昭和61年5月20日 443

ELISA法(酵 素免疫測定法)に よるLegionella pneumophilaに

対す る血清抗体価測定 に関す る研究

長崎大学医学部第2内 科

古賀 宏延 道津 安正 中島 学 長沢 正夫

中里 博子 重野 秀明 森 賢治 田中 光

伊藤 直美 河野 茂 重野 芳輝 山口 恵三

広田 正毅 斉藤 厚 原 耕平

(昭 和60年11月1日 受 付)

(昭 和60年12月10日 受 理)

Key words: Legionnaires' disease, antibody, ELISA

要 旨

Legionnaires'disease(在 郷軍 人病,Legionellosis:レ ジオネ ラ感染 症)の 血 清学 的診 断法 の ひ とつ

として,ELISA法(Enzyme-linked immunosorbent assay,酵 素 免疫 測定 法)を 用 い,血 清抗 体価 測定

の検討 を行 な った.

血 清 はCDCの 方法 に準 じて 作製 した家 兎 免疫 血 清 を用 い,抗 原 はLegionella pneumophila sero-

group 1～6を1.0%の ホル マ リンで処 理 し,420nmの 吸光 度でO. D. 0.5に な る よ うに菌浮 遊液 を作製 し

て用 いた.

ELISA法 はIFA法(間 接 蛍光 抗体 法)と 比 較 して感 度 が良 い反面,各serogroup間 のcross reaction

や,他 の菌種 に対 す るcross reaction(と くにPseudomonas aeruginosaやBacteroides fragilis)が 低 頻

度 なが ら認 め られた.

菌 体 その もの を抗原 と して用 いたELISA法 は,手 技 的 に も簡 単 で,費 用 もか か らず,感 度 も良いた め,

本 症 の補 助 的診 断法 としての価 値 は高 い もの と思 われ た.

序 文

Legionnaires'diseaseの 診 断 は,(1)DFA(直

接 蛍 光 抗 体 法)に よ る検 体 中 のLegionella pneumo-

philaの 証 明,(2)IFA(間 接 蛍 光 抗 体 法)に よ る血

清 抗 体 価 の 上 昇,(3)菌 の分 離 の いず れ か の 方 法

で 行 な わ れ て い るの が 現 状 で あ る1)～4)14).

今 回,我 々 はELISA法(Enzyme-linkedim-

munosorbent assay,酵 素 免 疫 測 定 法)に よ り,抗

レ ジ オ ネ ラ抗 体 価 測 定 の検 討 を行 な った.ELISA

法 はIFAと 同様,手 技 は簡 単 で,迅 速 診 断 が で き

る ば か りで な く,感 度 が 良 く,測 定 値 の判 定 は 客

観 的 な デ ー タ と し て 得 られ る.ま た,Radioim-

munoassay(RIA)の よ うに放 射 性 物 質 を 使 う と

い う取 り扱 い 上 の制 限 も な く,同 時 に多 数 の 検 体

が処 理 で き る とい う点 で も有 用 性 の高 い検 査 法 で

あ る の で,今 後 広 く用 い られ る よ うに な る と思 わ

れ る.本 法 に お け る基礎 的 検 討 を 主 に して,そ の

成 績 を報 告 す る.

材 料 と方 法

1) 抗 原 の 作 製

Legionella pneumophila serogroup 1～6の 標 準

株 〔米 国Centers for Disease Control(CDC)お

よびLos Angeles, VA Hospital(Dr. P. H. Edel-

stein)よ り分 与 〕 を 抗 原 と し て用 い た.作 製 法 は

Table 1に 示 した よ うに,B-CYE寒 天 培 地 を 用

別刷請求先:(〒852)長 崎市坂本町7-1

長崎大学医学部第2内 科 原 耕平

444 感染症学雑誌 第60巻 第5号

Table 1 Preparation of bacterial antigens

1) Inoculate the organism heavily on B-CYE agar and

incubate for 2days at 35•Ž

2) Harvest and kill by suspending overnight in 1%

Formalin

3) Centrifuge (2000•~g for 5min), resuspend, and adjust

with 0.5% Formalin to give a turbidity reading of O.

D. 0.5 (420 nm) (This is roughly comparable to 2•~

108 bacterial cells/ml)

4) Add the preservative, sodium azide (NaN3) to a

final concentration of 0.05%

5) Store antigens at 4•Ž

い,空 気 環 境 下 で,35℃,2日 間 培 養 した 後 ,1.0%

ホ ル マ リン溶 液 に て 集 菌 し,一 夜 静 置 .2,000gで

5分 間 遠 沈 後 上 清 を す て,再 び0.5%ホ ル マ リン溶

液 に 懸 濁 し,420nmの 吸 光 度(O. D.)が0.5に な る

よ うに菌 液 の濃 度 を 調 製 した.こ の 時 の 菌 数 は 約

2×108個/mlに 相 当 し た.ま た 防 腐 剤 と し て

NaN3を 最 終 濃 度 が0.05%に な る よ うに添 加 し,

これ を 抗 体 価 測 定 用 の抗 原 と し て4℃ にて 保 存 し

た.

2) 抗 体 の 作 製

L.pneumophila serogroup 1～6の 標 準 株 を 前

述 の 抗 原 作 製 の方 法 に よ り培 養 後 ホ ル マ リン処 理

し,こ れ に等 量 のFreund完 全 ア ジ ュバ ン トを 加

え よ く混 和 し,こ れ を 抗 体 作 製 用 の 抗 原 液 と した .

Jonesら5)の 免 疫 ス ケ ジ ュ ール に の っ と り,白 色 家

兎(体 重2.5～3.0kg)の 背 部,つ い で 大 腿 筋,さ

らに 静 脈 内 に この 抗 原 液 を接 種 し た の ち 全 採 血 し

た.具 体 的 ス ケ ジ ュ ー ル をTable 2に 示 した.

3) 抗 体 価 の 測 定(ELISA法)

Nunc社(デ ン マ ー ク)のpolystyrene製Im-

munoplateを 用 い た.Table3に 示 し た よ う に

Poly-L-Lysine(PLL)溶 液(pH7.2のPBSで10

μg/mlの 濃 度 に希 釈)を 各wellに50μlず つ 入 れ,

4℃ に て 一 夜 静 置 し た.翌 日PBSで3回 洗 浄 し

た後,こ れ に前 述 の 抗 体 価 測 定 用 の抗 原 液 を50μl

ず つ 加 え,2,000rpmで1時 間 遠 沈.再 びPBSで

洗 浄 後,非 特 異 的 結 合 を ふ せ ぐ 目的 で10%FCS

加PBSを 各50μl添 加 し,1時 間 静 置 した.

被 検 抗 血 清 の適 当 な 希 釈 系 列(50～204,800倍)

を 作 り,各 々 の濃 度 の検 体 を2～3 wellに50μlず つ

Table 2 Preparation of antisera

(1) Preparation of vaccine for antiserum production

1) Inoculate the organism heavily on B-CYE agar

and incubate for 2days at 35•Ž

2) Harvest and kill by suspending overnight in 1%

Formalin-0.85% saline

3) Centrifuge (2000•~g for 5min), resuspend, and

adjust with 0.5% Formalin-0.85% saline to give

a turbidity reading of 40 International Units (This

is roughly comparable to 4•~109 bacterial cells/

ml)

4) Mix with an equal volume of Freund's complete

adjuvant

(2) Immunization schedule

Day 1: Distribute 2ml of vaccine by

intracutaneous injection into 20-40 sites

along the shaved back of each rabbit

Day 31: Inject lml of vaccine deep into the thigh

muscle of each hind leg of the rabbit (2ml

total)

Day 38: Inject 2ml of the vaccine intravenously into

each rabbit (no adjuvant)

Day 45: Inject 2ml of the vaccine intravenously into

each rabbit (no adjuvant)

Day 52: Exsanguinate the rabbits

Table 3 ELISA technique

1) Put 50 ƒÊl of a poly-L-lysine solution (10ƒÊg/ml of

PBS, pH 7.2) into each well of microtiter plates

and incubate for overnight at 4•Ž

2) Discard poly-L-lysine and wash with PBS 3 times

3) Put 50ƒÊl of bacterial suspension (equivalent to 107

bacteria/well) into each well and centrifuge (2000

rpm for 1h)

4) Discard bacterial suspension and wash with PBS 3

times

5) Put 50ƒÊl of PBS containing 10% Fetal calf serum

and incubate for lh at room temperature

6) Wash with PBS 3 times

7) Add 50ƒÊl of serum dilution to each well and in-

cubate for 2h at room temperature

8) Wash with PBS 3 times

9) Add 50 ƒÊl of ALP conjugated Goat anti-Rabbit IgG

(diluted 1/400) and incubate for 2h at room temper-

ature

10) Wash with PBS 3 times

11) Put substrate (PNP) and incubate for 30 min at

room temperature

12) Add 5 N NaOH to stop reaction

13) Read O. D. at 405 nm

加 え(duplicate～triplicate),室 温 で2時 間反 応 さ

せ た.こ れ を3回 洗 浄 した 後,第2抗 体 と して ア

昭和61年5月20日 445

ル カ リ フ ォス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗 家 兎IgGヤ ギ 血

清 を用 い,こ れ を400倍 に 希 釈 して 各wellに50μl

ず つ 入 れ,室 温 で2時 間 反 応 させ た.な お血 清 の

希 釈 お よび 第2抗 体 の 希 釈 はす べ て20%FCS加

PBSで 行 な った.

次 に 基 質 としてP-Nitrophenol phosphate(PNP,

1mg/ml)を 用 い,30分 間 反 応 さ せ て 発 色 さ せ た

の ち5N, NaOHで 反 応 を 止 め た.ELISAオ ー ト

リー ダ ー と して は,Dynatek社(米 国)のMR580

を用 い,405mmでO. D.を 測 定 した.

な お,コ ン トロ ー ル血 清 と し て,免 疫 前 の正 常

家 兎 血 清(15羽 か らの15検 体)を 用 い た.

4) 抗 原 量(濃 度)の 決 定

適 切 な 抗 原 濃 度 を 決 定 す る た め に,checker-

board titrationを 行 な った.抗 原 液(L. pneumo-

phila serogroup 1)を420nmの 吸 光 度 で測 定 し,

0.D.2.0か ら適 当 な11段 階 の希 釈 系 列 を作 り,こ

れ に対 す る抗 血 清(L.penumophila serogroup 1

に よ る 免 疫 家 兎 血 清)も50倍 か ら400倍 ま で の4段

階 に 希 釈 した もの を 用 い て,前 記ELISA法 に て

各 々反 応 させ た.

5) 抗 血 清 の 吸 収

L.pneumophila serogroup 1免 疫 家 兎 血 清 を 用

い て 吸 収 試 験 を 行 な っ た.L.pneumophila sero-

group 1～6の 菌 を 培 養 後 ホル マ リン処 理 し,一 夜

静 置 した 後 数 回 洗 浄 した.serogroup 1抗 血 清 は

20%FCS加PBSで100倍 に希 釈 した 後,各 菌 液

と等 量 混 合 し一 夜 静 置 した.吸 収 前 の 抗 血 清 と吸

収 後 の各 々の 抗 血 清 に つ い て,L.pnemmophila

serogroup 1の 菌 に 対 す る抗 体 価 を測 定 した.

6)他 菌 種 に対 す るcross reaction

L.pneumophila以 外 の 細 菌,9菌 種18株(Sta-

phylococcus aureus; TERASHIMA, ATCC

12228, Escherichia coli; NIHJ JC-2, BHN, Kp,

ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae; PCI 602,

DENKEN, ATCC 13883, Enterobacter cloacae;

ATCC 23355, Serratia marcescens; ATCC 8100,

Proteus vulgaris; ATCC 21100-1, ATCC 13315,

Aeromonas liquefaciens; Y-62, Pseudomonas

aeruginosa; KOBAYASHI, NCTC 10490,

ATCC 27853, Pseudomonas stutzeri)お よ び

Bacteroides fragilis の臨床分離株31株 について,

Fig. 1 Checker-board titration for the assay of antisera (Legionella pneumo-

phila serogroup 1)

446 感染症学雑誌 第60巻 第5号

Fig. 2 Antibody activity of Control and Immunized sera

Antigen; Sero 1 Antigen; Sero 2 Antigen; Sero 3

Antigen; Sero 4 Antigen; Sero 5 Antigen; Sero 6

L. pneumophila serogroup 1抗 血 清 を用 い て

cross reactionを 調 べ た.抗 原 の 作 製 は,前 記 のL.

pneumophilaに お け る方 法 に 準 じた.

7) レ ジ オ ネ ラ感 染 症 患 者 の 血 清 抗 体 価 測 定

米 国 でLegionnaires'diseaseと 診 断 さ れ た 患

者 の血 清 抗 体 価 を,前 記 のELISA法 に よ り測 定

した.抗 原 はL. pnenmophila serogroup 1～6を

用 いた.

成 績

抗 原 濃 度 決 定 の た め のchecker-board titra.

tionの 結 果 を,L.pneumophila serogroup 1に 関

し てFig.1に 示 した.す べ て の 抗 血 清 の 希 釈 系 列

に お い て,抗 原 濃 度 がO. D.約0.5(菌 数 と し て約

2×108個/ml)の 時 に405nmの0.D.値 が 最 も 高

い値 を 示 した .図 示 し な か った がL.pneumophila

serogroup 2～6も 同 様 の 結 果 で あ った の で,以 後

は この抗 原 濃 度 を用 い て す べ て の 血 清 の 抗 体 価 測

定 を行 な うこ と と した.

L.pneumophila serogroup 1～6に よ る免 疫 家

兎 血 清 と コ ン トロ ール 血 清 の本 法 に よ る抗 体 価 を

Fig.2に 示 した.正 常 家 兎 血 清 は い ず れ も最 小 希

釈 濃 度 で あ る50倍 希 釈 に お い て もO. D. 0.1以 下

の反 応 しか 認 め られ ず,希 釈 倍 数 が 増 す ご と に0.

D.の 値 も 漸 減 し た.以 上 の 結 果 か ら,今 後 の

ELISA法 に よ る血 清 抗 体 価 測 定 のtiter(ELISA

抗 体 価)と し て は,便 宣 的 にO. D.が0.1以 上 に な

る血 清 の 最 大 希 釈 倍 数 を も って 表 す こ と と した.

Fig.3～8に は そ れ ぞ れL.pneumophila sero-

group 1～6で 免 疫 した 家 兎 血 清 の,L. pneumo-

phila serogroup 1～6の 抗 原 に対 す る抗 体 価 を 示

した.serogroup 1免 疫 家 兎 血 清 は別 途 に行 な った

IFA抗 体 価 が1,600倍 で あ った の に対 し,ELISA

昭和61年5月20日

Fig. 3 Rabbit serum immunized with L. pneumo-

phila serogroup 1

Arltigen; Serogroup 1-6

IFA titer; 1600×

ELISA titer; 12800×

Fig. 4 Rabbit serum immunized with L. pneumo-

phila serogroup 2

Antigen; Serogroup 1-6

IF A tlter; 800×

ELISA titer; 12800×

抗 体 価 は12,800倍 を示 した.serogroup 2～6の 抗

原 に対 して は,serogroup 6に800倍 と最 も高 い値

を 示 した もの の,い ず れ もserogroup 1に 対 す る

Fig. 5 Rabbit serum immunized with L. pneumo-

phila serogroup 3

Antigen; Serogroup 1-6

IFA titer; 1600×

ELISA titer; 102400×

Fig. 6 Rabbit serum immunized with L. pneumo-

phila serogroup 4

Antigen; Serogroup 1-6

I F A titer; 6400•~

ELISA titer; 6400•~

抗 体 価 に 比 し極 め て 低 い値 で あ った(Fig.3).同

様 にserogroup 2と3の 抗 血 清 はIFA抗 体 価 は

そ れ ぞ れ800倍 と1,600倍 で あ っ た が,ELISA抗 体

448 感染症学雑誌 第60巻 第5号

Fig. 7 Rabbit serum immunized with L. pneumo-

phila serogroup 5

Antigen: Serogroup 1-6

1FAtiter; 1600×

ELISA titer; 6400×

Fig. 8 Rabbit serum immunized with L. pneumo-

phila serogroup 6

Antigen; Serogroup 1-6

IFA titer; 800×

ELISA titer; 25600×

価 は そ れ ぞ れ 対 応 す る 抗 原 に 対 して12,800倍 と

102,400倍 を 示 した.し か しserogroup 2に よ る 抗

血 清 はserogroup 3の 抗 原 に対 して も12 ,800倍,

serogroup 3に よ る抗 血 清 はserogroup 2の 抗 原 に

Fig. 9 Rabbit serum absorbed with L. pneumo-

phila serogroup 1-6

serogroup 2-6

Fig. 10 Cross reaction against

Staphylococcus aureus; TERASHIMA,ATCC 12228 Escherichia coil; NIHJ JC-2, BHN, Kp

ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae; PC 1602, DENKEN

ATCC 13883 Enterobacter cloacae; ATCC 23355 Serratia marcescens; ATCC 8100 Proteus vulgaris; ATCC 21100-1

ATCC 13315 Aeromonas liquefaciens; Y-62 Pseudomonas aeruginosa; KOBAYASHI

NCTC 10490, ATCC 27853 Pseudomonas stutzeri

Serogroup 1

対 し て51,200倍 と い ず れ も 強 いcross reactionを

認 め る 結 果 が 得 ら れ た(Fig.4, 5).serogroup 4と

昭和61年5月20日

Fig. 11 Cross reaction against Bacteroides fragilis

(31 clinical isolates)

Fig. 12 Patient with Legionnaires' disease (Amer-

ican), serogroup 1

IFA titer; 1024×

ELISA titer; 6400×

5の 抗 血 清 はIFA抗 体 価 が そ れ ぞ れ6,400倍 と

1,600倍 で あ った が,ELISA抗 体 価 は い ず れ も

6,400倍 で あ った.こ れ らの 抗 血 清 はserogroup 6

の 抗 原 に対 して,い ず れ も800倍 の 抗 体 価 を示 した

(Fig.6, 7).serogroup 6の 抗 血 清 はIFA抗 体 価

は800倍 で あ った が,ELISA抗 体 価 は25,600倍 を

示 した.こ の抗 血 清 はserogroup 2の 抗 原 に対 し

て は12,800倍,serogroup 3の 抗 原 に対 して は6,400

倍 の抗 体 価 が 認 め られ た(Fig.8).

次 にL.pneumophila serogroup 1に 対 す る抗 血

清 を 用 い て 抗 体 の 吸 収 試 験 を 行 な った 結 果 を

Fig.9に 示 した.抗 体 吸収 前 の 抗 血 清 の 反 応 に比

し,serogroup 2～6の 菌 で 吸 収 した 抗 血 清 で はわ

ず か に 反 応 の 低 下 が 認 め ら れ た に す ぎ な か った

が,serogroup1の 菌 で 吸収 した 場 合 は極 め て 強 い

抗 体 価 の 低 下 が 認 め られ た.す な わ ち,serogroup

1に 対 す る抗 体 はserogroup 1の 菌 に お い て の み

特 異 的 に 吸収 され,他 のserogroupの 菌 で は ほ と

ん ど吸 収 さ れ な い とい う結 果 で あ った.

L.pneumophila以 外 の 菌 種 に 対 す るL.pneu-

mophila serogroup 1免 疫 家 兎 血 清 の抗 体 価 をFig.

10, 11に 示 した.P.aeruginosaの3株(1,600倍)と

P.vulgarisの1株(1,600倍),そ れ に嫌 気 性 菌 の

B.fragilisの2株(12,800倍 以 上)に 高 い抗 体 価 が

得 られ た.

米 国 でLegionnaires'disease(L.pneumophila

serogroup 1に よ る)と 診 断 され た 患 者 血 清 の抗 体

価(serogroup 1～6に 対 す る)をFig.12に 示 した.

ELISA抗 体 価 はserogroup 1に 対 して は6,400倍

で あ った が,同 時 にserogroup 6に 対 して も6,400

倍 と判 定 され る結 果 で あ った.

考 察

抗 原 抗 体 反 応 を定 量 的 に観 察 す るた め の免 疫 測

定 法 が,現 在 数 多 く開 発 さ れ利 用 され つ つ あ る.

な か で も抗 原 あ るい は 抗 体 の どち ら か一 方 を 何 ら

か の物 質 で 標 識 す る方 法,い わ ゆ る標 識 免疫 測 定

法 が 盛 ん で,と くに 蛍 光 物 質 を 用 い るfluoroim-

munoassay(FIA)や,放 射 性 同 位 元 素 を 用 い る

radioimmunoassay(RIA)の 応 用 が 開 発 され て い

る.

FIAは 以 前 か ら微 生 物 検 査 や 免 疫 検 査 の 分 野

で用 い られ て い る診 断法 で あ る が,操 作 の 自動 化

が 困 難 で あ る こ とや,結 果 の 判 定 に 客 観 性 が な い

こ と な どが難 点 で あ る.ま たRIAは20数 年 前 に 開

450 感染症学雑誌 第60巻 第5号

発 され た 検 査 法 で,幅 広 い 分 野 に お い て 最 も感 度

の 高 い 測 定 法 と して 用 い られ て い る.

と くに 微 量 の検 体 の 測 定 を 必 要 とす る内 分 泌 学

の 分 野 で の発 達 は 著 し い.し か し そ の反 面,放 射

性 同位 元 素 を使 用 す る とい う困 難 さ もあ り,た と

え ば 標 識 試 薬 の 半 減 期 が 短 か く不 便 で あ る こ と

や,人 体 へ の影 響 を 無 視 で きず,使 用 場 所,使 用

資 格 な どの 制 約 が あ り,さ ら に廃 棄 物 の 処 理 な ど,

取 り扱 い 上 種 々 の 問 題 が あ る.

これ に 対 して 酵 素 免 疫 測 定 法(Enzyme-linked

immunosorbent assay, ELISA法)は,1971年 ス

ウ ェ ーデ ン と オ ラ ン ダ で 最 初 の 試 み が 報 告7)8)さ

れ て 以 来,各 分 野 で 急 速 に発 展 し て きた 検 査 法 で

あ り,誰 で も,ど こで も,簡 単 に で き る とい う利

点 が あ る.さ らに 測 定 感 度 もRIAと 同 等 か,そ れ

以 上 で,標 識 試 薬 も長 期 保 存 が 可 能 な うえ,人 体

へ の 影 響 も全 くな い とい う長 所 が あ る.

今 回,我 々 は このELISA法 を 用 い て,Legion-

naires' diseaseの 抗 体 価 測 定 につ い て検 討 した .

諸 外 国 で は1978年 にFarshyら9)が,可 溶 性 抗 原 を

用 い たELISA法 に よ り本 症 患 者 の 血 清 抗 体 価 を

測 定 し,1982年 に はWreghittら10)が,ELISA法

に よ る抗 体 価 測 定 がIFA抗 体 価 と よ く相 関 し,さ

らにELISA法 の ほ うが よ り感 度 が 高 い こ と を報

告 して い る.ま た彼 ら は,ELISA法 の 使 用 抗 原 と

し て4種 類 の 可 溶 性 抗 原(Boiled sonicated

antigen, Phenol extracted antigen, Farshyら の

soluble antigen, EDTA-extracted antigen)を 比

較 検 討 して い る が,我 々 は この よ うな 可 溶 性 抗 原

とは 別 に,菌 体 そ の も の を 用 い たELISA法 を 検

討 した.

菌 体 抗 原 を 用 い たELISA法 は ま だ 文 献 的 報 告

が少 な く,1980年 にCummingsら11)が β-haemolytic

streptococciを,1981年 にIsonら12)が.Neisseria

gonorrhoeaeを 用 いたELISA法 を報 告 して い るに

す ぎ な い.1982年 に はElderら13)がStreptococcus

sanguisを 用 い たELISA法 を報 告 し,こ れ をWhole-

bacterial cell ELISA(略 し て,bact ELISA)と

呼 ん だ.こ の よ うに 菌 体 抗 原 を 用 い るELISA法

は,一 般 の可 溶 性 抗 原 と同 様,手 技 が簡 単 で 迅 速 に

行 な え るだ け で な く,精 製 した 蛋 白抗 原 を 作 る と

いう困難 さや,資 用の問題がな く,ど の施設にお

いても簡単にで きるという特徴がある.我 々もこ

のよ うな利点から,マ ス ・スクリーニングの補助

的手段 として,こ のbact ELISA法 を試みた.

ELISA法 による抗体価測定の結果判定に関 し

てはい くつかの方法があるが,今 回我 々が用いた

方法は検体を段階希釈 し,そ のすべ てをELISA

法でduplicateあ るいはtriplicateで 測定 し,便宣

上吸光度(O. D.)が0.1以 上を示す希釈系列の最終

点を力価 とした.こ のような方法以外にも,検 体

をある一定濃度に希釈して反応 させ,吸 光度があ

る値(た とえばO. D. 0.2と か0.4な ど)を 越えた場

合を陽性とする方法や,検 体の吸光度 と既知陰性

試料の吸光度の比を算出し,あ る一定値以上を陽

性 とす る方法などがある.

また,ELISA法 によるcross reactionの 検討 も

一定 したものがある訳ではないが,私 達が設定し

た力価の表示法でみると,各serogroup間 および

いくつかの菌種 との間に種 々の程度に近似 した抗

体価が得 られ,い わゆるcross reactionと 考 えら

れ る結果が得 られた.こ のことはELISA法 の感

度が高いためと,菌 体抗原を用いているとい う点

から,菌 体表面抗原の共通を反映 しているため と

思われた.こ のことは逆に,表 面抗原の特徴を知

ることがで きるとともに,た とえば線毛抗原 に対

す る特異的な抗体の検出などにも応用される利点

があるとも考 えられた13).

また,抗 体 の抗原 特異 性 を知 る 目的 で,L.

pneumophila sergroup 1抗血清を用いて抗体吸収

試験を行なったが,こ の結果からserogroup 1抗

血清は,serogroup 1の菌に対 して特異性の高い抗

体であることが証明された.他 のserogroupの 抗

血清においても同様の吸収試験を行なえば,抗 原

特異性の程度を知 ることがで きるもの と思わ れ

る.

他菌種を用いたcross reactionの 結果では,P

aeruginosa,P.vulgaris, B.fragilisの 一部の菌に

軽度のcross reactionを 認めたが,こ の結果は

IFA法 によるcross reactionの 報告5)6)とほぼ一

致してお り,や はり菌体表面抗原の共通性に関す

るものと推測された.

昭和61年5月20日 451

米 国 の レ ジ オ ネ ラ感 染 症 患 者 の 血 清 を用 い た 抗

体 価 測 定 の 検 討 で は,こ の 血 清 はIFA法 でsero-

group 1の 菌 に 対 し て1,024倍 の 抗 体 価 が確 認 され

て い た が,ELISA法 で は6,400倍 の 抗 体 価 で あ っ

た.ま た,serogroup 6の 抗 原 に 対 し て も 強 い

cross reactionが 認 め られ,O. D.値 を一 定 に 設 定

して の 抗 体 価 表 示 法 に問 題 が あ る と考 え られ た.

現 在Legionnaires' diseaseの 診 断 に は,蛍 光 抗

体 法 を 用 いた 検 査(DFA, IFA)が 利 用 され て い る

が,こ の 方 法 の大 き な問 題 点 は,熟 練 を必 要 とす

る た め,施 設 問 で の 成 績 に相 違 が み られ た り,蛍

光 顕 微 鏡 の機 種 に よ っ て も成 績 に 相 違 が 出 て くる

可 能 性 が あ る こ とで あ る.こ の よ うな欠 点 を 補 う

目的 でELISA法 を 用 い る こ とは 非 常 に 有 用 で,

と くにbact ELISAは,前 述 した よ うな あ る程 度

のcross reactionは 存 在 す る もの の,利 点 は 多 く,

今 後 は 患 者 血 清 の ス ク リー ニ ン グ検 査 と して,あ

る い はL.pneumophilaに 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル

抗 体 のassayと し て も 幅 広 く利 用 で き る も の と

思 わ れ る.

なお,本 研究は本学会に よる援助を受 けた ものであ り,

本論文の要 旨は第57回 日本感染症学会(大 阪)に おいて発

表 した.

文 献

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452 感染症学雑誌 第60巻 第5号

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Detection of Antibodies to Legionella pneumophila

Hironobu KOGA, Yasumasa DOTSU, Manabu NAKASHIMA, Masao NAGASAWA, Hiroko NAKAZATO, Hideaki SHIGENO, Kenji MORI, Hikaru TANAKA, Naomi ITO, Shigeru KONO, Yoshiteru SHIGENO, Keizo YAMAGUCHI,

Masaki HIROTA, Atsushi SAITO & Kohei HARA The Second Department of Internal Medicine, Nagasaki University School of Medicine

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test has been employed to detect antibodies to Legio-nella pneumophila serogroup 1-6.

Antisera to Legionella pneumophila were produced in rabbits by the method of Centers for Disease Control (CDC, 1979). We used whole bacterial cells of Legionella pneumophila, killed by suspending in 1.0% formalin overnight, as a ELISA antigen.

Although ELISA was much sensitive than indirect fluorescent antibody (IFA), weak cross reactions with a few strains of Pseudomonas aeruginosa and Bacteroides fragilis were observed.

The advantage of a whole-bacterial cell ELISA (bact ELISA) were numerous. Coating with the whole cell was as simple and rapid as with soluble purified antigen. In addition, use of whole cells ob-viated the necessity of laborious or expensive antigen purification procedures.

Consequently, it was considered that the bact ELISA was useful in clinical studies, for serological diagnosis of Legionnaires' disease.