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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
EMPREGO DAS TÉCNICAS DE PCR E VIDAS® NA DETERMINAÇÃO DA Escherichia coli O157:H7 EM QUEIJOS
MINAS FRESCAL EM FEIRAS LIVRES E ESTABELECIMENTOS SOB INSPEÇÃO FEDERAL
Rosangela Nunes Carvalho
Orientador: Prof. Dr. Antonio Nonato Oliveira
GOIÂNIA 2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
EMPREGO DAS TÉCNICAS DE PCR E VIDAS® NA DETERMINAÇÃO DA Escherichia coli O157:H7 EM QUEIJOS
MINAS FRESCAL EM FEIRAS LIVRES E ESTABELECIMENTOS SOB INSPEÇÃO FEDERAL
Dissertação apresentada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás Área de Concentração: Higiene e Tecnologia de Alimentos Linha de Pesquisa: Ciência e Tecnologia de Alimentos Orientador: Prof. Dr. Antonio Nonato Oliveira Comitê de Orientação: Profª. Drª. Iolanda Aparecida Nunes Prof. Dr. Jaison Pereira de Oliveira
GOIÂNIA 2009
ii
iii
DEDICATÓRIA
Dedico a meus pais, João e Divina que são o alicerce da minha vida. À Sandra, que sempre foi muito mais que uma amiga e a principal incentivadora deste trabalho. Sempre e fielmente a DEUS, por me fortalecer diante das dificuldades.
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me fortalecido e sustentado.
Ao meu orientador Dr. Antonio Nonato Oliveira, pela orientação,
incentivo e pelas sugestões que contribuíram para o aprimoramento deste
trabalho.
Ao professor Dr. Albenones José de Mesquita, pelo qual tenho grande
admiração, agradeço os ensinamentos, paciência e confiança dispensadas.
À Sandra Queiroz Porto de Mesquita pelo incentivo, companheirismo e
apoio constante em todos os momentos. Sua amizade para mim tem um valor
enorme. À minha querida mestra e amiga professora Drª. Cíntia Silva Minafra e
Rezende, tenho seu entusiasmo e sua capacidade profissional como exemplo.
Ao professor Dr. Jaison Pereira Oliveira pelo auxílio durante a análise
estatística do trabalho.
À Camila Silveira de Melo e Wilson Ricardo, pela amizade,
companheirismo e total apoio durante o mestrado. Ao Wesdras e Adriano P. Q. de
Mesquita, pela disposição em auxiliar durante o experimento. A todos os
profissionais do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária,
Neuza Dias, Euza Dias, Nelma Nunes, Lorena, Amanda, Marcos, Adair, Laila,
Mirela, Ane e Jaqueline pelo apoio durante as análises.
As minhas amigas Marcele Louise Tadaeike, Giselle N. Moreira, Maria
Magaly e Aline Aparecida Ribeiro que sempre estiveram ao meu lado.
Agradecer a todos que ajudaram a construir esta dissertação não é
tarefa fácil. O maior perigo que se coloca para a redação dos agradecimentos não
é decidir quem incluir, mas decidir quem não mencionar. Então, a meus amigos
que, de uma forma ou de outra, contribuíram com sua amizade e estiveram
presentes me aconselhando e incentivando com carinho e dedicação, gostaria de
expressar minha profunda gratidão.
Agradeço a minha família que é o grande alicerce da minha vida.
A esses todo meu carinho.
v
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................ 3
2.1 Escherichia coli ................................................................................................ 4
2.2 Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC).......................................... 6
2.3 Mecanismo de patogenicidade......................................................................... 7
2.4 Reservatório ..................................................................................................... 9
2.5 Alimentos envolvidos...................................................................................... 10
2.6 Queijo Minas Frescal...................................................................................... 12
2.6 Detecção de E. coli O157:H7 pela reação em cadeia da polimerase............. 15
2.7 Detecção de E. coli O157:H7 pelo kit comercial VIDAS ECO O157®............. 16
3 OBJETIVOS ...................................................................................................... 18
3.1 Objetivo geral ................................................................................................. 18
3.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 18
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 19
4.1 Fonte de amostras, local de execução das análises e definição dos ensaios 19
4.2 Amostragem................................................................................................... 20
4.3 Detecção de Escherichia coli O157:H7 .......................................................... 22
4.3.1 VIDAS ECO O157® ..................................................................................... 22
4.3.2 Técnica da reação em cadeia da polimerase – PCR .................................. 26
4.3.2.1 Processamento das amostras e extração de DNA genômico .................. 26
4.3.2.2 Primers utilizados nas reações e condições de amplificação................... 27
4.4 NMP de Coliformes Termotolerantes ............................................................. 28
4.5 NMP de Escherichia coli................................................................................. 29
4.6 Análise estatística .......................................................................................... 30
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................... 31
5.1 Detecção de Escherichia coli O157:H7 por meio do kit VIDAS ECO O157®.. 31
5.2 Detecção de Escherichia coli O157:H7 por meio da PCR.............................. 34
5.3 Comparação entre os resultados obtidos com a utilização do kit comercial
VIDAS ECO O157® e a técnica de PCR segundo a origem do queijo Minas
Frescal ................................................................................................................. 41
vi
5.4 Comparação da ocorrência de E.coli O157:H7 entre amostras oriundas de
feiras e amostras fabricadas em estabelecimentos sob Inspeção Federal segundo
a técnica empregada............................................................................................ 44
5.4 Determinação do NMP de Coliformes Termotolerantes ................................. 45
5.4 Determinação do NMP de Escherichia coli .................................................... 48
7 CONCLUSÕES ................................................................................................. 51
8 REFERÊNCIAS................................................................................................. 52
vii
LISTA DE FIGURAS Figura 1 Representação esquemática dos ensaios analíticos realizados
20
Figura 2 Mapa da região metropolitana de Goiânia
21
Figura 3 Cones e barretes 23
Figura 4 Detecção dos antígenos de E.coli O157 por meio do kit VIDAS ECO O157®
23
Figura 5 Equipamento VIDAS®
24
Figura 6 Colônias sorbitol negativo em ágar SMAC-CT
25
Figura 7 Colônias com crescimento característico em CHROMagar O157®
26
Figura 8 UFCs típicas de E.coli em ágar EMB
30
Figura 9 Eletroforese em gel de agarose a 2% de produtos de E.coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal, com o par RfbR/RfbR (292pb)
37
Figura 10 Eletroforese em gel de agarose a 2% de produtos de E.coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal, com o par FliC-a/FliC-b (247pb)
38
Figura 11 Resultados obtidos segundo os primers utilizados e as fontes de detecção
39
Figura 12 Distribuição de E.coli O157:H7 e E.coli O157 não H7 em queijos Minas Frescal segundo a origem por meio da técnica de PCR
39
Figura 13 Ocorrência de E.coli O157:H7 em queijos Minas Frescal segundo a fonte e o método de detecção utilizado
41
Figura 14 Porcentagem de amostras de queijo Minas Frescal em acordo e desacordo com a legislação (BRASIL, 2001) em relação ao NMP de coliformes Termotolerantes
47
Figura 15 Porcentagem de amostras de queijo Minas Frescal segundo a origem com resultados de NMP menores e maiores que 3,0 NMP/g (limite de detecção da técnica na diluição inicial utilizada)
50
viii
LISTA DE TABELAS Tabela 1 Resultados para E.coli O157 obtidos no equipamento VIDAS®
para as amostras de queijo Minas Frescal segundo as fontes de detecção. Goiânia – GO, 2009
31
Tabela 2 Distribuição de Escherichia coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal segundo as fontes, detectadas por meio do kit comercial VIDAS ECO O157®, isoladas e confirmadas por bioquímica e sorologia. Goiânia – GO, 2009
32
Tabela 3 Detecção de Escherichia coli O157:H7 em queijo Minas Frescal segundo as fontes de detecção e os pares de primers utilizados para amplificação. Goiânia-GO, 2007
36
Tabela 4 Distribuição de Escherichia coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal segundo as fontes, detectadas por meio da técnica de PCR. Goiânia – GO, 2009
39
Tabela 5 Comparação entre a freqüência de E.coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal oriundas de feiras livres segundo o método de detecção, por meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009
42
Tabela 6 Comparação entre a freqüência de E.coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal independente da origem segundo o método de detecção, por meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009
42
Tabela 7 Comparação entre a freqüência de E.coli O157 em amostras de queijo Minas Frescal independente da origem segundo o equipamento VIDAS® e o primer Rfb, por meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009
43
Tabela 8 Comparação entre a freqüência de E.coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal segundo a fonte e o método de detecção, por meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009
44
Tabela 9 Comparação dos resultados de NMP de Coliformes Termotolerantes da amostras de queijo Minas Frescal segundo a origem e em relação ao microbiológico vigente (BRASIL, 2002), por meio do teste de χ², Goiânia – GO, 2009
45
Tabela 10 Comparação entre médias do NMP de Coliformes Termotolerantes em queijos Minas Frescal segundo a fonte de detecção por meio do teste t de Student, Goiânia-GO, 2009
46
ix
Tabela 11 Distribuição de freqüência do NMP de Coliformes Termotolerantes segundo a fonte de detecção, colhidas no município de Goiânia -GO,2009
47
Tabela 12 Comparação entre médias do NMP de Escherichia coli em queijos Minas Frescal segundo a fonte de detecção por meio do teste t de Student, Goiânia- GO, 2009
49
x
LISTA DE QUADROS Quadro 1 Primers utilizados neste estudo
27
Quadro 2 Condições de amplificação dos primers usados no estudo
28
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
A/E Attaching/effacing
APHA American Public Health Association CH Colite hemorrágica
DAEC E.coli de aderência difusa
EAEC E.coli enteroagregativa
EHEC E.coli enterohemorrágica
EIEC E.coli enteroinvasiva
EPEC E.coli enteropatogênica
ETEC E.coli enterotoxigência
IF Inspeção federal
NMP Número mais provável
PCR Reação em cadeia da polimerase
SUH Síndrome urêmica hemolítica
STEC E.coli produtora de toxina Shiga
Stx Toxina Shiga
VTEC E.coli produtora de verotoxina
xii
RESUMO
Escherichia coli O157:H7 é um sorotipo de E.coli pertencente ao grupo STEC - E.coli produtora de toxina Shiga - que tem sido incriminado em surtos de toxinfecção alimentar bem como em casos esporádicos de colite hemorrágica e síndrome urêmica hemolítica em vários países. No Brasil não há dados sobre possíveis surtos causados por E. coli O157:H7, mas este patógeno vem sendo frequentemente encontrado em fezes bovinas. Tendo-se em vista a suscetibilidade do queijo Minas Frescal à contaminação por E.coli O157:H7 e que o leite é um dos alimentos mais envolvidos em surtos, objetivou com o presente trabalho determinar a ocorrência deste microrganismo em queijos Minas Frescal, além de comparar as técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e teste VIDAS ECO O157®(bioMérieux, Lyon, France) na detecção do patógeno. Para tanto, analisou-se 30 amostras oriundas de feiras livres de Goiânia e 30 de estabelecimentos sob Inspeção Federal localizados em Goiás e que comercializam seus produtos em supermercados de Goiânia. Também foram determinados o Número Mais Provável (NMP) de Coliformes Termotolerantes e NMP de E. coli nestas amostras. Nas amostras oriundas de feiras livres detectou-se E.coli O157:H7 em 6,67% e 23,33% quando utilizou-se o VIDAS ECO O157®
e PCR, respectivamente. Nas amostras provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal o microrganismo não foi detectado. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre VIDAS ECO O157® e PCR na detecção do patógeno em amostras oriundas de feiras livres e estabelecimentos sob Inspeção Federal. Não observou-se diferença significativa (p> 0,05) entre amostras oriundas de feiras livres e indústrias sob Inspeção Federal quando utilizou-se o VIDAS ECO O157® na detecção de E.coli O157:H7. Quando empregou-se a técnica de PCR, constatou-se diferença (p< 0,05) entre as origens das amostras. Em 86,67% das amostras oriundas de feiras livres detectou-se a presença de Coliformes Termotolerantes acima do nível estabelecido pela legislação enquanto que, nas amostras provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal esse percentual foi de 10%. As amostras de queijo Minas Frescal provenientes de feiras livres revelaram-se mais contaminadas por E.coli do que as oriundas de estabelecimentos sob Inspeção Federal e comercializadas em supermercados.
Palavras-chave: queijo Minas Frescal, STEC, PCR, VIDAS ECO O157®.
xiii
ABSTRACT
Escherichia coli O157:H7 is a serotype that belongs to Shiga toxin-producing Escherichia coli group and it has been incriminated in outbreaks of food poisoning and also as cause of sporadic cases of hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome in many countries. In Brazil, there is no data available about outbreaks caused by E. coli O157:H7, but this pathogen has been found often in cattle feces. Taking into consideration the high susceptibility of Minas Frescal cheese to the contamination by E. coli O157:H7 and also considering that milk is frequently associated with outbreaks, the aim of this research was to determinate the occurrence of the pathogen in Minas Frescal cheese, and also to compare techniques for this bacterium detection, such as PCR (Polymerase Chain Reaction) and VIDAS ECO O157® (bioMérieux, Lyon, France) test. Thirty cheese samples were collected from open-air markets in Goiânia and thirty samples were collected from establishments under Federal Inspection located in Goiás that trade their products in supermarkets in Goiânia. The MPN (More probable number) of Thermo-tolerant Coliforms and MPN of E. coli were also determined from the samples. From those samples collected in open air markets, E. coli O157:H7 was detected in 6,67% and 23,33% when the technique used was VIDAS ECO O157®
and PCR, respectively. From those samples collected in establishments under Federal Inspection, the bacterium was not detected. There was no significant difference (p>0,05) between VIDAS ECO O157® and PCR for pathogen detection in samples from open air market and establishments under Federal Inspection. No significant difference (p> 0,05) was observed in samples collected from open air market and industries under Federal Inspection when VIDAS ECO O157® was used to E.coli O157:H7 detection. When PCR technique was applied, there was significant difference (p< 0,05) between samples’ origin. In 86,67% of samples collected from open air markets, Thermo-tolerant Coliforms were detected over the level established in Brazilian legislation, but in samples collected from industries under Federal Inspection, this value was 10%. The Minas Frescal cheese samples collected from open air market were more contaminated by E.coli than those collected from establishments under Federal Inspection and commercialized in supermarkets.
Key-word: Minas Frescal cheese, STEC, PCR, VIDAS ECO O157®
1 INTRODUÇÃO
A segurança alimentar tem sido tema de vários estudos e debates,
devido principalmente à gravidade e ao aumento do número de doenças
veiculadas por alimentos. As indústrias, órgãos regulamentadores e sistemas de
vigilância sanitária têm lançado mão de ferramentas de gerenciamento, tais como
Boas Práticas de Fabricação (BPF) e Análise de Perigos e Pontos Críticos de
Controle (APPCC), objetivando a produção de alimentos seguros. A utilização
adequada destes métodos garante a diminuição nos riscos de contaminação dos
alimentos por microrganismos patogênicos.
As doenças veiculadas por alimentos são de grande importância para a
saúde pública por causa dos problemas e prejuízos que trazem para a saúde dos
consumidores. Escherichia coli O157:H7 foi reconhecida como um importante
patógeno vinculado a doenças alimentares a partir de 1983 devido a um surto
ocorrido pela ingestão de hambúrgueres mal cozidos em um restaurante fast-food
nos Estados Unidos da América (EUA), desde então tem sido relatado diversos
surtos de toxinfecção alimentar provocados por este patógeno em vários países
do mundo.
Segundo MEAD et al. (1999), estima-se que aproximadamente 73.000
casos de enfermidades de origem alimentar ocasionados por E.coli O157:H7
ocorrem nos Estados Unidos a cada ano e, desses 61 são fatais. Mais
recentemente, FRENZEM et al. (2005) estimaram que pelo menos 2000
americanos são hospitalizados e cerca de 60 morrem em decorrência de
infecções provocadas por E.coli O157:H7. Isto justifica o fato da E.coli O157:H7
ser objeto de numerosos estudos, pois trata-se do sorotipo mais freqüentemente
envolvido em casos de síndrome urêmica hemolítica (SUH), doença grave e
muitas vezes fatal. No Brasil, ainda não existe registro de surto de doença de
origem alimentar provocado pela E.coli O157:H7, embora este sorotipo já tenha
sido isolado de caso de doença e fezes de bovinos.
A carne bovina moída é o alimento mais frequentemente envolvido em
surtos provocados por E.coli O157:H7, em seguida o leite e seus derivados são
considerados importantes vias de veiculação. Após um surto de toxinfecção
alimentar causado pela E.coli O157:H7 associado ao consumo de queijo fresco
2
nos EUA, a presença deste microrganismo neste produto adquiriu considerável
importância.
No Brasil, o queijo Minas Frescal é um produto que tem ampla aceitação
comercial e faz parte do hábito alimentar de grande parte da população. Segundo
BRASIL (2004), foram produzidos 28,8 toneladas de queijo Minas Frescal durante
o ano de 2004 no Brasil. Por ser um produto fresco é suscetível à alteração
microbiológica e sendo o leite a principal matéria prima de fabricação e um dos
alimentos frequentemente envolvidos em surtos, torna-se relevante a pesquisa de
E.coli O157:H7 neste produto. Além disso, apesar da legislação brasileira
determinar o uso de leite pasteurizado na sua fabricação ainda existe a prática de
produzir queijos com leite cru em nosso país. Aliado a isso, tem-se o fato do
tratogastrointestinal dos bovinos ser o principal reservatório deste patógeno, que
já foi detectado no rebanho nacional.
Considerando o exposto, relevância do tema, a expressiva quantidade de
queijo Minas Frescal comercializado em feiras livres de Goiânia-GO, bem como
em supermercados, propôs-se o presente estudo que tem como objetivo maior
determinar a ocorrência de E.coli O157:H7 em queijos Minas Frescal
comercializados em Goiânia. Também foram determinados o Número Mais
Provável (NMP) de Coliformes Termotolerantes e NMP de E. coli nestas
amostras.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
De acordo com a Portaria n° 146, de 07 de março de 1996 do
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1996), “queijo é o
produto fresco ou maturado obtido por separação parcial do soro de leite ou leite
reconstituído ou de soros lácteos, coagulados, com ou sem adição de aditivo”.
Ainda segundo esta Portaria, queijo fresco é o produto pronto para consumo logo
após sua fabricação.
O queijo Minas Frescal, considerado o único genuinamente nacional, é
um produto de grande aceitação no mercado, de elaboração simples e alto
rendimento de fabricação, o que atrai o interesse de indústrias de pequeno, médio
e grande porte (BRIGIDO et al., 2004). No ano 2004, o Minas Frescal ocupou a
quarta posição na produção brasileira de queijos sob Inspeção Federal, com 28,8
toneladas (BRASIL, 2004). No Brasil, atualmente, não estão disponíveis dados
oficiais sobre a produção de queijos, o que segundo, a Associação das Indústrias
de Queijo (ABIQ, 2006), entidade representativa dos fabricantes nacionais, deve-
se à configuração do mercado produtor, onde proliferam centenas de micro
laticínios que atuam regionalmente e muitas vezes fora do âmbito do Serviço de
Inspeção Federal.
A contaminação dos queijos Minas Frescal vem assumindo
considerável importância no aspecto da saúde pública, sendo considerada pela
Vigilância Sanitária um problema emergente que exige maior atenção por parte
dos órgãos oficiais, principalmente no que concerne ao controle higiênico-
sanitário do produto (BRIGIDO et al., 2004).
Estudos realizados no Brasil revelam, de maneira repetitiva, um quadro
desfavorável da qualidade microbiológica do queijo Minas Frescal. Nesse sentido,
vários trabalhos têm reportado a ocorrência de elevados índices de contaminação
e a presença de bactérias patogênicas nesse tipo de queijo, destacando-se a
Escherichia coli (ARAÚJO et al., 1997; SILVA et al., 2001; ARAÚJO et al., 2002;
CAMPOS et al., 2006; SALOTTI et al., 2006; PANETO et al., 2007).
4
2.1 Escherichia coli
O gênero Escherichia compreende as espécies E. coli, E. fergusonii, E.
hermannii, E. vulneris e E. blattae sendo a primeira a de maior importância em
saúde pública (TRABULSI & ALTERTHUM, 2005). A E. coli é um bastonete
Gram-negativo, anaeróbio facultativo da família Enterobactereaceae (ANGELES,
2002). Foi isolada pela primeira vez em 1885 das fezes de crianças com diarréia
por um bacteriologista alemão, Dr. Theodor Escherich (HUTTEN & MORAES,
2000). Não apresenta termorresistência, sendo destruída a 60°C, em poucos
segundos, mas é capaz de resistir por longo tempo em temperaturas de
refrigeração. O pH próximo do neutro propicia condições ótimas para seu
desenvolvimento, a multiplicação pode ocorrer abaixo dos 4,4 desde que os
demais fatores intrínsecos e extrínsecos sejam ótimos. A atividade de água
mínima exigida para seu desenvolvimento é de 0,95 (GERMANO & GERMANO,
2003).
A Escherichia coli é encontrada normalmente no intestino dos animais
e homem, suprimindo bactérias nocivas e participando da síntese de algumas
vitaminas como as do complexo B e vitamina K (MARGALL et al., 1997). Esta
estreita associação com as fezes do homem e dos animais representa a base do
teste para verificação da contaminação fecal da água e dos alimentos, tão usado
em saúde pública, por meio das análises de Número Mais Provável (NMP) de
Coliformes Termotolerantes e NMP de E. coli (TRABULSI & ALTHERTUM, 2005).
A maioria das cepas são inócuas e não causam doenças, no entanto,
existem algumas linhagens de Escherichia coli que são patogênicas ao homem e
estão associadas a doenças de origem alimentar (BETTS, 2000; ANGELES,
2002). Essas cepas ocuparam o segundo lugar, no período de 1993 a 1997, entre
os principais agentes de doenças de origem alimentar nos Estados Unidos, onde
responderam por 7,4% dos surtos e 28,3% das mortes provocadas por bactérias
naquele país (OLSEN et al., 2000).
A tipificação sorológica da Escherichia coli baseia-se na determinação
do tipo de antígeno. São eles o antígeno somático (O), relacionado com
polissacarídeos da membrana externa; antígeno flagelar (H), com proteínas dos
flagelos e o capsular (K), a polissacarídeos capsulares. De acordo com ANGELES
5
(2002), existem 176 antígenos somáticos O, 112 flagelares H e 60 capsulares K.
O antígeno O é responsável pelo sorogrupo e a determinação do antígeno
somático e flagelar (O:H) pelo sorotipo ao qual pertence o microrganismo.
A tipagem sorológica tem sido amplamente utilizada para caracterizar a
Escherichia coli. Porém, uma vez que os fatores de virulência estão mais
diretamente associados com a patogenicidade do que os antígenos de superfície,
apenas a sorologia não é adequada para caracterizar cepas de E.coli como
patogênicas. A identificação das cepas patogênicas de E.coli baseia-se,
sobretudo na presença de genes de virulência associados a cada categoria do
enteropatógeno (MENG et al., 2001).
Segundo ANGELES (2002), dentre as cepas de Escherichia coli
capazes de provocar doenças em indivíduos humanos, existem atualmente seis
classes que, de acordo com seu mecanismo de patogenicidade e fatores de
virulência, foram agrupadas em: E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli
enteropatogênica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E.coli
enteroagregativa (EAEC), E.coli enteroinvasiva (EIEC), E.coli de aderência difusa
(DAEC). Linhagens pertencentes a cada categoria utilizam diferentes estratégias
para provocar infecção, conseqüência da versatilidade de seu genoma que é
conferida principalmente por suas configurações genéticas: plasmídeos de
virulência e ilhas de patogenicidade, além da presença de bacteriófagos. Dentre o
grupo das diarreogênicas destaca-se a E. coli enterohemorrágica (EHEC), capaz
de causar desde diarréia não complicada a colite hemorrágica, e doenças
potencialmente fatais como síndrome urêmica hemolítica (PATON & PATON,
1998).
O grupo das E.coli enterohemorrágicas (EHEC) também chamadas de
E.coli produtora de toxina Shiga (STEC) ou E.coli produtora de verotoxina (VTEC)
tornou-se um dos mais importantes patógenos humanos devido ao seu potencial
zoonótico emergente (BEUTIN, 2006). No presente trabalho, será adotada a
expressão E.coli produtora de toxina Shiga (STEC) por ser a mais comumente
utilizada pelos pesquisadores.
No contexto da segurança alimentar, particularmente, os surtos por
EIEC, ETEC e STEC, são os melhores documentados. Os surtos por STEC têm
ocorrido com maior freqüência nos EUA, Canadá, Reino Unido e Japão.
6
GERMANO & GERMANO (2003), afirmaram que até o início da atual década, em
particular no Brasil, ainda não houve nenhum registro de casos de STEC.
2.2 Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC)
As cepas de Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) foram
descritas pela primeira vez em 1977, sendo reconhecidas como causadoras de
doenças em humanos e animais em 1983. A patogenicidade das cepas de STEC
parece estar associada a uma série de fatores, incluindo a produção de várias
citotoxinas, coletivamente chamadas de toxinas Shiga (Stx), similares à toxina
produzida pela bactéria Shigella dysenteriae (HUSSEIN & SAKUMA, 2005;
BEUTIN, 2006; CHAHED et al., 2006). O termo toxina Shiga é sinônimo de
verotoxina, nome que deriva da observação de que a toxina de Shiga é tóxica
para células Vero, e esta também é a origem do termo VTEC (E. coli produtora de
verotoxina), ainda usado por alguns autores como sinônimo de EHEC e STEC
(LAW, 2000).
As STEC são reconhecidas como um importante grupo de patógenos
emergentes e tornaram-se um grande desafio à saúde pública, pois possuem um
alto grau de infectividade para os seres humanos, mesmo presente em baixo
número no alimento ingerido - 10 UFC de acordo com o Food and Drugs
Administration (FDA, 2001) - são capazes de provocar infecção. O aumento
gradativo da ocorrência de surtos alimentares causados por STEC em todo o
mundo tem mostrado a importância da obtenção de informações sobre a
epidemiologia dessa bactéria e de seus reservatórios. Neste sentido, o principal
reservatório de STEC são os bovinos, que as elimina por meio das fezes. Estas
bactérias de maneira direta ou indireta podem atingir a cadeia alimentar dos seres
humanos causando graves doenças (KARMALI, 1989; YOON & HOVDE, 2008).
O grupo STEC tem mais de 400 sorotipos que produzem toxinas,
porém, de acordo com KARMALI et al. (2009), o sorotipo O157:H7 predomina,
sendo o mais frequentemente associado a surtos de colite hemorrágica e
síndrome urêmica hemolítica. O CDC (Center for Disease Control and Prevention)
estima que a cada ano pelo menos 2.000 americanos são hospitalizados e cerca
7
de 60 morrem em decorrência de infecções provocadas por E.coli O157:H7,
gerando um custo anual de 405 milhões, que incluem 370 milhões de dólares por
mortes prematuras, 60 milhões com assistência médica e 5 milhões por perda de
produtividade (FRENZEM et al., 2005). No entanto, existem outros sorogrupos de
STEC, não O157, que têm sido incriminados em surtos de toxinfecção alimentar.
Os principais e mais frequentemente associados a doenças são: O23, O91, O103,
O111, O118 e O121 (HUSSEIN & SAKUMA, 2005).
As linhagens produtoras de toxinas Shiga (Stx) do sorogrupo O157 são
clones em origem e, fenotípica e genotipicamente muito semelhantes. Sendo que,
o principal sorotipo produtor de Stx isolado é o O157:H7, embora o sorotipo
O157:H-, e variações não móveis sejam ocasionalmente isoladas (LAW, 2000).
As principais características que diferenciam E. coli O157:H7 das
demais cepas de E. coli são: o crescimento ínfimo ou nulo a 44°C; a incapacidade
de utilizar o sorbitol e produzir a enzima β-glicuronidase (MARGALL et al., 1997;
ANGELES, 2002). Por estas características biológicas e químicas, não são
detectadas nas análises de Coliformes Termotolerantes pelo método do Número
Mais Provável (NMP), que utiliza a fermentação da lactose a 44,5°C como
característica confirmativa, nem nas análises diretas de E. coli utilizando
substratos para a enzima β-glicuronidase (SILVA et al., 2003).
2.3 Mecanismo de patogenicidade
O mecanismo de patogenicidade das STEC é complexo e envolve
vários fatores de virulência. Apesar disso, a patogênese das infecções por STEC,
e em especial a E.coli O157:H7, pode ser dividida nas seguinte etapas:
sobrevivência no ambiente ácido do estômago, adesão à mucosa e colonização
do cólon, produção e absorção das toxinas e lesão vascular (YOON & HOVDE,
2008; KARMALI et al., 2009).
As STEC são dotadas de um sistema de regulação que lhes permite
adaptar-se e sobreviver no ambiente ácido do estômago (LAW, 2000). Graças a
8
esta capacidade de adaptação, é relativamente pequeno o número de bactérias
necessárias para causar uma infecção (FDA, 2001).
Ultrapassada a barreira gástrica, as STEC sobreviventes atingem o
intestino grosso, onde aderem à mucosa. Foi relatada uma relação direta entre a
presença do gene eae e a capacidade da STEC em causar doenças nos seres
humanos. Este gene eae codifica uma proteína externa da membrana,
denominada intimina. O processo de adesão é mediado por esta proteína que
interage com a proteína tirosina translocada para a superfície do enterócito. Da
interação intimina /tirosina resulta a lesão A/E (attaching and effacing) citado por
MENG et al., (2001). A lesão A/E caracteriza-se por uma estreita ligação entre a
membrana do enterócito e a parede bacteriana, o que desencadeia alterações no
citoesqueleto celular com consequente perda das microvilosidades dos
enterócitos, o que por si só já é suficiente para causar diarréia (LAW, 2000;
TRABULSI & ALTERTHUM, 2005; YOON & HOVDE, 2008; KARMALI et al.,
2009).
Após a adesão à mucosa do intestino, o microrganismo prolifera,
coloniza o cólon e produz toxinas. A produção da toxina Shiga é característica
comum a todas as STEC (PATON & PATON, 1998). Em vez de toxina, deve-se
reportar toxinas Shiga porque existem pelo menos duas toxinas Shiga conhecidas
como Stx1 e Stx2, sendo a última subdividida em quatro variedades (Stx2b,
Stx2c, Stx2d e Stx2e). A toxina Stx1 é imunologicamente idêntica à toxina da S.
dysenteriae e a Stx2 somente relacionada (MENG et al., 2001). A maioria das
E.coli O157:H7 isoladas produzem somente a Stx2; ocasionalmente são
produzidas Stx1 e Stx2, e raramente são encontrados isolados que produzam
somente Stx1 (GRIFFIN & TAUXE, 1991).
As células endoteliais são primariamente atingidas, sendo as renais as
que possuem um maior número de receptores para as toxinas desta bactéria
(HUTTEN & MORAES, 2000). Tanto a perda de sangue pelas fezes como a
insuficiência renal da síndrome urêmica hemolítica decorrem da ação de Stx
sobre o endotélio vascular. No cólon, deve ocorrer o rompimento de vasos e nos
rins ocorre obstrução dos vasos do glomérulo, o que leva a insuficiência renal
(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005).
9
2.4 Reservatório
A espécie bovina constitui-se no reservatório mais importante de
Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) e a maioria dos surtos de
infecções humanas causadas por estas bactérias deve-se ao consumo de carne
bovina mal cozida, leite de vaca não pasteurizado e de águas de abastecimento e
recreação contaminadas pelo conteúdo intestinal desses animais (HUSSEIN &
SAKUMA, 2005; SANDRINI et al., 2007). Diversos autores em diferentes países
têm isolado sorotipos patogênicos de STEC a partir de fezes de bovinos
saudáveis (HANCOCK et al., 1997; CERQUEIRA et al., 1999, MOREIRA et al.,
2003; HUSSEIN & SAKUMA, 2005; SANDRINI et al., 2007; STELLA et al., 2008).
A STEC está presente tanto no intestino do gado de corte como no
gado leiteiro e a excreção é mais comum em períodos quentes. A ocorrência é
maior em animais jovens e o agente pode permanecer viável no meio ambiente
por até dois anos (HANCOCK et al.,1997).
Em revisão feita sobre a ocorrência de STEC em bovinos, HUSSEIN &
SAKUMA (2005), estimaram que 0,2 a 48,8% das fezes de bovinos estejam
contaminadas com E.coli O157:H7. Estimativas mais elevadas são consideradas
(0,4 a 74%) quando a frequência de outros sorotipos de STEC em bovinos é
avaliada. Nos Estados Unidos, o sorotipo O157: H7 foi encontrado em 63% dos
confinamentos investigados em 13 estados americanos (HANCOCK et al., 1997).
Estudos realizados no Brasil têm encontrado uma alta ocorrência de
STEC em amostras de fezes de bovinos (CERQUEIRA et al., 1999; MOREIRA et
al., 2003; VETTORATO et al., 2003; IRINO et al., 2005; SALES et al., 2006;
FARAH et al., 2007; SANDRINI et al., 2007; TIMM et al., 2007; STELLA et al.,
2008). CERQUEIRA et al. (1999) avaliaram 197 amostras fecais de rebanhos
bovinos do Estado do Rio de Janeiro, e verificaram a ocorrência de STEC em
71% das amostras. Em gado leiteiro, a freqüência de isolamento foi de 82% e em
gado de corte, 53%. Desses isolados, três (1,5%) foram identificados como E.coli
O157:H7, sendo este provavelmente o primeiro trabalho a relatar o isolamento
deste sorotipo no Brasil.
Em pesquisa realizada no sul do Brasil, MOREIRA et al. (2003)
observaram a ocorrência de STEC em 57 (95%) das 60 fazendas investigadas, e
10
em 119 (49%) das 243 vacas. Embora constatando-se como alta a frequência de
cepas produtoras de Stx, não houve isolamento do sorotipo O157:H7. Em estudo
posterior, IRINO et al. (2005) detectaram a presença de STEC em 25,5% das
amostras de fezes de bovinos oriundas de fazendas no estado de São Paulo,
sendo que E.coli O157:H7 foi encontrada em 0,65% dos animais.
SANDRINI et al. (2007) investigaram a produção de toxinas Shiga em
1.127 isolados de Escherichia coli feitos a partir de 243 bovinos de leite, de água
de consumo humano e animal e de amostras de leite de 60 propriedades da bacia
leiteira de Pelotas com objetivo de determinar a prevalência e E.coli produtora de
toxina Shiga. Esses autores detectaram STEC em 48% dos animais e em 95%
das propriedades examinadas, sendo que o sorogrupo O157 foi encontrado em
1,2% dos animais. STELLA et al. (2008) identificaram o sorogrupo O157 em 0,9%
(4/430) das amostras de fezes de bovinos leiteiros provenientes da região de
Ribeirão Preto em São Paulo, tendo sido confirmada a presença do sorotipo
O157:H7 em 0,45% (2/430) das amostras.
Permanece incerta a participação da E.coli O157:H7 na ocorrência de
doença humana no Brasil. Por outro lado o grande rebanho bovino nacional, a
importação de animais para uso em melhoramento genético - de países com
ocorrência do sorotipo O157:H7 - assim como o hábito de consumo de carne, leite
e derivados de origem bovina sem tratamento térmico adequado, associada à
comercialização de produtos sem fiscalização sanitária, a globalização do
comércio de alimentos, ou mesmo a inexistência de uma programa específico de
vigilância sanitária na importação de alimentos, são fatores que contribuem para o
favorecimento da manutenção de animais infectados e o desencadeamento de
doença humana por E. coli O157:H7 no país (RIBEIRO et al., 1999).
2.5 Alimentos envolvidos
A carne bovina moída (hambúrguer) é a maior responsável pela
ocorrência de surtos de Escherichia coli O157:H7 (KARMALI, 1989; KARMALI et
al., 2009). Em seguida os produtos lácteos, como os leites crus e queijos, são
considerados importantes veículos. Do mesmo modo, sucos de frutas não
11
pasteurizados e produtos de origem vegetal consumidos crus, também constituem
relevante perigo em saúde pública (BETTS, 2000).
A contaminação de carcaças ocorre provavelmente durante o abate por
meio do contato com fezes e pele dos animais contaminados. Além disso, a
deposição de fezes dos animais no solo pode contaminar águas superficiais e
pelo fato do microrganismo se manter por longo período no esterco (HANCOCK et
al., 1997), pode contaminar os vegetais através da adubação. A manipulação
inadequada dos alimentos pode promover a contaminação cruzada como também
a transmissão pessoa a pessoa, sempre pela via fecal-oral (HUTTEN & MORAES,
2000).
É importante ressaltar que no Brasil não houve nenhum registro de
casos de surtos de doenças de origem alimentar provocado por STEC
(GERMANO & GERMANO, 2003). Entretanto, algumas pesquisas realizadas no
país vêm demonstrando a possibilidade de surgimento da doença. RIOS (2005)
detectou a presença da E.coli O157:H7 em 9 (11,25%) das 80 amostras
analisadas de meias-carcaças bovinas provenientes de dois frigoríficos de
Goiânia. CERQUEIRA et al. (1997) avaliaram a ocorrência de E. coli, capazes de
provocar diarréia, em carne crua bovina no Rio de Janeiro. Esses autores
obtiveram 42 cepas positivas isoladas de 34 (32,4%) amostras dentre 105
examinadas. Apesar de não ter sido isolado o sorotipo O157:H7, 21 (50,0%) eram
produtoras de toxina Shiga (STEC), enquanto as demais foram classificadas
como ETEC ou EPEC.
Surtos associados ao consumo de leite cru têm sido bem
documentados por vários autores (CLARKE et al., 1989; ANON, 1994), embora
segundo DE BUYSER et al. (2001) seja difícil estimar a proporção de doenças
veiculadas por leite e derivados devido às limitações dos sistemas de vigilância.
Desde a ocorrência de um surto de doença de origem alimentar
causada por Escherichia coli O157:H7 associada com o consumo de queijo fresco
(DURCH et al., 2000), a presença deste microrganismo neste derivado lácteo
tornou-se ponto de discussão. Segundo QUINTO & CEPEDA (1997) o leite
destinado à produção dos queijos pode estar contaminado com este
microrganismo devido aos procedimentos inadequados de ordenha que culminam
na contaminação do leite.
12
O leite utilizado na fabricação dos queijos deve ser obtido com a
máxima higiene e mantido em baixa temperatura, desde a ordenha até o seu
beneficiamento, visando garantir as características físicas, químicas e nutricionais
(BONFOH et al., 2003). A composição do leite, sua microbiota natural, a
contaminação pós-pasteurização, o processamento e manipulação, os
equipamentos, a temperatura de estocagem e o transporte inadequados podem
resultar em altos níveis de microrganismos patogênicos em queijos (ARAÚJO et
al., 2002).
Segundo MENG et al. (1998) o consumo de carne mal cozida e leite
cru foi considerado a principal causa de infecções causadas por E.coli O157:H7
em humanos. Como já foi dito o trato intestinal dos bovinos é reconhecidamente
um reservatório de E. coli O157:H7 e por conseguinte, as fezes contém os
microrganismos que podem contaminar o leite durante a ordenha. Isso explica a
origem da contaminação em um surto de E. coli O157:H7 em 1998 no oeste
central de Wisconsin (nos EUA), onde queijos frescos foram implicados como a
fonte da infecção (DURCH et al., 2000).
2.6 Queijo Minas Frescal
O queijo Minas Frescal é um alimento nutritivo e de baixo custo, sendo
muito popular entre os consumidores no Brasil. É preparado com leite integral
apresentando uma umidade de 43% e vida de prateleira de 10 a 14 dias
(GONZALEZ et al., 2000). Apresenta grande suscetibilidade a contaminações
microbianas, que podem ocorrer a partir do leite utilizado como matéria prima, ou
por contaminações cruzadas durante ou após o processamento. As
contaminações aliadas às alterações decorrentes podem, em poucos dias, tornar
o queijo inaceitável ou até mesmo impróprio para o consumo (ROCHA et al.,
2006).
Ressalta-se que, mesmo não sendo permitido, ainda é produzido a
partir de leite cru sendo um problema para a saúde dos consumidores, pois
constitui importante veículo para inúmeros agentes etiológicos de enfermidades
13
zoonóticas, entre eles a Escherichia coli (ARAÚJO et al., 2002; SHOUTEN et al.,
2004).
Há relatos confirmando que os queijos Minas Frescal comercializados
no Brasil são amplamente contaminados. ARAÚJO et al. (1997) observaram que
100% das amostras de queijo Minas Frescal obtidas em supermercados e
padarias localizadas na cidade do Rio de Janeiro, revelaram a presença de
Coliformes Termotolerantes em níveis acima dos tolerados. Das 21 marcas de
queijo Minas Frescal analisadas pelo INMETRO (2006) e comercializadas em
cinco Estados do país, cinco (23,81%) foram reprovadas por apresentarem
contaminação por Coliformes Termotolerantes acima dos valores tolerados pela
legislação.
Em outro estudo realizado na cidade do Rio de Janeiro, ARAÚJO et al.
(2002) verificaram que 95,5% das amostras de queijo Minas Frescal analisadas
apresentavam um alto nível de Coliformes Termotolerantes. SALOTTI et al.
(2006) analisaram 60 amostras de queijo Minas Frescal, por meio da
determinação do Número Mais Provável (NMP) de Coliformes Termotolerantes,
sendo 30 de produção artesanal e, 30 de produção industrial fiscalizadas pelo
Serviço de Inspeção Federal (SIF). Apresentaram-se em desacordo com o
estabelecido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), 83,4% das
amostras artesanais e 66,7% das amostras fiscalizadas pelo SIF.
Com o objetivo de avaliar a qualidade higiênico sanitária do queijo
Minas Frescal produzido artesanalmente e comercializado em Cuiabá – MT,
LOGUERCIO & ALEIXO (2001) analisaram 30 amostras e verificaram que 93,33%
apresentaram resultados em desacordo com o padrão vigente para a análise de
NMP de Coliformes Termotolerantes.
CAMPOS et al. (2006) detectaram a presença de Escherichia coli em
70,8 % (17/24) das amostras de queijo Minas Frescal fabricados em um laticínio
no estado de Goiás. Os autores constataram que as condições higiênico-
sanitárias do produto testado não foram satisfatórias, podendo apresentar perigo
à saúde dos consumidores em razão de sua larga comercialização no Estado.
Segundo ROCHA et al. (2006) a sobrevivência de microrganismos
patogênicos, entre eles a E. coli, durante todo o processamento e
armazenamento do queijo Minas Frescal deve ser considerada, devido à
14
possibilidade de contaminação da matéria prima, das superfícies em contato
direto ou indireto com o produto durante o processamento e ao fato da
multiplicação microbiana ser inevitável durante esse período. SAAD et al. (2001)
verificaram que E.coli O157:H7 pode sobreviver em queijo Minas Frescal, devido
as características intrínsecas deste produto que o torna favorável ao crescimento
deste patógeno. Desse modo, este tipo de queijo assume considerável
importância em saúde pública, dadas as suas condições peculiares de produção,
exigindo maior atenção por parte dos órgãos oficiais de fiscalização e
regulamentação, principalmente, no que concerne ao controle higiênico sanitário
(GERMANO & GERMANO, 2003).
STEPHAN et al. (2008) analisaram por meio da técnica de reação em
cadeia da polimerase (PCR) 432 queijos frescais fabricados com leite cru na
Suíça, no ano de 2006, e 364 em 2007. Esses autores encontraram uma
prevalência de 3,7 % no ano 2006 e 6,3% em 2007, embora não tenha sido
encontrada nenhum isolado de E.coli O157:H7. Esses resultados sugerem que
este tipo de queijo pode ser um veículo em potencial de STEC, e por
conseqüência, do sorotipo O157:H7 para humanos.
Escherichia coli O157:H7 foi detectada em 7,84% das amostras de
queijo fresco provenientes de Lima, no Peru (MORA et al., 2007) e em 4% dos
queijos fabricados a partir de leite cru na Turquia (ÖKSÜZ et al., 2003). No
entanto, ZAGO et al. (2007) não observaram a ocorrência de E.coli O157:H7 em
amostras de queijo fresco produzido com leite cru na Itália.
Surtos associados à STEC ainda não foram confirmados em nosso
país, no entanto, existem relatos de alta prevalência de STEC em bovinos
saudáveis (CERQUEIRA et al., 1999; IRINO et al., 2005, SANDRINI et al., 2007;
STELLA e al., 2008). Além disso, PANETO et al. (2007) ao estudarem 50 queijos
Minas Frescal elaborados com leite não pasteurizado obtidos em supermercados
da região Centro Oeste do Brasil, encontraram Escherichia coli em 96% e, destas,
6% pertenciam ao grupo STEC. Apesar de não ter sido isolado o sorotipo
O157:H7, os autores sugerem que o queijo Minas Frescal pode ser veículo de
transmissão de STEC e por conseqüência de E.coli O157:H7.
No estado de São Paulo, um estudo vem sendo conduzido pelo Centro
de Vigilância Epidemiológica (CVE/SES-SP, 2007) para conhecer a situação do
15
patógeno e da síndrome, além de estabelecer pontos de referência para a
implantação de um sistema adequado de vigilância e prevenção. No entanto,
atualmente, ainda não existem dados sistematizados sobre a ocorrência de E. coli
O157:H7 e síndrome urêmica hemolítica no país. Embora este sorotipo já tenha
sido isolado de processos de doença, nunca foi relacionado a um grande número
de casos (IRINO et al., 2002), apesar de em países vizinhos como Argentina,
Chile e Uruguai as infecções por E.coli O157:H7 e outras STEC sejam
relativamente freqüentes (MITTELSTAEDT & CARVALHO, 2006) . Esta diferença
pode estar relacionada a uma proteção imunológica causada pelas infecções por
outro grupo de E.coli patogênica, as EPEC (E.coli enteropatogênica), que são
bastante freqüentes no Brasil e também têm a capacidade de ocasionar a lesão
A/E (BEUTIN, 2006; PALMEIRA et al., 2005).
2.6 Detecção de E. coli O157:H7 pela reação em cadeia da polimerase
A tecnologia da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi
desenvolvida por Kary Mullis e colaboradores em 1986. Desde então, tem
provocado um grande impacto na biologia molecular, devido à sua enorme
sensibilidade e especificidade para amplificar pequena quantidade de DNA em
milhões de cópias para detecção, sequenciamento, clonagem e diagnóstico,
dentre outros (HUSSEIN & SAKUMA, 2005).
A PCR é um dos principais métodos moleculares utilizados para
detecção de E.coli O157:H7 e tem sido utilizada por diversos autores na detecção
deste patógeno (ÖKSÜZ et al., 2003; IRINO et al., 2005; PANETO et al., 2007;
STEPHAN et al., 2008). Esta técnica apresenta como vantagens a especificidade
e sensibilidade bem como a rapidez na sua execução (PATON & PATON, 1998).
Por outro lado apresenta como desvantagem a presença de inibidores da reação
presentes na própria amostra e a facilidade de contaminação durante o processo
(WANG, 1997; FREITAS et al., 2006). Além disso, a sequência a ser escolhida
para o iniciador (primer) deve conter uma região bastante conservada para que
não ocorra a diminuição na eficiência do anelamento. Variações da PCR como
PCR multiplex, PCR em Tempo Real também são utilizados. A maioria destas
16
técnicas é usada para determinar a presença de microrganismos na amostra sem
a necessidade do isolamento do microrganismo (PATON & PATON, 1998;
FARAH, 2000).
Visando a detecção de Escherichia coli O157:H7 por meio da técnica
de PCR, foram selecionados quatro pares de primers para detecção dos genes
rfbE e fliC que estão envolvidos na biossíntese dos antígenos, somático O157 e
flagelar H7.
ABDULMAWJOOD et al. (2003) desenharam um par de primers
específico para detecção de E.coli O157, chamado Gi-O157, o qual foi testado em
um estudo colaborativo incluindo 12 laboratórios internacionais. Tratou-se de uma
parte do maior projeto europeu sobre diagnóstico por PCR, onde foi desenvolvido
e validado por meio de teste interlaboratorial a amplificação de uma seqüência do
gene rfbE O157. O par de primers testado mostrou alta seletividade para a
confirmação do sorotipo O157 em cultura pura do microrganismo.
HU et al. (1999) também desenharam um par de primers específico
para o antígeno O157 denominado Rfb envolvido na biossíntese do antígeno
O157, O111, O9 e O101 (n° de acesso ao GenBank: S83460, U13629, D43637 e
X59852, respectivamente). Esses antígenos foram analisados e comparados
usando o Genetics Computer Group (GCG versão 9.1), obtendo-se duas
seqüências de primers (RbfF e RfbR) específicas para o gene O157.
Para amplificar seqüências específicas do antígeno H7 foi escolhido o
par de iniciadores desenhado por WANG et al. (2002). Este par anela nas
posições 1068-1088 e 1314-1294 da seqüência fliC que codifica o antígeno H7 da
E.coli (n° de acesso ao GenBank: AF228488), e obtém um produto de PCR de
247 pb.
2.7 Detecção de E. coli O157:H7 pelo kit comercial VIDAS ECO O157®
Muitos pesquisadores utilizam a PCR como método de diagnóstico, no
entanto no presente estudo, além desta metodologia foi empregado o kit
comercial VIDAS ECO O157®. Trata-se de um teste imunoenzimático, que
17
permite a detecção de antígenos de E.coli O157 pelo método ELFA (Enzyme
Linked Fluorescent Assay) utilizando o sistema automatizado VIDAS® (FRANÇA,
1998).
É um método rápido e útil para detecção de E.coli O157 em amostras
de alimentos, pois emite resultado dentro de 24 horas após o início da análise.
Além disso, permite a análise de uma grande quantidade de amostras devido à
simplicidade do método (HAMADA et al., 2002).
HUCKER et al. (2006) avaliaram a eficácia do sistema de imunoensaio
automatizado VIDAS® para a detecção de Escherichia coli O157:H7 em leite. Os
resultados obtidos por esses autores revelaram que o mini-VIDAS ECO O157® foi
superior ao método convencional, com sensibilidade, especificidade e acurácia de
100%, 97,9% e 99,3%, respectivamente. Em trabalho semelhante, VERNOZY-
ROZAND et al. (1998) constataram que o método VIDAS® foi superior ao
tradicional.
Por outro lado, TUTENEL et al. (2003) concluíram que o VIDAS ECO
O157® apresentou baixa especificidade, pois apenas 27 (6%) das 451 amostras
de carne positivas no equipamento VIDAS® foram confirmadas pelo método
tradicional de isolamento e identificação.
18
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
• Verificar a ocorrência de Escherichia coli O157:H7 em queijos Minas
Frescal produzidos artesanalmente e em estabelecimentos de leite e
derivados sob Inspeção Federal em Goiás, e comercializados
respectivamente em feiras livres e supermercados de Goiânia.
3.2 Objetivos específicos
• Determinar a ocorrência de E. coli O157:H7 em amostras de queijo Minas
Frescal por meio das técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR)
e kit VIDAS ECO O157® (bioMérieux, Lyon, France).
• Comparar os resultados obtidos pelo emprego do método de identificação
de E. coli O157:H7, VIDAS ECO O157® (bioMérieux, Lyon, France) e
PCR.
• Comparar a ocorrência de E. coli O157:H7 entre queijos Minas Frescal
comercializados em feiras-livres e queijos Minas Frescal fabricados em
estabelecimentos sob Inspeção Federal.
• Comparar os resultados da determinação do Número Mais Provável - NMP
de Coliformes Termotolerantes e Escherichia coli em queijos Minas Frescal
comercializados em feiras livres e em queijos Minas Frescal fabricados em
estabelecimentos sob Inspeção Federal.
19
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Fonte de amostras, local de execução das análises e definição dos ensaios
Para a realização do experimento foram colhidas amostras de queijo
Minas Frescal produzidos artesanalmente e comercializados em feiras livres de
Goiânia-GO e em estabelecimentos sob Inspeção Federal localizados em Goiás e
comercializados em supermercados de Goiânia-GO. As análises foram realizadas
nos laboratórios de Microbiologia de Alimentos e Água e Biologia Molecular do
Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade
Federal de Goiás.
Para tanto, foram realizados os seguintes ensaios analíticos definidos
abaixo e representados na Figura 1:
a) Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 por meio do teste VIDAS ECO O157®
(bioMérieux, Lyon, France).
b) Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 por meio da técnica de PCR.
c) NMP de Coliformes Termotolerantes (APHA, 2001).
d) NMP de Escherichia coli (APHA, 2001).
20
VIDAS
positivo negativo
IsolamentoBioquímica e
Sorologia
Ausência de E.coli O157:H7
Queijo
Enriquecimento primário
Enriquecimento seletivo
Antisoro H7
Presença de E.coli O157:H7
Ausência de E.coli O157:H7
Primer para detecção do antígeno O157
PCR
Se - ► Ausência de E.coli O 157
Se + ► Presença de E.coli O 157
Primer para detecção do antígeno H7
Se + ► Presença de E.coli O 157: H7
Se - ► Presença de E.coli O 157 não H7
NMP de Coliformes Termotolerantes
NMP de E.coli
Diluição
Se + para anti-soro O157
positivo negativo
Presença de E.coli O157 não H7
Se - para anti-soro O157
VIDAS
positivo negativo
IsolamentoBioquímica e
Sorologia
Ausência de E.coli O157:H7
Queijo
Enriquecimento primário
Enriquecimento seletivo
Antisoro H7
Presença de E.coli O157:H7
Ausência de E.coli O157:H7
Primer para detecção do antígeno O157
PCR
Se - ► Ausência de E.coli O 157
Se + ► Presença de E.coli O 157
Primer para detecção do antígeno H7
Se + ► Presença de E.coli O 157: H7
Se - ► Presença de E.coli O 157 não H7
Primer para detecção do antígeno O157
PCR
Se - ► Ausência de E.coli O 157
Se + ► Presença de E.coli O 157
Primer para detecção do antígeno H7
Se + ► Presença de E.coli O 157: H7
Se - ► Presença de E.coli O 157 não H7
Se + ► Presença de E.coli O 157
Primer para detecção do antígeno H7
Se + ► Presença de E.coli O 157: H7
Se - ► Presença de E.coli O 157 não H7
NMP de Coliformes Termotolerantes
NMP de E.coli
Diluição
NMP de Coliformes Termotolerantes
NMP de E.coli
Diluição
Se + para anti-soro O157
positivo negativo
Presença de E.coli O157 não H7
Se - para anti-soro O157
FIGURA 1- Representação esquemática dos ensaios analíticos realizados
4.2 Amostragem
No período de janeiro a março de 2009 foram colhidas 30 amostras de
queijos Minas Frescal oriundas de 30 feiras livres do município de Goiânia/GO.
Segundo listagem obtida na Secretaria Municipal de Desenvolvimento Econômico,
existem 68 feiras livres diurnas em Goiânia. Feiras noturnas não foram
consideradas na realização deste estudo por privilegiarem o comércio de roupas e
artesanato. Das 68 feiras livres existentes durante a realização do experimento
foram sorteadas 30 sendo que, de cada, foi sorteada uma banca para colheita de
amostra, perfazendo um total de 30 amostras. Freqüentemente um mesmo
feirante participa de mais de uma feira durante a semana, por isso durante a
colheita tomou-se o cuidado de não colher amostras do mesmo feirante ou
21
mesmo produtor de queijo. A distribuição de feiras sorteadas no município de
Goiânia pode ser visualizada na Figura 2.
FIGURA 2 – Mapa da região metropolitana de Goiânia Os números correspondem aproximadamente à localização das feiras livres onde a amostragem foi realizada.
Legenda: 01. Vila Nova, 02. St. Criméia Oeste, 03. St. Sul, 04. Conjunto Itatiaia, 05. St. Fama, 06. St. Bueno, 07. Jd.
América, 08. Conjunto Vera Cruz II, 09. Vila Pedroso, 10. Vila Novo Horizonte, 11. Parque Santa Rita, 12. Parque das
Laranjeiras, 13. Jd. Guanabara, 14. Jd. Balneário Meia Ponte, 15. Parque Industrial João Vaz, 16. St. Urias Magalhães, 17.
St. Petro Ludovico, 18. Vila União, 19. Jd. Nova Esperança, 20. Jd. Liberdade, 21. Jardim Lageado, 22. Vila Abajá, 23. St.
Oeste, 24. Conjunto Riviera, 25. Bairro Capuava, 26. St. Sudoeste, 27. St. Aeroporto, 28. Bairro Goiá, 29. Parque
Amazonas, 30. Jd. Novo Mundo
Fonte: Lista Telefônica de Goiânia e Região Metropolitana – Assinantes Comerciais e Classificados. Plublicar do Brasil
Listas Telefônicas Ltda, 2008 – com modificações.
22
Durante este mesmo período foram colhidas 30 amostras de queijo
Minas Frescal provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal, de
maneira que o número de amostras colhidas de cada fabricante fosse
proporcional à quantidade de queijos produzidos pelo estabelecimento durante o
ano de 2007, dado obtido junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento. Durante a realização do experimento existiam 10
estabelecimentos sob Inspeção Federal produtores de queijo Minas Frescal no
Estado de Goiás que comercializavam seus produtos em supermercados de
Goiânia. Para este estudo foram colhidas amostras de todos os estabelecimentos
produtores deste tipo de queijo, sendo que a coleta realizada em supermercados
da capital.
As amostras de queijo foram colhidas em suas embalagens originais,
nas quais o produto encontrava-se pronto para comercialização. Uma vez
colhidas, foram acondicionadas em caixas isotérmicas contendo gelo e
transportadas até o laboratório onde foram processadas num período máximo de
24 horas.
4.3 Detecção de Escherichia coli O157:H7
Visando determinar a ocorrência de E.coli O157:H7 em queijos Minas
Frescal utilizou-se o kit comercial VIDAS ECO O157® e a técnica da reação em
cadeia da polimerase (PCR) para a detecção do microrganismo.
4.3.1 VIDAS ECO O157®
O kit VIDAS ECO O 157® (bioMérieux, Lyon, France) é composto pelos
cones e barretes (Figura 3) além de dois calibradores, um controle positivo e um
controle negativo. O cone é utilizado como fase sólida no qual encontram-se
adsorvidos os anticorpos anti-E.coli O157, que irão fixar-se aos antígenos, se
presentes nas amostras previamente encubadas em caldo de enriquecimento. Os
23
elementos não fixados são eliminados por lavagem. Em seguida, anticorpos
conjugados com uma enzima são aspirados automaticamente do barrete pelo
equipamento e inseridos no cone, fixando-se aos antígenos de E.coli O157 que
estão presos aos anticorpos da parede do cone. Por fim, é aspirado também do
barrete um substrato o qual é inserido no cone e degradado pela enzima
conjugada com anticorpo formando um produto cuja fluorescência emitida é
medida pelo equipamento (GRIF et al., 1998), Figura 4.
FIGURA 3 - Cone e barrete Fonte: bioMérieux (2009)
FIGURA 4 – Detecção dos antígenos de E.coli O157 por meio do Kit VIDAS ECO O157®
Fonte: bioMérieux (2009)
ConeCone
Organismo Organismo alvoalvo
AMOSTRA LAVAGEM CONJUGADO SUBSTRATO
E
E
E
E
E E
E
E
E
E
370 n
m450 nm
REAREAÇÇÃO IMUNOLÃO IMUNOLÓÓGICAGICA REAREAÇÇÃO ENZIMÃO ENZIMÁÁTICATICA- 7-1
ConeCone
Organismo Organismo alvoalvo
AMOSTRA LAVAGEM CONJUGADO SUBSTRATO
E
E
E
E
E
E
E EEE
EE
EE EE
E
E
E
E
E
E
E
E
370 n
m450 nm
REAREAÇÇÃO IMUNOLÃO IMUNOLÓÓGICAGICA REAREAÇÇÃO ENZIMÃO ENZIMÁÁTICATICA- 7-1
Barrete
Cone
Barrete
Cone
24
Os procedimentos de análise foram conduzidos em acordo com as
instruções descritas pelo fabricante do kit VIDAS ECO O 157® (bioMérieux, Lyon,
France). Neste experimento foi utilizado o protocolo geral para produtos
alimentares validado pela AFNOR (N° BIO-12/8-07/00).
Inicialmente, 25 gramas da amostra foram homogeneizados em 225
mL de caldo Tripcase Soja modificado (Difco, USA) suplementado com solução
aquosa de Acriflavina-HCl (concentração final de 10 mg/L) e incubados durante 6
a 7 h a 41°C. Em seguida, transferiu-se 1 mL do caldo de pré-enriquecimento
para 9 mL de caldo Mac Conkey (Difco, USA) com Cefixima (concentração final
de 0,05 mg/L) e Telurito de Potássio (concentração final de 2,5 mg/L) incubado-o
por 18 h a 36°C. Após incubação, transferiu-se 2 mL deste caldo para um tubo de
ensaio com tampa de rosca que foi aquecido a 100°C durante 15 minutos. O
caldo restante foi conservado entre 2°C-8°C para a confirmação no caso de
resultados positivos.
Foram colocados 0,5 mL da amostra aquecida no primeiro poço da
barrete. Em seguida, foram introduzidos a barrete e o cone no equipamento
VIDAS® (Figura 5). Todas as etapas foram realizadas automaticamente pelo
módulo analítico VIDAS®. Terminado o teste, o sistema informatizado do
equipamento forneceu o resultado como positivo ou negativo. No caso dos
resultados positivos iniciou-se a confirmação por meio do plaqueamento em ágar
Mac ConKey Sorbitol (Difco, USA) suplementado com Cefixima e Telurito de
Potássio (SMAC-CT), na concentração final de de 0,05mg e 2,5 mg/L,
respectivamente; a partir do caldo Mac Conkey com Cefixima e Telurito de
Potássio, conservado entre 2°C – 8°C.
FIGURA 5 – Equipamento VIDAS® Fonte: arquivo pessoal (2009)
25
Foram selecionadas 40 unidades formadoras de colônias (UFCs)
suspeitas de E.coli O157:H7, sorbitol negativo, que apresentaram-se incolores no
ágar SMAC-CT (Figura 6). Devido às dificuldades encontradas no isolamento de
colônias sorbitol negativas com perfil bioquímico característico, procedeu-se o
plaqueamento em ágar cromogênico CHROMagar O157® (Figura 7), que contém
substratos cromogênicos e assim permite a identificação presuntiva da E.coli
O157:H7 e diferenciação de outros microrganismos presentes, como citado por
CHURCH et al. (2007). As UFCs típicas foram repicadas em ágar Tríplice açúcar
ferro - TSI, sendo que, aquelas que apresentaram crescimento compatível - base
e bisel amarelos com produção de gás e sem produção de H2S - foram
submetidas à caracterização bioquímica. Considerou-se prova positiva para E.
coli O157:H7 quando a leitura apresentou os seguintes resultados: indol,
vermelho de metila, lisina e ornitina positivos; Voges Proskauer - VP, citrato de
Simmons e sorbitol negativos. Os isolados com perfil bioquímico característicos
foram submetidos à sorologia por meio da utilização dos anti-soros O157 e H7.
Como controle positivo foi utilizada a cepa de referência adquirida junto
à coleção do Laboratório de Materiais de Referência do Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz,
Escherichia coli (EHEC) O157:H7 INCQS 00171.
FIGURA 6 - Colônias sorbitol negativo em ágar SMAC-CT
Fonte: arquivo pessoal (2009)
Colônias sorbitol negativo
26
FIGURA 7 – Colônias com crescimento característico de E.coli O157 em CHROMagar O157®
Fonte: arquivo pessoal (2009)
4.3.2 Técnica da reação em cadeia da polimerase – PCR
4.3.2.1 Processamento das amostras e extração de DNA genômico
Inicialmente, 25 gramas da amostra foram homogeneizados com 225
mL de caldo Tripcase Soja modificado suplementado com solução aquosa de
Acriflavina-HCl (concentração final de 10 mg/L) e incubados durante 6 a 7 h a
41°C. Em seguida, transferiu-se 1 mL do caldo de pré-enriquecimento para 9 mL
de caldo Mac Conkey com Cefixima e Telurito de Potássio (concentração final de
0,05mg e 2,5 mg/L, respectivamente), incubando-o por 18 h a 35°-37°C. Após
incubação, uma alíquota de 1,5 mL do caldo foi centrifugado a 10.000 rpm/10 min.
Descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi ressuspendido em 500 µL de
tampão Tris-EDTA (TE, 10Mm Tris, 1mM EDTA, pH 8,0). A extração do DNA
genômico foi realizada de acordo com o protocolo do High Pure PCR templante
preparation Kit (Roche®, Mannhein, Germany).
Para avaliar a qualidade e determinar a concentração do DNA extraído,
5 µL de solução de DNA foram submetidos à eletroforese submarina em gel de
agarose 0,8% em tampão TBE 0,5X (Tris-Borato-EDTA, pH 8,0) a 100V/45min.
Como padrão de massa molecular para DNA foi utilizado 4 µL de Low DNA Mass
27
Ladder (Invitrogen®, Brazil), que após eletroforese resultou em fragmentos de DNA
contendo 200ηg, 120ηg, 80ηg, 40ηg, 20ηg e 10ηg. Os géis de agarose foram
corados em solução aquosa de Gel Red Nucleic Acid Get Stain 10.000X
(Uniscience®, Brazil), e fotografados em fotodocumentardor digital Gel Doc XR
(Bio-Rad®, USA).
A concentração de DNA foi estimada por comparação visual com os
fragmentos de Low DNA Mass Ladder (Invitrogen®, Brazil). Uma vez determinada
a concentração de DNA em solução, esta foi diluída para 100ηg/5µL e estocada a
-20°C.
4.3.2.2 Primers utilizados nas reações e condições de amplificação
Foram utilizados os primers Gi-O157, Rfb e FliC para detecção de
Escherichia coli O157:H7 (Quadro 1) sendo que os primers Gi-O157
(ABDULMAWJOOD et al., 2003) e Rfb (HU et al., 1999) são complementares à
região do gene rfbE envolvida na biossíntese do antígeno somático O157 e o
primer FliC (WANG et al., 2002) complementar à região do gene fliC que codifica
o antígeno flagelar H7.
QUADRO 1 – Primers utilizados neste estudo
Gene Primer Sequência de bases (5’-3’) Amplicon (pb) Autor rfbEo157
Gi-O157-I
Gi-O157-II
CGA GTA CAT TGG CAT CGT G
ATT GCG CTG AAG CCT TTG
484 ABDULMAWJOOD et
al., 2003
rfbEo157 RfbF
RfbR
GTG TCC ATT TAT ACG GAC ATC CAT G
CCT ATA ACG TCA TGC CAA TAT TGC C
292 HU et al., 1999
fliCH7 FliC-a
FliC-b
TCA CAT CGC AAA AGC AAC TCC
GTC GGC AAC GTT AGT GAT ACC
247 WANG et al., 2002
A mistura de PCR (50µL) usada continha 0,2 µL de cada primer (100
pmol/µL), 5 µL de dNTP (100 mmol, Invitrogen, Brazil), 5 µl de tampão 10X
(Invitrogen, Brazil), 0,125 µL de solução de MgCl2 (1M, Invitrogen, Brazil), 0,234
µL de Taq polimerase (5U/ µL, Invitrogen, Brazil), 34,242 µL de água ultra-pura e
5 µL do DNA extraído.
28
A etapa de amplificação foi realizada em termociclador PTC-100
(Programmable Thermal Controler – MJ Research®, USA) seguindo as condições
descritas no Quadro 2.
QUADRO 2- Condições de amplificação dos primers usados no estudo
Referência ABDULMAWJOOD et al., 2003 HU et al., 1999 WANG et al., 2002
Amplicon 484 pb 282 pb 247 pb
Desnaturação inicial 93°C/3 min 94°C/5 min 95°C/8 min
Ciclos 30 35 30
Desnaturação 93°C/15 s 94°C/30 s 95°C/30s
Anelamento 60°C/15 s 59°C/60 s 58°C/30s
Extensão 72°C/30 s 72°C/60 s 72°C/30s
Extensão final 72°C/5 minutos 94°C/5 min 72°C/7 min
Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroferese
submarina em gel de agarose a 2% e tampão TBE 0,5X, pH 8,0, com corrida a
100V/75 min. Os géis foram corados em solução aquosa de Gel Red Nucleic Acid
Get Stain 10.000X (Uniscience®, Brazil) e os resultados visualizados e
fotografados em fotodocumentardor digital Gel Doc XR (Bio-Rad®, USA).
Como controle negativo de reagentes foi utilizada a mistura de reação
adotada para cada par, com substituição do DNA por água ultra-pura. Como
controle positivo utilizou-se uma cepa de referência adquirida junto à coleção do
Laboratório de Materiais de Referência do Instituto Nacional de Controle de
Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz, Escherichia coli
(EHEC) O157:H7 INCQS 00171. Utilizou-se como padrão de peso molecular o
100pb DNA Ladder (Invitrogen®, Brazil).
4.4 NMP de Coliformes Termotolerantes
A determinação do NMP de Coliformes Termotolerantes por grama
(NMP/g) de amostra foi conduzida em acordo com APHA (2001). Inicialmente,
29
foram selecionadas três diluições decimais adequadas da amostra e transferidos
1 mL para tubos contendo 10 mL de caldo Lauril Sulfato de Sódio com tubos de
Durhan invertidos (fase presuntiva). Após incubação a 35 ± 1°C durante 48h, dos
tubos positivos que apresentaram produção de gás e turvação do caldo, foi
transferida uma alíquota de 10 µL para tubo contendo caldo EC com tubo de
Durham invertido que, em seguida, foram incubados em banho maria a 44,5 ±
0,2°C durante 48 horas (fase confirmativa).
Foram considerados positivos na fase confirmativa os tubos que
apresentaram turvação do caldo e presença de gás, visualizado por meio da
constatação de bolhas no interior dos tubos de Durhan. O resultado foi expresso
em Número Mais Provável calculado com auxílio da tabela de McCrade com base
no número de tubos positivos em cada uma das três diluições.
4.5 NMP de Escherichia coli
A análise de NMP de Escherichia coli foi realizada conforme a
metodologia preconizada por APHA (2001). Dos tubos contendo caldo EC e que
foram positivos na fase confirmativa da determinação de Coliformes
Termotolerantes, foi retirada uma alíquota de 1µL e realizado o plaqueamento em
ágar EMB (eosin methylene blue). Após incubação a 35°C durante 24 - 48 horas,
as placas foram avaliadas e, quando presentes, foram transferidas três UFCs
típicas (roxas com brilho verde metálico, Figura 8) e três atípicas (roxas sem
brilho verde metálico) para tubo contendo ágar TSI. Depois de incubados 35 ±
1°C por 18 – 24 h, aqueles que apresentaram crescimento característico de E.coli
(base e bisel amarelos com produção de gás e sem produção de H2S) foram
submetidos às provas bioquímicas de indol, VM, VP e critrato de Simmons. As
UFCs que apresentaram perfil ++ - - ou - + - - foram consideradas positivas para
presença de E. coli. O resultado foi expresso em NMP calculado com o auxílio da
tabela de McCrade com base no número de tubos positivos.
30
FIGURA 8 – UFCs típicas de E.coli em ágar EMB
Fonte: arquivo pessoal (2009)
4.6 Análise estatística
A análise dos dados referentes à detecção e distribuição de E.coli
O157:H7 foi realizada com base na análise descritiva com distribuição de
freqüência, além do teste qui-quadrado (χ²) e o teste t para a comparação dos
resultados (SAMPAIO et al., 1998).
31
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Detecção de Escherichia coli O157:H7 por meio do kit VIDAS ECO O157® Na Tabela 1 são apresentados os resultados obtidos no equipamento
VIDAS® para as amostras de queijo Minas Frescal segundo as fontes de
detecção. Para as amostras provenientes de feiras livres, do total de amostras
analisadas, 25/30 (83,33%) foram positivas para Escherichia coli O157 e 5/30
(16,67%) negativas. Nas amostras oriundas de estabelecimentos sob Inspeção
Federal (IF), 20/30 (66,67%) foram positivas e 10/30 (33,33%) negativas.
TABELA 1 – Resultados para Escherichia coli O157 obtidos no equipamento
VIDAS® para as amostras de queijo Minas Frescal segundo as fontes de
detecção. Goiânia – GO, 2009.
Escherichia coli O157 – equipamento VIDAS® (+) (-)
Fontes
N° % N° % Feira livre 25/30 83,33 5/30 16,67 Estabelecimentos sob IF 20/30 66,67 10/30 33,33 Total 45/60 75 15/60 25
(+) resultado positivo ao VIDAS®. (-) resultado negativo ao VIDAS®. N°: resultado obtido/amostras analisadas.
É importante ressaltar que o equipamento VIDAS® detecta por meio do
uso do kit comercial VIDAS ECO O157®, a presença ou ausência de E.coli O157
através de uma reação antígeno-anticorpo. Entretanto, para que esse resultado
seja confirmado é necessário o isolamento do microrganismo. Assim, das 45/60
(75%) amostras positivas no equipamento VIDAS®, isolou-se o microrganismo em
apenas 2/60 (3,33%), a confirmação de E.coli O157:H7 foi realizada por meio de
provas bioquímicas e sorológicas conforme descrito no item 4.3.1 .
A Tabela 2 apresenta a distribuição de E.coli O157:H7 - resultados
confirmados - em queijos Minas Frescal segundo as fontes, detectados por meio
do kit comercial VIDAS ECO O157®. Os isolados confirmados como E.coli
O157:H7 eram provenientes de feiras livres de Goiânia.
32
TABELA 2 – Distribuição de E. coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal
segundo as fontes, detectadas por meio do kit comercial VIDAS ECO O157®,
isoladas e confirmadas por bioquímica e sorologia. Goiânia – GO, 2009.
Escherichia coli O157:H7 (+) (-)
Fontes
N° % N° % Feiras livres 2/30 6,67 28/30 93,33
Estabelecimento sob IF 0/30 0 30/30 100 Total 2/60 3,33 58/60 96,67
(+) resultado positivo ao VIDAS®. (-) resultado negativo ao VIDAS®. N°: resultado obtido/amostras analisadas.
Observa-se por meio da análise dos resultados (Tabelas 1 e 2) que o
equipamento detectou a presença do microrganismo em um número elevado de
amostras 45/60 (75%). Apesar disso, o resultado final para E.coli O157:H7 foi
relativamente baixo (3,33%) se comparado ao resultado emitido pelo
equipamento, pois, isolou-se o microrganismo em apenas duas amostras. Vale
destacar que, durante o experimento, fez-se o plaqueamento em ágar CT-SMAC
no mínimo 4 vezes e testou-se de cada placa 10 UFCs sugestivas tendo-se um
total de 40 isolados, sendo que destes nenhum foi confirmado com sendo E.coli
O157:H7.
Diante da dificuldade em isolar o microrganismo em ágar CT-SMAC
procedeu-se então ao plaqueamento em ágar cromogênico CHROMagar O157®.
Nesse ágar conseguiu-se isolar o microrganismo em apenas duas amostras.
Acredita-se que a dificuldade no isolamento do microrganismo possa ser
decorrente da presença de células mortas e/ou injuriadas do microrganismo,
presença do patógeno em número muito pequeno no alimento, ou ainda, da
interferência da microbiota endógena do leite.
Essa mesma dificuldade em isolar a Escherichia coli O157:H7 foi
também encontrada por TUTENEL et al. (2003) que concluíram que o VIDAS
ECO O157® apresentou baixa especificidade, pois apenas 27 (6%) das 451
amostras de carne positivas no equipamento VIDAS® foram confirmadas pelo
método tradicional de isolamento e identificação.
33
Analisando os resultados apresentados na Tabela 2 nota-se que a
Escherichia coli O157: H7 foi isolada em 2/30 (6,67%) das amostras oriundas de
feiras livres, não tendo sido isolada em amostras provenientes de
estabelecimento sob Inspeção Federal. A ocorrência do patógeno em amostras
de queijo Minas Frescal oriundas de feiras livres pode ser explicada, em parte,
pela baixa qualidade dos queijos produzidos de forma artesanal e não submetidos
à fiscalização. Esses queijos, geralmente são produzidos com leite cru que é um
dos alimentos frequentemente envolvidos em surtos de toxinfecção
alimentar causados por E.coli O157:H7 (CLARKE et al., 1989; ANON, 1994;
BETTS, 2000) em países da América do Norte e Europa. Vale ressaltar que, o
tratogastrointestinal dos bovinos é o principal reservatório do microrganismo que
pode contaminar o leite durante os procedimentos de ordenha (HUSSEIN &
SAKUMA, 2005). No Brasil, alguns autores já detectaram a presença deste
patógeno no rebanho nacional (CERQUEIRA et al., 1999; IRINO et al., 2005;
SANDRINI et al., 2007) o que pode explicar a presença do patógeno nas
amostras analisadas.
No Brasil não existem estudos focados na detecção desse
microrganismo por meio do kit VIDAS ECO O157®, entretanto alguns trabalhos
internacionais utilizaram este método. BONARDI et al. (2000) pesquisaram a
ocorrência de E.coli O157:H7 por meio do VIDAS ECO O157® em 40 amostras de
leite cru e 40 amostras de creme de leite não pasteurizado oriundas de nove
fábricas localizadas na Província de Parma (norte da Itália), não tendo sido
detectado o microrganismo. Com vistas determinar a ocorrência de E.coli
O157:H7 em leite cru na Hungária, HUCHER et al. (2006) analisaram 250
amostras por meio do uso do VIDAS ECO O157® e obtiveram um (0,4%)
resultado positivo que posteriormente foi confirmado.
A ocorrência de E.coli O157:H7 determinada pelo sistema VIDAS® foi
de 6,67% em amostras oriundas de feiras livres. Esse resultado é corroborado
pelos de STEPHAN et al. (2008). Esses autores detectaram a presença do
patógeno em 3,7% das amostras de queijos frescos analisadas em 2006 e em
6,3% das examinadas em 2007 na Suíça. Se assemelham aos de MORA et al.
(2007) que constataram a presença de E.coli O157:H7 em 7,84% das amostras
de queijos fabricados com leite cru em Lima, Peru e aos de ÖKSÜZ et al. (2003)
34
que detectaram esse patógeno em 4% das amostras de queijo analisadas na
Turquia.
No Brasil, PANETO et al. (2007) analisaram 50 amostras de queijo
Minas Frescal produzidos com leite cru, oriundos de supermercados de Araguaína
- Tocantins e verificaram a presença de STEC em 6% das amostras. Apesar de
não ter sido isolado o sorotipo O157:H7 esses resultados sugerem que este
produto pode ser veículo de transmissão deste patógeno, o que foi confirmado no
presente estudo.
Em relação às amostras oriundas de estabelecimentos sob Inspeção
Federal, o kit VIDAS ECO O157® não confirmou a presença do microrganismo em
nenhuma amostra. Esses resultados concordam com os obtidos por ZAGO et al.
(2008) na Itália e PANETO et al. (2007) no Brasil quando determinaram a
ocorrência de E.coli O157:H7 em queijos frescos. Observa-se que nas amostras
provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal, provavelmente, a
pasteurização foi efetiva, pois apesar do equipamento VIDAS® ter detectado E.coli
O157 na amostra analisada, não foi possível isolar o microrganismo o que sugere
a presença de células mortas e/ou injuriadas do microrganismo.
5.2 Detecção de Escherichia coli O157:H7 por meio de PCR Para a detecção de E. coli O157:H7 foram utilizados os pares de
iniciadores ou primers Gi-O157-I e Gi-O157-II (ABDULMAWJOOD et al., 2003) e
RfbF e RfbR (HU et al., 1999) na detecção do antígeno somático O157 e o par
FliC-a e FliC-b (WANG et al., 2002) na detecção do antígeno flagelar H7.
Ao analisar os pares de primers utilizados na detecção do antígeno
somático O157 no GenBank, verifica-se que estes podem detectar além de E.coli
O157:H7, a Escherichia fergusonni O157, segundo trabalho publicado por FAGAN
et al. (2006). No referido trabalho os autores isolaram uma bactéria em carcaça
bovina que apresenta reação positiva com anticorpos de E.coli O157, que foi
identificada com sendo E. fergusonni. Então os autores fizeram o sequenciamento
do gene que codifica o antígeno somático O157 deste isolado e verificaram que o
mesmo possui alta identidade com o da E.coli O157 sugerindo que houve
35
transferência genética do antígeno O entre E.coli O157:H7 e E. fergusonni. Este
foi o primeiro e até o momento o único relato de isolamento de E.fergusonni
contendo o antígeno O da E. coli O157. FAGAN et al. (2006) concluíram que as
implicações para a indústria da carne e laboratórios que utilizam a detecção do
antígeno O157 para a pesquisa de E.coli O157:H7 são mínimas, pois só um
isolado até a data de publicação do artigo havia sido encontrado. No entanto, este
resultado revela a capacidade de transferência de genes de virulência entre
diferentes espécies de Escherichia o que pode provocar o aparecimento de
isolados de Escherichia com um maior potencial para causar doenças em
humanos. Por se tratar de um caso isolado tem-se, portanto que os pares de
primers Gi-O157 e Rfb são específicos na detecção de E.coli O157:H7.
Na Tabela 3 estão distribuídos os dados relativos à detecção de E. coli
O157:H7 segundo os pares de primers utilizados na PCR.
36
TABELA 3 - Detecção de Escherichia coli O157:H7 em queijo Minas Frescal segundo as fontes de detecção e os pares de
primers utilizados para amplificação. Goiânia-GO, 2007.
Par RfbF/RfbR Par GiO157-I/GiO157-II Par FliC-a/FliC-b
(+) (-) (+) (-) (+) (-)
FONTES
N° % N° % N° % N° % N° % N° %
Feiras livres 21/30 70 9/30 30 0/30 0 30/30 100 7/30 23,33 23/30 76,67
Estabelecimentos sob IF 15/30 50 15/30 50 0/30 0 30/30 100 0/30 0 30/30 100
Total 36/60 60 24/60 40 0/60 0 60/60 100 7/60 11,67 53/60 88,3
RfbF/RfbR: detecta o antígeno O157 da E.coli O157:H7. GiO157-I/GiO157-II: detecta o antígeno O157 da E.coli O157:H7. FliC-a/FliC-b: detecta o antígeno H7 da E.coli
O157:H7.
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ao PCR. N°: resultado obtido/amostras analisadas.
37
Das amostras de queijo Minas Frescal provenientes de feiras livres,
21/30 (70%) foram positivas e 9/30 (30%) negativas ao par de primers RfbF/RfbR,
enquanto 30/30 (100%) das amostras de queijo Minas Frescal foram negativas ao
par GiO157-I/GiO157-II. Das amostras de queijo Minas Frescal oriundas de
estabelecimentos sob Inspeção Federal, 15/30 (50%) foram positivas e 15/30
(50%) negativas quando se utilizou o par de primers RfbF/RfbR, enquanto 30/30
(100%) das amostras de queijo Minas Frescal foram negativas ao par GiO157-
I/GiO157-II.
As Figuras 9 e 10 referem-se à eletroferese em gel de agarose a 2% de
produtos de amplificação detectados com os pares de primers RfbF/RfbR e FliC-
a/FliC-b, respectivamente. O par RfbF/RfbR apresenta maior eficiência na
detecção de E.coli O157, enquanto que com o par GiO157-I/GiO157-II não
detectou o patógeno em nenhuma amostra. Isto pode ser explicado, em parte,
pelo fato de o par de primers desenhado por ABDULMAWJOOD et al. (2003) ter
sido testado apenas em cultura pura. Por outro lado, o par elaborado por HU et al.
(1999) se mostrou eficiente na detecção do microrganismo em fezes de bovinos,
ou seja, cultura mista. Vale lembrar, que a extração de DNA das amostras de
queijo Minas Frescal analisadas no presente estudo foi realizada a partir do caldo
CT-SMAC tratando-se, portanto de uma cultura mista.
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16
292 pb 292 pb
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16
292 pb 292 pb
FIGURA 9 – Eletroforese em gel de agarose a 2% de produtos de E.coli O157:H7
em amostras de queijo Minas Frescal, com o par RfbR/RfbR (292pb) Canaletas 01 e 16 padrão de peso molecular (100 pb DNA Ladder); 15 controle positivo (INCQS 00171); 02 a
05, 07, 08, 10, 12 e 13 amostras positivas para o par RfbF/RfbR; 14 controle negativo; 06,09 e 11 amostras
negativas para o RfbF/RfbR.
38
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16
247 pb 247 pb
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16
247 pb 247 pb
FIGURA 10 – Eletroforese em gel de agarose a 2% de produtos de E.coli
O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal, com o par FliC-a/FliC-b (247pb) Canaletas 01 e 16 padrão de peso molecular (100 pb DNA Ladder); 15 controle positivo (INCQS
00171); 03, 04, 05, 07 e 09 amostras positivas para o par FliC-a/FliC-b; 14 controle negativo; 02,
06, 08 e 10 a 13 amostras negativas para o par FliC-a/FliC-b.
Essa diferença de detecção do antígeno somático O157 pelos pares de
primers em amostras de queijo Minas Frescal pode ser explicada, em parte, pela
diferença de sensibilidade dos mesmos, ou seja, o par Rfb-F/Rfb-R mostrou-se
mais sensível à concentração e degradação do DNA extraído para amplificação.
Desta forma, justifica-se a associação de mais de um par de primers na detecção
de um mesmo gene alvo.
Com relação ao par FliC-a e FliC-b observa-se que 7/30 (23,33%) das
amostras oriundas de feiras livres são positivas enquanto que as amostras
provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal 30/30 (100%) são
negativas.
A Figura 11 apresenta os resultados encontrados segundo o uso dos
primers e a origem do queijo Minas Frescal, e a Figura 12, mostra os resultados
finais de detecção de E.coli O157:H7 pela técnica de PCR. Na Tabela 4 estão
contidos os dados relativos à distribuição percentual de E.coli O157:H7 em
queijos Minas Frescal segundo as fontes, detectadas por meio da técnica de
PCR.
39
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
Rfb Gi-O157 FliC
Feira livre Estabelecimento com SIF
FIGURA 11 – Resultados obtidos segundo os primers utilizados e as fontes de
detecção
0%5%
10%15%20%25%30%35%40%45%50%
E.coli O157:H7 E.coli O157 não H7
Feira livre Estabelecimento com SIF
FIGURA 12- Distribuição de E.coli O157:H7 e E.coli O157 não H7 em queijos
Minas Frescal segundo a origem por meio da técnica de PCR.
TABELA 4 – Distribuição de Escherichia coli O157:H7 em amostras de queijo
Minas Frescal segundo as fontes, detectadas por meio da técnica de PCR.
Goiânia – GO, 2009
Escherichia coli O157:H7 - PCR (+) (-)
Fontes
N° % N° % Feiras livres 7/30 23,33 23/30 76,67
Estabelecimento sob IF 0/30 0 30/30 100 Total 7/60 11,67 53/60 88,33
(+) resultado positivo ao PCR. (-) resultado negativo ai PCR. N°: resultado obtido/amostras analisadas.
40
Nota-se que a ocorrência de E.coli O157:H7 obtida por meio da técnica
de PCR foi de 23,33% (7/30) em queijo Minas Frescal provenientes de feiras
livres e 0% (0/30) em queijos oriundos de estabelecimentos sob Inspeção Federal
(Tabela 4). Além disso, observa-se na Figura 12 a presença de E.coli O157 não
H7 em 46,67% (14/30) das amostras oriundas de feiras e em 50% (15/15) das
amostras fabricadas por estabelecimentos sob Inspeção Federal.
Ao avaliar a presença de E.coli O157:H7 detectada por meio da técnica
de PCR em amostras oriundas de feiras livres, observa-se uma ocorrência
relativamente maior quando comparada com a encontrada por outros autores.
STEPHAN et al. (2008) detectaram a presença deste patógeno em 3,7% das
amostras de queijo frescos analisadas em 2006 e em 6,3% das amostras
examinadas em 2007 na Suíça. Em estudo anterior, MORA et al. (2007)
verificaram a presença de E.coli O157:H7 em 7,84% das amostras de queijos
fabricados a partir de leite cru em Lima, Peru e ÖKSÜZ et al. (2003) em 4% das
amostras analisada na Turquia.
Em relação às amostras oriundas de estabelecimentos sob Inspeção
Federal, a técnica de PCR não detectou a presença do microrganismo em
nenhuma delas. Esse resultado concorda com os obtidos por ZAGO et al. (2008)
na Itália e PANETO et al. (2007) no Brasil.
Assim como nos resultados obtidos pelo kit VIDAS ECO O 157 tem-se
a presença de E.coli O157:H7 em queijos oriundos de feiras livres e a ausência
em amostras provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal. A
ausência em amostras submetidas à fiscalização deve-se provavelmente a
pasteurização do leite e às Boas Práticas de Fabricação exigidas pelo órgão
fiscalizador. No entanto, nas amostras de feiras livres onde a fiscalização durante
a produção e comercialização não ocorre observa-se a presença do
microrganismo segundo a técnica de PCR num percentual de 23,33%. É
importante ressaltar, que o PCR das amostras analisadas foi realizado a partir de
uma cultura mista e que ao fazer o plaqueamento em ágar seletivo destas
amostras isolou-se o microrganismo em duas amostras. Vale lembrar, que tanto
a análise por meio do kit VIDAS ECO O 157® quanto por PCR foram realizadas a
partir do mesmo caldo.
41
5.3 Comparação entre os resultados obtidos pelo kit comercial VIDAS ECO O157® e a técnica de PCR segundo a origem do queijo Minas Frescal A Figura 13 apresenta a ocorrência de E.coli O157:H7 em queijos
Minas Frescal comercializados em feiras livres e em queijos fabricados em
estabelecimentos sob Inspeção Federal, segundo o método de detecção. Em
feiras livres verifica-se uma freqüência de 6,67% quando se utiliza o teste VIDAS
ECO O157® e 23,33% quando o PCR. Nas amostras provenientes de
estabelecimentos sob Inspeção Federal a ocorrência é de zero percentual para as
duas técnicas usadas.
0,0%
5,0%
10,0%
15,0%
20,0%
25,0%
Feira Estabelecimento com SIF
VIDAS ECO O157® PCR
FIGURA 13 – Ocorrência de E.coli O157:H7 em queijos Minas Frescal segundo a
fonte e o método de detecção utilizado.
Ao comparar as técnicas empregadas na determinação da ocorrência
do patógeno em amostras oriundas de estabelecimentos sob Inspeção Federal
observa-se que não há diferença entre os resultados obtidos pelo kit VIDAS ECO
O157® e a técnica de PCR, já que ambas apresentaram percentual zero de
detecção. Na análise dos resultados encontrados para os queijos oriundos de
feiras livres utilizou-se o teste de χ² (Tabela 5). Como χ²calculado foi menor que o
χ²tabelado (χ²tabelado = 3,84 e GL= 1), observa-se que não há diferença significativa
(p>0,05) entre VIDAS ECO O157® e PCR na detecção de E.coli O157:H7 nas
amostras oriundas de feiras.
42
TABELA 5 – Comparação entre a freqüência de E.coli O157:H7 em amostras de
queijo Minas Frescal oriundas de feiras livres segundo o método de detecção, por
meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009.
E.coli O157:H7 – Feira livre Técnica positivo negativo Total
VIDAS ECO O157® 2 (4,5) 28 (25,5) 30 PCR 7 (4,5) 23 (25,5) 30 Total 9 51 60
Teste χ² p
3,267974 0,070645
Ao aplicar o teste de χ² sem considerar a origem do queijo (Tabela 6),
nota-se que também não há diferença significativa na ocorrência do patógeno
quanto ao método de detecção utilizado.
TABELA 6 – Comparação entre a freqüência de E.coli O157:H7 em amostras de
queijo Minas Frescal independente da origem segundo o método de detecção, por
meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009.
E.coli O157:H7 Técnica positivo negativo Total
VIDAS ECO O157® 2 (4,5) 58 (55,5) 60 PCR 7 (4,5) 53 (55,5) 60 Total 9 111 120
Teste χ² p
3,003003 0,08311
Ao avaliar os resultados da análise de NMP de Coliformes
Termotolerantes dos queijos provenientes de feiras livres (Tabela 11), percebe-se
que provavelmente esses queijos foram fabricados com leite cru devido aos altos
resultados encontrados. Logo, a presença de E.coli O157:H7 neste produto pode-
se ser explicada pela prática, ainda que não permitida pela legislação vigente, de
se fabricar queijos a partir de leite não pasteurizado, principalmente quando
consideradas as características de pequenas propriedades quanto ao sistema de
produção e ação da fiscalização.
43
Entretanto foi constatada a presença de E.coli O157 não H7 tanto nas
amostras oriundas de feiras quanto nas de indústrias sob Inspeção Federal pela
técnica de PCR. Ao utilizar o kit VIDAS ECO O157® também detectou-se a
presença de E.coli O157 sem, no entanto, ter-se isolado o microrganismo em boa
parte (43/60) das amostras analisadas.
Ao aplicar o teste de χ² para comparar os resultados obtidos pelo
equipamento VIDAS® e os encontrados ao utilizar o par de primers Rfb (Tabela 7)
verifica-se que não há diferença significativa (p> 0,05) entre os resultados. Esta
constatação sugere que tanto o equipamento VIDAS®, que detecta o
microrganismo através de reação antígeno-anticorpo, quanto o PCR, detectaram
células mortas ou células presentes em número muito pequeno, já que não foi
possível isolar o microrganismo na maioria da amostras. Isto pode ser explicado,
em parte, pelo fato de que nas amostras oriundas de feiras, provavelmente os
isolados de E.coli O157 detectados pelas duas técnicas estavam presentes em
pequeno número, devido à microbiota competidora presente no leite. Já nas
amostras provenientes das indústrias sob Inspeção Federal possivelmente,
estariam injuriados e/ou mortos devido ao tratamento térmico aplicado ao leite.
TABELA 7 – Comparação entre a freqüência de E.coli O157 em amostras de
queijo Minas Frescal independente da origem segundo o equipamento VIDAS® e
o primer Rfb, por meio do teste de χ²,Goiânia – GO, 2009.
E.coli O157 Técnica positivo negativo Total
VIDAS® - resultados do equipamento 45 (40,5) 15 (19,5) 60
PCR – resultados do primer Rfb 36 (40,5) 24 (19,5) 60 Total 81 23 120
Teste χ² p
3,076923 0,0794
44
5.4 Comparação da ocorrência de E.coli O157:H7 entre amostras oriundas de feiras livres e amostras fabricadas em estabelecimentos sob Inspeção Federal segundo a técnica empregada
Para comparar a ocorrência de E.coli O157:H7 entre amostras oriundas
de feiras livres e amostras oriundas de indústrias sob Inspeção Federal, segundo
a técnica de detecção empregada, aplicou-se o teste de qui-quadrado (χ²)
conforme mostrado na Tabela 8. Observa-se que não há diferença significativa
(p> 0,05) entre amostras de feiras livres e indústrias sob Inspeção Federal quando
se utiliza o teste VIDAS ECO O157®. Quando emprega-se a técnica de PCR,
constata-se que há diferença (p< 0,05) entre as origens das amostras.
TABELA 8 – Comparação entre a freqüência de E.coli O157:H7 em amostras de
queijo Minas Frescal segundo a fonte e o método de detecção, por meio do teste
de χ²,Goiânia – GO, 2009.
E.coli O157:H7 – VIDAS ECO O157® Fonte positivo negativo Total
Feira livre 2 (1) 28 (26,5) 30 Estabelecimentos sob IF 0 (1) 30 (26,5) 30
Total 2 53 60 Teste χ²
p 2,0690 0,1105
E.coli O157:H7- PCR
Fonte positivo negativo Total Feira livre 7 (3,5) 23 (26,5) 30
Estabelecimentos sob IF 0 (3,5) 30 (26,5) 30 Total 7 53 60
Teste χ² p
7,9245 0,0049
45
5.4 Determinação do NMP de Coliformes Termotolerantes A Tabela 9 apresenta os resultados da análise de comparação da
qualidade bacteriológica das amostras de queijos Minas Frescal oriundos de
feiras livres de Goiânia e amostras provenientes de indústrias sob Inspeção
Federal de Goiás e comercializados em supermercados de Goiânia em relação ao
padrão microbiológico estabelecido pela ANVISA (BRASIL, 2001), segundo o
modelo do teste qui-quadrado (χ²).
TABELA 9 – Comparação dos resultados de NMP de Coliformes Termotolerantes
das amostras de queijo Minas Frescal segundo a origem e em relação ao
microbiológico vigente (BRASIL, 2002), por meio do teste de χ², Goiânia – GO,
2009.
NMP de Coliformes Termotolerantes Origem ≤ 500 NMP/g > 500 NMP/g Total
Feira livre 4 (15,5) 26 (14,5) 30 Estabelecimento sob IF 27 (15,5) 3 (14,5) 30
Total 31 29 60 Teste χ²
p 35,31
< 0,0001
Ao analisar os resultados de NMP de Coliformes Termotolerantes
(Tabela 9) verifica-se que existe diferença significativa (p < 0,05), entre as
amostras quanto à origem, pois χ²calculado(35,31) foi maior que χ² tabelado (3,84).
Além disso, nota-se que os queijos Minas Frescal oriundos de feiras livres
apresentam-se mais contaminados (resultados > 500 NMP/g) que os queijos
provenientes de estabelecimentos sob Inspeção Federal. Com o intuito de
confirmar o resultado do teste de qui-quadrado de que existe diferença
significativa entre amostras quanto à origem, aplicou-se o teste de t de Student
(Tabela 10). Para a aplicação do teste de t os dados foram transformados em
logaritmo na base 10 para atender aos pressupostos da análise estatística de
homogeneidade dos resultados, pois as amostras apresentaram valores que
variavam de 3 a 11.000. Por meio do teste de t confirmou-se o resultado obtido
46
pelo qui-quadrado de que existe diferença significativa entre as amostras quanto à
origem (p<0,01) e, pela análise das médias, que os queijos oriundos de feiras
livres apresentam-se mais contaminados.
TABELA 10 - Comparação entre médias do NMP de Coliformes Termotolerantes
em queijos Minas Frescal segundo a fonte de detecção por meio do teste t de
Student, Goiânia- GO, 2009.
Teste – t: duas amostras presumindo variâncias equivalentes Variável 1 – Feira livre Variável 2 - SIF
Média 3,6261 0,7335 Variância 0,7164 0,6122
Observações 30 30 Stat t 13,7453
P(T≤ t) bi-caudal > 0,0001 t crítico bi-caudal 2,0017
≤ = menor ou igual. A Tabela 11 apresenta a distribuição de freqüência do Número Mais
Provável (NMP/g) de Coliformes Termotolerantes das amostras de queijo Minas
Frescal produzidos artesanalmente e em estabelecimentos sob Inspeção Federal
em relação ao padrão microbiológico vigente. Das 30 amostras de queijos
artesanais comercializados em feiras livres de Goiânia, quatro (13,33%)
apresentam-se em acordo com o padrão estabelecido pela legislação e 26
(86,67%) em desacordo. Por outro lado, dos 30 queijos fabricados por
estabelecimentos sob Inspeção Federal e comercializados em supermercados de
Goiânia, 27 (90%) encontram-se em acordo com o padrão e três (10%) em
desacordo. A Figura 14 mostra o percentual de amostras que se encontram em
acordo e em desacordo com os padrões estabelecidos pela ANVISA, conforme
Resolução –RDC n° 12, de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001).
47
TABELA 11 – Distribuição de freqüência do NMP de Coliformes Termotolerantes
segundo a fonte de detecção, colhidas no município de Goiânia -GO,2009.
NMP/g de Coliformes Termotolerantes
Amostras artesanais – Feiras livres
Amostras inspecionadas- Supermercados
n % n % ≤ 5,0 x 102 4 13,33 27 90 > 5,0 x 102 26 86,67 3 10
Total 30 30 N = n° de amostras no intervalo. ≤ = menor ou igual. > = maior que
0102030405060708090
% d
e am
ostra
s
queijo artesanal queijo inspecionado
Amostras em desacordo Amostra em acordo
FIGURA 14 – Porcentagem de amostras de queijo Minas Frescal em acordo e
desacordo com a legislação (BRASIL, 2001) em relação ao NMP de Coliformes
Termotolerantes
Em trabalho semelhante, SALOTTI et al. (2006) analisaram 30
amostras de queijos Minas Frescal produzidos artesanalmente e 30 amostras de
queijos inspecionados pelo serviço federal. Os resultados de que 83,3% dos
queijos produzidos artesanalmente estavam em desacordo com a legislação e
16,6% em acordo são semelhantes aos encontrados no presente estudo. Em
relação aos queijos inspecionados pelo Serviço Federal, verificaram percentuais
bem superiores aos encontrados no presente estudo, sendo que 66,7% das
amostras apresentaram-se em desacordo com o padrão para o produto.
No que se refere ao queijo produzido artesanalmente, os resultados
encontrados no presente estudo são corroborados por LOGUERCIO & ALEIXO
48
(2001) que ao avaliarem a qualidade microbiológica do queijo Minas Frescal
artesanal comercializado em Cuiabá, verificaram 93,33% das amostras em
desacordo com a legislação vigente.
ARAÚJO et al. (1997) reportaram que 100% das amostras de queijo
Minas Frescal obtidas em supermercados e padarias da cidade do Rio de Janeiro,
continham Coliformes Termotolerantes em níveis acima dos tolerados. Esses
resultados são bem superiores aos encontrados no presente trabalho, no qual
apenas 10% das amostras fiscalizadas pelo Serviço Federal estão em desacordo
com a legislação.
Observa-se na Tabela 11 que um número elevado de amostras (26/30)
de queijos produzidos artesanalmente e comercializados em feiras-livres estão
em desacordo com os padrões estabelecidos pela legislação. O grupo dos
Coliformes Termotolerantes, cujo habitat geralmente é o trato intestinal do homem
e animais indica contaminação de origem ambiental e fecal do produto
(KORNACHI & JOHNSON, 2001). Por outro lado, o número de amostras
inspecionadas em desacordo com o padrão foi bem inferior (3/10), evidenciando
que as Boas Práticas de Fabricação exigidas pelo Serviço Inspeção Federal
constitui uma importante ferramenta para se garantir a produção de alimentos
seguros.
Da análise dos dados do presente estudo depreende-se que as Boas
Práticas de Fabricação durante a produção contribuem sobremaneira para a
obtenção de baixos níveis de NMP Coliformes Termotolerantes, como pode ser
observado na Figura 14. Entretanto, observa-se que 10% das amostras estão em
desacordo com o padrão indicando a necessidade de se intensificar a fiscalização
para garantir a execução das boas práticas, diminuindo o risco de contaminação
dos queijos e preservando a saúde do consumidor.
5.4 Determinação do NMP de Escherichia coli Relativamente ao NMP de E.coli, observa-se na Tabela 12 uma
diferença significativa (p<0,0001) entre os valores médios das amostras de queijo
Minas Frescal, quanto à origem. O valor médio de NMP de E.coli dos queijos
49
oriundos de feiras livres e produzidos artesanalmente é maior que a média
apresentada pelas amostras provenientes de estabelecimentos sob Inspeção
Federal, revelando que os queijos comercializados em feiras apresentam o
patógeno em um número maior de amostras.
TABELA 12 - Comparação entre médias do NMP de Escherichia coli em queijos
Minas Frescal segundo a fonte de detecção por meio do teste t de Student,
Goiânia-GO, 2009.
Teste-t: duas amostras presumindo variâncias diferentes Variável 1- Feira livre Variável 2- SIF
Média 2,1777 0,6641 Variância 1,4794 0,4253
Observações 30 30 Stat t 6,0069
P(T<=t) bi-caudal < 0,0001 t crítico bi-caudal 2,0154
A legislação brasileira não estabelece padrões microbiológicos para a
análise de NMP de Escherichia coli em queijos Minas Frescal, entretanto a
presença deste patógeno em número elevado no alimento indica contaminação
de origem fecal, condições higiênicas insatisfatórias de produção e perigo para
saúde dos consumidores já que diversas linhagens de E.coli são
comprovadamente patogênicas para os homens e animais. Essa contaminação,
além de identificar as más condições higiênicas do produto, indica, também, a
possibilidade de veiculação pelo alimento de patógenos pertencentes aos grupos
EPEC, ETEC, EIEC, EAEC, STEC e em especial E.coli O157:H7, como está
comprovado no presente trabalho.
Na Figura 15 são apresentados os percentuais de amostras com
resultados de NMP de Escherichia coli inferiores e superiores a 3,0 NMP/g.
Observa-se que 10% (3/30) dos queijos comercializados em feiras livres
apresentam resultados inferiores a 3,0 NMP/g e 90% superiores. Enquanto os
queijos comercializados em supermercados, inspecionados pelo Serviço Federal,
apresentam resultados de 90% (27/30) das amostras inferiores a 3,0 NMP/g e
10% (3/30) superiores a 3,0 NMP/g.
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
queijo artesanal queijo inspecionado
<3,0 NMP de E.coli>3,0 NMP de E.coli
FIGURA 15 – Porcentagem de amostras de queijo Minas Frescal segundo a
origem com resultados de NMP menores e maiores que 3,0 NMP/g (limite de
detecção da técnica na diluição inicial utilizada).
Em relação aos queijos comercializados em feiras livres, produção
artesanal, o resultado encontrado no presente estudo assemelha-se ao obtido por
PANETO et al. (2007) que encontraram 96% das amostras de queijos Minas
Frescal elaborados com leite cru contaminadas por E.coli. No que se refere aos
queijos produzidos por indústrias sob fiscalização federal, o resultado obtido é
bem inferior ao encontrado por CAMPOS et al. (2006) que reportaram a presença
de E.coli em 70,8% das amostras de queijos fabricadas em um laticínio do estado
de Goiás.
Verifica-se no presente trabalho que as amostras oriundas de feiras
livres apresentaram maiores índices de contaminação que as de
estabelecimentos sob Inspeção Federal. Tal constatação evidencia a importância
da fiscalização sobre a produção de alimentos, haja vista que as amostras
provenientes de indústrias sob fiscalização apresentaram índices bem inferiores
de contaminação e, o perigo de se consumir produtos fabricados artesanalmente.
O elevado percentual de amostras de queijo Minas Frescal de feiras livres
contaminadas por E. coli é preocupante, devido ao risco potencial de causar
enfermidades e ainda a possibilidade da presença de outros enteropatógenos.
51
7 CONCLUSÕES Em função dos resultados obtidos conclui-se que:
• A ocorrência de E.coli O157:H7 em amostras de queijo Minas Frescal de feiras
livres é de 6,67% e 23,3% , respectivamente quando o kit VIDAS ECO O157®
e a PCR são empregados como métodos de diagnóstico. E, de zero
percentual em estabelecimentos sob Inspeção Federal em ambos os métodos.
• Na comparação dos resultados obtidos pelos métodos de identificação de
Escherichia coli O157:H7, VIDAS ECO O157® e PCR revelaram-se similares
independentemente da origem da amostras.
• Amostras de queijo Minas Frescal provenientes de feiras livres e de
estabelecimentos sob Inspeção Federal, ao teste VIDAS ECO O157®, são
similares, mas diferem quando a técnica de diagnóstico empregada é a PCR.
• Coliformes Termotolerantes acima do nível estabelecido pela legislação
vigente estão presentes em percentual elevado (86,67%) das amostras de
queijo Minas Frescal oriundos de feiras livres e baixo percentual (10%) em
amostras de estabelecimentos sob Inspeção Federal.
• As amostras de queijo Minas Frescal provenientes de feiras livres revelaram-
se mais contaminadas por E.coli do que as oriundas de estabelecimentos sob
Inspeção Federal e comercializadas em supermercados.
Comentário:
É necessária maior atenção das autoridades sanitárias no que se refere à
autorização de produção e comercialização do queijo Minas Frescal, uma vez
que, contaminados por E.coli O157:H7 podem causar sérios problemas à saúde
dos consumidores.
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