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Elisa (IgA) Anti- toxoplasma gondii Integrantes: Nicole Garrido.S Gonzalo Díaz

Elisa1 (IgA)Anti-Toxoplasma Gondii

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Elisa (IgA) Anti-toxoplasma gondii

Integrantes: Nicole Garrido.SGonzalo Díaz

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Principio del test:

• El kit de Elisa provee un ensayo semicuantitativo in vitro para detección de anticuerpos humanos clase IgA contra Toxoplasma gondii en suero o plasma.El kit contiene micro concentraciones de reactivo de antigeno de Toxoplasma gondii. En la primera reaccion el suero diluido se incubara en los pocillos. En caso de resultados positivos para los anticuerpos IgA (tambien IgG y IgM) se ligara este con el antigeno del pocillo. Para detectar el anticuerpo ligado , se realiza una segunda incubación usando una enzima conjuda antihumana (conejo) con una enzima conjuga ( peroxidasa) que luego catalizara una reaccion colorimétrica.

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Preparación y estabilidad de los reactivos

• Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) unos 30 minutos antes de usar. Después del primer uso, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si se • conserva a 2 ° C a 8 ° C y protegidos de la contaminación.

• Pocillos recubiertos, no abrir hasta su uso.

• Los calibradores y los controles están prediluidos y listos para uso.

• Conjugado enzimático: listo para uso. El conjugado enzimático se debe mezclar cuidadosamente.• Buffer de lavado : el buffer esta en una concentración de 10x ,

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• Buffer de lavado: Está concentrado 10x. Si hay presencia de cristales debe calentarse a 37 ° C y mezclar bien antes de diluir. La cantidad requerida debe ser utilizada de la botella usando una pipeta limpia y se diluye con agua desionizada o destilada 1:9 (1 parte de reactivo más 9 partes de agua destilada).

El buffer de lavado diluido se mantiene estable durante 1 mes cuando se almacena entre 2 ° C a 8 ° C y se manejan adecuadamente.

• Cromógeno / solución sustrato: lista para usar. Cerrar el frasco inmediatamente después de su uso, ya que el contenido es sensible a la luz. Debe ser incoloro para su uso. No utilizar la solución si es de color amarillo.

• Solución stop : lista para uso

• IMPORTANTE: calibradores y controles utilizados han sido negativos para Ags HB, VIHanti-VIH1 y VIH2 mediante inmunoensayos enzimáticos y métodos de inmunofluorescencia indirecta. No obstante, todos los materiales deben ser tratados como peligro potencial de infección y deben ser manejados con cuidado.

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Preparación y estabilidad de la muestra

• Suero humano con EDTA, heparina o plasma citratado• Estabilidad: las muestras de pacientes para la investigación

pueden ser guardados por 14 días (en 2 a 8C°)• Dilución de la muestra: las muestras de pacientes se diluyen

1:101 en buffer de trabajo. Por ejemplo: Diluir 10 ul de suero en 1,0 ml de tampón de muestra y mezclar bien con vortex.

• Los controles y calibradores vienen pre-diluidos listos para su uso.

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Incubación• Incubación simple: transferir 100 ul de el calibrador, del control

positivo y negativo y la muestra diluida del paciente, el pipeteo no debe durar mas de 15 minutos , luego se incuba por 3 minutos en una pieza con una temperatura ambiente-

• Lavado: Manual lavado en 3 secuencias usando 300 ul de BufferAutomático: lavado en 3 secuencias con 400 ul en cada lavado. Luego

del lavado utilizamos un papel absorbente el cual retira el exceso de solución buffer (liquido residual > a 10 ul puede interferir con el sustrato y puede dar valores mas bajos que los esperados y lavados en cortos tiempos pueden dar valores mas elevados que el real.

• Incubación de conjugados : pipetear 100ul de enzima conjugada (peroxidasa unida a Ig.A antihumano) en 2 pasos en cada micro placa , incubar por 30 minutos a una Tªambiente.

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• Lavado: realizar el lavado ya descrito anteriormente• Incubación del sustrato ,pipetiar 100ul de sustrato dentro de

cada micro placa (3 etapas) incubar por 15 minutos a T° de 18-25C°

• Solución stop: Pipetear 100 ul de solución stop dentro de cada micro placa en el mismo orden que se agrego el sustrato.

• Medición : fotométrica puede estar la medición en una rango de 450 a 620. Realizar esta medición luego de adicionar la solución stop

• ¤ Antes de medir agitar la micro placa , homogenizar y distribuir la solución.

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Protocolo de pipeteo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A C P 6 P 14 P 22

B Pos.

P 7 P 15 P 23

C Neg P 8 P 16 P 24

D P 1 P 9 P 17

E P 2 P 10 P 18

F P 3 P 11 P 19

G P 4 P 12 P 20

H P 5 P 13 P 21

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• Este protocolo es una ejemplo de determinación cuantitativa de anticuerpos en 24 pacientes (p1-p24)

• Calibrador , control positivo , y negativo son incubados en un pocillos diferentes cada uno.

• La fiabilidad del test es aumentada con determinación en duplicados .

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Calculo de los resultados:

• Los resultados pueden ser evaluados semi cuantitativamente y son calculados por un radio que evalúa la absorbancia del control o la muestra del paciente por sobre la absorbancia del calibrador usando la siguiente formula:

• Absorbancia del control o del paciente = Radio

Absorbancia del calibrador

Interpretación de los resultados • Radio <0.8 = negativo• Radio >0.8 a<1.1 = bordeline • Radio >1,1=positivo

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Características del test.• Calibración:• La calibración de los controles se realiza en unidades internacionales

(UI), utilizando el suero de referencia con anticuerpos de Toxoplasma gondii

• Para cada grupo de pruebas realizadas, los valores de la medición de los calibradores y las unidades internacionales y / o coeficientes determinados para los controles positivo y negativos deben corresponder a los límites establecidos para las pruebas del kit.

• Si los valores especificados para los controles no son alcanzados, los resultados pueden ser inexactos y la prueba debe repetirse.

• Antígeno: El antigeno utilizado es Toxoplasma gondii organismo fue purificado por

centrifugación de gradientes de densidad y además utilizando un detergente

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• Especificidad y Sensibilidad

Se hizo un cateo de 231 pacientes que fueron investigados usando la técnica de Elisa IG-A Anti Toxoplasma Gondii y con otro Elisa de método de referencia, dando como resultado la especificidad fue de 83,1% con una sensibilidad de 94,5%

• Interferencias

• No fueron observadas interferencias con sueros hemolizados, lipemicos o ictericos en concentraciones superiores a 20 mg/dL para trigliceridos y para 0,4 mg/mL para bilirrubina.

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Significancia clínica:Es una Infección parasitaria producida por un protozoo intracelular,

Toxoplasma gondii.Se presenta en tres estados durante su ciclo evolutivo y evolución de la infección . trofozoíto, quiste y ooquiste.Es una de las zoonosis más difundida en la naturaleza

Forma infectante y vía de Transmision:

• QUISTES : carnivorismo,ingestión de carnes crudas o insuficientemente cocidas

• TROFOZOITOS: vía transplacentaria, y tranfusional de sangre u otros fluídos .

• OOQUISTES : ingestión de alimentos , agua de bebida contaminada

con fecas de gatos, que contengan ooquiste de T.gondii

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Patología:

Infección intracelular , especialmente del sistema retículo-endotelial, células del sistema nervioso.Destrucción celular, reacción inflamatoria y finalmente fibrosis

FORMAS CLINICAS:FORMAS CLINICAS:

TOXOPLASMOSIS ADQUIRIDA PACIENTE INMUNOCOMPETENTE

•Principalmente asintomática

•Sintomáticos : Linfoadenopatias o ganglionar

Ocular

Meningoencefálica

miocárdica, pulmonar

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TOXOPLASMOSIS CONGENITA

Generalizada aguda: Infección al final del embarazo, compromiso general, prematurez fiebre, hepato y esplenomegalia etc.

Encefalitis aguda: Infección a mediados del embarazo,Hidrocefalia coriorretinitis, microcefalia,calcificaciones y finalmente retardo sicomotor. etc.

Secuelas: Infección al inicio del embarazo: Enfermedad intrauterina,casos severos Hidrocefalia, macro o microcefalia, calcificaciones cerebrales, Coriorretinitis.

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FIN!!!

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Quiste

Toxoplasmas libres en etapa proliferativa