Les éléments mobiles sont des fragments d’ADN insérés dans le génome d’un organisme hôte, qui ont la propriété de se déplacer d’un point à un autre du génome: on dit « de transposer » à l’intérieur de la même cellule.

On peut les classer en deux groupes chez les bactéries :

- les transposons

- les plasmides

Eléments génétiques mobiles

Les plasmides

Molécules d'ADN circulaire

� Extrachromosomiques

� Réplication autonome

� Transmis de façon stable au cours des divisions cellulaires

� Non indispensables à la bactérie-hôte

� Confèrent à la bactérie-hôte une grande souplesse génétique

� Présents chez la plupart des espèces bactériennes

� Très différents les uns des autres

� Taille variable entre 1 à 400 kb

Les plasmides : caractéristiques générales

Association modulaire de gènes regroupés en unités fonctionnelles.� Les gènes impliqués dans la réplication

• Un plasmide est un réplicon, il possède donc un système de réplication autonome, lui permettant de se maintenir à un taux constant dans les cellules au cours des divisions successives.

• Ce système de régulation est à l'origine du phénomène d'incompatibilité et du contrôle du nombre de copies plasmidiques dans la cellule bactérienne.

• Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la même cellule,car leur réplication est soumise au même système de régulation.

• Les plasmides sont ainsi classés en groupe d'incompatibilité ou groupe Inc.

• Des plasmides appartenant au même groupe d'incompatibilité présentent de fortes homologies ADN/ADN et sont fortement apparentés structuralement.

Propriétés des plasmides

� Les gènes de transfert : les plasmides conjugatifs• Un plasmide conjugatif : plasmide autotransférable d'une bactérie à une

autre par conjugaison.• Taille > 30 kb chez Escherichia coli 90 kb - 30 à 50 kb gènes tra.• Nombre de copies faible : 1 à 3 par cellule.• L'ensemble des gènes nécessaires à la conjugaison chez F sont organisés

en opéron : l'opéron tra.• Codent pour :

les pili sexuelsles protéines nécessaires à la conjugaison

• Transfert :Interspécifique, intragénérique, « hétérogrammique »

• Conséquence : rôle très important dans la dissémination de l'information génétique.

Propriétés des plasmides

Les plasmides non conjugatifs : non autotransférables

Taille plus petite : 1 à 70 kb

Souvent cryptiques

Contrôle relâché de la réplication : nombre de copies > 10

Mais il peuvent être transférés à une autre bactérie par :

• transduction

• mobilisation

Plasmides non conjugatifs

Les gènes impliqués dans la réplication

oriR

rep

Plasmide

oriRoriR : origine de réplication: origine de réplication reprep : gènes de réplication: gènes de réplication

Les gènes de transfert : les plasmides conjugatifs

oriRoriR : origine de réplication: origine de réplication reprep : gènes de réplication: gènes de réplication opéronopéron tratra : opéron des gènes de transfert: opéron des gènes de transfert

oriR

rep

Plasmideconjugatif

opéron tra

oriR

Les gènes conférant des propriétés nouvellesaux bactéries

oriRoriR : origine de réplication: origine de réplication reprep : gènes de réplication: gènes de réplication opéronopéron tratra : opéron des gènes de transfert: opéron des gènes de transfert

Plasmide R

conjugatif

gène(s)de résistance

ou de virulence

opéron tra

rep

Les gènes de résistance aux antibiotiques

Les plasmides de résistance aux antibiotiques ou plasmides R, découverts dans les années 1950.

Plasmides retrouvés dans toutes les espèces bactériennes, à l'exception deStreptococcus pneumoniae.

C'est de loin le support génétique le plus fréquent de la résistance aux antibiotiques.La résistance plasmidique concerne la quasi-totalité des antibiotiquesLa résistance est liée à la synthèse de protéines nouvelles et non à une modification

des constituants bactériens normaux(mutation chromosomique) :

. altération de la cible de l'antibiotique (sulfamides)

. modification du transport de l'antibiotique (tétracycline)

. inactivation de l'antibiotique (ß-lactamines, aminosides)

. substitution de la cible de l'antibiotique (macrolides)

Les gènes conférant des propriétés nouvelles aux bactéries

Genres ou espèces bactériennes portant des plasmides de résistance aux antibiotiques

Bactéries à Gram négatif EnterobacteriaecaePseudomonasAeromonasVibrioHaemophilusAcinetobacterBordetellaPasteurellaYersiniaCampylobacterBacteroidesNeisseria gonorrhoeaeNeisseria meningitidis

Bactéries à Gram positif

ActinomycesBacillusClostridiumListeriaStreptococcus sp.Enterococcus sp.Lactococcus sp.Staphylococcus sp.Lactococcus sp.Staphylococcus sp.

Les gènes de virulence- Etudiés surtout chez les entérobactéries (Escherichia coli, Shigella, Yersinia,

Salmonella), mais également chez des bactéries à Gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis).

- Plasmides de grande taille : > 200 kb.Exemples :

Le plasmide de virulence de Shigella code pour les protéines permettant à la bactérie de se multiplier dans les cellules de la muqueuse digestive.Certaines hémolysines sont localisées sur des plasmides.Toxine LT ou ST chez E. coli entérotoxinogène.Facteurs d'adhésion.

Les gènes conférant des propriétés nouvelles aux bactéries

Ce sont des facteurs non indispensables à la vie de la bactérie.Cause d'erreur pour l'identification des souches.Sont d'un grand intérêt sur le plan biotechnologique, car peuvent

dégrader des produits chimiques.

Les gènes conférant des propriétés nouvelles aux bactéries

Les gènes métaboliques

Les transposons

� Séquence d'ADN capable de promouvoir leur translocation

- d'un réplicon sur un autre : transposition intermoléculaire

- sur le même réplicon : transposition intramoléculaire

La transposition

- Séquences d'ADN capables de changer de localisation dans le génome sans jamais apparaître à l'état libre

- Les transposons ne peuvent se répliquer mais codent pour les déterminants de la transposition et ceux d'autres fonctions (résistance aux antibiotiques)

- La transposition: mécanisme d'évolution rapide consistant dans l'addition pure et simple de gènes (ADN) de taille définie au sein d'un génome (chromosome / plasmide) et en l'absence d'homologie de séquence nucléotidique (recombinaison illégitime).

Définition des transposons

- Première évocation de gènes mobiles venue d'expériences de génétique chez le maïs (Mcclintock 1951).

- Lors de caractérisation des plasmides, il a été observé d'étranges recombinaisons de gènes de résistance aux antibiotiques:

Découverte des séquences IS (insertion sequences) en 1968 dans l’opéron galde E. coli, puis d’un transposon poteur de la résistance à l’ampicilline chez P.aeruginosa en 1971.Le gène amp, s'accompagnait du même accroissement de taille du plasmide receveur, preuve directe d'une addition de matériel génétique (10 kb)(1974).

Découverte des transposons chez les bactéries

Caractéristiques générales

- Événement rare (10-5 à 10-6).

- Absence d'homologie entre les ADN interagissant.

- Indépendante des fonctions de recombinaison de la bactérie-hôte (protéine RecA).

- Peut théoriquement s'intégrer n'importe où. Cependant certaines régions riches en A+T, entraînant une certaine conformation de l'ADN-cible, constituent des points chauds d'insertion.

- Multicopies dans certaines bactéries: exemple: 5-10 copies de IS1 dans E coli, 40 copies dans Salmonella.

La transposition

Transposition

TnTnTn

Tn

P1

P2

Chromosome

Classification- Les séquences d'insertion.

- Les transposons composites.

- La famille Tn3.

- Les transposons conjugatifs.

Les transposons

tnp

IR IRIS

Séquences d'insertion

IS : séquence d'insertionIR : séquence inversée répétéetnp: transposase (endonucléase spécifique + intégrase)

- Éléments transposables les plus simples, très répandus chez les bactéries à Gram négatif (entérobactéries)

- Plusieurs copies intégrées dans le chromosome ou dans un plasmide.

- Structure moléculaire: taille ( 700 et 5700 bp). Flanquées de 2 séquences inversées répétées plus ou moins parfaites (IR), indispensables pour la transposition et affines de facteurs de transposition.

- La longueur de la séquence cible génomique est variable d’une IS à l’autre, pas de séquence consensus.

?+

( )

( )?

+

Tn

?

ADN Cible

Tn

tnpA tnpR bla

SRIIR IR

Transposons de type Tn3

IR : séquence inversée répétée et tnpA, gène codant pour la transposase

tnpR : gène codant pour la résolvase SRI: site de résolution interne

bla : gène de résistance aux ß-lactamines

Très nombreux chez les bactéries :

- à Gram négatif : Tn3 (4.9 kb, ApR), Tn4 (20 kb, ApR, SmR, SuR), Tn1721 (10 kb,TcR)

- à Gram positif: Tn551 (5.3 kb, EmR), Tn917 (5.2 kb, EmR)

Tnp

IR IRIS

tnp

IR IRIS

Transposons composites

IS : séquence d'insertionIR : séquence inversée répétéetnp : transposase

Fragment d'ADN :gène de résistance aux antibiotiques, gène de virulence,gène métabolique

Très nombreux chez les bactéries à Gram négatif :. Tn5 (5,7 kb, KmR). Tn9 (2,6 kb, CmR). Tn10 (9,3 kb, TcR)

cat chloramphénicoltet tétracyclineKm kanamycine

Insertions- dans une phase codante : interruption de la phase, polypeptide tronqué.

- en amont d'un gène dans une zone régulatrice : dérégulation •soit transcription inhibée (éloignement entre promoteur et séquences

activatrices ou destruction de ces dernières, •soit transcription activée (promoteur propre faible, remplacé par un

promoteur fort présent à l'intérieur du transposon); ceci peut conduire à l'induction ectopique (ectopique = autre lieu) de la transcription (dérégulation spatio-temporelle).

Inversions ou délétions

affectant les portions de génome situées entre deux éléments transposables :

•dans la même orientation : délétion •en orientation opposée : inversion

Types de mutations causées par les transposons

Transposons conjugatifs

fonction tra+ tetM xis-Tn int-tn

xis-Tn : gène codant pour l'excisionaseint-Tn : gène codant pour l'intégrasetetM : gène codant pour la résistancefonction tra+ : gènes nécessaires au transfert

Détectés chez les bactéries à Gram positif :

. Tn916 (E. faecalis, 16 kb, TcR)

. Tn1545 (S. pneumoniae, 25 kb, KmR, EmR, TcR

Tn1545 et transposons apparentés

Tn91618 kb Tra+

Hc Hc Hc Hc Hc

2324 22 21 20 19 17 16 15 14 13 6 9 7 int-Tnxis-TntetM18 812

Hc

oriT10

Tn154525,3 kb Tra+

Hc Hc Hc Hc Hc

6 9 7 int-Tnxis-TntetM 812

Hc

10ermAMaphA

Mobilités intra- et intercellulaire de Tn1545 et des éléments apparentés

Chromosome

Plasmide

Intégration(Int)

Excision(Xis +Int) Intégration

(Int)

D o n a tric e R é c e p tr ic ex

Transfert(tra)

Tn1545

Spectre d'hôte des transposons conjugatifs

Bacillus spp.Clostridium spp.Enterococcus spp.Lactococcus spp.Listeria spp.Staphylococcus spp.Streptococcus spp.

Escherichia coliPseudomonas fluorescens

potentiel donneur de Tn916

- Les transposons constituent un génome collectif ou un patrimoine génétique commun, dans lequel puissent les bactéries en fonction de leur nécessité d'adaptation ou de la pression de sélection

- Ces éléments sont la preuve du "génie génétique in vivo : Création de mutations nouvelles, de recombinaisons, de réarrangements des génomes. Ils contribuent au polymorphisme.

- Mutations: modulation de l'expression d'un gène.- Réarrangements: insertion, inversions, délétions…

Rôle et intérêt des transposons

Modes de transposition

• par l’intermédiaire d’une coupure simple brin (transposon procaryotes: Mu, Tn3). Les extrémités 3’OH libérées peuvent servir d’amorce à la réplication. Une réplication semi-conservative a lieu pendant la transposition (cf l’exemple de Tn3).

Excision de l’élément transposable •parfaite : par recombinaison entre les séquences cibles (qui sont en orientation directe), restauration de la séquence sauvage, avec une seule séquence cible. •imparfaite : par recombinaison sur les LTRs (ex: Ty), une LTR reste au site d'insertion entre deux séquences cibles qu'on appelle LTR solo. •imparfaite : par cassure double brin et réparation imparfaite (ex: élément P), délétion de matériel génomique de part et d'autre du point d'insertion •réarrangement : addition de matériel génomique inconnu

Recombinaison •entre 2 éléments situés sur des chromosomes non homologues : translocation

•entre 2 éléments non alléliques mais situés sur des chromosomes homologues : translocation.

Conversion géniqueModification de la séquence d'un élément transposable par copie de la séquence d'un autre élément transposable du même type situé ailleurs dans le génome.

Extraction et purification de l'ADN plasmidiqueMini préparation par la méthode de la lyse alcaline.

- Lyse des bactéries.- Dénaturation de l'ADN par action combinée de la soude et du SDS.- Renaturation de l'ADN plasmidique et précipitation de l'ADN

chromosomique.

Ultracentrifugation en chlorure de césium bromure d'éthidium.

Analyse du contenu plasmidique par électrophorèse en gel d'agarose.- Digestion par des enzymes de restriction : profil de restriction.- Transfert selon la technique de Southern et hybridation avec des sondes

spécifiques.

Méthodes d'études des plasmides (1)

Cure et transfert de l'ADN plasmidiqueCure plasmidique : élimination du plasmide de la bactérie qui l'héberge.

- Cure spontanée, événement rare.- Cure chimique avec des produits qui vont inhiber sélectivement la

réplication plasmidique ou interférer avec la ségrégation de ces molécules (agents intercalants).

- Cure thermique.

Transfert- Conjugaison à une bactérie réceptrice.- Transformation.

Méthodes d'études des plasmides (2)

TRANSFORMATION

Extraction de l'ADN plasmidique

Sélection Km (ou Ap, Sm, Tc)

Phénotype : (Ap, Km, Tc)Souche : T1 (transformant 1)

Bactérie sauvage (WT)P1

P3P2

p1 : plasmide conjugatifApKmTc

P2 : plasmide non conjugatifSmSu mobilisable par p1

P3 : plasmide non conjugatif Apnon mobilisable par p1

P1

Bactérie sauvage (WT)

P1P2P3

+ Réceptrice compétente

P3P2

(Sm, Su)T2

(Ap)T3

Kmou Apou Tc Sm Ap

antPintI1

attI+

antP

ant1R+

resistance gene 1

integrase gene

Int

resistance gene 2

Int

Les Intégrons : des structures qui permettent une construction modulaire des plasmides de résistance