Francisco B.T. Pessine

Depto. Físico Química/Instituto de Química/UNICAMPCP 6154

13084-971 Campinas/SPe-mail: fpessine@iqm.unicamp.br

• Encapsulação e caracterização de fármacos em sistemas micro e nano particulados

• Lipossomas• Ciclodextrinas • Microesferas• Nanoesferas

SISTEMAS CARREADORES DE FÁRMACOS

• PRINCIPAIS APLICAÇÕES DE TECNOLOGIAS MODERNAS PARA ENTREGA DE ATIVOS• I. LIPOSSOMAS

• Adjuvantes em vacinas• Entrega sustentável de ativos no local da injeção

• Entrega passiva a tumores• Entrega passiva ao endotélio pulmonar em terapia gênica

• Entrega a nódulos linfáticos e a outros órgãos• II. Niossomas

• Adjuvantes em vacinas• Entrega passiva a tumores

• III. Nano/Micropartículas• Adjuvantes em vacinas

• Entrega passiva a tumores• IV.Emulsões

• Veículos para administração de ativos lipofílicos• V. Ciclodextrinas

• Solubilização de ativos hidrofóbicos para uso oral e parenteral

Lipossomas

Estruturas agregadas formadas por bicamadas lipídicas com 2 domínios: polar e apolar

modelo de membrana biológica

- biocompatibilidade

- fornece meios lipofílico e aquoso

- proteção e liberação controlada do conteúdo encapsulado

- direcionamento com marcadores específicos

- in vivo: iv, im, ocular, pulmonar, nasal,tópico

Lipídios

Fosfatidilcolina

Fosfatidilcolina e colesterol

Hydration of the dry film method

Hydrogenated phosphatidylcholine and cholesterol

(3:1 w/w) + isotretinoin (1:20 w/w drug to lipid ratio)

Rota-evaporating

30min, 35oC, N2

Hydration

0,9%NaCl

30min, 65oCDry film

+ chloroform + methanol (2:1v/v)

agitation

Heater

syringe

+ 7,5% ethanol

Injection method

0,9% NaCl solution

Método da hidratação do filme seco

Encapsulação de Nistatina em lipossomas

• Estrutura molecular

Extrusão

• Tipos de vesículas

Tipos de bicamadas

Lipossomas

• Localização de moléculas em bicamadas

Lipossomas

Formação de um lipossoma

Filme lipídico secoH2O Intumescimento

Agitação

MLV

Extrusão

Sonicação e homogeneização

LUV

SUV

Lipossomas

• Corte longitudinal de um lipossoma

Anfotericina B e Nistatina

• Fórmulas estruturais de AnfB e Nys

Molécula de fosfatidilcolina

Transferência do conteúdo lipossomal para o interior da célula

Inserção de AnfB em bicamada lipossomal

•

Francisco B.T. Pessine

Instituto de QuímicaDepartamento de Físico Química

fpessine@iqm.unicamp.br

• ENCAPSULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FÁRMACOS EM SISTEMAS MICRO E NANO PARTICULADOS

• Lipossomas• Ciclodextrinas

• Micro/Nanoesferas

Spectrofluorimetry and Chemometrics for Investigation of Norfloxacin Distribution in Multilamellar Liposomes

Applied Spectroscopy xx, xxx (2005)

Introdução

• Norfloxacin: partially hydrophobic fluoroquinolone antibiotic active against Gram+/- bacteria, inhibiting the gyrase enzyme Topoisomerase II. Good sensitiser of singlet oxygen.

• Highly effective in the treatment of infectious diseases, mainly in the urinary/respiratory tracts.

• Has a zwitterionic amphoteric nature, being ionized over the whole pH range, due to -COOH and –NH2 groups. This influence its distribution/affinity for lipid bilayers and it is also related to the phototoxic properties of NFX, under solar UV radiation (induction of dermic tumors in rats, phototoxicity in mamalian cells in vitro, accumulation in lysosomes of HS68 human skin fibroblasts and other citoplasmatic organelles)

• Entrapment of NFX in liposomes: can be of therapeutic interest as they provide different pathways of interaction with bacterial cells, compared to the normal routes, being useful in the treatment of infections caused by quinolone resistant/poorly sensitive bacteria to this drug.

• Investigation on the distribution of NFX in liposomes: provides a better understanding of its interaction with biological membranes.

•.

Equilíbrios entre diferentes espécies de NFX

•

Objetivos

• Investigar a distribuição de NFX em bicamadas lipídicas de lipossomas MLV em pH 7.0 usando:

• supressão de fluorescência• grau de anisotropia• quimiometria

Experimental

• MLV containing NFX: prepared with soy-bean phosphatidylcholine (Epikuron 200SH; 25/45mg), cholesterol (15mg) and NFX (10.0mol) all dissolved in CHCl3:MeOH (2:1; v:v)

• The solvents were evaporated and the lipid film was hydrated with 10.0mL of 0.010 mol/L HEPES buffer (pH 7.0) at 65oC.

• Steady state measurements of fluorescence anisotropy of free and

liposomal NFX (pH 7.0) were obtained on a Jobin Yvon-Spex Spectrofluorimeter, with L geometry.

• This technique is based on the excitation and emission of polarized light which excites the fluorophores, according to their orientation relative to the direction of the polarized excitation. The emission can be depolarized by rotational diffusion, with an angular displacement during the lifetime of the excited state. The emitted radiation does not show the same orientation as the excitation one.

• The degree of anisotropy is:

II

IIr

II

II

2

• Excitation source: Xe lamp (=284nm). Fluorescence monitored at 426nm at constant T. Free

and encapsulated NFX incubated in quartz cells at 25oC (<Tm53oC) in the presence of I- and acrylamide as quenchers in 0.010mol/L HEPES buffer (pH 7.0). All solutions contained 0.010mol/L sodium thiophosphate to prevent oxidation of I- toward I-3.

• Data were analyzed according to Stern-Volmer equation:

•

• F0/F: fluorescence intensities in the absence/presence of quencher. KD: Stern-Volmer collision constant.

• To distinguish between two populations of fluorophores a modified Stern-Volmer equation was used:

• Fa: fraction of the initial fluorescence supressed by the quencher Q; F: difference between the fluorescence intensity in the absence (F0) and presence (F) of quencher; KD: Stern-Volmer constant.

•

][10 QKF

FD

)/1(])][/(1[0aa fQKf

F

F

Quimiometria

• To resolve the overlapped spectra and quenching profiles of the zwitterionic and neutral forms, the chemometric method “Self-Modeling Curve Resolution” was applied. This method uses Principal Components Analysis, based on kernel Singular Value Decomposition (SVD). It allows spectral deconvolution assuming the presence of only two substances. The SMCR method uses the following assumptions:

• a) the curves must be non-negative• b) the curves in the data set must be a linear combination of two linearly

independent curves• c) at least one wavelength must exist for each substance where just that

substance fluoresces.

• The SMCR method was carried out on a matrix constructed of relative fluorescence spectra, F0/F.

•

Resultados/Discussão

• Anisotropy measurements give qualitative information on the incorporation of NFX molecules into the lipidic bilayers of liposomal vesicles. Fluorescence quenching spectra treated with chemometric methods confirm the existence of two populations of NFX (neutral and zwitterionic) in MLV liposomes at pH 7.

• Results: the zwitterionic form of NFX was incorporated into lipid/aqueous interface of the liposomes, and the neutral form was located toward the center of the bilayers. I- can quench the fluorescence of both forms of NFX in non-liposomal solution, but it cannot quench the encapsulated neutral form in the bilayer because these ions doesn't have access to the interior of the bilayers. On the other hand, acrylamide can penetrate into the bilayer, reaching the neutral species and quenching its fluorescence.

• Anisotropy measurements gives a strong indication of encapsulation. The results (Table I),

allowed the observation of values directly related to the kind of environment where the fluorophores were distributed. In hydrophobic environments, such as liposomal lipidic bilayers, higher values were noted, followed by ones from micelles. This means that the molecules of NFX penetrate into these two systems, causing a difference in their rotational diffusion, having a more restricted degree of freedom in organized systems like liposomes and miceles.

• .

• Free rotations in solution were related to the smallest values of r. However, NFX showed a stronger interaction in EtOH and CH3Cl than in aqueous solutions, decreasing its rotational movements, and increasing the anisotropy values.

• NFX molecules are inserted deeply into the lipidic bilayer of MLV liposomes. In neutral medium, there is an equilibrium between the neutral and zwitterionic forms of NFX, where the latter one predominates. The neutral form is incorporated into the bilayer, while the zwitterionic form is in contact with the water/lipid interface

•

Tabela 1: Graus de anisotropia

• Solutions of NFX (1.0 x 10-5 mol/L) r •

• Deionized water 0.019

• HEPES buffer (pH 7) 0.024

• Citrate buffer (pH 3) 0.025

• Ethanol 0.077

• Chloroform 0.052

• SDS (pH 7) 0.086

• SDS (pH 3) 0.106

• MLV (45mg PC; NFX 1.0x10-4mol/L) 0.378

• MLV (25mg PC; NFX 1.0x10-4mol/L) 0.269

• Fluorescence quenching using I- and acrylamide as quenchers, in free and in liposomal NFX

solutions (pH=7): the concentrations of quenchers varied from 0 to 0.25mol/L (these concentrations does not changes the bilayer structure).

• Using Chemometrics: it was possible to resolve the emission spectra and the fluorescence quenching profiles of the neutral/zwitterionic forms of NFX separately (Figs. 2 and 3). The quenching constants were obtained from the experimental spectra and not from the calculated ones.

• Stern-Volmer equation: applied for each fluorescence quenched spectra. It describes the occurrence of dynamic and static quenching. The Stern-Volmer plots deviated from linearity with upward curvatures, suggesting the presence of static and dynamic quenching.

• Dynamic quenching: quenchers interacts with the excited state, decreasing the fluorescence intensity and lifetime.

• Static quenching: the quencher remove the molecules from the excited state, decreasing only the emission intensity.

•

Fig. 2: Espectros resolvidos e supressão da fluorescência

•

350 400 450 500 550

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Int em

is o

f ea

ch s

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

wavelength (nm)

a

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Int e

mis o

f e

ach

sp

eci

e o

f N

FX

(a

. u

.)

[quencher] (mol.dm-3

)

350 400 450 500 550

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Int em

is o

f ea

ch s

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

wavelength (nm)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Int em

is o

f ea

ch s

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

[quencher] (mol.dm-3)

c d

b

Fig. 3: Espectros resolvidos e supressão da fluorescência

•

350 400 450 500 550

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Int em

is o

f eac

h es

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

wavelength (nm)0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Int em

is o

f ea

ch s

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

[quencher] (mol.dm-3)

350 400 450 500 550

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Int em

is o

f ea

ch s

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

wavelength (nm)

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Int em

is o

f ea

ch s

peci

e of

NF

X (

a. u

.)

[quencher] (mol.dm-3)

a b

c d

• Linear Stern-Volmer plot: indicative of a single class of fluorophores, all equally accessible to the quencher.

• The existence of two populations of fluorophores (neutral and zwitterionic forms) in MLV liposomes at pH 7, which is in accordance with the partial hydrophobicity of NFX, allowed the use of the modified Stern-Volmer equation to obtain the rate of collisional encounters between the fluorophore and the quencher, called Stern-Volmer constant values (Table 2).

Tabela 2: Constantes de Stern-Volmer

• Sample Quencher NFX specie KD (L/mol)

• NFX I Zwitterion 71.8 • Neutral 21.8

• NFX-MLV I Zwitterion 14.4• Neutral

• NFX Acrylamide Zwitterion 2.01• Neutral 3.32

• NFXMLV Acrylamide Zwitterion 3.07• Neutral 4.82

• Acrylamide quencher: it was observed that, for the free drug in solution, the neutral form showed better interaction with this quencher than the zwitterionic (Kzwit=2.01 and Kneut=3.32L/mol). Also, a blue shift in the spectrum was observed for the neutral specie. The ground state of this specie has a smaller dipole moment than the excited one. Such a state is better stabilized when interacting with acrylamide, which is a nonpolar molecule.

• MLV liposomes: both zwitterionic and neutral forms were quenched by acrylamide, confirming the existence of two populations of NFX (neutral and zwitterionic) in lipid bilayers.The local insertion of acrylamide molecules in the lipid bilayer changes the environment around the NFX, increasing its interactions with the quencher molecules. There is an widening of the spectral band for the neutral specie, which is the one that has a better affinity for acrylamide. The descending behavior of quenching profiles proves the existence of such specie, free in solution or inserted in the lipidic bilayers.

•

Conclusions

• According to the modified Stern-Volmer constant values (Table 2), it is seen that I- quenches both forms of NFX when it is free in solution.

• I-: can quench the fluorescence of the encapsulated drug only when the it is in hydrophilic region.

• Acrylamide: hydrophobic molecule, located inside the bilayer and quench the fluorescence of encapsulated NFX molecules.

• MLV liposomes: only the zwitterionic form was accessible to the quencher, although at a lower rate than that observed for the free form. The neutral species was not quenched by I- because it was located deeper, near the center of the bilayer. This lack of quenching is due to the inability of the charged and hydrated I- to enter the non polar interior of the liposome.

• The drug NFX is incorporated in MLV bilayers.

Encapsulação e caracterização do antineoplásico Irinotecan (CPT-11) em lipossomas

Patente INPI 204.377-7 (09Out02)D.N. Biloti, M.H.A. Santana, F.B.T. Pessine, Lipid membrane with low proton permeability, Biochim. Biophys. Acta 1611, 1

(2003)

Interação com albumina do soro humano (HSA)

Encapsulação/caracterização em lipossomas estericamente estabilizados

Estruturas químicas de derivados da Camptotecina (CPT)

• Formas lactona e carboxilato

Perfis temporais da fluorescência da lactona e carboxilato

• A: CPT-11 livre• B: CPT-11 lipossomal

Espectros resolvidos e perfil temporal da fluorescência

• A: espectros das formas lactona (___) e carboxilato (- - -)• B: perfil temporal das formas lactona (___) e carboxilato (- - -)

Relação estrutura-atividade de Camptotecinas

• Atividade antineoplásica• 01: grupos aza

• 02: grupos metileno dióxi • 03: grupos hidroxi-metoxi ; substituintes volumosos

• 04: substituições • 05: grupos alquil • 06: substituições

• 07: anel piridona essencial • 08: anel lactona essencial

• 09: anel de 7 membros estabiliza a lactona• 10: anel lactona intacto essencial

• 11: isômero R é inativo• 12: substituições

Resolução das bandas espectrais via SVD

• A: bandas espectrais calculadas com o método SVD

B: Bandas espectrais das espécies puras obtidas com o método SVD

Domínios e sub-domínios estruturais de HSA

• HSA: 1 único resíduo de triptofano

Espectros de fluorescência de CPT-11

• A: Espectro na ausência de HSA• B: Espectro na presença de HSA (30mg/mL)

Espectros e perfis temporais da fluorescência de Tyr/Trp/subdomínio IIA/HSA em soluções contendo CPT-11

• A: Espectros Tyr (- - - - ) e Trp (----)

• B: Perfis temporais

Espectros de fluorescência de CPT-11 em tampão HEPES

• A: CPT-11 livre• B: CPT-11 lipossomal

Espectros de fluorescência de CPT-11 em tampão HEPES

• A: CPT-11 livre: espécies lactona (-----) e carboxilato (- - - - )• B: CPT-11 lipossomal: espécies latona (-----) e carboxilato (- - - - )

Permeabilidade de bicamadas a íons H+

• Sonda fluorescente: 9-aminoacridina

Permeabilidade de bicamadas a íons H+

• Sonda fluorescente: 9-aminoacridina

CiclodextrinasCiclodextrinas

AplicaçAplicaçõões gerais das es gerais das CDsCDs

SolubilizaçãoEstabilização

Redução

Liberação Controlada

Extração Seletiva Aumento dabiodisponibilidade

- Luz, UV-radiação- Temperatura- Oxidação- hidrolises

- odor desagradavel- sabores ruins

solubilidade em agua-evitar solventes organicos

Redução da volatilidade

Outras aplicações das CDsCosméticos:

Xampús, produtos de banho, loções, desodorantes, pastas de dente,

etc.

Agricultura:

Formulação de pesticidas, fungicidas, herbicidas, etc.

Produtos industrializados:

Processo de reprodução (fotografia, tintas), fumos, inibidores de

corrosão, detergentes industriais, corantes, resinas, estabilizadores de

enzimas, baterias, colas, extintores, etc.

Farmácia:

Preparações: parenteral, dermatológica, retal, vaginal, nasal,

oftalmológica, transdérmica, etc.

Estrutura e propriedadesEstrutura e propriedades

Oligossacarídeos cíclicos com ligação -1,4 da

-D-glucopiranose na conformação de cadeira

Forma: Cone truncado

Hidroxilas 1as (C6): cavidade <

Hidroxilas 2as (C2 e C3): cavidade >

Pontes de Hidrogênio intramoleculares:

- rigidez do anel

- estabilidade

Cavidade hidrofóbica

Superfície hidrofílica

Tipos de ciclodextrinas naturaisTipos de ciclodextrinas naturais

--CiclodextrinaCiclodextrina-Pouco utilizada-Limitação: baixa eficiência de complexação com muitas drogas.

- - CiclodextrinaCiclodextrina-Mais utilizada-Alta eficiência de complexação com muitas drogas.-Limitação: baixa solubilidade em água.

- - CiclodextrinaCiclodextrina-Perfil toxicológico favoravel.-Limitação: Eficiência de complexação frequentemente < -CD.

O

O

O

O

O

O

O

O O

O

O

O

O

OR

OH

OR

OH

OH

OH

ORHO

HO

RO

HO

HO

HO OH

OHOH

OR

OHHO

HO

RO

CDs R

HPCD CH2CHOHCH3

RMCD CH3

substituições das hidroxilas nas posições C2, C3 e C6

Ciclodextrinas modificadasCiclodextrinas modificadas

- solubilidade

- habilidade quelante

- estabilidade dos complexos de inclusão

biodisponibilidade e da atividade

- aplicações

*Otimização Propriedades:

CDs naturais e modificadasCDs naturais e modificadas

LIMITAÇÃO:LIMITAÇÃO: dimensões da molécula hóspede e da CD.

Porque as CDs sPorque as CDs sãão usadas?o usadas?

solubilidade aquosa de fármacos

estabilidade química de fármacos

distribuição do fármaco através das membranas biológicas

estabilidade física de fármacos.

• Converter drogas líquidas em pó microcristalino.

• Prevenir as interações fármaco-fármaco e fármaco-excipiente.

irritação local após a administração tópica ou oral.

• Prevenir a absorção do fármaco pela pele ou após administração oral.

MMéétodos de preparaçtodos de preparaçãão de complexoso de complexos

a)a) COPRECIPITAÇÃO:COPRECIPITAÇÃO:

- CD/Água + fármaco/éter etílico (1:1)

- Agita (24 hs.)

- Resfria a 2oC Cristal

- Lavado com éter etílico

- Resíduo: seco a vácuo (50oC) COMPLEXO

b) “FREEZE DRYING”:b) “FREEZE DRYING”:

- CD/Água + fármaco + NH4OH

- Borbulhar N2(g): eliminar NH4OH

- pH 7

- Liofilizar COMPLEXO

d) KNEADING:d) KNEADING:

- CD + droga ( proporções) + Água (1 mL)

- Macerado (45 min.) em almofariz de ágata

- Secar: pressão reduzida (2 dias)

- COMPLEXO

e) MISTURA-FÍSICA :e) MISTURA-FÍSICA :

- CD + droga (proporções)

- Macerado (15 min.) em almofariz de ágata

- COMPLEXO

FormaçFormaçãão de complexos o de complexos

1. Aproximação da molécula hóspede à CD

2. Eliminação de moléculas de água da cavidade da CD

3. Assimilação destas moléculas de água pela água circundante ( Entropia)

4. Interação da CD e hóspede forças de van der Waals e formação de Pontes de hidrogênio

5. Reconstituição da estrutura hidratada do complexo

Exemplos de complexos com CDs de complexos com CDs

Complexo Doxorubicina-CD

Complexo Aspirina-CD

Técnicas para caracterizaçTécnicas para caracterizaçãão dos o dos complexos complexos

a) DSC

b) TGA

c) IV

d) Difração de Raio-X

e) RMN

f) Absorção UV/V

g) Fluorescência

h) Dicroísmo Circular

Propriedades do hPropriedades do hóóspede apspede apóós incluss inclusãão o

ESPECTRO ABSORÇÃO

- Deslocamento batocrômico ou alargamento de banda

- Intensidade absorbância

FLUORESCÊNCIA

- intensidade de fluorescência

- altera o tempo de vida e o grau de anisotropia

DICROíSMO CIRCULAR

- Efeito de Cotton: hóspede aquiral quiral

ESPECTRO RMN

- Deslocamento sinais dos H do interior da cavidade

FOTOESTABILIDADE

- decomposição

T. Higuchi, K.A. Connors, “Phase-solubility techniques”.

Adv. Anal. Chem. Instrum. 4, 117 (1965).

Estudos sobre solubilidade Estudos sobre solubilidade 

- presença complexos inclusão verdadeiros

- proporção hóspede/CD

- dados termodinâmicos sobre estabilidade

Excesso do fármaco + CD ( concentrações): equilíbrio

Análise por Absorção UV/V [fármaco]

Gráfico: [CD] vs [fármaco]

0.0

0.2

0.00 0.25 0.50

Dru

g so

lub

ility

(M

)

HPCD conc. (M).

Solubilidade de carbamazepina em Solubilidade de carbamazepina em solução aquosa HP-solução aquosa HP-CDCD

N

CNH2O

AALL-tipo de perfil:-tipo de perfil:0.1

Inclinação = 0.37 < unidade 1:1 complexo

1

0

1:1150

37.01004.0

37.0

1

MMslopeS

slopeK

Referências Referências

1. W. Saenger, "Cyclodextrin inclusion compounds in research and industry", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19, 344 (1980).

2. T. Loftsson, M. Brewster, "Pharmaceutical applications of

cyclodextrins. 1. Drug solubilization and stabilization", J.

Pharm. Sci. 85, 1017 (1996).

3. T. Higuchi, K.A. Connors, “Phase-solubility techniques”

Adv. Anal. Chem. Instrum. 4, 117 (1965).

Equipe

• Doutorado• Débora N. Biloti (FAPESP): Irinotecan@LPS• Milene H. Martins (CNPq): Isotretinoina@LPS• Edeilza G. Brescansin (UEM/PICDT): Nistatina@LPS• Débora Simoni (PED): Anfotericina B@LPS• Ana P.V. Lala (Capes): Nimodipina@CD• Fernanda M. Tomé (UNIP): 5-Fluoruracil@CD• Rita C.S. Pompei (Biotech): Vancomicina@LPS

• Mestrado• Angélica Cassemiro (Dosage): Clobetasol@CD• Adriana Calderini (CNPq): Minoxidil@CD

• Iniciação Científica• Mônica S.A. Oliveira (FAPESP): Hidroquinona@CD

• Pós Doc• Carlos A. Oliveira (UFU): Zn-ftalocianina@LPS

• Agradecimentos: FAPESP, CNPq, FAEP, Capes, Cristália, EMS, ICN, Labogen, Medley, Stiefel, Degussa, Genzyme

•