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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
EMÍLIA SOUSA DE OLIVEIRA
EMERGÊNCIA DE ENTEROCOCCUS RESISTENTE À
VANCOMICINA NA CIDADE DO NATAL/RN
Natal
Dezembro, 2016
EMERGÊNCIA DE ENTEROCOCCUS RESISTENTE À VANCOMICINA NA CIDADE
DO NATAL/RN
por
Emília Sousa de Oliveira
Orientador: Prof. Dra. Maria Celeste Nunes de Melo
Natal
Dezembro, 2016
Monografia apresentada à coordenação do curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de bacharel em Biomedicina.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia Emergência de Enterococcus resistente à vancomicina na cidade do Natal/RN
elaborada por Emília Sousa de Oliveira
e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina
e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, 08 de dezembro de 2016
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Profa. Dra. Maria Celeste Nunes de Melo (DMP)
_________________________________________
Profa. Dra. Maria José de Brito Costa Fernandes (DMP)
_________________________________________
Me. Miguel Angel Ansaldi Júnior (Centro de Patologia Clínica)
Oliveira, Emília Sousa de. Emergência de Enterococcus resistente à vancomicina na cidadedo Natal/RN / Emília Sousa de Oliveira. - Natal, 2016. 43 f.: il.
Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grandedo Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina. Orientadora: Profa. Dra. Maria Celeste Nunes de Melo.
1. Enterococcus faecalis - Monografia. 2. Resistência àvancomicina - Monografia. 3. VRE - Monografia. 4. PFGE -Monografia. I. Melo, Maria Celeste Nunes de. II. UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 579.86
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB
AGREDECIMENTO
Agradeço primeiramente a Deus por ter me acompanhado em toda a trajetória pelo curso
de Biomedicina dando-me forças quando achava que não conseguiria continuar e lembrando-
me sempre que com Ele tudo é possível.
À minha orientadora, Prof. Dra. Maria Celeste, por acreditar em mim, desde o momento
que cheguei ao laboratório como bolsista do programa Jovens Talentos para Ciências e sem
nenhum conhecimento na área de microbiologia. Pelos vastos ensinamentos que me fizeram
conhecer melhor e amar esse campo de pesquisa.
Ao Prof. Dr. Ermeton pelos seus valiosos ensinamentos e por ser um exemplo, para
mim, de profissional.
A todos do laboratório, aos que já saíram, aos que permanecem e aos que acabaram de
entrar. À Carol, ao Thiago, à Sabina, à Bruna, ao Ganilson, à Bruna Helena, à Julliette, à Talita
e à Renata agradeço por me ensinarem muito do que aprendi nesses mais de quatro anos de
LaBMed.
Às técnicas do laboratório de microbiologia, Erika e Alessandra, por estarem sempre
dispostas a ajudar nas muitas vezes que precisei utilizar algum equipamento do laboratório
escola ou mesmo em responder as minhas inúmeras dúvidas.
Aos meus pais, pela formação, sempre incentivado ao estudo e pesquisa, pelo carinho e
apoio e por serem meu alicerce nessa jornada.
Aos meus irmãos por esteram presentes em todos os momentos, mesmo longe ainda
estão comigo.
Às minhas tias e tios por me apoiarem sempre e me incentivarem ao estudo e dedicação
sendo exemplos de vida. Em especial à tia Meire, que esteve presente me ajudando quando
precisei encontrar o antibiótico que faltava para finalizar o trabalho.
À André por me aturar nos momentos de estresse da produção do TCC e por conseguir
me acalmar e acalentar. E por também me ajudar na procura ao antibiótico.
Aos meus amigos e colegas que ganhei nesses anos de curso, que foram de suma
importância e essenciais nessa caminhada. Em especial ao grupo 9 - Sara Ester, Raquel, Talita,
Gustavo, Daniel, Pedro, Marcel e Renata. E às minhas amigas de longa data Mirella, Andréa,
Maria Júlia, Stella, por estarem sempre comigo me apoiando.
À todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente a minha formação como
cidadã, como biomédica e para a realização desse trabalho.
ii
SUMÁRIO
O gênero Enterococcus pertence ao grupo dos cocos Gram-positivos dispostos,
morfologicamente, em pares ou cadeias curtas. Eles colonizam naturalmente o ser humano,
principalmente o sistema gastrointestinal. Contudo, esse gênero vem emergindo como um
importante agente patogênico oportunista causador de infecções, tanto comunitárias quanto
hospitalares. A sua sobrevivência no ambiente hospitalar está relacionada com a presença da
resistência intrínseca a diversos antimicrobianos, além da sua capacidade de aquisição de
resistência por mutação ou por elementos genéticos móveis. O objetivo desse estudo é
caracterizar fenotípica e geneticamente cepas de Enterococcus resistentes à vancomicina.
Foram analisados cinco isolados provenientes de hospitais diferentes coletados de sangue
periférico, swab anal, líquido cefalorraquidiano e secreção purulenta. Os isolados foram
identificados no nível de espécie através do sistema automatizado VITEK 2. O perfil de
resistência aos antimicrobianos comumente utilizados na clínica médica para o tratamento de
infecções por Enterococcus foi avaliado por meio da técnica de disco-difusão, do E-test e da
diluição em meio sólido, segundo recomendação do Clinical and Laboratory Stardards
Institute, 2016. As relações genéticas foram avaliadas pela técnica da eletroforese em campo
pulsado (PFGE). Todas as cepas foram identificadas como Enterococcus faecalis e
apresentaram resistência à vancomicina, tetraciclina, ciprofloxacina, assim como a altos níveis
à gentamicina e à estreptomicina. Uma amostra apresentou resistência à linezolida e todas foram
sensíveis à ampicilina e à fosfomicina. Os isolados apresentaram dois pulsotipos distintos, A e
B, no qual o pulsotipo A predominou em quatro cepas. A emergência da resistência à
vancomicina observada nesse estudo pode apontar para uma possível mudança na
epidemiologia das infecções enterocócicas na cidade do Natal.
PALAVRAS-CHAVE: Enterococcus faecalis; resistência à vancomicina; VRE; PFGE.
iii
ABSTRACT
The genus Enterococcus belongs to the group of Gram-positive cocci, morphologically
arranged in pairs or chains. It colonizes the human microbiota, mainly the gastrointestinal
system. This genus has emerged as an important opportunistic pathogen causing community
and nosocomial infections. The survive in the hospital environment is related to the presence
of intrinsic resistance to many antibiotics, in addition to capabilities of resistance acquisition
by mutation or mobile genetic elements. The aim of the study is to characterize phenotypic and
genetically strains of vancomycin-resistant Enterococcus. Five strains from different hospitals
were analyzed, it was collected from peripheral blood, anal swab, cerebrospinal fluid and
purulent secretion. The isolates were identified at the species level by automated system VITEK
2. The resistance profile to antimicrobials was assessed by disk-difusion test, E-test and dilution
in agar as recommended by the Clinical and Laboratory Stardards Institute, 2016. The genetic
relationship between the strains were evaluated by the technique of Pulsed Field Gel
Electrophoresis (PFGE). All strains were identified as Enterococcus faecalis and showed
resistance to vancomycin, tetracycline, ciprofloxacin, as well as high levels of gentamicin and
streptomycin. One sample had resistance to linezolida and all of them were sensitive to
ampicillin and fosfomycin. The isolates had two distinct types, A and B, in which pulse A
predominated in four strains. The emergence of resistance to vancomycin observed in this study
may point to a possible change in the epidemiology of enterococcal infections in the city of
Natal.
KEYWORDS: Enterococcus faecalis; Vancomycin-resistant; VRE; PFGE
iv
ÍNDICE
Página
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... v
LISTA DE TABELAS ................................................................................................... vii
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... viii
1- INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 9
1.1 – Enterococcus ................................................................................................ 9
1.2 – Resistência aos antimicrobianos ................................................................... 10
1.3 - Enterococcus resistentes à vancomicina ....................................................... 11
2 – REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 15
3 – NORMAS DO PERIÓDICO: The Brazilian Journal of Infectious Diseases”
(BJID).............................................................................................................................
21
4 – ARTIGO: Emergência de Enterococcus resistente à vancomicina na cidade do
Natal/RN ........................................................................................................................
32
v
LISTA DE ABREVIATURA
AMP Ampicilina
CIM Concentração Inibitória Mínima
CIP Ciprofloxacina
CLSI Clinical And Laboratory Stardards Institute
D-Ala D-alanina
D-Lac D-lactase
D-Ser D-serina
EST Estreptomicina
FOS Fosfomicina
GEN Gentamicina
HLAR High-Level Aminoglycoside Resistance
LaBMed Laboratório De Bacteriologia Médica
LCR Líquido Cefalorraquidiano
LNZ Linezolida
mg Miligrama
MH Müeller-Hinton
mL Mililitro
MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus
NaCl Cloreto de Sódio
PBP Penicilin Binding Protein
PCR Polimerase Chain Reaction
PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis
pH Potencial de Hidrogênio Iônico
vi
PYR Pirrolodonil Arilamidase
TEC Teicoplanina
TET Tetraciclina
Tn Transposons
VAN Vancomicina
VRE Vancomycin-Resistent Enterococcus
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características microbiológicas das cepas de Enterococcus
faecalis: antibiograma, determinação do CIM e perfil de
PFGE.
38
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Perfil de PFGE das cepas de Enterococcus faecalis em gel de
agarose 1,2% corado com 0,5 µg/mL de brometo de etídio. PM:
Peso Molecular; E1- 5: Cepas de Enterococcus faecalis em
análise.
37
9
1. INTRODUÇÃO
1.1. Enterococcus
Os Enterococcus pertencem à família Enterococcaceae e são compostos por 55 espécies
bacterianas já descritas na literatura (PARTE et al., 2014). Observados pela primeira vez em
1899, por Thiercelin, foram chamados de “entérocoque” para enfatizar a sua origem intestinal
(THIERCELIN, 1899; KÖHLER et al., 2007). No século XX estas bactérias pertenciam ao
gênero bacteriano Streptococcus. Na década de 30, o gênero Streptococcus foi dividido por
Sherman em quatro classes: piôgenicos, viridans, lácteos e enterococos (FACKLAM,
CARVALHO e TEIXEIRA, 2002; MORENO et al., 2006). Somente em 1984, Schleifer e
Kilpper-Bälz, utilizando-se de técnicas moleculares, conseguiram realizar a distinção do gênero
Enterococcus (SCHLEIFER AND KILPPER-BÄLZ, 1984).
Constituído por bactérias pertencentes ao grande grupo das Gram-positivas, os
Enterococcus apresentam morfologia de cocos ovalados dispostos em pares, cadeias curtas ou
células isoladas (FLACKLAM et al., 2002). São anaeróbios facultativos, capazes de crescer em
temperaturas variantes de 10 e 45°C, em ambientes ricos em sais – até 6,5% de cloreto de sódio
–, com pH variante do ácido ao básico (pH entre 4 e 9,6) e resistentes a 60°C por até 30 minutos
(SHERMAN, 1937). Além disso, são capazes de hidrolisar bile na presença de esculina,
produzir pirrolodonil arilamidase (PYR) e sem produzir a enzima catalase (WINN et al., 2014).
Por apresentar capacidade de sobrevida e adaptação em diversos tipos de ambientes, até
os mais hostis, as propriedades funcionais dos Enterococcs vêm sendo estudadas com as
seguintes aplicações: na biotecnologia ambiental com a biorremediação; na indústria
alimentícia com a biopreservação de alimentos; e nos tratamentos terapêuticos com os
probióticos (FRANZ et al. 2003; FRANZ et al. 2011; MORENO et al., 2006; PINTO et al.,
2001).
Esses microrganismos estão presentes na microbiota do ser humano. Normalmente,
encontrados no intestino e no trato geniturinário feminino. Também são encontrados na
microbiota de outros animais, no solo e na água (GIRAFFA, 2002). Algumas espécies benéficas
são importantes na produção de queijos e leites fermentados, utilizadas como cultura de
arranque, responsáveis pelo aroma e sabor (GIRAFFA, 2002; MORENO et al., 2006). Contudo,
esse gênero bacteriano vem emergindo nas últimas décadas como um importante agente
patogênico oportunista causador de infecções, tanto comunitária quanto hospitalares. Nos
10
Estados Unidos, ele é considerado o segundo microrganismo mais isolado em infecções
nosocomiais urinárias e o terceiro causador de bacteremia adquirida em ambiente hospitalar
(CETINKAYA, FALK e MAYHALL, 2000; BAZET et al., 2005). Eles são capazes de agir
como oportunistas em idosos, pacientes imunocomprometidos, portadores de doenças graves,
pacientes com internação prolongada, cirurgia prévia ou uso de antibiótico de largo espectro,
merecendo atenção nos casos de endocardite infecciosa, bacteremia, síndromes diarreicas,
infecção do trato urinário entre outras (CARVALHO et al., 2008; HÖRNER et al., 2005). A
maioria das infecções por Enterococcus origina-se da microbiota do paciente e em menor
proporção pode ser transmitida por contato ou mesmo através do consumo de alimentos
contaminados. De acordo com TORNIEPORTH et al. (1996), o modo de transmissão mais
prevalente desse gênero é por transferência, pelo contato das equipes médicas.
Algumas espécies são consideradas importantes patógenos. As que promovem a
colonização e a infecção em seres humanos são o Enterococcus faecalis e o Enterococcus
faecium, os quais estão associados a 80-90% e 10-15%, respectivamente, dos isolados de
infecções enterocócicas; as demais espécies são menos frequentes – menos de 5% dos isolados.
(RUOFF et al., 1990).
1.2. Resistência aos antimicrobianos
A recente atenção voltada aos enterococos não está focada somente no aumento das
infecções nosocomiais ocasionadas por essas bactérias, mas também na elevada resistência aos
antimicrobianos que esses organismos apresentam. O hospital é um ambiente propício a
supressão bacteriana com seleção de organismos resistentes, além da potencial disseminação
do microrganismo e dos seus genes de resistência. Sua sobrevida hospitalar está relacionada
com a presença da resistência intrínseca a diversos antimicrobianos utilizados na rotina, além
da sua capacidade de aquisição de resistência por mutação ou por elementos genéticos móveis,
como plasmídeos e transposons, em decorrência da sua plasticidade genômica (CLEWELL et
al., 1990).
A resistência intrínseca dos enterococos localiza-se no cromossomo bacteriano. Eles
possuem resistência intrínseca a baixos níveis de aminoglicosídeos e de lincosamidas, além de
uma concentração inibitória mínima (CIM) elevada cefalosporinas e resistência à ação das
sulfanamidas e trimetropim. A resistência aos aminoglicosídeos deve-se a sua reduzida
permeabilidade da parede celular. Já a elevada CIM dos agentes beta-lactâmicos é decorrente
da diminuição da afinidade das proteínas de ligação da penicilina (PBP) presente na membrana
11
(CETINKAYA, FALK e MAYHALL, 2000). A resistência à ação dos antibióticos que agem
inibindo a síntese de ácido fólico para produção de ácido nucleicos (sulfanamidas e
trimetropim) é resultado da utilização pela bactéria de ácido fólico pré-sintetizado (WINN et
al., 2014).
Extrinsecamente, os Enterococcus adquiriram novos genes capazes de elevar a CIM ou
mesmo tornar a cepa resistente ao fármaco. A resistência adquirida a altas concentrações de
aminoglicosídeos mediada por transposons é um exemplo; nessa hipótese ocorre a diminuição
da ligação do antimicrobiano ao ribossomo (sítio de ação do fármaco) ou da codificação de
enzimas modificadoras do aminoglicosídeo (CENTINKAYA et al., 1990). Esse fenômeno é
conhecido como fenótipo de resistência a níveis elevados de aminoglicosídeos (HLAR - high-
level aminoglycoside resistance). Em virtude disso, a terapia antimicrobiana para infecções
enterocócica, que era realizada pela combinação sinérgica da penicilina com o aminoglicosídeo,
tornou-se ineficiente, reduzindo, assim, as opções de tratamento (ARIAS, CONTRERAS e
MURRAY, 2010). Outros exemplos de resistências mediadas por plasmídeos são às
tetraciclinas, às quinolonas e às linezolidas. A resistência às tetraciclinas e às quinolonas são
encontradas com frequência no enterococos, elas são resultadas da redução da afinidade ao
sítio-alvo (ribossomo – tetraciclina – e DNA girasse e topoisomerase – ciprofloxacina) e
mecanismo de efluxo, geralmente por bombas de efluxo (CATTOIR et al., 2015; HUANG et
al., 2016). Já a resistência à linezolida, rara em enterococos, decorre em virtude de uma mutação
no alvo do antibiótico, no 23S rRNA ou nas proteínas ribossomais (BENDER et al., 2016).
1.3. Enterococcus resistente à vancomicina
A resistência aos gliopeptídeos ocorre devido a alteração do sítio alvo, o terminal do
precursor pentapetídicos D-Alanina é modificado para D-lactato (D-Lac) ou D-serina (D-Ser).
Essa mudança na região terminal ocasiona a quebra de uma ligação de hidrogênio essencial
para a formação do complexo (antibiótico-precursor) resultando na diminuição da afinidade e
nos altos níveis de resistência (COURVALIN, 2006). Diversos genes contribuem para a
resistência à vancomicina em Enterococcus, sendo eles: vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG,
vanL, vanM e vanN (CATTOIR e LECLERCQ, 2013). Dentre eles, os mais prevalentes são
vanA, vanB e vanC.
O gene vanA possui um elevado nível de resistência à vancomicina (CIM ≥ 64 μg/mL)
e a teicoplanina (CIM ≥ 16 mg/L), muitas vezes, induzida por antibióticos da classe
glicopeptídica (CATTOIR e LECLERCQ, 2013). Ele é carreado por um plasmídeo da família
12
Tn3, denominado Tn1546. As cepas com o gene vanB possuem resistência induzida à
vancomicina (CIM 4 μg/mL), contudo, diferente do vanA, apresentam susceptibilidade à
teicoplanina (CIM < 0,5-1 μg/mL) (CATTOIR e LECLERCQ, 2013). O gene vanB também é
carreado por um transposon, o Tn1547. Tanto o operon vanA quanto o vanB sintetizam ligases
que catalisam a formação do substrato D-Lac. Por estarem localizados em transposons que
residem em plasmídios, favorece a transmissão horizontal, entre as espécies, como também a
possibilidade de transferência de genes para patógenos mais virulentos, como o Staphylococcus
aureus. Contudo, raramente o operon vanA é detectado no S. aureus, devido a ineficácia da
replicação desses plasmídeos em estafilococos (COURVALIN, 2006; SIEVERT et al., 2008;
COURVALIN, 2006). Já a cepa com fenótipo vanC, que sintetiza a D-Ser, apresenta uma
resistência constitutiva à baixos níveis de vancomicina (CIM 2-32 μg/mL) e susceptibilidade à
teicoplanina (CIM 0,5 – 1 mg/L), sendo uma característica intrínseca do Enterococcus
gallinarum e Enterococcus casseliflavus (LEBRETON et al., 2011).
A vancomicina é um antibiótico glicopeptídeo derivado do organismo conhecido como
Streptomyces orientalis. O composto é ativo contra a grande maioria dos microrganismos
Gram-positivos. Sua atividade resulta na inibição da síntese da parede celular bacteriana,
interferindo na sua formação, ligando-se ao terminal D-alanina-D-alanina (D-Ala-D-Ala)
gerando um complexo entre o antibiótico e o precursor da cadeia, impedindo a ação enzimática
que resultaria na transglicosilação e transpeptidação para síntese do peptídeoglicano
(COURVALIN, 2006). Sua principal indicação é em infecções graves por estafilococos, nos
pacientes alérgicos à beta-lactâmicos e estafilococos resistentes à meticilina e oxacilina. Além
de ser de escolha para infecções por enterococos resistentes à penicilina, administrado
sinergicamente com um aminoglicosídeo (TAVARES, 2001; ARIAS, CONTRERAS,
MURRAY, 2010).
O fármaco foi descoberto por Edmund Knonfield, em 1953, e licenciado, nos Estados
Unidos, em 1958. Em virtude da sua toxicidade resultante de impurezas no composto, a
vancomicina era utilizada como antibiótico de segunda escolha, entre 1960 e 1970
(MOELLERING, 2006). Na década de 80, com a aumento de infecções ocasionadas por
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), o medicamento tornou-se a primeira
escolha para o tratamento das infecções ocasionadas por esses microrganismos (LEVINE,
2006). Em 1988, em uma cultura de vigilância de um paciente com leucemia linfocítica aguda
(LLA) foi isolado o primeiro Enterococcus resistente à vancomicina (VRE) (LECLERCQ et
al., 1988). Após o primeiro isolado, diversos relatos foram reportados ao redor no mundo
(GAMBAROTTO, et al. 2000; LEE, et al. 2007). No Brasil, o VRE foi reportado somente no
13
ano de 1998 em Curitiba (DALLA-COSTA et al., 1998). A partir desse ano, o VRE foi isolado
em outras cidades pelo Brasil, detectado como causa de surtos hospitalares ou de forma
endêmica (ZANELLA et al., 1999; ALBUQUERQUE et al., 2000; D’AZEVEDO et al., 2000;
CEREDA et al., 2001; RESENDE et al., 2014; RIBAS et al., 2007 e ZANELLA et al., 2003).
Em estudo realizado pelo programa de monitoramento da resistência da América Latina, 27%
dos enterococos resistentes à vancomicina foram isolados do Brasil (JONES et al., 2013). De
acordo com Boletim Informativo, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a
infecção ocasionada por VRE possui prevalência de notificação de 17%, com o maior número
de casos concentrados nas regiões sul, centro-oeste e suldeste, sendo 2% dos casos de VRE
foram reportados no nordeste brasileiro (BRASIL, 2014).
No período de 2000 a 2002 foi demostrado, em um estudo realizado em São Paulo, o
aumento da taxa de isolamento de amostras de enterococos no hospital universitário foi de mais
de 50% (FURTADO et al., 2005). No Brasil, diferentemente da epidemiologia das infecções
enterocócicas dos Estados Unidos e da Europa, os VRE são a oitava causa de infecções humanas
(ROSSI, 2011). Apesar do crescente número de isolamento de VRE, o primeiro relato na região
do nordeste brasileiro, foi de um estudo realizado com amostra coletadas em 2004, no Hospital
Universitário na cidade do Recife (VILELA et al., 2006). Em Natal, um estudo epidemiológico
realizado em 2012, com mais de cem isolados de enterococos, não observou nenhuma cepa
resistente à vancomicina (COSTA, 2012). Com isso, na cidade do Natal, até o presente
momento, não havia descrição de Enterococcus resistente à vancomicina.
Um estudo realizado em São Paulo, com objetivo de avaliar a disseminação de VRE em
centros clínicos da cidade, apresentou o resultado de disseminação policlonal das cepas
(CEREDA et al., 2002). Posteriormente, em outro estudo, realizado no mesmo estado, com o
objetivo semelhante de caracterização molecular com cepas apresentando resistência aos
glicopeptídeos, observou-se a disseminação monoclonal inter-hospitalar, como detecção de
cepas estritamente relacionadas, em hospitais distantes entre si (MORETTI et al., 2004).
Estudos moleculares vêm demostrando a existência de grupos genéticos associados a isolados
de Enterococcus faecium presentes nos surtos hospitalares, como a linhagem genética
denominada complexo clonal 17 (CC17) (WILLEMS et al., 2005). Os surtos provenientes de
Enterococcus faecalis, por sua vez, estão associadas, normalmente aos CC2 e CC9
(NALLAPAREDDY, et al. 2005; WAAR, et al. 2002). A tipagem molecular corrobora com o
estudo epidemiológico dessa bactéria cada vez mais emergente nos hospitais. Poucos são os
estudos, no Brasil, que apresentam a análise epidemiológica do VRE, reforçando assim a
importância da pesquisa de vigilância desse microrganismo.
14
Tendo em vista a relevância do gênero Enterococcus como agente causador de infecções
severas e crescente emergência de cepas resistentes, principalmente à vancomicina, e diante da
carência de dados epidemiológicos das infecções enterocócicas, principalmente na região
nordeste do Brasil, estudos que visem conhecer mais da epidemiologia desse patógeno são
importantes.
15
2. REFERÊNCIAS
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Rio de Janeiro, Brazil: strains showed genetic relationship with high-level gentamicin resistant
(HLGR) endemic clone. Interscience Conference On Antimicrobial Agents And Chemotherapy.
v. 40, p 107, 2000;
ARIAS, C. A.; CONTRERAS, G. A.; MURRAY, B. E. Management of multidrug-resistant
enterococcal infections. Clinical microbiology and infection, Wiley Online Library, v. 16, n. 6,
p. 555 – 562, 2010;
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Uruguay. Revista Médica del Uruguay, v. 21, n. 2, p. 151-158, 2005;
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BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária - Anvisa. Boletim Informativo - Segurança
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http://portal.anvisa.gov.br/documents/33852/272031/Boletim+Seguran%C3%A7a+do+Pacien
te+e+Qualidade+em+Servi%C3%A7os+de+Sa%C3%BAde+n%C2%BA+09+de+dezembro+
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CARVALHO, M. G. S. et al. Designation of the provisional new Enterococcus species CDC
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CATTOIR, V.; LECLERCQ, R. Twenty-five years of shared life with vancomycin-resistant
enterococci: is it time to divorce? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Br Soc Antimicrob
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3. NORMAS DO PERIÓDICO: The Brazilian Journal of Infectious Diseases” (BJID)
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4. ARTIGO:
Emergência de Enterococcus resistente à vancomicina na cidade do Natal/RN
33
Emergência de Enterococcus resistente à vancomicina na cidade do Natal/RN
Emília Sousa de Oliveira, Maria Celeste Nunes de Melo1
1 Laboratório de Bacteriologia Médica, Departamento de Microbiologia e Parasitologia,
Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brasil.
SUMÁRIO
O gênero Enterococcus pertence ao grupo dos cocos Gram-positivos dispostos,
morfologicamente, em pares ou cadeias curtas. Colonizam a microbiota do ser humano,
principalmente do trato gastrointestinal. Contudo, esse gênero vem emergindo como um
importante agente patogênico oportunista causador de infecções, tanto comunitária quanto
hospitalares. O objetivo desse estudo é caracterizar fenotípica e geneticamente cepas de
Enterococcus resistentes à vancomicina. Foram analisados cinco isolados provenientes de
hospitais diferentes. Os isolados foram identificados a nível de espécie através do sistema
automatizado VITEK 2. O perfil de resistência aos antimicrobianos comumente utilizados na
clínica médica para o tratamento de infecções por Enterococcus foram avaliados através da
técnica do disco-difusão, do E-test e da diluição em meio sólido, segundo recomendação do
Clinical and Laboratory Standards Institute, 2016. As relações genéticas foram avaliadas pela
técnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE). As cepas foram identificadas como
Enterococcus faecalis e apresentaram resistência à vancomicina, tetraciclina, ciprofloxacina,
gentamicina e estreptomicina. Uma amostra apresentou resistência à linezolida e todas foram
sensíveis à ampicilina e à fosfomicina. Apresentaram dois pulsotipos distintos, A e B, no qual
o pulsotipo A predominou em quatro cepas. A emergência de resistência à vancomicina
observada nesse estudo pode apontar para uma possível mudança na epidemiologia das
infecções enterocócicas na cidade do Natal, revelando um clone de Enterococcus resistente à
vancomicina disseminado entre hospitais da cidade.
PALAVRA-CHAVE: Enterococcus. resistência à vancomicina. VRE. PFGE.
34
INTRODUÇÃO
O gênero Enterococcus vem emergindo nas últimas décadas como um importante agente
patogênico oportunista causador de infecções nosocomiais. A maioria das infecções por
Enterococcus origina-se da microbiota do paciente, já em menor proporção pode ser transmitida
por contato ou mesmo através do consumo de alimentos contaminados [1]. Eles são capazes de
agir como agente oportunistas principalmente em imunocomprometidos, merecendo atenção
nos casos de endocardite infecciosa, bacteremia, síndromes diarreicas em recém-nascidos e
infecção do trato urinário [2, 3]. As espécies bacterianas que normalmente promovem a
colonização e a infecção em seres humanos são o Enterococcus faecalis e o Enterococcus
faecium [4]. Sua sobrevivência hospitalar está relacionada com a presença da resistência
cromossomal a diversos antimicrobianos utilizados na rotina, além da sua capacidade de
aquisição de resistência por mutação ou por elementos genéticos móveis [5].
A vancomicina é um antibiótico glicopeptídeo ativo contra a grande maioria dos
microrganismos Gram-positivos. Sua atividade resulta na inibição da síntese da parede celular
bacteriana, interferindo na sua formação[6]. Foi criado em 1953, mas somente na década de 80,
com a aumento de infecções ocasionadas por Staphylococcus aureus resistente à meticilina
(MRSA), a vancomicina tornou-se primeira escolha para infecções enterocócicas [7]. Em 1988,
foi isolado o primeiro Enterococcus resistente à vancomicina (VRE) [8]. Após o primeiro
isolado, diversos relatos foram reportados ao redor no mundo [9, 10]. No Brasil, o VRE foi
reportado somente no ano de 1998 em Curitiba [11]. A partir desse ano, o VRE foi isolado em
outras cidades pelo Brasil de forma endêmica [12-16]. O primeiro isolado da região Nordeste,
ocorreu em 2006, no Hospital Universitário na cidade do Recife [17]. Em estudo realizado na
cidade do Natal, em 2012, com mais de cem isolados de enterococos, não apresentou nenhuma
cepa resistente à vancomicina [18]. Com isso, em Natal, até o presente momento, não havia
descrição de VRE.
Em estudo realizado em São Paulo, com objetivo de caracterização molecular de cepas
apresentando resistência aos glicopeptídeos, observou-se a disseminação monoclonal inter-
hospitalar, como detecção de cepas estritamente relacionadas [19]. Estudos moleculares vêm
demostrando a existência de grupos genéticos associados a isolados de E. faecium presentes
nos surtos hospitalares, como a linhagem genética denominada complexo clonal 17 (CC17)
[20]. Os surtos provenientes de E. faecalis estão associadas, normalmente aos CC2 e CC9 [21
e 22]. A tipagem molecular corrobora com o estudo epidemiológico dessa bactéria cada vez
35
mais emergente nos hospitais. Poucos são os estudos, no Brasil, que apresentam a análise
epidemiológica do VRE.
O objetivo desse estudo é caracterizar fenotípica e geneticamente cepas Enterococcus
resistentes à vancomicina, além de relatar a mudança na epidemiologia de infecções
entorocócicas na cidade do Natal.
MATERIAIS E MÉTODOS
Comitê de Ética
O projeto foi submetido para o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte para a dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE).
Amostras
As amostras de Enterococcus resistentes à vancomicina foram provenientes de cinco
pacientes internados em diferentes hospitais (A-E) em setembro de 2015, na cidade do Natal.
Foram isolados a partir de hemocultura, swab anal, cultura de secreção purulenta e cultura de
líquido cefalorraquidiano. Foram identificadas utilizando o sistema automatizado VITEK 2
(BioMérieux, França) de acordo com as recomendações do fabricante.
Avaliação da susceptibilidade aos antimicrobianos
Avaliadas quanto ao perfil de resistência aos antimicrobianos através da técnica do
disco-difusão segundo as recomendações do Clinical and Laboratory Stardards Institute
(CLSI) [23]. Os antimicrobianos (DME, Brasil) testados foram: ampicilina 10μg,
ciprofloxacina 5μg, tetraciclina 30μg, linezolida 30μg, fosfomicina 200μg e gentamicina 120μg
e estreptomicina 300μg (detecção de fenótipo de resistência a níveis elevados aos
aminoglicosídeos– HLAR). A confirmação da resistência aos glicopepitídeos foi realizada
através da determinação da concentração inibitória mínima utilizando a técnica do E-test
(PLAST LABOR, Brasil) para vancomicina e a diluição em meio sólido para teicoplanina
(UNIÃO QUÍMICA, Brasil), seguindo as recomendações do CLSI.
36
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
As cepas foram analisadas quanto a sua relação genética através da técnica da
Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), por restrição com a enzima Sma I, segundo a
metodologia recomendada por Teixeira [24]. A análise foi realizada pelo critério de Tenover
[25].
RESULTADOS
Todas as cepas foram identificadas, pelo sistema automatizado VITEK 2, como
Enterococcus faecalis. As características microbiológicas dos isolados encontram-se na tabela
1. Todas as cepas avaliadas apresentaram resistência a, no mínimo, quatro antimicrobianos
testados. As cepas foram resistentes de tetraciclina e de ciprofloxacina assim como,
apresentaram o fenótipo de resistência a níveis elevados à estreptomicina e à gentamicina,
demostrando o fenótipo HLR e elevado CIM à vancomicina (> 32 μg/mL). Quatro das cepas
analisadas apresentaram perfil de resistência elevado para teicoplanina (> 128 μg/mL) e uma
apresentou CIM de susceptibilidade intermediária (> 16 μg/mL). Todas as cepas foram
sensíveis à ampicilina e à fosfomicina. Apenas uma cepa apresentou resistência à linezolida.
Os perfis clonais gerado pelo PFGE podem ser visualizados na figura 1. Foram obtidas
cerca de 15 bandas para cada amostra. Das cinco amostras analisadas, três apresentaram perfil
clonal semelhante e foram nomeadas grupo clonal A. Uma cepa apresentou apenas 3 bandas
diferentes e foi nomeada como subclone A1. A última amostra, com oito bandas de diferença
como um outro clone.
37
Figura 1: Perfil de PFGE das cepas de Enterococcus faecalis em gel de agarose 1,2% corado
com 0,5 µg/mL de brometo de etídio. PM: Peso Molecular; E1- 5: Cepas de Enterococcus
faecalis em análise.
38
Tabela 1: Características microbiológicas das cepas de Enterococcus faecalis: antibiograma, determinação do CIM e perfil de PFGE.
1disco apresentando concentração elevada para definição do fenótipo de resistência a níveis elevados (HLAR, high-level aminoglycoside
resistance); a interpretação dos resultados seguiu as recomendações do CLSI, 2016. LCR: Líquido Cefalorraquidiano. AMP: Ampicilina; CIP:
ciprofloxacina; TET: Tetraciclina; LNZ: Linezolida; FOS: Fosfomicina; GEN: Gentamicina; EST: Estreptomicina; VAN: Vancomicina; TEC:
Teicoplanina. R: Resistente; S: Sensível.
Sítio de coleta Hospital Antibiograma CIM (μg/mL) PFGE
AMP CIP TET LNZ FOS GEN1201 EST3001 VAN TEC
E1 Sangue periférico A S R R S S R R > 256 > 128 A
E2 Sangue periférico B S R R R S R R 32 > 16 B
E3 Swab anal C S R R S S R R > 256 > 128 A
E4 LCR D S R R S S R R > 256 > 128 A
E5 Secreção purulenta E S R R S S R R 192 > 128 A1
38
39
DISCUSSÃO
Um dos principais patógenos causadores de infecções hospitalares e considerado um
reservatório de genes de resistência e virulência pela sua grande capacidade de aquisição e
transferência de material genético, o Enterococcus vem ganhando espaço como um importante
patógeno oportunista nos últimos anos [26].
Uma grande preocupação em torno desse gênero é transferência de genes de resistência
a patógenos considerados mais virulentos, como para o Staphylococcus aureus, por intermédio
de plasmídeos. Em 2002, nos Estados Unidos, foi reportado o primeiro caso de S. aureus
resistente à vancomicina, apresentando o gene vanA de enterococos, sugestionando
transferência entre espécies [27].
No Boletim Informativo da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a
infecção ocasionada por VRE apresentavam prevalência de notificação de 17%, com o maior
número de casos concentrados nas regiões sul, centro-oeste e suldeste, sendo 2% dos casos de
VRE foram reportados no nordeste brasileiro [28].
Em estudo realizado há quatro anos com 117 cepas de Enterococcus isolados de
hospitais da cidade do Natal (dados não publicados), foi observado que as cepas possuíam
sensibilidade à vancomicina e à teicoplanina [18]. A mudança da epidemiologia da infecção
por Enterococcus encontrado nesse estudo evidencia a importância de uma constante cultura de
vigilância para controle epidemiológico.
A alta resistência à aminoglicosídeos, demostra a presença do fenótipo HLAR. A
resistência à gentamicina coincidindo com a resistência ao glicopeptídeo (vancomicina)
demonstra que esses fármacos, utilizados sinergicamente em infecções complicadas, como o
caso de endocardites, estão se tornando cada vez menos eficazes. [29]
Embora uma cepa tenha apresentado resistência à linezolida, nos chama atenção, uma
vez que esse fármaco é uma das últimas escolhas para tratamento de infecções por bactérias
Gram-positivas multirresistentes, incluindo os Enterococcus resistentes à vancomicina com alta
resistência à ampicilina [30].
A tipagem molecular por PFGE mostrou a existência um clone que predominou entre
as amostras analisadas. As cepas pertencentes ao mesmo tipo clonal apresentaram um perfil de
resistência similar. Como os Enterococcus faecalis são microrganismo com grande capacidade
adaptativa [1], após a introdução ao ambiente hospitalar, sua erradicação é complexa e difícil.
A possibilidade de disseminação do clone com resistência deve ser tratada com cautela,
40
utilizando-se de protocolos de prevenção e controle para eliminação desses microrganismos
multirresistentes.
Pela sua difícil erradicação e grande disseminação é necessário um cuidado especial
com esses patógenos. Utilizando-se sempre dos protocolos de cultura de vigilância e controle
de infecções nas unidades de saúde. Além da atenção ao uso de antibiótico.
CONCLUSÃO
A emergência de cepas de Enterococcus resistentes à vancomicina isolados na cidade
do Natal, aponta para numa possível mudança na epidemiologia das infecções enterocócicas na
cidade do Natal. Além de demostrar a presença de um clone predominando entre as amostras
estudadas, indicando a disseminação de um clone de Enterococcus faecalis resistente à
vancomicina difundido na cidade do Natal/RN.
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