1

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola – Elméleti Orvostudományok Program: I/3. Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai

DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra

Készítette: dr. Hegedüs Márton

Témavezető: Dr. Fekete Andrea, egyetemi docens Programvezető: Dr. Rontó Györgyi, professor emeritus Hivatalos bírálók: Dr. Sasvári Mária, egyetemi docens

Dr. Török Szabina, tudományos főmunkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Monos Emil, professor emeritus Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Csík Gabriella, egyetemi docens

Dr. Török Szabina, tudományos főmunkatárs

Budapest 2006

2

Tartalomjegyzék 0. Rövidítések jegyzéke......................................................................................... 6 1. Bevezetés ............................................................................................................... 7 2. Irodalmi áttekintés ............................................................................................ 9

2.1. AZ ULTRAIBOLYA SUGÁRZÁS ................................................................. 9

2.1.1. Fizikai jellemzők ...................................................................................... 9 2.1.2. A spektrum felosztása............................................................................... 9

2.2. TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES UV FORRÁSOK............................. 10

2.2.1. Napsugárzás............................................................................................ 10 2.2.2. Az ózon szerepe...................................................................................... 11 2.2.3. Az ózonlyuk............................................................................................ 12 2.2.4. Légköri tényezők hatása az UV dózisra ................................................. 13 2.2.5. Mesterséges UV források ....................................................................... 15

2.3. AZ UV SUGÁRZÁS BIOLÓGIAI HATÁSAI.............................................. 16

2.3.1. Az UV sugárzás és a földi élet kialakulása............................................. 16 2.3.2. Exobiológiai vonatkozások .................................................................... 18 2.3.3. A jelen ökoszisztémát érintő változások ................................................ 19 2.3.4. Az egészség és a napfény ....................................................................... 20 2.3.5. Immunszuppresszió ................................................................................ 21 2.3.6. Hóvakság, szürkehályog......................................................................... 23 2.3.7. Az UV sugárzás bőrre gyakorolt általános hatásai................................. 23 2.3.8. A bőrrákok epidemiológiája ................................................................... 25 2.3.9. A bőrrákok tumorbiológiája ................................................................... 27

2.4. MOLEKULÁRIS HATÁSOK, A DNS KÁROSODÁSA ............................. 29

2.4.1. Molekuláris fotobiológia ........................................................................ 29 2.4.2. Lipidek és fehérjék UV sérülései............................................................ 30 2.4.3. A fehérjék szerepe a DNS sérülésében................................................... 31 2.4.4. A DNS UV elnyelése.............................................................................. 32 2.4.5. A DNS gerjesztése.................................................................................. 34 2.4.6. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) .................................................... 36 2.4.7. Pirimidin-(6-4)-pirimidon fotoproduktumok (6-4 PD) .......................... 37 2.4.8. Pirimidinek egyéb sérülései.................................................................... 38 2.4.9. Oxidatív léziók ....................................................................................... 39 2.4.10. Lánctörések............................................................................................. 40

2.5. AZ UV SUGÁRZÁS DOZIMETRIÁJA........................................................ 41

2.5.1. Fizikai UV dózis..................................................................................... 41 2.5.2. A biológiai hatékonyság becslése........................................................... 43 2.5.3. Biológiai doziméterek............................................................................. 45

3. Célkitűzések....................................................................................................... 46

3

4. Anyagok és módszerek................................................................................... 48

4.1. T7 BAKTERIOFÁG ...................................................................................... 48

4.1.1. A fágok tudományos jelentősége............................................................ 48 4.1.2. A fág életciklusa ..................................................................................... 49 4.1.3. A T7 fág tenyésztése............................................................................... 49 4.1.4. A T7 fág szerkezete ................................................................................ 50 4.1.5. „Fűtött fág” állapot ................................................................................ 51 4.1.6. T7 DNS................................................................................................... 52 4.1.7. T7 biológiai dózis és mérése .................................................................. 52

4.2. MINTAKÉSZÍTÉS......................................................................................... 53

4.2.1. Fág szuszpenzió...................................................................................... 53 4.2.2. DNS oldat ............................................................................................... 54 4.2.3. DNS és fág vékonyrétegek ..................................................................... 54 4.2.4. A DNS konformáció befolyásolása ........................................................ 56

4.3. A MINTÁK KEZELÉSE................................................................................ 57

4.3.1. Oldatok besugárzása ............................................................................... 57 4.3.2. Vékonyrétegek űrszimulációs kezelése .................................................. 58

4.4. A KIÉRTÉKELÉS MÓDSZEREI.................................................................. 60

4.4.1. Spektrofotometria ................................................................................... 60 4.4.2. Gélelektroforézis .................................................................................... 61 4.4.3. Specifikus enzimatikus emésztés............................................................ 63 4.4.4. DNS–fehérje keresztkötések meghatározása.......................................... 63 4.4.5. A DNS sérülése T7 fágok túlélése alapján ............................................. 64

4.5. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ.................................................................... 65

4.5.1. A PCR működése ................................................................................... 65 4.5.2. A primerek.............................................................................................. 67 4.5.3. A QPCR paraméterei .............................................................................. 69 4.5.4. Kvantitatív kiértékelés............................................................................ 70

5. Eredmények....................................................................................................... 71

5.1. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ OPTIMALIZÁLÁSA................................ 71

5.1.1. A kiindulási DNS ................................................................................... 71 5.1.2. Az exponenciális amplifikáció tartománya ............................................ 72 5.1.3. DNS-koncentrációval arányos amplifikáció........................................... 73

4

5.2. UV DÓZIS HATÁSA A PCR TERMÉK MENNYISÉGÉRE ...................... 74

5.2.1. A cél fragmens szerepe........................................................................... 74 5.2.2. Öt különböző spektrumú UV sugárforrás hatása.................................... 77

5.3. A FÁG-FEHÉRJÉK JELENLÉTÉNEK HATÁSA ....................................... 78

5.3.1. T7 fág, „fűtött fág”, izolált DNS ............................................................ 78 5.3.2. UV fotosérülés különböző DNS konformációkban................................ 79

5.4. VÉKONYRÉTEGEK ÉS VÁKUUMKEZELÉS ........................................... 80

5.4.1. A fág és DNS vékonyrétegek szerkezete................................................ 80 5.4.2. Vákuum hatása a vékonyrétegekre ......................................................... 81 5.4.3. Hőmérséklet-ingadozás következményei ............................................... 83

5.5. VÉKONYRÉTEGEK ULTRAIBOLYA BESUGÁRZÁSA ......................... 84

5.5.1. UVC sugárzás hatása a vékonyrétegekre................................................ 84 5.5.2. A többszörös rétegek árnyékoló hatása .................................................. 87 5.5.3. Különböző fotoproduktumok keletkezése napszimulátor hatására ........ 88 5.5.4. Kombinált kezelések: vákuum és UV sugárzás együttes hatása ............ 89

6. Megbeszélés........................................................................................................ 91

6.1. T7 FÁG BIOLÓGIAI DOZIMÉTER KIÉRTÉKELÉSE............................... 91

6.1.1. PCR beállítása ........................................................................................ 91 6.1.2. T7 fág biológiai dózismérő hitelesítése .................................................. 92 6.1.3. A proteinek szenzibilizáló hatása ........................................................... 94

6.2. SZIMULÁLT VILÁGŰR HATÁSA ............................................................. 96

6.2.1. A minták minőségének ellenőrzése ........................................................ 96 6.2.2. A vákuum által okozott dehidráció......................................................... 98 6.2.3. Vákuum által okozott sérülések............................................................ 100 6.2.4. Az UVC fotoproduktumok DNS szerkezetét módosító hatása ............ 102 6.2.5. Telítődés az UVC sérülések mennyiségében........................................ 103 6.2.6. A rétegvastagság védő hatása ............................................................... 105 6.2.7. Különböző sérülés típusok megoszlása ................................................ 106 6.2.8. A vákuum és az UVC sugárzás szinergisztikus hatása......................... 108

7. Következtetések.............................................................................................. 110 8. Összefoglalás ................................................................................................... 117 9. Summary .......................................................................................................... 118

5

10. Irodalomjegyzék ........................................................................................ 119 10.1. FELHASZNÁLT IRODALOM ............................................................... 119 10.2. FELHASZNÁLT INTERNETES FORRÁSOK ...................................... 132

11. Saját publikációk jegyzéke..................................................................... 133

11.1. CIKKEK ................................................................................................... 133

11.2. ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK ............................................................ 134 11.3. ISMERETTERJESZTŐ TEVÉKENYSÉG.............................................. 137

12. Köszönetnyilvánítás .................................................................................. 138

6

0. Rövidítések jegyzéke

Az értekezésben többször előforduló rövidítések és magyarázatuk:

6-4 PD 6-4 fotodimer A adenin AP apurinezett/apirimidinezett lézió bp bázispár BED biologically effective dose C citozin CFC klór-fluoro-karbon CPD ciklobután-pirimidin-dimer DLR Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt DNS dezoxiribonukleinsav dNTP dezoxinukleozid-trifoszfát DU Dobson unit EDTA etilén-diamin-tetra-acetát ESA European Space Agency EVT Experiment Verification Test G guanin HT7 T7 egyenérték dózis ISS International Space Station MED minimal erythema dose m / RNS messenger / ribo-nukleinsav NASA National Astronautics and Space Administration NMSC non-melanoma skin cancer OD optikai denzitás PUVA pszoralén + UVA Q / PCR quantitative / polymerase chain reaction r.h. relative humidity RPM rotation per minute SDS sodium-dodecyl-sulfate T timin UV ultraibolya UVA 315–400 nm UVB 280–315 nm UVC 100–280 nm

7

1. Bevezetés

Az élőlényeket érő ultraibolya sugárzás legfontosabb forrása a Nap. Az ózonréteg

vékonyodása, a napozási szokások változása és a mesterséges források elterjedése

(pl.: szolárium, ipari és orvosi célú alkalmazások) miatt az emberi szervezetet érő

ultraibolya sugárterhelés összességében növekszik. Emellett olyan nagy energiájú, az

UV tartományba eső sugárzás hatásaival is fokozottan számolnunk kell, ami a légkör

szűrő hatása miatt korábban nem képezte részét az élőlények természetes

környezetének, és amely biológiai szempontból más hullámhosszaknál veszélyesebb. A

változó UV sugárzás élővilágra kifejtett hatásainak felmérése és előrejelzése bonyolult

feladat, ami biológiai doziméterek használatát teszi szükségessé.

Az élő szervezetek sugárkárosodásában a fehérjékkel kölcsönhatásban álló

nukleinsav kitüntetett szerepet játszik. A biológiai hatások közé tartozik többek között a

sejthalál és a bőrrákok kialakulásában szerepet játszó mutációk megjelenése. Az

ultraibolya sugárzás következményeinek jelentős része az örökítőanyagban kialakuló

változatos sérülésekre vezethető vissza, ezért célszerű magát a DNS-t használni

biológiai doziméterként.

A DNS sérülések tanulmányozásához a T7 bakteriofág ideális modell rendszer,

mert a fág izolált DNS-e mellett a kromoszóma modelljének tekintett intakt fágban a

fehérjékkel való kölcsönhatás következményei is vizsgálhatóak. A T7 bakteriofág

szerkezete ismert, laboratóriumi felhasználásának módszerei letisztultak és a

Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében több évtizedes

tapasztalat áll rendelkezésre a fágok felhasználásával kapcsolatban. A molekuláris

biológiai technikák fejlődésével a DNS UV fotosérüléseinek detektálásában emellett új

utak is megnyíltak. Ezért a jelen dolgozat témája a DNS alapú biológiai dozimetria

kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra T7 bakteriofág és molekuláris biológiai

technikák felhasználásával.

8

Munkám természetéből következik, hogy az részben új módszerek kifejlesztésére,

megbízhatóságuk ellenőrzésére, részben ezek gyakorlati felhasználására irányult.

Kísérleteim során a kvantitatív polimeráz láncreakció segítségével meghatározott DNS

sérülések és a biológiai dózis között kerestem kapcsolatot. Vizsgálataimat

kiterjesztettem a széles biológiailag releváns dózistartományra, és egyes, az UV

sérülések kialakulását befolyásoló tényezők hatásainak elemzésére.

A DNS és egyszerűbb mikroorganizmusok világűrbeli sorsa fontos kérdés az élet

kialakulásával és bolygók közti átvitelének lehetőségével kapcsolatban. Az élet

szempontjából a világűrben uralkodó vákuum és a nagy energiájú UV sugárzás a

legfontosabb limitáló tényezők, amik hozzátartoznak a Nemzetközi Űrállomásra

küldendő fág és DNS vékonyrétegek űrszimulációs kezeléséhez is. A DNS sérülések

detektálására szolgáló új eljárást – más módszerekkel kiegészítve – a gyakorlatban

alkalmaztam a szimulált világűrbeli körülmények vékonyrétegekre kifejtett hatásainak

tanulmányozásában.

9

2. Irodalmi áttekintés

2.1. AZ ULTRAIBOLYA SUGÁRZÁS 2.1.1. Fizikai jellemzők

„Kezdetkor teremtette Isten az eget és a földet. ... és Isten szólt: „Legyen

világosság”, és világos lett” (Genesis I, 1.1.). A Teremtés első mozzanatai között

szükség volt a fényre, hiszen a földi élet a Nap nélkül elképzelhetetlen.

A fény fizikailag elektromágneses sugárzás, a terjedési irányra és egymásra

merőlegesen, szinkron oszcilláló elektromos és mágneses erőtér. Az energia adott

mennyiségeit fotonokba csomagolva közvetíti. A fény természetének megértését sokáig

nehezítette a fotonok kettős viselkedése. Az általuk szállított energiával fordítottan

arányos, rövidebb hullámhosszakon a részecskékre jellemző tulajdonságokat mutatják,

míg az alacsonyabb frekvenciájú sugárzás hullámtermészettel rendelkezik

(Rontó és Tarján 1997).

E = h ν = h (c/λ), ahol:

h : 6,626 · 10-34 Js, Planck-állandó;

ν : frekvencia [Hz];

c : fénysebesség [m/s];

λ : hullámhossz [m].

2.1.2. A spektrum felosztása

Az optikai tartományt az elektromágneses spektrum 100 nm és 1 mm közé eső

szakasza jelenti. Ide tartozik a nagyobb energiájú ultraibolya (UV), a 400–800 nm-es

látható fény (VIS) és az infravörös (IR) sugárzás, ahogy azt az 1. ábra mutatja. Az

élőlények megtanulták hasznosítani a Napból érkező energiát. A hősugárzásnak szerepe

van az éghajlat meghatározásában. Az energia legnagyobb részét közvetítő látható fényt

használják a növények a fotoszintézishez, ebben a hullámhossz-tartományban szemünk

csapjai és pálcikái a frekvenciakülönbségeket színbeli eltérésként érzékelik. Egyes

10

állatok (pl.: méhek) a közeli ultraibolya tartományban is látnak, az embereknek azonban

erre nincsen érzékszervük (Nilsson 1996). Az UV sugárzás káros hatásai ellen ezért

csak akkor tudunk védekezni, ha a minket érő dózist méréssel meg tudjuk határozni.

1. ábra. Az elektromágneses spektrum tartományai (Nilsson 1996 nyomán)

2.2. TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES UV FORRÁSOK

2.2.1. Napsugárzás

A Wien-féle eltolódási törvény (λmax T = Wien-állandó) értelmében magasabb

hőmérsékletű testek emissziós színképe a nagyobb energiák felé tolódik. Életünkben a

legjelentősebb feketetest sugárzó 6000 K körüli felszíni hőmérsékletével a Nap. Ezen a

hőmérsékleten már jelentős ultraibolya kisugárzással is számolni kell. Távoli galaxisok

megfigyelésénél ezért a csillagászok UV felvételeket is készítenek. A Föld légkörének

határára érkező teljes energiát a szolár konstans adja meg, átlagos értéke 1,37 kW/m2. A

napfénynek mintegy 7%-a esik az ultraibolya tartományba (Nicholson és mtsai 2005),

ennek azonban csak töredéke éri el a Föld felszínét.

Az atmoszférában való elnyelődés szerint a nagy energiájú optikai sugárzás

további felosztása lehetséges hullámhossza alapján. A 100 és 280 nm közötti UVC-t a

légkör nitrogén és oxigén molekulái teljes mértékben elnyelik és szétszórják. A

11

280–315 nm-es UVB jelentős részét az UVC által generált ózon hivatott elnyelni. Az

ennél nagyobb hullámhosszú UVA a látható fényhez hasonlóan gyakorlatilag akadály

nélkül jut le a felszínre.

2.2.2. Az ózon szerepe

A légkör molekuláinak a sugárzással való kölcsönhatása nem csak szűrőként

fontos. 240 nm-nél rövidebb hullámhosszú fotonoknak oxigénnel való ütközésekor a

molekula atomjaira hasad. A kialakuló, páratlan elektronnal rendelkező gyökök igen

reakcióképesek és a kétatomos oxigénhez kapcsolódva exotherm folyamat során ózon

(O3) alakul ki. A keletkezés helye szerint így jött létre a sztratoszférában, a Föld felszíne

felett mintegy 25–40 km-rel az ózonréteg. Mára az ózon mennyisége átlagosan 0,5 pars

pro million (ppm), a felszíni nyomáson mintegy 3 mm vastag réteget alkotna, ezt

tekintik 300 Dobson-egységnek (DU).

Az ózon kötései a 320 nm körüli fotonok energiáját elnyelve felszakadnak és a

molekula kiindulási elemeire bomlik, ahogy az a 2. ábrán látható. Az ózonréteg

magasságában a felszabaduló hőnek megfelelően ezért a sztratoszféra környező

rétegeihez képest magasabb hőmérséklet uralkodik. Az O3 bomlása oxigén, hidrogén,

nitrogén és klór szabad gyökök által közvetített láncreakcióban is létrejöhet. Az 1995-ös

kémiai Nobel-díjat a nitrogén-oxidok és a klór-fluoro-karbonok (CFC) e folyamatban

játszott szerepének tisztázásáért ítélték oda P.J. Crutzennek és munkatársainak.

2. ábra. Az UV sugárzás útja a Föld felszínére (Nilsson 1996 nyomán):

Az oszlopok a Föld felszínét elérő sugárzás relatív intenzitását érzékeltetik

12

2.2.3. Az ózonlyuk

A Nap által kibocsátott spektrum emberöltőnyi léptéken mérve nem változik. A

felszínt elérő dózist meghatározó ózon megoszlásáért, keletkezéséért és bomlásáért

felelős folyamatok azonban érzékeny egyensúly elemei.

Az 1970-es évek óta nem fér kétség a sztratoszféra ózonrétegének

vékonyodásához. A jelenséget rövid távon és helyileg elősegítik természetes éghajlati

változások és vulkánkitörések is (pl.: Mount Pinatubo, 1992) (Madronich és mtsai

1998), de a globális folyamatokra ezek nem adnak magyarázatot.

Mára a magas légkörben közvetlenül kimutatott köztitermékek alapján

bebizonyosodott a mesterséges kibocsátásból származó anyagok elsődleges szerepe. A

többek között hűtőgépekben és dezodorok hajtógázaként használt klór-fluoro-karbonok

(CFC), a tűzoltásban fontos halonok és a bromidok a magas légkörben UVC sugárzás

hatására olyan aktivációs reakción eshetnek át, aminek termékei katalizálják az ózon

bomlását eredményező láncreakciót. A vegyületek egy része hosszú életidejű, több mint

100 évig maradhat a légkörben. Az UV sugárzás hatására a CFC-ről leszakadó klór

gyök megtámadja az O3-t és az abból lehasított egyik atommal a 3. ábrán mutatott

módon kötésre lép. A klór-monoxiddal szabad oxigén reagál és O2 keletkezik. A

folyamatot elindító klór változatlanul visszamarad, és újabb reakciót kezdeményez

(Nilsson 1996).

3. ábra. Az ózon bomlása klór gyök katalizátorral (Nilsson 1996 nyomán)

Az ózonréteg vastagságát a Föld felszínéről Dobson-spektrofotométerekkel,

magas légköri ballonos mérésekkel és a Total Ozone Mapping Spectroradiometer

(TOMS) segítségével, műholdról folyamatosan követik. A vékonyodás évszaktól és

földrajzi szélességtől való függést mutat. A legnépesebb mérsékelt égövben

13

évtizedenkénti 5%-os, gyorsuló tendenciájú fogyást mutattak ki. A trópusokat a jelenség

alig érinti. Az Antarktisz, Új-Zéland és Ausztrália térségében azonban 20%-os

kumulatív vékonyodás lépett fel. Ha az ózonréteg vastagsága 100 Dobson-egység alá

csökken, ózonlyuk alakul ki.

A magyarázat egy egyedülálló meteorológiai jelenségben rejlik. A telente

kialakuló sarki légörvény elszigeteli az Antarktisz légterét. A sötétségben lehűlő

levegőben jégkristályok csapódnak ki. Ezek felszíne felfogja a tavasz első napsugarait,

így a gyöngyházfelhőkben fokozott a jégkristályokra adszorbeálódott CFC-k UVC

okozta aktivációja. A légörvény felszakadásával a hőmérséklet emelkedik és a

keletkezett ózonszegény levegő észak felé sodródik. Az ózonlyuk középpontjában a tél

végén 75%-os hiány jön létre. 1995-ben európányi terület felett gyakorlatilag megszűnt

a védő réteg (4. ábra). Az Arktiszon eddig ez a jelenség nem öltött ilyen mértéket, mert

a levegő – környezetével keveredve – nem hűl le eléggé (Nilsson 1996).

4. ábra. Az Antarktisz feletti ózonlyuk alakulása 1979-től 1999-ig (NASA–TOMS):

Megfigyelhető a sötétkék színkóddal jelölt ózonlyuk (

14

A felhők vízcseppeket, jégkristályokat, részben ipari eredetű port és – többek

között égés nyomán keletkező – kénsav-aeroszolt tartalmazhatnak. A fedettség

vastagságát, optikai tulajdonságait, térbeli és időbeli megoszlását is figyelembe kell

venni az UV-protektív hatás becsléséhez, ami igen jelentős is lehet (Bornman és van der

Leun 1998). Ráadásul az emberi tevékenység nyomán a levegőbe kerülő aeroszolok és a

troposzférikus ózon szintjében is erős ingadozások mutatkoznak.

A gázmolekulák és részecskék hosszabb úton többet nyelnek el az egyes

fotonokból. Következésképpen délben fokozott a nagy energiájú sugárzás. Nyáron a

napi UVB dózis 75%-a reggel 9 és délután 3 óra között érkezik a Földre, a leégésnek

ekkor legnagyobb a veszélye (Nilsson 1996). A jelenség szerepet játszik a dózis

földrajzi szélességtől való függésében is. Ugyanakkor az Egyenlítőtől távolodva a

napsugárzás beesési szöge egyre jelentősebb évszaki ingadozást mutat, a sarkokon

szélsőséges viszonyokkal. Ez azonos intenzitás mellett a felszíni fluxus csökkenésében

jelentkezik. A nyári napforduló tájékán így nem csak a nappalok hossza miatt könnyű

barnulni, hanem azért is, mert a Nap magasan áll a horizont felett. A fényszórás a

rövidebb hullámhosszú komponenseket érinti elsősorban, ami a felszínt érő UV

spektrum minőségét is befolyásolja és azt az egyenlítő környékén a veszélyes, nagyobb

energiájú tartomány felé tolja (Bérces és mtsai 1999).

A tengerszint feletti magasság sem elhanyagolható tényező. Ha a hegycsúcsok

kiemelkedését az atmoszféra teljes vastagságához viszonyítjuk, az arány csekélynek

tűnhet, de számításba kell venni, hogy a gravitációnak és a gázok

összenyomhatóságának köszönhetően a légkör anyagának túlnyomó része az alsó

10 km-ben összpontosul. 300 méter emelkedés 4%-kal fokozza a napsugárzás leégést

kiváltó hatását (Nilsson 1996). Egyes felületek, mint a hó, a víz, a homok ráadásul a

sugárzás jelentős részét visszaverik, albedojuk közel 1 (Bornman és van der Leun

1998). A napozási szokások változását a sugárzás–légkör kölcsönhatás figyelembe

vételével értékelve összességében egyre nagyobb dózisú és egyre rövidebb

hullámhosszú UV sugárzás elszenvedésével lehet számolni.

15

2.2.5. Mesterséges UV források

Ma használt mesterséges fényforrásaink egy része nemkívánatos

melléktermékként a látható mellett az UV tartományban is emittál. A fénycsövek

mellett ilyenek a magas üzemi hőmérsékleten működő és ezért UV-ben is sugárzó

kvarc-halogén izzók. Ez a dózis azonban a Nap fényéhez képest elhanyagolható.

Kivételt egyes speciális alkalmazási területek képeznek, amiknek az elszenvedett UV

dózis és a szükséges védekezés (pl.: hegesztő pajzs) szempontjából nagy jelentősége

lehet.

Széles körben elterjedt az UV fény alkalmazása az egészségügyben és a

kozmetikai iparban. A szoláriumok kvarclámpáiban az UVA tartomány barnító hatását

igyekeznek kihasználni. A bőrgyógyászatban használt PUVA kezelés során az UVA

hatását fényérzékenyítő 8-metoxi-pszoralénnel potencírozzák. UVC-t kibocsátó

germicid lámpákkal légterek és felületek csíramentesítése érhető el. Ez a hatás ívóvíz és

szennyvíz tisztítására és élelmiszerek tartósítására is felhasználható.

Egyes ragasztóanyagok polimerizációjának gyorsítására UV fényt használnak az

ipar számos területén, a fogászatban, az ortopéd sebészetben, de még lovak patkolásánál

is. A hegesztés során keletkező ívfény UVC-t is tartalmaz. Egyes nyomdai, lakkozó és

gyorsszárító eljárások során szintén ultraibolya sugarakat használnak (Tenkate 1999).

Széleskörűen elterjedt az ultraibolya sugárzás által keltett fluoreszcencia

felhasználása. Biológiai minták szerves molekulái és egyes kristályok is mutathatják a

jelenséget, így vér, vizelet nyomok és ásványok azonosíthatók. Láthatatlan festékekkel

bankjegyek, műtárgyak jelölhetők meg. Terjedőben van az UV keltette fluoreszcencia

szórakoztató ipari és művészeti felhasználása is, ami a szórakozóhelyek „fekete

fényétől” a fluoreszkáló festékkel készített festményekig és látvány elemekig terjed.

A mindennapi élet során ezért nem csak a napozási szokások változása és az

ózonréteg vékonyodása, hanem a mesterséges források miatt is egyre többet találkozunk

az ultraibolya sugárzással.

16

2.3. AZ UV SUGÁRZÁS BIOLÓGIAI HATÁSAI

2.3.1. Az UV sugárzás és a földi élet kialakulása

Az UV sugárzás Janus-arcú jelenség. A sejtek örökítőanyagát roncsolja, így nem

csoda, hogy az élet a részleges védelmet jelentő tengerekben fejlődött ki. Az ózonréteg

megjelenését 2 milliárd évvel ezelőttre teszik, amikor a kékeszöld algák által termelt

oxigén megfelelő szintet ért el. Feltételezhető, hogy az élet kialakulásának idején még

számottevő UVB sugárzás érte a Föld felszínét. A biomolekulákban elnyelődő

fotonoknak szerepe lehetett az élet kialakulásában és a korai evolúcióban. A vékonyodó

ózonréteg alatt napjainkban ismét előtérbe kerül az UVB sugárzás immunszuppressziót,

szürkehályogot, leégést és bőrrákot okozó hatása.

Máig sem tisztázott kérdés, hogy hogyan kerültek az első biomolekulák a Földre.

Ígéretes elképzelések szerint külső forrás is feltételezhető. A híres Miller-Urey kísérlet

óta több sikeres próbálkozás történt szerves vegyületek, cukrok, amino- és nukleinsavak

„őslevesből” történő előállítására. A kiindulási anyagok, H2O, CO, CO2, CH3OH, NH3

és szükséges energiaforrásként az elektromágneses sugárzás a bolygóközi térben

megtalálhatóak (Munoz Caro és mtsai 2002). A mai tudományos vélemény szerint a

fiatal Földön a légköri körülmények nem igazán kedveztek a szerves molekulák

véletlenszerű szintézisének (Chyba 2005). A bolygóközi tér anyagát besűrítő

porszemcsék, meteoritok és üstökösök azonban lehetséges helyszínei ilyen reakcióknak.

A bolygóközi tér szerves anyagának egy része ma is eljut a Föld felszínére. A

meteoritok egyik fajtájának, a szenes kondritok anyagának akár 5 súlyszázalékát is

szerves vegyületek teszik ki. A Murchison meteoritból nukleinsav-analógokat,

aminosavakat és cukrokat tudtak izolálni (Cooper és mtsai 2001, Epstein és mtsai 1987,

Stoks és Schwartz 1982). A 4,5–3,8 milliárd évvel ezelőtt zajlott késői erős meteorit

bombázás idején a jóval sűrűbb légkör (10 bar CO2) erősen lefékezte a belépő

meteoritokat. 10 km/sec becsapódási sebesség alatt a szerves vegyületek sem

szenvedtek teljes hőbomlást (Chyba és mtsai 1990). Az Antarktisz jegéből izolált 50–

100 µm átmérőjű mikrometeoritok jelentős tömeget képviselnek, nagy részük erősebb

felhevülés nélkül érte el a Föld felszínét. A késői erős bombázás időszakában, ami

17

egybeesik az élet kialakulásának feltételezett időpontjával, így 106–107 kg/év szerves

anyag érkezett a bolygóközi térből a Földre, ami bőven fedezhette a mai 1014 kg-os

biomassza széntartalmát (Clancy és mtsai 2005).

A Földre való megérkezés előtt a szerves anyagot a világűrben folyamatos

ultraibolya sugárzás és vákuum hatás érte. A világűrbeli paraméterek biológiai mintákra

kifejtett hatását számos tudományos kísérletben vizsgálták. Baktérium spórákkal

folytatott kísérletek szerint a spórák egy része képes ellenállni a világűrben uralkodó

szélsőséges körülményeknek (Rettberg és mtsai 2002). Az információt tároló DNS és

RNS makromolekulák is elég stabilak, ha por vagy agyag szemcsékhez adszorbeálódva

bizonyos védelmet kapnak (Scappini és mtsai 2004).

A pánspermia elmélet az élet bolygók közti átvitelének lehetőségével foglalkozik.

A meteorit becsapódások által a felszínből kilökött porszemcsék és kőzetdarabok más

égitestekre is eljuthatnak. Modellszámítások alapján 109 nagyságrendbe teszik az elmúlt

4 milliárd év alatt a Marsról a Földre érkezett meteoritok számát (Mileikowsky és mtsai

2000). Ezeknek felszínén és repedéseiben a mikroorganizmusok kis százaléka képes

lehet túlélni a kilőkődés, az utazás és a becsapódás viszontagságait. Az út során az élet

szempontjából az egyik legkritikusabb tényező a világűrben uralkodó nagy energiájú

UV sugárzás és az extrém vákuum (Horneck és Baumstark-Khan 2001).

A világűrben a Nap UV sugárzása mellett a Napból származó részecske

sugárzással is számolni kell. A napszél és a napkitörések anyaga 90–95%-ban

protonokból, 5–10%-ban α-részecskékből és viszonylag kevés nehéz ionból áll. A

Naprendszert elérő galaktikus kozmikus sugárzás protonokat (85%), elektronokat, α-

részecskéket (14%) és 1% körüli arányban nehéz ionokat, ún. HZE – nagy (High)

töltésű (Z>2) és energiájú (E) – részecskéket tartalmaz (Horneck 1998).

Biológiai szempontból a HZE részecskék a legveszélyesebbek. Az elnyelő

anyagban (kőzetdarabban) másodlagos sugárzást keltenek, ezért az általuk leadott

energia nem a felszínen a legnagyobb, hanem hozzávetőleg 10 cm-es mélységben

(Mileikowsky és mtsai 2000). A HZE részecskék fluxusa viszonylag alacsony

(a kozmikus sugárzás ≈1%-át adják) és a Bacillus subtilis spórákkal folytatott

kísérletekben elsősorban azokat a spórákat inaktiválták, amik az útjukba estek (vagy

0,2 µm távolságon belül voltak), de még a telibe talált spórák 27%-a is életképes maradt

18

(Horneck és mtsai 2001a). A számítások szerint olyan apró célpontok, mint a spórák

(0,2 µm2) vagy bakteriofágok (0,004 µm2) sok egyedet tartalmazó populációiban több

százezer év után is számottevő lehet a túlélők száma (Horneck 1998).

Az élet a világűrön keresztül el is hagyhatja a Földet. Régóta ismert, hogy az

űrjárművek nem sterilezhetők tökéletesen. Mikroorganizmusok millióit viszik magukkal

a világűrbe és arra az égitestre, ahova leszállnak. Korábban feltételezték, hogy a világűr

extrém körülményeit a potyautasok úgysem képesek túlélni. Alaposabb vizsgálat

azonban rámutatott, hogy különösen a járművek rejtett zugaiban van esély

biomolekulák ilyetén átvitelére (Nicholson és mtsai 2005). A kontamináció

értékelhetetlenné teszi az élet nyomai után való kutatást. Ezért felvetődött a Marson

nemzeti parkokhoz hasonló bolygóvédelmi övezetek kijelölése (Horneck és

Cockell 2004).

2.3.2. Exobiológiai vonatkozások

Az exobiológia az élet Földön kívüli lehetőségével foglalkozó tudományág.

Közvetlen bizonyítékokra mind a mai napig nem támaszkodhat. Lehetőség nyílik

viszont az élet világűrbeli sorsának tanulmányozására, az ehhez kapcsolódó elméletek

mérésekkel történő alátámasztására. Az űrkutatás más területeihez hasonlóan az itt

született eredmények nem csak elméleti jelentőséggel bírnak, hanem fontos

következményekkel számolhatunk a földi élet sorsára vonatkozóan is.

Ilyen jellegű kísérletekre a múltban többször sor került (pl.: Biopan, Perseus,

LDEF – Long Duration Exposure Facility). A legújabb lehetőséget a Nemzetközi

Űrállomás (International Space Station – ISS) jelenti. Az ISS felépítése 1998-ban

kezdődött, elkészültével a legnagyobb űrbeli létesítménynek fog számítani. A 45 tonnás

építmény 350–400 km magasságban, 90 perc alatt kerüli meg a Földet. 6 laborató-

riumában 6–7 asztronauta állandó munkáját tervezik.

Az Európai Űrügynökség (ESA) kifejlesztett egy asztrobiológiai kísérletek

végzésére alkalmas berendezést, amit az űrállomás tartószerkezetére fognak rögzíteni.

Az EXPOSE egység fő célja az űrbeli körülményeknek a mikroorganizmusokra és a

biológiailag fontos makromolekulákra kifejtett hatásainak vizsgálata. A berendezés

fedélzetére tervezett kísérletek segítségével további értékes adatokhoz juthatunk az

örökítőanyag világűrbeli sorsát illetőleg (5. ábra).

19

5. ábra. A Nemzetközi Űrállomás és az EXPOSE egység (NASA–ESA)

Az ESA által támogatott első 8 exobiológiai kísérlet közül 6 a ROSE (Response of

Organisms to the Space Environment) nemzetközi konzorcium tudományos kísérlete.

Ezek egyike a magyar PUR (Phage and Uracil Response), melynek célja az űrbeli

körülmények hatásainak vizsgálata nukleinsavakon és modelljeiken. Az adatok

kiértékelése közelebb vihet számos alapvető kérdés megválaszolásához:

– Lehetséges-e biológiailag releváns molekulák, vagy ezek darabjainak átvitele a

világűrben egyik égitestről a másikra – esetleg meteoritokhoz kötődően?

– Miként alakulhatott ki az élet a maitól eltérő összetételű ősi légkörben?

– Fennmaradhat-e az élet akkor, ha az ózonpajzs tovább vékonyodik?

2.3.3. A jelen ökoszisztémát érintő változások

A felszínt érő UV sugárzás nem csak az élet múltja és jövője szempontjából

érdekes, hanem jelenét is befolyásolja. Az ózonréteg vékonyodása által okozott

változások már ma is komoly hatással vannak a földi ökoszisztémára.

Az élelmezési szempontból fontos gabona, kukorica terméshozamát az UVB

terhelés csökkenti, jóllehet a jelenség csak igen súlyos ózon fogyásnál válna

számottevővé. A besugárzás növekedésével a növények beporzási időszaka korábbra

tolódik, az ezt végző ízeltlábúak fejlődési ciklusa azonban csak hosszabb idő alatt tud

alkalmazkodni a megváltozott körülményekhez. A házi- és haszonállatoknál azonban

már most leírták a szürkehályog és a szőrtelen testtájak daganatainak gyakoribb

megjelenését, ami gazdasági károkat okoz. Elsősorban egyes fejlődő országokban a

20

tenger az élelem fő forrása. Az ultraibolya sugárzás megtizedelheti a tápláléklánc alapját

képező planktonok állományát. Másfelől a csekély alkalmazkodó képesség miatt a

tengeri állatok ikráinak és lárváinak jelentős részét is elpusztítja (Nilsson 1996), így

éppen a legszegényebb területek juthatnak a nyugat CFC-kibocsátása miatt az éhínség

szélére.

Az ipari méretű égetés nyomán felszaporodó szén-dioxid felelős az

üvegházhatásért. Az UVB sugárzás emelkedésével az erdők biomasszája megcsappan,

és a tengeri algák fotoszintézise is jelentősen csökken, így a szárazföldi és a vízi

élővilág is kevesebb CO2-t tud megkötni. Az óceánok vizében felhalmozódó

humuszsavak vagy a fában lévő lignin kevéssé vesznek részt a biológiai körforgásban.

UV sugárzás hatására azonban bomlanak, a termékekből pedig a mikroorganizmusok

már fel tudják szabadítani a szén-dioxidot (Nilsson 1996).

Az ózon fogyatkozásának következményeit tehát nem elég a humán populáció

szintjén és más jelenségektől (pl.: az üvegházhatástól) izoláltan felgöngyölíteni, hiszen a

bolygó valamennyi élőlénye egymásra van utalva.

2.3.4. Az egészség és a napfény

Az élet ma ismert formáinak többségét a napfény tartja fenn. Az ember

létezéséhez szükséges éghajlat kialakításán kívül fontos, hogy a táplálék fotoszintézis

útján keletkezik. Látásunk a földfelszínt legnagyobb mértékben elérő hullámhosszakra

(400–800 nm) érzékeny csapokra és pálcikákra épül. A 7-dehidrokoleszterin B-gyűrűje

a bőrben UV sugárzás hatására hasad, a keletkezett kolekalciferolból két további

hidroxilációs lépés nyomán keletkezik a kalcium- és foszfor-anyagcserét irányító

D-vitamin, aminek újabban rákellenes hatását is feltételezik (Ainsleigh 1993). Az UV

sugárzás féken tartja a bőrfelületen és a környezetben élősködő mikroorganizmusokat

(nyáron kevesebb az acne). A fény gyógyító hatását a dán Finsen felismerése óta a

fototerápiában is alkalmazzák (Roelandts 2002). Az alvás-ébrenlét és a szteroid

hormonok cirkadián ritmusa a napszakok váltakozásához kötött (Fonyó 1999). A téli

depressziókért részben a napfény hiányát teszik felelőssé. A napfényre tehát előnyös

hatásai miatt mindenképpen szükségünk van. Az 1. táblázat emellett azonban

összefoglalja azokat a káros hatásokat is, amelyekkel az ultraibolya sugárzás kapcsán

számolnunk kell.

21

1. táblázat. Az ultraibolya sugárzás hatásai egészségünkre

Előnyös hatások: Káros hatások: Molekuláris hatások: D-vitamin szintézis immunszuppresszió oxidatív stressz

csíraszám csökkentés hóvakság, cataracta fehérje/lipid peroxidáció fototerápia leégés, bőrrákok DNS károsodás

2.3.5. Immunszuppresszió

Az immunrendszer UV okozta károsodása bőrtípustól függetlenül lép fel. Az

addig sajátként felismert sejtfelszíni molekulák besugárzást követő megváltozása, a

sejtek fotolízisével felszabaduló, addig elzárt antigének (pl.: DNS, hisztonok) és a

membrán bomlásakor keletkező arachidonsav metabolit prosztaglandinok gyulladásos

választ (napallergia, fotodermatitis) indítanak meg. A leégést követő

immunszuppresszió feladata ennek kivédése lehet.

A sugárzás elsődleges célpontja az epidermisben elhelyezkedő, vagy azon

átvándorló antigént prezentáló Langerhans-sejt. Feladata a szervezet első védelmi

vonalán áttört ágensek felkutatása és bemutatása a nyirokcsomókban. UV sugárzás

hatására a sejtek eltűnnek a bőrből és dendritikus morfológiájuk is megváltozik. A

jellegzetességüknek számító MHC-II, ICAM és ATP-áz expressziója csökken. Helyüket

mononukleáris makrofágok veszik át (Vink és Roza 2001).

Az urokaninsav izomerizációja és a DNS károsodása folytán megváltozhat a

gyulladásban szereplő gének expressziója. A besugárzás hatásait utánozni képes

radiomimetikum a stratum corneumban a hisztidin deaminációjával keletkezett

izomerből UV sugárzás hatására kialakuló cisz-urokaninsav, ami TNF-α-t szabadít fel

(Nilsson 1996).

Végeredményképpen a drenáló nyirokcsomókban a T-sejtek aktiválódása zavart

szenved, az antigén prezentáció kisiklik a T-szuppresszorok (Th2) felé, ahogy azt a

6. ábra is mutatja. A T-helper (Th1) sejtek működését a besugárzás hatására felszaba-

duló TNF-α és IL-10 gátolja. Mindkét sejttípus a másik funkcióját gátló cytokineket is

termel (Th1: IL-12→ Th2↓, Th2: IL-10→ Th1↓). A celluláris immunválasz gyengül, a

humorális immunválasz túlsúlyra jut, idegen anyagokkal szemben nő a tolerancia, amit

a kontakt hyperszenzitivitás csökkenése jelez (Grossman és Leffell 1997).

22

6. ábra. Az immunválasz módosulása UV besugárzás hatására

(Grossman és Leffell 1997 nyomán): Az áthúzott nyilak az adott hatás gátlását jelzik

Az autoimmun kórképek közül a humorális eredetű szisztémás lupus

erythematodes (SLE) UV sugárzás hatására fellángol (vespertilio a fénynek kitett

testtájakon). A celluláris immunitás hibájából kialakuló sclerosis multiplex (SM) vagy

psoriasis remisszióba kerülhet (PUVA kezelés).

A sejtes védekezés gyengülése túlérzékenységi reakciók csökkenésével és latens

herpes labialis aktiválódásával jól követhető. Finsen (Nobel-díj, 1903) leírta, hogy a

napfény gyógyítólag hat a bőr tuberculosisára, később viszont kiderült, hogy a

pulmonális TBC-t rontja. A besugárzás csökkentheti az élő, attenuált kórokozókkal

végzett vakcinálás hatékonyságát, sőt veszélyessé teheti azt (pl.: BCG). Az UV

irradiáció immunszuppresszív hatása folytán fokozza a legtöbb fertőző betegségre

(pl.: HIV, TBC, herpes, candidiasis, listeriosis) való fogékonyságot (Armstrong 1994).

A lokális és generalizált immunszuppresszió a daganatok, bőrrákok kialakulásának is

kedvez (Longstreth és mtsai 1998).

23

2.3.6. Hóvakság, szürkehályog

A szembe jutó UV sugárzás nagy részét a cornea és a lencse nyeli el, így főleg

ezek károsodása várható (Tenkate 1998). Az okulonegatív hatásokhoz a szervezet nem

tud adaptálódni.

A fotokeratitis, fotoconjunctivitis és a retinopathia tünetei akut sugárártalomként

24 órán belül jelentkeznek. A vörös szem, fájdalom, könnyezés, fénykerülés jellegzetes

tünetegyüttesét hóvakságként emlegetik. Reflektáló környezetben – homokon, vízen

vagy havon – folytatott tevékenység, védőpajzs nélküli hegesztés, szolárium használat

kapcsán lép fel.

Közegészségügyi és gazdasági szempontból a legjelentősebb késői szemhatás az

UV sugárzás által kiváltott szürkehályog (kortikális cataracta). A cataracta

világviszonylatban a vakság leggyakoribb oka. A szemlencsét felépítő hosszú kollagén

rostokat az UV sugárzás széttördeli, ami a lencse átlátszóságának csökkenését

eredményezi. Az UV sugárzás az alkoholizmussal és a cukorbetegséggel azonos súllyal

latba eső rizikótényező! Szürkehályog műtét vagy látásélességet javító beavatkozás

(CLEAR – Clear Lens Extraction and Replacement) során a műlencse (IOL – Intra-

Ocular Lens) ma már UV-abszorbenssel dúsított sziloxán-akrilát kopolimerből készül.

A pinguecula (a cornea transzparenciáját csökkentő burjánzás) és a pterygium

(a conjunctivális nyálkahártya ráterjedése a corneára) vonatkozásában az UV sugárzás

szintén hajlamosító tényező lehet (Longstreth és mtsai 1998).

2.3.7. Az UV sugárzás bőrre gyakorolt általános hatásai

A bőr leggyakoribb akut léziója az UVB hatásra kialakuló napégés, ami a

bőrpírtól a hólyagképződésig fokozódhat. Szövettani képét az epidermisben

apoptotikus, dyskeratotikus keratinocyták (napégés-sejtek) megjelenése, a Langerhans-

sejtek eltűnése és kereksejtes infiltráció, később hyperproliferáció jellemzi.

Legérzékenyebbek az ismételt expozíció után is kevéssé barnuló, világos bőrű

(kevés eumelanin), az I-es bőrtípushoz tartozó, többnyire kaukázusi, gyakran szeplős,

vörös (sok pheomelanin) vagy szőke hajú, kék szemű egyének. Náluk a legnagyobb a

24

bőrrákok kockázata is. A másik szélsőséget az V-ös bőrtípusú, sötét bőrű afrikaiak és

afro-amerikaiak képezik (Moan és mtsai 1999). A hazai népesség legnagyobb része a

II–III. bőrtípusba sorolható.

A napfényre való érzékenységet a testfelület pigmentációja alapvetően

meghatározza. Az egyedfejlődés során a mélybe vándorolt neuro-ektodermális eredetű

melanocyták az általuk termelt pigmenteket a környező keratinocytáknak adják át

(Szende 1999). A barna eumelanin fényelnyelése révén védi a bőr mélyebb rétegeit a

sugárzástól. A narancssárga pheomelanin viszont UVB hatására oxigén gyököket hoz

létre, sőt feltételezik közreműködését a melanomák kialakulásában is. A 7. ábrán a

normalizált sérülési hatásspektrum melanin jelenlétében 320 nm felett jelentősen eltér a

DNS sérülési hatásspektrumától. Ezeken a hullámhosszakon a melanin járulékos

kromofórként igen jelentős elnyelést mutat (lásd a 9. ábrát is) és közvetett módon –

például szabad gyökök révén – hozzájárulhat a sérülések kialakulásához (Setlow 1999).

7. ábra. DNS, DNS+melanin és epidermis modell elméleti sérülési hatásspektruma

(Setlow 1999 nyomán): 20 µg/ml DNS és 12 ng/ml melanin abszorpciós spektrumának

összegeként meghatározva, 270 nm-nél 1 értékre normálva, valamint az epidermis

transzmissziós spektrumával súlyozva

25

Ma a Föld felszínére elsősorban a legkisebb energiájú UVA sugárzás jut el. Mivel

a melanin szintézisét serkenti, ezért a szoláriumokban felhasználják a barnulás

eléréséhez. A kellemetlen leégés kialakításában nem főszereplő, emiatt azonban

veszélyes is, mert észrevétlenül nagy sugárterhelést okozhat, és egyértelműen szerepet

játszik a legrosszabb indulatú bőrrákok, a melanomák kialakulásában (Gallagher és Lee

2006). Xiphophorus halakban sokszorosára nőtt a melanoma előfordulása UVA

besugárzás után, amiben nem a DNS, hanem közvetett módon a melanin elnyelésének is

szerepe lehet (Setlow és mtsai 1993). Elsősorban a krónikus UVA sugárzás

bőröregedéshez vezet. Hatásait részben reaktív oxigén gyökök (ROS – Reactive Oxygen

Species) közvetítik. Az abnormális elasztikus és a degenerálódó kollagén rostok miatt a

bőr elveszti rugalmasságát és ráncosodik .

Napjainkban az ózonréteg vékonyodása miatt egyre jelentősebb az UVB

expozíció. Ezt a sugárzást a szoláriumok is felhasználják, mert a melanin felszabadítása

révén gyorsítja a barnulást. Kellemetlen hatásai közé tartozik a bőrpír (erythema) és a

leégés kiváltása. Közvetlen rizikófaktora a bőrrákoknak, de a szervezet védekezésének

gyengítésével közvetetten is kedvez a tumorok kialakulásának (Longstreth

és mtsai 1998).

2.3.8. A bőrrákok epidemiológiája

Az UV sugárzás által okozott legsúlyosabb elváltozások a bőrtumorok. Az

idősebb korosztálynál jelentkező nem-melanomatikus bőrrákok (NMSC) a

keratinocyták burjánzásai. Az ide tartozó laphámrák (squamous cell carcinoma, SCC) és

a Krompecher Ödön által elsőként leírt bazálsejtes karcinoma (BCC, ulcus rodens)

kiváltásában a p53 gén UVB okozta gátlásának tulajdonítanak szerepet. A melanocyták

transzformációját a melanoma malignumban (cutaneous malignant melanoma, CMM)

az UVA irradiácóhoz kötik (de Gruijl 1996).

A fehér kaukázusi embercsoport daganatos megbetegedései között a BCC

(basalioma), SCC (laphámrák) és a CMM (melanoma) igen gyakori, az Egyesült

Államokban például az első helyen állnak (de Gruijl 1999). Előfordulásuk 1930 és 1990

között évi 5%-kal emelkedett! De ez csak részben köszönhető a megváltozott napozási

szokásoknak. Incidenciájuk az Egyenlítőtől való távolság növekedésével – az UVB

terhelés visszaesésével – csökken (Moan és mtsai 1999). Mivel a napsugárzás a

26

legelterjedtebb környezeti rákkeltő ágens, a bőrtumorok a leggyakoribb megelőzhető

daganatos betegségeknek számítanak. Leginkább a napfénynek kitett felületeken, arcon,

nyakon, kézháton jelentkeznek, és főleg az I–II-es bőrtípusúakat sújtják. Az egyes

bőrrák típusok kialakulásában és tulajdonságaiban fontos különbségek mutatkoznak,

amiket a 2. táblázat foglal össze.

BCC és CMM esetében megfigyelték, hogy a korábbi feltételezésekkel ellentétben

nem az elszenvedett összdózis, hanem annak időbeli sűrűsödései hozhatók kapcsolatba

az átmenetileg exponált testtájak (pl.: törzs) érintettségével. A gyermekkori leégések

hajlamosítanak a bőrrák kialakulására. A 18. életévet megelőző időszak fontosságát

magyarázza egyrészt, hogy a gyermekek nem figyelnek magukra, bőrük igen érzékeny,

ők szenvedik el az UV életdózis 80%-át és elég sokáig élnek ahhoz, hogy a késői káros

hatások is manifesztálódjanak. A lökésekben érkező sugárzáshoz – a nem rendszeresen

napoztatott testtájakon és a nem jól barnulóknál – a szervezet nem tud hatékonyan

alkalmazkodni, így ez tovább fokozza a kockázatot (Armstrong 1994).

2. táblázat. Az egyes bőrrák típusok fontosabb tulajdonságai

Jellemző BCC (NMSC) SCC (NMSC) CMM Relatív előfordulás gyakori (80%) közepes (15%) ritka (2%)

Incidencia kapcsolata a földrajzi szélességgel

közepes erős gyenge

Kiváltó tartomány UVB UVB UVA Kockázatos UV terhelés gyermekkori leégés kumulatív dózis gyermekkori leégés

Prekancerózis lehet nem ismert actinicus keratosis, papilloma

dysplasiás naevus

Elsősorban károsodik PTCH, p53 ras, p53 ras, INK4a Áttétképző hajlam szinte nincs előfordul igen agresszív

Prognózis jó közepes rossz

27

2.3.9. A bőrrákok tumorbiológiája

Tumorok kialakulásakor a sejtek osztódásának és működésének szabályozása

felborul a folyamatokat irányító szignál transzdukciós útvonalak károsodása miatt. A

sejtek biztosítják maguknak a növekedési szignált (proliferáció), amelyeket gátló

faktorokat a sejtek figyelmen kívül hagynak (dedifferenciáció), kikerülik a

programozott sejthalált (az apoptosist), korlátlan osztódási képességre tesznek szert

(immortalizáció), fenntartják az angiogenezist és szöveti invázióra (metasztatizálás)

válnak hajlamossá (Szende 1999).

Az ultraibolya sugárzás elsődleges célpontja a sejtekben az örökítőanyag,

amelyben az UV fotonok különböző károsodásokat hoznak létre. A jelátviteli utak

maradandó károsodása a fehérjéket kódoló gének sérülésére vezethető vissza. Tumorok

kialakulásához elengedhetetlen legalább egy protoonkogén (pl.: növekedési faktor vagy

annak receptora) aktivációja (gain of function). Ez az állapot jellemző a malignomát

megelőző, már osztódási előnnyel rendelkező sejteket tartalmazó prekancerózisokra

(pl.: keratinocyta burjánzás papillomában SCC-nél). A rák kialakulásának ezen

sebesség-meghatározó lépését a differenciációs szignálokra érzéketlen sejtek folyamatos

szelekciója uralja. A malignus transzformációhoz átlagosan további 3–4

tumorszuppresszor gén (pl.: p53, Rb) inaktivációja (loss of function) is szükséges

(Grossman és Leffell 1997). Genetikus prediszpozíció esetén már az őssejtek hordoznak

egy mutációt, ami mellett egyetlen további sérülés (second hit) is elégséges lehet a

transzformációhoz.

A rákok kialakulásában a mutációk mellett legalább ilyen fontos szerep jut a

kijavítás elmaradásának is. Egészséges sejtekben az S-fázis addig nem indul meg, amíg

a DNS hibái fennállnak. Xeroderma pigmentosum A–G variánsaiban a CPD-k és 6-4

PD-k kijavításának autoszomális recesszív elégtelensége vezet a bőrrákok 1000-szeres

incidenciájához (de Gruijl és mtsai 2001). Mindezek alapján a liposzómába zárt

hibajavító enzimek (pl.: T4 endonukleáz V.) a fényvédő készítmények fontos

alkotóelemeivé válhatnak (Yarosh és mtsai 2001).

A bőrrákok esetében több olyan mutációt azonosítottak, amiknek kialakulása az

UV sugárzással közvetlenül kapcsolatba hozható. A kis G-proteineket kódoló ras

protoonkogének károsodását már egyes bőrrákmegelőző állapotokban is sikerült

kimutatni. Ilyen esetek többségében UVB sugárzásra specifikus CC→TT tranzíciókat

28

találtak a ras génben. A mutáns ras a membrán belső oldalához asszociáltan GTP-t

kötve aktiválódik és állandó osztódási szignálként bekapcsolva tartja a növekedési

faktorok tirozin-kináz (TRK) kaszkádját. A PTCH gén hibáját mutatták ki BCC

sporadikus eseteiben, de familiáris Gorlin- és Bazálsejtes naevus-szindrómában (BCNS)

is. A mutációk nagy része itt is UVB-specifikus C→T, CC→TT csere, amiknek

eredményeként felszaporodik az apoptosis egyik inhibitora, a bcl-2 (Mitchell

és mtsai 1996).

Tumorszuppresszorok UV sugárzás okozta mutációja valószínűsíthető az Rb és a

p53 jelátviteli utakat is befolyásoló INK4a gén esetében (de Gruijl és mtsai 2001). A

p53 tumorszuppresszor fehérje kontrollálja a sejtciklust, az apoptosist, a differenciációt

és a DNS repairt is. A p53 mutációja a humán tumorok felében kimutatható (de Gruijl

1996). A sejtmag sérülése esetén G1-fázisban tartja a sejtet, amíg a DNS-t az enzimek

teljesen ki nem javítják, vagy – túlzott mértékű károsodás esetén – sor nem kerül a

programozott sejthalálra (Szende 1999). Ennek megfelelően besugárzás után magasabb

a p53 koncentrációja. A gén működésének köszönhető a daganatok egy részének

elkerülése és a leégést követően az apoptotikus napégés-sejtek kialakulása. A p53

mutációi SCC-ben és BCC-ben az UVB sugárzásra jellemző jegyeket mutatják, kisebb

csoportokba tömörülnek a gén mentén, ami a pirimidin dimerek kijavításának helyi

nehezítettségét tükrözheti. Egy-egy tumorban valamennyi sejt azonos típusú mutációt

hordoz, bizonyítva, hogy egyetlen sejt klonális expanzója alakítja ki a daganatot.

Egészséges és korai rákmegelőző állapotokban a mutációk változatosabbak, ami

szelekciós folyamatok szerepére utal (Grossman és Leffell 1997).

A 8. ábra röviden bemutatja, hogyan eredményezik a bőrrákokhoz kapcsolható

károsodott ras, INK4a, PTCH és p53 proteinek a sejt bizonyos jelátviteli útjainak kóros

serkentését, más utak esetében pedig azok kóros gátlását. Végeredményképpen a

sejtciklust irányító ciklinek és ciklin-dependes-kinázok (cdk) aktivitásában történik

változás, ami miatt a sejtosztódás és annak gátlása közötti finom egyensúly felborul.

29

8. ábra. A különböző jelátviteli utak szerepe a sejtciklus szabályozásában

(Szende 1999 kiegészítésével)

2.4. MOLEKULÁRIS HATÁSOK, A DNS KÁROSODÁSA

2.4.1. Molekuláris fotobiológia

Biológiai hatást a fotobiológia I. alaptörvénye értelmében csak az abszorbeált

energia okoz. A sugárzás elnyelésében főszerepet játszó molekulák a kromofórok,

amelyek rájuk jellemző abszorpcióval rendelkeznek. A sejt összetevői a melanin

kivételével az UVA-t kölcsönhatás nélkül átengedik. Az ózon fogyatkozásával

felszaporodó UVB-t a 9. ábrán bemutatottak szerint abszorbeálják, ezért az jelentős

hatással van rájuk. A keletkező fotoproduktumok biokémiai változásokhoz, azok pedig

a sejt reakciójához és az erre adott szervezeti szintű válaszhoz vezetnek (Longstreth és

mtsai 1998) (9. ábra).

30

9. ábra. A sejtek kromofórjaitól indul a biológiai hatás megjelenéséhez vezető több-

lépcsős folyamat, a fő kromofórok közé tartozik az örökítőanyag mellett a melanin és

az urokaninsav, továbbá a fehérjékben megtalálható két aminosav: a tirozin és a trip-

tofán; 290 nm alatti komponenseket a természetes felszíni sugárzás nem tartalmaz

(Longstreth és mtsai 1998 nyomán)

A sugárzás oki szerepének bizonyítéka, ha egy-egy biológiai végpontot

(pl.: erythema, karcinogenezis, sejthalál) sikerül egyetlen molekuláris fotoproduktumra

visszavezetni (pl.: DNS sérülések). Ebben az esetben a következmény hatásspektruma

és a keresett, sérülő vagy szenzibilizátor kromofór (pl.: DNS) elnyelési színképe

megegyezik. Hatásspektrumon az objektum által a vizsgált hatás szempontjából

egyetlen beeső foton felé mutatott felület (hatáskeresztmetszet), vagy az átalakult

molekulák és az elnyelt fotonok arányának (kvantumhatásfok) a hullámhossz

függvényében való ábrázolását értjük (Rontó és Tarján 1997).

2.4.2. Lipidek és fehérjék UV sérülései

A fehérjék egy része, a zsírszerű anyagok és egyéb sejtalkotók nem nyelnek el

jelentős UV energiát, de károsodásuk reaktív oxigén gyökök útján kialakulhat. Kivételt

képeznek a bőrben a fényelnyelésre specializálódott vegyületek, mint az urokanin és

elsősorban a melanin. Az UV sugárzás arachidonsav felszabadulásához vezet

31

membránlipid peroxidáció és az ezt követő foszfolipáz-hidrolízis révén. Az

arachidonsav metabolitjai a gyulladásos mediátorként ismert prosztaglandinok. Ez is

hozzájárul a leégés alkalmával fellépő inflammáció kialakulásához (Grossman és

Leffell 1997). A sejtváz érintettsége része lehet a karcinogenezisnek, mert a

mikrotubulusok szerepet játszanak a sejt növekedésében és osztódásában.

A proteinek a sejtek szárazanyag-tartalmának több mint 50%-át teszik ki. Az UV

sugárzás okozta sejthatások hatásspektrumának a DNS elnyeléséhez viszonyított

vöröseltolódása a fehérjék szerepére utal. Abszorpciójuk jelentősége egyértelmű az

izokromatid törések és a fehérjékhez kapcsolt sejtfunkciók, mint a nátrium- és

aminosav-transzport szempontjából. Megfelelő hullámhosszon végzett besugárzás az

enzimaktivitás csökkenését eredményezi. A fehérjék fő kromofórjai az aromás

aminosavak, a tirozin és a triptofán – elnyelésük csak 220 nm alatt és 300 nm felett

közelíti meg a DNS-ét.

2.4.3. A fehérjék szerepe a DNS sérülésében

A DNS–fehérje keresztkötések kialakulásának hatásspektruma a DNS elnyelését

követi, majd egy második csúcsot mutat 400 nm-nél, amiben járulékos kromofóroknak

lehet jelentőségük (Peak és Peak 1991). Anaerob körülmények között a keresztkötések

száma megcsappan, ami reaktív oxigén szerepére utal (Distel és mtsai 2006). A

hisztonokkal való keresztkötés timin–lizin és uracil/timin–SH-csoport kapcsolatnak

tudható be. Az ilyen típusú sérülések kialakulása a besugárzást követően is folytatódik,

amit részben a CPD-k kijavítására érkező enzimeknek a DNS-hez való kötődésével

magyaráznak (Moan és mtsai 1999). A keresztkötések kijavítására az élő szervezetek

igen hatékony mechanizmusokkal rendelkeznek (Peak és mtsai 1985).

Támadáspontot az UV fény számára főleg a kromatinban elhelyezkedő DNS

jelent. A promóter szekvenciákhoz kapcsolódó transzkripciós aktivátor és represszor

fehérjék védhetik és érzékenyíthetik is a DNS-t (Pfeifer 1997). A DNS–fehérje kötődés

fotoproduktumok keletkezését befolyásoló hatását elsőként a lac operon esetében

tapasztalták (Becker és Wang 1984). Valószínűleg a fehérjék jelenléte árnyékolás révén

nem csak védheti a genomot, hanem a B-DNS geometriájának torzításával megkönnyíti

a szomszédos nukleotid bázisok kettős kötéseinek fedésbe kerülését is. A lánc görbítése

számos átírási faktor funkciójához elengedhetetlen, ugyanakkor a legnagyobb sérülés

32

sűrűséget éppen ezeken a szakaszokon mérték. A lokálisan kialakuló konformáció

jellege szabja meg, hogy melyik lézió milyen gyakorisággal keletkezik. A kötődő

fehérje a hibák kijavítását is gátolhatja, így fokozva a mutagén hatást. Másfelől a

fotoproduktumok erősen akadályozhatják a DNS-regulátor proteinek kötődését. A

sejtciklus szabályozásának befolyásolásával ennek a tumorok kialakulásában is szerepe

lehet (Pfeifer 1997).

2.4.4. A DNS UV elnyelése

A dezoxiribonukleinsav kettős spirálban egymással szemben komplementer

nukleotid bázisok helyezkednek el, a molekula kitekert szerkezete létrához hasonló

képet mutat (10. ábra). A sejt örökítőanyaga szerencsétlen véletlenképpen az UV

sugárzás fő kromofórja is. Elnyelési spektruma a sejthalál, a kromoszóma aberrációk és

a transzformáció kialakulásának hatásspektrumához nagyon közel áll, vagyis sérülése e

folyamatok megindítója. A DNS a legnagyobb energiájú UVC fotonokra a

legérzékenyebb, abszorpciós maximuma 260 nm körül van, így a molekuláris hatások

vizsgálatához ez a tartomány jól használható. Biológiai szempontból a Föld felszínén

csak a DNS által szintén hatásosan abszorbeált UVB-vel kell számolni. A 220–300 nm-

es sávban valamennyi bázis elnyel, ellentétben a nukleinsav cukor és foszfát

komponenseivel. UVA esetén endogén fényérzékenyítő anyagok közvetítésével a DNS

fotooxidációja kerül előtérbe. Az UV sugárzás hatására igen változatos léziók

keletkezhetnek, amelyek egy részét a 10. ábra mutatja be. A különböző típusú

fotoproduktumok egymáshoz viszonyított aránya a sugárzás színképétől és a

körülményektől függ. UVC–UVB hatására túlnyomó többségben dimer

fotoproduktumok alakulnak ki két szomszédos pirimidin bázisból (Mitchell

és mtsai 1996).

33

10. ábra. A DNS sematikus ábrája és a különböző UV fotoproduktumok

(Mitchell és mtsai 1996 nyomán)

A fotoproduktumok mutagenitása sejttenyészeteken, bőrrákok és szintetikus

oligonukleotidok esetében jól követhető. A DNS öröklődő károsodásai többnyire

tranzíciók (G↔A,C↔T), transzverziók (G/A↔C/T), tandem mutációk (két bázist érint)

és frame shiftek (3-mal nem osztható számú bázis inzerciója vagy deléciója).

A környezet is nagymértékben befolyásolja a DNS viselkedését, ezért erre is

tekintettel kell lenni az örökítőanyagban lejátszódó folyamatok vizsgálatakor. Nem csak

a nukleinsav denaturációját okozó hőmérséklet-, víztartalom-, ionerősség- vagy pH-

változások fontosak. A DNS stabilitása széles tartományban (pH 5–9; ionerősség

10-3–1; hőmérséklet: 0 °C–DNS olvadáspontja) nem mutat jelentős változást. Az életnek

pontosan egy ilyen, szélsőségek között is megbízható információhordozóra van

szüksége.

A környezet változásaira az örökítőanyag konformáció-változással reagál, ami a

DNS–UV fény kölcsönhatást, az elnyelési spektrumot is befolyásolja. A protonálódás és

töltés-átrendeződés talaján meginduló denaturációt minden esetben hyperkrom effektus,

a nukleotid bázisok „stacking” kölcsönhatásának csökkenése jelzi. Míg a normál

34

DNS-ben, 3,4 Å bázistávolság mellett a lánc elnyelési spektrumának minősége az azt

felépítő mononukleotidokéhoz képest nem tér el (a λmax azonos), addig az abszorpció

mértéke ≈30%-os csökkenést mutat. A helikális konfigurációban létrejövő

kölcsönhatások nem szolgáltatnak kielégítő magyarázatot, hiszen a hypokrom effektus

akkor is fellép, ha nincs geometriai rendezettség. A nukleozidok elnyelése a hidrofób

erőknek köszönhetően apoláros oldószerekben is csökken. Sőt, RNS, egyszálú DNS és

szintetikus polimerek esetében kimutatták, hogy nem is a hidrogén-kötésektől függ. A

hypokromia mértéke a lánc hosszával hozzávetőleg a 10. tagig növekszik.

Magyarázattal az egymás közelében lévő bázisok elektrosztatikus kölcsönhatása és az

ezt elősegítő – poláros közegben fellépő – hidrofób erők szolgálnak. Az alap és a

gerjesztett állapot közötti elektronátmeneteket jellemző vektorok a fentieknek

köszönhetően az egyes bázisok esetében részleges fedésbe kerülnek (Patrick és Rahn

1976). A bázisok egymásra rétegződésében bekövetkező változások a spektrumban

ezért gyakran hyperkrom effektusként észlelhetők.

2.4.5. A DNS gerjesztése

A DNS-ben elnyelt UV foton a nukleotid bázis kettős kötéseinek egyik π elektron-

ját egy addig üres π* lazító pályára juttatja, így keletkezik a 260 nm-es abszorpciós

csúcs. A σ elektronok hasonló viselkedése ritka. Átrendeződések, különböző gerjesztett

állapotok érintettsége, kovalens kötések szakadása és létrejötte, valamint a molekula

más részeinek való energiaátadás segítségével a végállapot három úton érhető el. Az

alapállapotba az energiának foton (fluoreszcencia, τ

35

11. ábra. A gerjesztő foton energiájának sorsa (Jablonski-diagram)

A 12. ábrán látható módon az alapállapotból nincs közvetlen átmenet a triplett

állapotba. Az elektron gerjesztett szingulett állapotának legalacsonyabb vibrációs

szintjéről viszont már nagyobb valószínűséggel valósul meg az ábrán is jelölt spin–

tiltott ISC a triplett állapotba. Az átmenet a fordított irányban is hasonlóképpen

nehézkes. A triplett állapot lecsengése ezért lassabb, így foszforeszcenciára (τ>10-3

másodperc) képes és a gerjesztés hosszabb élettartama miatt kémiai reakcióra is jóval

hajlamosabb! Egyes érzékenyítő molekulák (pl.: pszoralén a PUVA-ban) képesek a

saját maguk által elnyelt energiát az alacsonyabban fekvő triplett állapotba pumpálni,

ezzel kedveznek a DNS fotoproduktumok kialakulásának (Patrick és Rahn 1976).

12. ábra. Az energiaállapotok közötti lehetséges átmenetek; a szingulett állapotból

inter-system crossing révén kialakuló triplett állapot a DNS fotoproduktumok elő-

futára lehet (Patrick és Rahn 1976 nyomán)

36

A kettős hélix szerkezet megváltoztatja a bázisok gerjesztett állapotának

lecsengését és azok ilyen körülmények között egymásra is erősebben hatnak. Már

dinukleotidokban is kialakulhatnak excimer állapotok, amiket egy szingulett gerjesztett

és egy szomszédos, alapállapotú bázis hoz létre (Crespo-Hernandez és mtsai 2005). A

köztük lévő távolság az energia minimumra való törekvés és a megváltozott

körülmények miatt csökken, a gerjesztés következményein immár osztozik a két

molekula. A kialakuló közös energiaszintek alacsonyabbak és valamivel hosszabb

élettartamúak lesznek a szingulett állapotéinál. Így az excimerek a fotokémiai reakciók

és a triplett állapotok előfutáraivá válhatnak.

Bár a helikális stabilitás 10 tag fölött nem növekszik tovább, a lánc hosszával új

lehetőségek nyílnak a többlet energiától való biztonságos megszabadulásra, így az

abszorpció is változhat. A foton elnyelése és a gerjesztett állapot kialakulása közötti

időben az energia egy része a közeli, szomszédos kromofór alacsonyabb

energiaszintjeire átadható. Kétszálú DNS-ben az energia a fotont elnyelő szál gerince

mentén eloszolhat. Ha sérülés alakul ki, azt az ép komplementer lánc segítségével a

hibajavító enzimek ki tudják javítani (Crespo-Hernandez és mtsai 2005). A jelenség

szétterjedésének a lánc teljes hossza felett még alacsony hőmérsékleten is gátat szab,

hogy G–C bázispárokból kialakuló excimerek alacsony energiaszintjük miatt

csapdaként működnek. Az A–T párok excimerjeiből triplett állapotú T jöhet létre,

aminek révén a gerjesztés a szingulett energiával szemben, bár lassabban, de akár 5

bázis távolságra is elvándorolhat, éppen a nagyobb megoszlás miatt viszont kevesebb

hatással van a DNS tulajdonságaira (Patrick és Rahn 1976).

2.4.6. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD)

Izolált pirimidinek oldatában a ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) triplett

állapoton keresztül transz izomerként keletkeznek. A cisz változat előfutára a szingulett

gerjesztés. Természetes DNS-ben a négy lehetséges diasztereomer közül csak a cis-syn

variáns fordul elő, ami az UVC-UVB sugárzás fő fotoproduktuma (13. ábra).

Kialakulásának leginkább a TT és a CT szekvencia kedvez, ahol a szomszédos bázisok

C5-C6-os kettős kötései között a cikloaddíció nagyobb valószínűséggel történik meg

(Ravanat és mtsai 2001).

37

13. ábra. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) (Ravanat és mtsai 2001)

A CPD-k kialakításában résztvevő fotonok a sérülések visszafordítására is

képesek lehetnek, a folyamat a lézió létrehozásánál mintegy tízszer nagyobb

kvantumhatásfokkal működik. A dimerek kialakulásának kvantumhatásfoka ≈20·10-4,

míg a dimerek fotoreverziójáé ≈650·10-4 (Patrick és Rahn 1976).

UVC-vel végzett besugárzás hatására a sejtekben a nagy molekulasúlyú DNS

szintézisének csökkenését mérték, vagyis a CPD-k a DNS-polimeráz által végzett

elongációt felfüggesztik. Besugárzás hatására a sejtek mitotikus indexe átmenetileg

csökkent az S-fázis elhúzódásának köszönhetően. A jelenséget fotoreaktiváló fénnyel

(UVC) végzett besugárzással – a hosszabb hullámhosszakkal ellentétben, ahol más

fotoproduktumok dominálnak – meg lehetett szüntetni.

Fotoreverziót okozó besugárzás után az eredeti citozin visszaalakulása mellett a

C4-es amino-csoport hidrolítikus OH szubsztitúciójával is számolni kell. Az uracil

megjelenése tranzíciót jelent, pirimidin bázist egy másik pirimidin helyettesít. A

jelenség a megváltozott párosodás miatt mutagenezisre vezethet, mert guanin helyett

adenin fog beépülni a komplementer láncba, majd az újabb replikáció alkalmával az

adenin timinnel kapcsolódik és megtörténik a citozin lecserélése, ami az UVB-re

jellemző elváltozás (Grossman és Leffell 1997).

2.4.7. Pirimidin-(6-4)-pirimidon fotoproduktumok (6-4 PD)

A 6-4 PD-k keletkezése a DNS abszorpciójának vöröseltolódását okozza, ugyanis

az UVC-hez képest elnyelési maximumuk (310 nm) a hosszabb hullámhosszak felé

esik. Fotolízisüket ugyanez a hullámhossz-tartomány okozza. A párhuzamos keletkezés

és bomlás terméke lehet a Dewar valencia-izomer (10%), ami a CC szekvenciákat

preferálja (Taylor és mtsai 1990). A kialakuló sérülések lúgos közegben egyszálú

38

törésként manifesztálódhatnak. A 6-4 PD-k elsősorban a CC és TC szekvenciákat

kedvelik (Pfeifer 1997). Szingulett gerjesztés nyomán az 5’ pirimidin C5-C6-os kettős

kötése és a 3’ bázis C4 karbonil(T)- vagy imino(C)-csoportja között instabil oxetán

vagy azetidin intermedier érintésével cikloaddíció jön létre a 14. ábrán szemléltetett

reakcióban. A biológiai hatásokért elsősorban a szubsztituált pirimidon-gyűrű felelős.

Az 5’ citozin itt is uracillá deaminálódhat, de a 3’ C érintett funkciós csoportja a kötés

kialakításában vesz részt (Ravanat és mtsai 2001).

14. ábra. 6-4 PD és Dewar-izomer kialakulása (Ravanat és mtsai 2001)

Megállapították, hogy az 5’ T-t tartalmazó dipirimidinek 10-szer fotoreaktívabbak

az 5’ C-oknál, és hogy a 3’ C a 6-4 PD-knek kedvez. Kialakulásukhoz a CPD-kkel (7˚)

ellentétben a bázisok jelentős kitekeredése (44˚) szükséges, ami ritkábban valósul meg

(Mitchell és mtsai 1996). Bár mennyiségük a CPD-kének csak 10–50%-a, a sejthalál, a

testvérkromatid cserék, a mutagenezis és a nukleinsav-szintézis gátlása elsősorban a 6-4

PD-kre vezethető vissza (Ravanat és mtsai 2001).

2.4.8. Pirimidinek egyéb sérülései

Az örökítőanyag dehidrált állapotában, elsősorban A-konformációban és

vékonyrétegeken a pirimidin dimerek egy további változata, a spóra fotoproduktum is

kialakulhat (15. ábra). A két timin bázis között létrejövő 5,6-dihidro-5-(α-timinil)-timin

nem csak szomszédos bázisok között alakul ki számottevő valószínűséggel, hanem a

láncon belül nagyobb távolságokat is áthidalhat, sőt különböző láncok között is létrejön

(Douki és mtsai 2003).

39

A CC→TT tranzíció annak ellenére az UVB mutagenezis főszereplője, hogy a

kérdéses szekvencia igen alacsony fotoreaktivitást mutat. Ez azt jelenti, hogy a DNS

öröklődő megváltozását kiváltó hatása – részben a lehetséges deaminációnak

köszönhetően – igen jelentős. A génexpresszió szabályozásában résztvevő 5-metil-

citozin sérüléseinek a protoonkogének aktivációjában lehet szerepe. Szingulett

gerjesztett citozinokon víz molekula nukleofil addíciójára kerülhet sor, aminek

eredményeként citozin-fotohidrát keletkezik. Deaminációval ez a termék uracil-

fotohidráttá is átalakulhat (Ravanat és mtsai 2001), amit a 15. ábra mutat.

15. ábra. Fotohidrát keletkezése (Ravanat és mtsai 2001); spóra fotoproduktum

(Douki és mtsai 2003); jellegzetes oxidatív lézió: 8-oxodGua (Ravanat és mtsai 2001)

2.4.9. Oxidatív léziók

Az UVA tartományban, ahol a DNS molekula elnyelése már kevésbé jelentős,

oxidatív léziók és DNS–fehérje keresztkötések jutnak főszerephez az örökítőanyag

károsításában. Purin bázisok sérülései főleg ezen az úton keletkeznek, de a teljes DNS

UVB okozta károsodásához csak mintegy 1%-ban járulnak hozzá. Kivételt képez az

adeninnek szomszédos adeninnel vagy timinnel kialakított dimerje, ami bizonyítottan

mutagén.

Az I. mechanizmusú reakciók egyelektronos oxidációt vagy H-elvonást

jelentenek. A guanin-kationok képződése elsődleges az alacsony ionizációs potenciál és

a máshol kialakult vándorló elektronhiány befogására való képesség miatt. A kialakuló

produktum elsősorban 8-oxo-7,8-dihidro-2’-deoxiguanozin (8-oxodGua, 15. ábra),

amely prolin vagy lizin peptidkötésben részt nem vevő szabad hidroxil-, vagy amino-

csoportjával lépve kölcsönhatásba a DNS–protein keresztkötések létrejöttében játszik

kulcsszerepet, de adeninnel is párosodhat (G→T transzverzió, UVA jellegzetesség).

spóra fotoproduktum

40

A triplett gerjesztett fotoszenzibilizátorok elektron-transzferrel az adenin

oxidációjára képesek. Levegőztetett vizes oldatban elsősorban 2’-deoxi-inozin és kisebb

részben 4,6-diamino-5-formamidopirimidin (FapyAde) keletkezik (Ravanat

és mtsai 2001).

A purin bázisok C6-os hidratációját követően hidroperoxidok alakulnak ki,

intramolekuláris átrendeződést követően glikolok, formamidok és hydantoinok a

végtermékek. A képet a timinek uracillá történő demetilációja színesíti. A cukor

komponens laktonná alakulása, és N1 deprotonálás során felszabaduló citozin és timin a

hasonló bázisokkal biadduktumokat képezhet, másik lehetőségként guaninnal két bázist

érintő tandem sérülés is kialakulhat.

A II. típusú, domináló oxidáció során a sejt gerjesztett állapotú

fotoszenzibilizátorai (riboflavin, porfirin, szteroid, benzofenon, kinonok) energia

átadásával szingulett állapotú oxigént hoznak létre, de erre az eredményre vezet számos

kémiai reakció is. O2-, OH· és H2O2 keletkezik a NADPH-, a xantin- és a flavin-oxidáz,

a légzési lánc citokrómjai és nukleotid–Fe2+ komplexek működése nyomán is (Ádám

és mtsai 1996).

A DNS-ben az oxidáció legfőbb támadáspontja az elektron-gazdag guanin. A

kettős láncban instabil endoperoxidokon keresztül főleg 8-oxodGua keletkezik. Ennek a

molekulának a jelenléte tehát utal az oxidatív stresszre. Alacsony ionizációs potenciál-

jának köszönhetően másodlagosan is képes I-es és II-es típusú reakciókban részt venni

(Ravanat és mtsai 2001).

2.4.10. Lánctörések

Míg az UVC és UVB régiókban nem a lánctörések a domináns sérülések, addig az

UVA és VIS tartományban a sejtekben több keletkezik belőlük, mint CPD-kből (Peak

és Peak 1991). Itt ugyanis már nem a DNS az egyetlen kromofór, és az alacsony

energiájú UV sugárzás által keltett reaktív oxigén gyököknek a száltörések

kialakulásában nagy szerepe lehet. Biológiai jelentőségük nem szignifikáns, amíg gyors

és teljes kijavításukra lehetőség van, de lánctörésekkel magyarázható a pontmutációk

alapján várható mértéket meghaladó inaktiváció UVA esetében (Moan és Peak 1989).

41

A száltörések közvetlen kialakulásához az elnyelődött fotonnak igen nagy

energiával kell rendelkeznie. Elméleti számítások alapján az egyszálú törések

kialakításához szükséges energiát 20, a kettős szálú törésekhez szükségeset 50 eV

környékén határozták meg (Nikjoo és mtsai 1999). Ilyen nagy energiával jellemzően a

vákuum-UV / röntgen tartományba tartozó fotonok rendelkeznek. Ezekhez képest az

UVC–UVB tartományban jóval kevesebb a száltörés.

A kettős szálú törések keletkezése összefüggést mutat a sejthalállal. Besugárzás

hatására kialakuló hosszú életidejű protein peroxil-gyökök kettős szálú DNS lánctörések

kialakításában is részt vesznek. A fehérjék jelenléte nem csak védheti az

örökítőanyagot, hanem gyökös mechanizmusú reakciókban is hozzájárulhat a sérülések

kialakulásához (Distel és mtsai 2006).

A DNS dehidrációja a száltörések kialakulásának különösen kedvez. A DNS

kettős hélixet stabilizáló hidrátburokból vízmolekulák kivonása olyan szerkezeti

változásokat okoz, amik a cukor–foszfát gerinc kötéseinek felszakadásához vezethetnek.

A vízelvonás az UV sugárzás által kiváltott száltörések kialakulását is fokozhatja. Egyes

fotoproduktumok helyén a dehidráció–rehidráció okozta stressz következtében

alakulhatnak ki száltörések (Dose és mtsai 1996).

2.5. AZ UV SUGÁRZÁS DOZIMETRIÁJA

2.5.1. Fizikai UV dózis

A földfelszínt elérő ultraibolya dózis meghatározására két eltérő, egymást

kiegészítő módszert dolgoztak ki. Számítógépes matematikai számításokban a Nap

sugárzási teljesítményét, a beesési szöget, a fotonokat szóró és elnyelő összetevők –

mint például az ózon, por, vízgőz – koncentrációit veszik figyelembe. Eredményként

elméleti térképek születnek, amiket a várható UV dózis előrejelzésére is fel lehet

használni. A matematikai modellel számított UV-indexhez a W/m2-ben kapott

irradianciát az erythema hatásspektrumával súlyozzák és 40-es szorzófaktort

alkalmaznak (International Comission on Non-Ionizing Radiation, 1995).

42

A hatékony védekezéshez az érintett népesség tájékoztatása nélkülözhetetlen. Ma

már a világ számos táján a Kanadában bevezetett UV-index az időjárás-előrejelzés

részét képezi. A nemzetközi rendszer 0-tól 15-ig terjedő skálát használ, ahol a 8 feletti

értékek már nagyon magasnak számítanak. Az előrejelzés segítségével a bőrtípus

figyelembevételével az egyén számára elkerülhetővé válik a túlzott expozíció.

A másik lehetőség az UV sugárzás direkt mérése, kémiai vagy fizikai hatásai

alapján. Megfelelő aktiválási energiával és hatáskeresztmetszettel rendelkező

fotokémiai reakciók felhasználhatók erre a célra, például az aceton bomlása vagy

poliszulfon rétegek sötétedése (Davis és mtsai 1976). Fizikai dózismérésre elsősorban