’RNA antisenso ha una sequenza complementare a una molecola di mRNA.
Il legame dell’RNA antisenso può bloccare la traduzione dell’ mRNA.
sok
Sistema host cell killing del plasmide R1
hok mRNA: emivita 20 min
sok mRNA: emivita < 1-2 min
128 bp
SDhok
Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso numero di copie assicura il mantenimento del plasmide all’interno di una popolazione batterica
OmpR
mRNA per OmpF
EnvZOmpF
sintesi di OmpC
micF RNA174 b
OmpC
La risposta all’osmolarità in E. coli
Regolazione post-traduzionale
Un enzima della catena può legare il prodotto finale che funziona da inibitore
Se il prodotto finale viene sintetizzato in eccesso o se diventa disponibile nell’ambiente, non è più conveniente per il batterio continuare a sintetizzarlo
Controllo tipico della via biosintetica degli amminoacidi
modificazione allosterica
Questo tipo di controllo è anche definito inibizione a feedback
