Encefalopatías Encefalopatías espongiformesespongiformes transmisibles humanastransmisibles humanas

Características, etiología, epidemiología y vigilanciaCaracterísticas, etiología, epidemiología y vigilancia

Dr. Christián Begué (Msc, PhD)(cbegue@fleni.org.ar)

CENTRO DE REFERENCIA NEUROPATOLOGICO Y DE BIOLOGIA MOLECULARDE ENCEFALOPATIAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES HUMANAS.INSTITUTO DE INVESTIGACIONES NEUROLOGICAS RAUL CARREA. FLENI.

Temario:- El Agente etiológico ¿Que es un prion?

- Clasificación etiológica

- CJ variante vs CJ esporádico

- Criterios de caso de EETs humanas

- ¿Como se resuelve / diagnostica un caso de CJ típico?

- Formulario de notificación de caso sospechado

- ¿Que tan susceptibles seriamos los argentinos al CJ variante?

- Distribución geográfica de casos en Argentina

- Registro epidemiológico

- Algunas conclusiones

Dr. Christián Begué – Instituto Raul Carrea - FLENI

PrPc:

Proteína

NORMAL

> estructura

secundaria α

PrPsc:

Proteína

ANORMAL (3D)

INFECCIOSA

> estructura

secundaria β

El agente etiológico consensuado de las EETs esel prion anómalo (una proteina con su conformación 3D alterada).

Concepto clave: Proteinas con capacidad Infectante.

Mecanismo consensuado de propagación es “de tipo catalítico”, por interacción (contacto) entre proteínas sanas con proteínas anómalas.

HIPOTESIS del PRION (Griffith 1967, Prusiner 1982) ¿Hay evidencias fuertes? SI¿Hay demostración formal (postulados de Koch)? NO.

EETs HUMANAS

DIMENSIONES COMPARATIVAS de PATÓGENOS(1 nm = 0.000000001 m = 1 x 10-9 m)

• Virus (generalización) ~ 300nm / Bacterias 200-1500nm

• PRIONES, un paradigma aparte, moléculas capaces de transmitir una enfermedad. Proteínas que transmiten información conformacional y así violarían el dogma central de la B Molecular.Fibrilla 15-150 nm; Moléculas (estado soluble):1 nm

Normalmente una proteína nace como una cadena de aa que luego se pliega (“se enrolla”) en su entorno fisiológico. Este plegamiento puede modificarse y ser patogénico.

-ADQUIRIDAS (<<1%)

Via oral

- Creutzfeldt-Jakob variante (CJv) > Asociado a la EEB por ingesta de animalesenfermos (217 casos en el mundo hasta 2010, 169 en Reino Unido).

- Kuru > Canibalismo ritual “de honra” a los antepasados practicado por la Tribu Fore (Papua – Nueva Guinea), posiblemente un individuo que tuvo una EET humana contagió a losdemás.

Via iatrogenica (ie. por procedim médico, involuntariamente)

- Creutzfeldt-Jakob variante (CJv) > Por transfusión de sangre (2 casos en RU); porcirugías (transplante de cornea); por instrumental mal esterilizado usado previamente en un paciente (CJv).

- CJ iatrogénico (CJi) > Por cirugías, injerto de duramadre, hormona de crecimientocadaverica (hGH), transfusión de sangre; etc;o instrumental mal esterilizado usado previamente en un paciente con otra EET humana.

ClasificaciónClasificación etiológicaetiológica ((ieie. . origenorigen))TresTres etiologíasetiologías: : adquiridaadquirida; ; esporádicaesporádica; y ; y hereditariahereditaria

EETs HUMANAS

- ADQUIRIDAS (<<1%) diapositiva ant. CJv y CJ iatrog

- IDIOPATICAS (85-90%)-Creutzfeldt-Jakob esporádico (CJe)(>85%)-Insomnio Fatal esporádico (IFe)

- HEREDITARIAS (10-15%)-Creutzfeldt-Jakob genético (CJf)-Insomnio Fatal Familiar (IFF) -Gertsmann-Sträussler-Scheinker (GSS)

---------------------------------------------------------------------Algunas mutaciones descriptas sobre el gen PRNP (codifica para PrP)

- CJ genético: D178N-129V, V1801, V 180I, M232R, T183A, T188A, E196K, E200K (la más frecuente en el mundo),V203I, R208H, V210 I,E211Q,M232R, 96bpi, 20bpi, 144bpi, 168bpi, 48bp del. - GSS: P102L, P105L, A117V, G131V, F198S, D202N, Q212P, Q217R, M 232T, 192bpi. - IFF: D178N-129M. - Otras mutaciones

EETs HUMANAS

Síntomas neurológicos de progresión rápida.

Características clínicas tempranas:Síntomas psiquiátricos y disturbios sensoriales (aparición progresiva y lenta).

Duración media desde el comienzo: menor a 8 meses.

Duración media desde el comienzo: mayor a 14 meses.

Edad de comienzo: 60 años o más. Edad de comienzo: muy generalmente menos de 40 años, media 29 años.

Incidencia global: 1-1.5 casos por millón de personas por año.

Incidencia: pocos casos en el mundo (217 hasta 2010).

CJ esporádico (85-90%)CJ variante (zoonosis) (>>1%)

Casos en Argentina: ~275 casos acumulados (1980-Abr 2011)

Casos en Argentina: ninguno (Abr-2011).

Neurotrófica.Tropismo: tejidos neuronales y linfaticos.

No hay un background (contexto) genético específico, sí un factor modulador, el codón 129 del gen del prion humano.

Genotipo suceptibilizante a manifestar la enfermedad, todos se infectan: homocigocidad metionina/metionina. en el codon 129 del gen del prion humano.

No hay factores de riesgo reconocidos.Adquirido por exposición al agente etiológico (oral o iatrogénica).

EETs HUMANAS

• ENF. NEURODEGENERATIVAS, afectan el SNC

• METABOLISMO ABERRANTE de la PROTEINA PRION (o PrP)

• PERIODO INCUBACIÓN MUY LARGO (2-40 años)

• EVOL RÁPIDA (CJe: 2-24m, Prm=6m; CJv Prm=14m:), SIEMPRE FATAL

• AFECTAN A HUMANOS Y A OTROS MAMÍFEROS

• TRANSMISIBLES. Por SNC (Cerebro; médula; tej. adyacentes son

INFECTIVOS)

• SIN DIAGNOSTICO PRE-CLÍNICO

• SIN TRATAMIENTO / CURA

• DIAGNOSTICO FINAL: BIO/AUTOPSIA (SNC) o WB PrPsc (SNC)

• Alta HETEROGENEIDAD CLÍNICA, PATOLOGICA y MOLECULAR

CARACTERISTICAS GENERALES

EETs HUMANAS

SINGULARIDAD de las EETs

Formas: (1)genéticas e (2)infecciosas no excluyentes;

(3)esporádicas (o idiopáticas).Hipótesis: el agente etiológico sería una proteína (del huésped).

EETs HUMANAS

3 Etiologías descriptas

Diagnóstico por PROTEOLISIS controlada (PK): Uno de los gold- standardsdiagnóstico, junto con la patología / inmunohistoquimica.

DIAGNOSTICO MOLECULAR

EETs HUMANAS

¿Como se resuelve/diagnostica un caso de CJ “clásico”?Enfoques multidisciplinarios integrados

• CLINICA COMPATIBLE y/o SUGERENTE (neurólogo).

• PATOLOGÍA e INMUNOHISTOQUÍMICA: Caracteristicas patológicas; patrón de distribución de PrPsc; mapeo de zonas del cerebro/cerebelo.

• WESTERN BLOT PrPsc (post-tratamiento con PK)Patrón de bandas (PM e intensidad de c/ isoforma).

• WESTERN BLOT de proteinas 14-3-3 en LCRMarcador de daño neuronal con alta S y E en el marco de CJ, refuerzode la presunción, test menos invasivo que biopsia (muy desaconsejadasalvo diagnostico alternativo = demencia tratable).

• SECUENCIACIONCuando hay historia familiar de demencia. Detección de mutaciones y polimorfismos (inserciones; deleciones; mutaciones puntuales).

• ELECTROENCEFALOGRAMA (EEG)(PSWP)Patrón de descargas característico.

• RESONANCIA MAGNETICA (imágenes)Señal hiperintensa en ganglios de la base/tálamo/corteza en secuenciasFLAIR o DWI.

EETs HUMANAS

PK - +

Criterios de caso CJ (OMS / EUROCJD)

CJ esporádico

CJ POSIBLE:(I) + 2 de (II) + duración < 2 años

I) Demencia rápidamente progresivaII) A. Mioclonias

B. Problemas visuales o cerebelososC. Problemas Piramidales o extrapiramidalesD. Mutismo aquinético

-------------------------------------------------------------------CJ PROBABLE:

(I) + 2 de (II); más (III) y/o (IV) y/o (V)

III) EEG típicoIV) Proteina 14-3-3 positiva en LCR por Western Blot IV) IRM. Señal alta en caudado y/o putamen en las secuencias FLAIR o

DWI.-------------------------------------------------------------------CJ DEFINIDO:

Confirmado por Neuropatología / inmunocitoquímica / biología molecular (Western Blot de PrPsc) (=> autopsia o biopsia)

EETs HUMANAS

Criterio de caso CJ genetico (OMS / EUROCJD)

CJ iatrogénico

Sindrome cerebelar progresivo en un paciente receptor de h. pituitaria

cadavérica o transplante de otro paciente (expuesto a riesgo conocido

o CJ esporádico ie. transplante de duramadre o cornea o sangre de CJv,

ETC.)

EETs GenéticasCaso PROBABLE

A) Desorden neuropsiquiátrico progresivo + pariente en primer grado

con EET definida o probable.

(O que sea)

B) Desorden neuropsiquiátrico progresivo + una mutación patogénica en

el gen PrnP. (Ver mutaciones descriptas en la bibliografía)

Caso DEFINIDO

A) Con confirmación por patología/molecular + pariente en primer

grado que sea EET definido o probable.

(O que sea)

B) Confirmado (Definido), con una mutación patogénica en el gen PrnP.

EETs HUMANAS

Criterios de caso de

CJ variante:

Signos psiquiátricos en el inicio de la enfermedad

EETs HUMANAS

Formulario que completa el neurólogo con información de su paciente con sospecha de alguna EET humana.

-IDENTIF del PACIENTE

-PROFESIONAL ACTUANTE

-MANIFEST CLINICAS

-ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS

-ANTECEDENTES PERSONALES

EETs HUMANAS

Dr. Christián Begué – Instituto Raul Carrea

Enfoque por NEUROPATOLOGIACreutzfeldt–Jakob esporádico (corteza)

Cambios espongiformes, HE Hiperplasia astroglial, GFAP

PrPSc, INMUNOMARCACION (3F4)

Perineuronal Sináptica Placas

•Ausencia de respuesta inflamatoria linfocítaria

EETs HUMANAS

Enfoque por técnicas de biología molecular: - Western Blot de PrPSSc, es diagnóstico de certeza. - Diagnóstico validado para EETs.

Homogenatos de cerebro (s.gris) post proteolisis controlada conPK.PrPSc tipo 1 (21 kDa), PrPTSE tipo 2 (19 kDa).

EETs HUMANAS

Enfoque por técnicas de biología molecular:Proteínas 14-3-3 en LCR, marcador de daño neuronal.

- Menos invasivo que biopsia.

- Diagnóstico complementario pre-mortem a ser evaluado junto con los demás elementos, WB 14-3-3 positivo en LCR no es diagnóstico de CJ, 14-3-3 negativo tampoco excluye el diagnóstico. Ventana de positividad.

- Permite reclasificar un caso CJ posible de acuerdo a los actuales criterios de CJ en caso probable (ie. con valor epidemiológico). - Ensayo de rutina en pacientes notificados dentro del marco de la Vigilancia de CJ.

N = 418 LCRs procesados (2000-2008)Sensibilidad del WB de proteína 14-3-3 (LCR): 72% (47/65), 18 casos 14-3-3 negativos resultaron CJ

Especificidad del WB de proteína 14-3-3 (LCR): 90.5%(114/126), 12 casos 14-3-3 positivos que resultaron excluidos con otro Dx por A/B o seguimiento clínico.

WB proteinas 14-3-3 en LCR:

EETs HUMANAS

ENFOQUE por Electroencefalograma (EEG)

- EEG de un paciente con CJ con 6 meses de evolución. Muestra las ondas pseudoperiodicas -bi o trifasicas- organizadas de 1 a 2 Hz, y muy poca otra actividad.

EETs HUMANAS

Ej : Pac. de 56 años (profesora) que en cuatro meses se volvió desconectada y olvidadiza, rápido deterioro y progresión a mutismo, postrada, incapaz de alimentarse, con mioclonías (espasmos o estertores).

Patrón patognomónico de CJ en este marco clínico (Cje), visto como una manifestación de una severa enfermedad de la sustancia gris involucrando la corteza y núcleos profundos.

- Señal anormal en areas talámica y pulvinar:

DWI FLAIR

ENFOQUE por IMAGENES DE RESONANCIA MAGNETICA

- Regiones involucradas en las secuencias de FLAIR o DWI: corteza y ganglios de la base.

EETs HUMANAS

ENFOQUE por Detección de mutaciones geneticas por Secuen.o RFLP

- Pacientes con historia familiar de enfermedad similar sugieren la posibilidad de que el caso sea genético (gen PrnP). Secuenciación dá información completa del gen. RFLP dá información sobre una mutación puntual específica planteada.

EETs HUMANAS

La mutación más común del CJ genético es E200K, en pacientes de origen chileno o patagónico.

Alelo normal (codon200): GAG=Glutamato, guanina (pico verde).

Alelo mutado (codon200): AAG=Lisina, adenina (pico rojo).

P M C A

Protein Misfolding Ciclic Amplification.

Análogo a PCR, pero con proteínas!

A 1/1000 dilution of hamster scrapie brainhomogenate was made into 5% healthyhamster brain homogenate. Aliquots weresubjected to 0, 5, 10, 20 or 40 PMCA cycles(a) or incubated for the same times, butwithout sonication (b). All samples weretreated with proteinase K.

Dr. Christián Begué – Instituto Raul Carrea - FLENI

¿Cuan susceptibles seríamos los argentinos al CJv si lo tuvieramos?…El genotipo del codon polimórfico 129 del gen PRNP:

- modulador del fenotipo- factor de susceptibilidad en los individuos infectados o con enfermedad

establecida.

Alelos - Met/Met > susceptibilizante al CJvposibles: - Val/Val > suceptibilizante a otras EETs humanasdel codon 129 - Met/Val > retarda la aparición de síntomas

Hipótesis de susceptibilidad asociada al codón 129– Individuos homocigotos = un solo pool de proteínas (129M o 129 V) >

interacción (entre proteínas) rápida y efectiva > aparición de síntomas más temprano.

– Individuos heterocigotos = dos pooles de proteínas (129M y 129 V) > interacción menos rápida y efectiva > aparición de síntomas más tardío, PERO SE INFECTA y TRANSMITE TAMBIEN!!.

EETs HUMANAS

-Ej.1: CJ variante, todos los individuos afectados (ie. enfermedad establecida) son Met/Met 129. Se detectó un único caso preclínico (fallecido por otra causa) con PrPsc en bazo con genotipo Met/Val luego de recibir transfusión de sangre con CJv (Peden, 2004).

Polimorfismo Met/Val c129 del gen PNRP humanoen Población control (sana) argentina -por RFLP- (n=300).

*Europa, †America, ‡No caucásicas

10092%0%8%92%Japón‡

30049%3%51%46%Argentina†

19152%6%48%46&Brazil †

8649%11%51%38%EE.UU.†

10649%12%51%37%Reino Unido*

10961%16%39%45%Polonia*

20660%15%40%45%Italia*

7455%13%45%42%Alemania*

16148.9%9.9%51.1%39%Francia*

30051.3%8.3%48.7%43%Austria*

(n)Homo-cigotas

Val/ValMet/ValMet/MetPaís

Mujeres = 197Varones = 103Rango de edad = 4-87 años Edad Promedio = 49,1 años -Poblaciones caucásicas

~50% de heterocigotas (M/V);~40% de homocigotas MM; y ~10% VV.

-Muestra japonesa, mayoría es MM.

EETs HUMANAS

Homocigot

Hetero-cigotas

Comparación de la distribución de Controles sanos vs CJ definidoCodon 129 del gen PrnP

(χ22=7.0; p<0.01) (χ22=16.1; p<0.001)

EETs HUMANAS

CJ (2009);

n=82

CJ n=49 -> misma tendencia

La susceptibilidad aumentada …

¿correlaciona con un alelo determinado (M o V) en codon 129? No.

Correlaciona con la homocigocidad? Si.

HETEROGENEIDAD en las EETs

… No solo el SNC sería

potencialmente infectivo …

Pacientes con CJ esporádico

•Detección de PrPSc por Western Blot

•10/28 muestras de bazos positivas

•8/32 muestras de músculo esquelét.

EETs HUMANAS

HIPOTESIS de SOLO-PROTEINA(Prusiner 1982, enrriquese 3000 veces el agente infeccioso: SCAPIE PROTEIN, PRION)

(Griffith, 1967. Patisons y Jones, 1967. SELF-REPLICATING PROTEIN, PROTEIN-ONLY MODEL

• La presencia de ácidos nucleicos específicos asociados al agente etiológico no pudo ser demostrado en la práctica por losvirólogos.

• La existencia de formas infecciosas, hereditarias y esporádicasde EETs.

• La resistencia a la infección con PrPsc en ratones PrPc K.O. (knock out = eliminación de un gen específico del genoma).

• La naturaleza protéica del agente infeccioso (core parcialmenteresistente a proteasas).

• PrPsc es la macromolécula más abundante en las fraccionesinfectivas (aunque no la única; trazas).

• Los experimentos de inoculación dan perfiles patológicosidentificables y reproducibles.

Dr. Christián Begué – Instituto Raul Carrea - FLENI

0,00

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2,50

1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Y

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Tota

l num

ber

of r

efer

rals

Total number of referrals

Definite and Probable TSEs

Incidence rate (w hole country)

Incidence rate (Buenos Aires city alone)

ARGENTINASuperficie: 2.780.400 km2 / Población:36.260.130 habitantes / Densidad: 13,04 habitantes/km²Incidencia (CJe y CJg): alcanza a 0.85 in 2008Buenos Aires (solo CABA)Superficie: 202.04 km2 / Población: 2.776.138 habitantes / Densidad:13.740,5 habitantes /km²Incidencia (CJe y CJg ): alcanza a 1.8 en 2008

- Argentina es un país extenso con baja densidad poblacional. Incidencia total (espy gen) llegó a 0.85 en 2008.

- Buenos Aires (CABA) tiene una alta densidad poblacional. Incidencia total (espy gen) llegó a 1.8 en 2008, similar a algunos paises europeos pequeños y altamente poblados.

- La mayoria de los casos E200K CJgprovienen de la Patagonia/límite con Chile.

0.85

1.8

CJe y CJg – distribución geográfica de la casuística

Epidemiología y Vigilancia de la ECJEETs HUMANAS

Genetic Creutzfeldt-Jakob (1997-2008)Age at Biopsy / Autopsy (36 data /38 cases)

(Range: 37,8 - 80,2 years. Mean: 58,9 years.)

0

5

10

15

20

20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 90-99

Age interval (years)

N° o

f cas

es

Sporadic Creutzfeldt-Jakob (1997-2008)Age at Biopsy / Autopsy (80 cases)

(Range: 38,1 - 86,2 years. Mean: 63,3 years.)

0

5

10

15

20

25

30

20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 90-99

Age interval (years)

N° o

f cas

es

Genetic TSEs (1997-2008)Estimated duration of illness (36 data / 38 cases)

(Range: 1,7 - 76 mo . Mean: 11,5 mo.)

0

1

2

3

4

5

6

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77

Duration (months)

N°

of c

ases

Sporadic CJD (1997-2008)Estimated duration of illness (75 data / 80 cases)

(Range: 0,9 - 70 mo . Mean: 7,7 mo.)

0

2

4

6

8

10

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14

16

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71

Duration (months)

N° o

f cas

es

Registro epidemiológico

CJ e CJ g

- Duración

- Edad a la biopsia o autopsia

Algunas conclusiones

•En Argentina, hasta ahora, no se han detectado casos de CJ variante. Sí, casos de CJ esporádico y genético (nada excepcional).

•La mutación más frecuente es E200K (CJg), ídem a global.

•WB proteína 14-3-3 (+) no es diagnóstico de ECJ, tampoco excluye el diagnóstico. Ensayo de rutina en pacientes notificados dentro del marco de la Vigilancia de CJ. 14-3-3 en LCR en fase muy temprana o tardía puede dar negativo.

•Si nos expusieramos al agente del CJv, el 100% sería susceptible y aprox el 50% de la población desarrollaría la enfermedad (ie, codon 129 genotipo met/met).

•Las técnicas diagnosticas, aun hoy a 30 años del descubrimiento, continúan apoyandose en el ensayo de proteolisis controlada.

•Los casos se resuelven de modo interdisciplinario.

AnexoPostulados de Koch (Wikipedia)

1. El agente patógeno debe estar presente en cada caso de la enfermedad en las condiciones apropiadas y ausente en las personas sanas. 2. El agente no debe aparecer en otra enfermedad de manera fortuita o saprófita. 3.El agente debe ser aislado del cuerpo en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad. 4. El agente debe provocar la enfermedad en un animal susceptible al ser inoculado. 5. El agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en los animales de experimentación.

La mayoría de las bacterias que causan enfermedad en el humano se ajustan a los postulados de Koch. Ej de excepción Mycobacterium leprae.

Algunos autores han adaptado estos postulados para explicar la probabilidad de que una molécula endógena pueda ejercer un papeldeterminado en la patogenia de un proceso.1. La molécula se expresa en casos de enfermedad2. La molécula se expresa en forma distinta en casos de enfermedad y en individuos sin enfermedad 3. La administración experimental de la molécula puede iniciar oexacerbar la enfermedad 4. La neutralización experimental de la molécula puede prevenir o mejorar la enfermedad

Agradecimiento

- A todos los médicos, neurólogos, patólogos y familias, que facilitan la información y notifican casos permitiendo obtener una casuística y diagnóstico de este grupo de patologías.

- A la Dra Taratuto, quien ha sido y es impulsora y referente en el diagnóstico de este grupo de enfermedades en humanos.

- A mis colegas en este grupo de difusión que permiten dar un cuadro acabado de esta zoonosis (el CJv).

- A ustedes por escuchar.Gracias.