ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V …Doktorska disertacija ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V NEKONVENCIONALNIH TOPILIH Sabina KAVČIČ Maribor, september 2014

Doktorska disertacija

ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V

NEKONVENCIONALNIH TOPILIH

Sabina KAVČIČ

Maribor, september 2014

Doktorska disertacija

ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V

NEKONVENCIONALNIH TOPILIH

Avtor: Sabina Kavčič

Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Somentor: red. prof. dr. Željko Knez

Maribor, september 2014

I

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

IZJAVA DOKTORSKEGA KANDIDATA

Podpisana: SABINA KAVČIČ, vpisna številka: 95032912

izjavljam,

da je doktorska disertacija z naslovom

Encimska sinteza laktatnih estrov v nekonvencionalnih topilih

rezultat lastnega raziskovalnega dela,

da predložena disertacija v celoti ali v delih ni bila predložena za pridobitev

kakršnekoli izobrazbe po študijskem programu druge fakultete ali univerze,

da so rezultati korektno navedeni in

da nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih.

Podpis doktorske kandidatke:

III

Zahvala

Za pomoč in podporo pri pripravi doktorske disertacije se zahvaljujem vsem, ki so kakorkoli sodelovali pri njej.

Posebno zahvalo namenjam mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb in somentorju red. prof. dr. Željku Knezu za izkazano zaupanje, usmerjanje, vzpodbudo k samostojnemu delu ter strokovne in znanstvene nasvete.

Iskrena hvala vsem sodelavcem v Laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko za sprejem in dobro delovno vzdušje.

Zahvaljujem se Mateju in najinima družinama ter prijateljem, ki so mi stali ob strani, me spodbujali in verjeli vame.

Nazadnje bi se rada zahvalila moji hčeri Lari za vse nasmehe, objemčke in poljubčke, ki so mi polepšali dneve in me spodbujali do konca.

IV

ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V NEKONVENCIONALNIH TOPILIH

Povzetek

Laktatni estri, ki se pogosto uporabljajo v prehrambeni, farmacevtski in kozmetični industriji, so med najbolj pomembnimi derivati mlečne kisline. V današnjem času je velik poudarek na biorazgradljivosti produktov in uporabi okolju prijazne tehnologije, zato je potrebno temu primerno tudi izbrati topila za sintezo laktatnih estrov. Encimsko katalizirane reakcije lahko namesto v vodnem mediju izvajamo tudi v konvencionalnih organskih topilih ali v nekonvencionalnih topilih, kot so superkritični fluidi in ionske tekočine.

Namen doktorske disertacije je bil izvesti encimsko sintezo laktatnih estrov, natančneje n-butil laktata, v nekonvencionalnih topilih. Kot nekonvencionalna topila smo uporabili superkritične fluide (superkritični ogljikov dioksid, superkritični trifluorometan in superkritični etan) in ionsko tekočino (CYPHOS IL-201). Vsa uporabljena topila predstavljajo zanimiv razred topil za encimsko katalizirane reakcije.

Imobilizirano lipazo B iz Candida antarctice smo uspešno uporabili kot biokatalizator za encimsko katalizirano esterifikacijo D,L-mlečne kisline z n-butanolom v visokotlačnem mešalnem šaržnem reaktorju. V superkritičnem ogljikovem dioksidu smo proučili vpliv razmerja substratov (D,L-mlečna kislina:n-butanol), koncentracije molekularnih sit, hitrosti mešanja, večkratne uporabe encima, tlaka, temperature in koncentracije ko-topila (n-heksan) na izkoristek D,L-mlečne kisline, produktivnost in začetno hitrost tvorbe estra n-butil laktata. Prav tako smo optimirali reakcijske parametre, tlak, temperaturo in koncentracijo ko-topila (n-heksan), pri izvedbi encimske esterifikacije v superkritičnem trifluorometanu. V sistemu superkritični ogljikov dioksid/ionska tekočina in superkritični trifluorometan/ionska tekočina pa smo proučili vpliv koncentracije ionske tekočine CYPHOS IL-201, temperature, tlaka in koncentracije encima na potek reakcije.

Nadalje smo očistili encimsko sintetiziran n-butil laktat ter določili antimikrobno aktivnost na različne testne mikroorganizme (Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium cyclopium, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens in Bacillus cereus).

Ključne besede: encimska esterifikacija, lipaza, n-butil laktat, superkritični fluidi, ionska tekočina

UDK: 54-139:577.151.3(043.3)

V

ENZYMATIC SYNTHESIS OF LACTATE ESTERS IN NONCONVENTIONAL SOLVENTS

Abstract

Lactic acid esters, which are widely used in the food, pharmaceutical and cosmetics industries are among the most important derivatives of lactic acid. Nowadays the biodegradability of the products and the use of environment-friendly technologies are of great importance, therefore a appropriate solvent for the synthesis of lactate esters should be choosen. In stead of aqueous medium, enzyme catalyzed reactions could be performed in conventional organic solvents or in nonconventional solvents, such as supercritical fluids and ionic liquids.

The purpose of the dissertation was to carry out the enzymatic synthesis of lactate esters, specifically n-butyl lactate in nonconventional solvents. As the nonconventional solvents, the supercritical fluids (supercritical carbon dioxide, supercritical trifluoromethane and supercritical ethane) and ionic liquid (CYPHOS IL-201) were used. All used solvents present an interesting class of solvents for enzyme-catalyzed reactions.

The immobilized lipase B from Candida antarctica was successfully used as a biocatalyst for the enzyme-catalyzed esterification of D,L-lactic acid with n-butanol in a high-pressure batch stirred-tank reactor. The influence of substrates ratio (D,L-lactic acid:n-butanol), concentration of molecular sieves, stirring rate, multiple use of the enzyme, pressure, temperature and concentration of co-solvent (n-hexane) on the efficiency of D,L-lactic acid, yield (productivity) and the initial rate of formation of the n-butyl lactate ester was studied when the reaction was performed in supercritical carbon dioxide. Also, the reaction parameters, such as, pressure, temperature and concentration of co-solvent (n-hexane) were optimized when the enzymatic esterification was carried out in the supercritical trifluoromethane. In the systems supercritical carbon dioxide/ionic liquid and supercritical trifluoromethane/ionic liquid, the impact of the concentration of ionic liquids CYPHOS IL-201, temperature, pressure and concentration of the enzyme of the reaction were studied.

Furthermore, the antimicrobial activity of enzyme synthesized n-butyl lactate against a variety of test microorganisms (Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium cyclopium, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens and Bacillus cereus) was determined.

Key words: enzymatic esterification, lipase, n-butyl lactate, supercritical fluids, ionic liquid

UDK: 54-139:577.151.3(043.3)

VI

VSEBINA

1 UVOD ..............................................................................................................1

2 TEORETSKE OSNOVE ...................................................................................3

2.1 Biokataliza .......................................................................................................3

2.1.1 Encimi .......................................................................................................... 3

2.1.1.1 Lipaze .................................................................................................... 4

2.1.1.2 Lipaza B iz Candida antarctice ............................................................... 7

2.2 Superkritični fluidi ............................................................................................7

2.3 Ionske tekočine .............................................................................................. 10

2.4 Laktatni estri .................................................................................................. 12

2.4.1 Lastnosti in uporaba ....................................................................................12

2.4.2 Encimska sinteza laktatnih estrov ................................................................15

2.4.3 Antimikrobna aktivnost ................................................................................16

2.4.3.1 Saccharomyces cerevisiae ...................................................................17

2.4.3.2 Aspergillus niger ...................................................................................17

2.4.3.3 Trichoderma viride ................................................................................18

2.4.3.4 Penicillium cyclopium ............................................................................18

2.4.3.5 Escherichia coli .....................................................................................18

2.4.3.6 Pseudomonas fluorescens ....................................................................19

2.4.3.7 Bacillus cereus ......................................................................................19

3 EKSPERIMENTALNI DEL ............................................................................. 20

3.1 Materiali ......................................................................................................... 20

3.2 Metode dela ................................................................................................... 20

3.2.1 Študija faznih prehodov za različne sisteme ................................................20

3.2.2 Sinteza n-butil laktata v nekonvencionalnih topilih .......................................21

3.2.3 Antimikrobna aktivnost ................................................................................22

3.2.3.1 Antibakterijska aktivnost........................................................................22

3.2.3.2 Antiglivna aktivnost ...............................................................................22

3.3 Analizne metode ............................................................................................ 22

3.3.1 Določitev sestave D,L-mlečne kisline ..........................................................22

3.3.2 Določitev sestave D,L-mlečne kisline med potekom encimske sinteze n-butil laktata .........................................................................................................23

VII

3.3.3 Določitev n-butil laktata s plinsko kromatografijo .........................................23

4 REZULTATI IN DISKUSIJA ........................................................................... 25

4.1 Določitev sestave D,L-mlečne kisline ............................................................. 25

4.2 Potrditev prisotnosti estrske vezi s FT-IR spektroskopijo ............................... 25

4.3 Optimiranje reakcijskih parametrov za sintezo n-butil laktata v SC CO2 ......... 26

4.3.1 Vpliv razmerja mlečna kislina:n-butanol na izkoristek D,L-mlečne kisline v SC CO2 .............................................................................................................26

4.3.2 Vpliv koncentracije molekularnih sit na izkoristek D,L-mlečne kisline v SC CO2 .................................................................................................. 28

4.3.3 Vpliv hitrosti mešanja na izkoristek D,L-mlečne kisline v SC CO2 ................29

4.3.4 Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na izkoristek D,L-mlečne kisline v SC CO2 ..........................................................................................30

4.3.5 Vpliv tlaka in temperature na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CO2 .....32

4.3.6 Vpliv koncentracije n-heksana na izkoristek D,L-mlečne kisline v SC CO2 ..40

4.3.6.1 Vpliv tlaka in temperature na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CO2 ob dodatku n-heksana ..........................................................................40

4.3.7 Sinteza n-butil laktata v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 ..........................46

4.3.7.1 Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CO2 .................................................................................................47

4.3.7.2 Vpliv temperature na encimsko sintezo n-butil laktata v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 ............................................................................50

4.3.7.3 Vpliv tlaka na encimsko sintezo n-butil laktata v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 ............................................................................53

4.3.7.4 Vpliv dodatka encima na izkoristek D,L-mlečne kisline v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 ............................................................................58

4.4 Optimiranje reakcijskih parametrov za sintezo n-butil laktata v SC CHF3 ....... 59

4.4.1 Vpliv tlaka in temperature na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CHF3 ...60

4.4.2 Vpliv koncentracije n-heksana na izkoristek D,L-mlečne kisline v SC CHF3 67

4.4.2.1 Vpliv temperature na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CHF3 ob dodatku n-heksana ...............................................................................68

4.4.2.2 Vpliv tlaka na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CHF3 ob dodatku n-heksana ................................................................................................70

4.4.3 Sinteza n-butil laktata v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 ........................73

4.4.3.1 Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na encimsko sintezo n-butil laktata v SC CHF3 ...............................................................................................74

4.4.3.2 Vpliv temperature na encimsko sintezo n-butil laktata v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 ..........................................................................77

4.4.3.3 Vpliv tlaka na encimsko sintezo n-butil laktata v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 ..........................................................................79

VIII

4.4.3.4 Vpliv dodatka encima na izkoristek D,L-mlečne kisline v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 ..........................................................................82

4.5 Antimikrobna aktivnost ................................................................................... 83

4.5.1 Antibakterijska aktivnost ..............................................................................84

4.5.2 Antiglivna aktivnost ......................................................................................86

5 ZAKLJUČEK .................................................................................................. 90

6 LITERATURA ................................................................................................ 94

7 ŽIVLJENJEPIS ............................................................................................ 101

8 OSEBNA BIBLIOGRAFIJA .......................................................................... 103

IX

SEZNAM SLIK

Slika 2.1: Struktura lipaze B iz C. antarctice. ......................................................................7

Slika 2.2: Fazni diagram za čisto komponento. ..................................................................8

Slika 2.3: Fosfonijev kation. ............................................................................................. 10

Slika 2.4: Uporabnost ionskih tekočin. ............................................................................. 12

Slika 2.5: L in D izomera mlečne kisline. .......................................................................... 13

Slika 2.6: Tvorba dimere mlečne kisline (MK2). ............................................................... 13

Slika 2.7: Tvorba trimere mlečne kisline (MK3). ............................................................... 14

Slika 2.8: Dimere laktida. ................................................................................................. 14

Slika 2.9: Shematski prikaz encimsko katalizirane esterifikacije D,L-MK z n-butanolom v SCF. .............................................................................................................. 16

Slika 2.10: SEM posnetek glive S. cerevisiae. ................................................................. 17

Slika 2.11: Rast glive A. niger na trdnem gojišču. ............................................................ 18

Slika 2.12: Rast glive T. viride na trdnem gojišču. ............................................................ 18

Slika 2.13: SEM posnetek bakterije E. coli. ...................................................................... 19

Slika 2.14: SEM posnetek bakterije B. cereus. ................................................................. 19

Slika 3.1: Slika visokotlačnega mešalnega šaržnega reaktorja s safirnim okencem. ........ 21

Slika 3.2: Shema in slika visokotlačnega mešalnega šaržnega reaktorja za izvedbo encimsko katalizirane esterifikacije D,L-MK v SCF. ....................................... 21

Slika 3.3: Umeritvena krivulja za n-butil laktat. ................................................................. 24

Slika 4.1: FT-IR spekter za a) vzorec in b) standard n-butil laktata. .................................. 26

Slika 4.2: Vpliv razmerja D,L-MK/n-butanol na izkoristek D,L-MK v SC CO2. ................... 27

Slika 4.3: Vpliv koncentracije molekularnih sit na izkoristek D,L-MK v SC CO2. ............... 28

Slika 4.4: Vpliv hitrosti mešanja na izkoristek D,L-MK v SC CO2. ..................................... 29

Slika 4.5: Vpliv večkratne uporabe imobiliziranega encima na izkoristek D,L-MK v SC CO2. ...................................................................................................................... 31

Slika 4.6: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435/SC CO2. ............ 32

Slika 4.7: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK in vsebnost vode v SC CO2 pri 35 °C. ............ 33

Slika 4.8: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 pri 35 °C. ......................... 33

Slika 4.9: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v SC CO2 pri 55 °C. ....................................... 35

Slika 4.10: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 pri 55 °C. ....................... 35

Slika 4.11: Vpliv uporabe VMŠR in VMŠRSO na izkoristek D,L-MK v SC CO2 pri 55 °C. . 36

Slika 4.12: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v SC CO2 pri 65 °C. ..................................... 37

X

Slika 4.13: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 pri 65 °C. ....................... 37

Slika 4.14: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na izkoristek D,L-MK v SC CO2.... 38

Slika 4.15: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2. ............................................................................................................... 39

Slika 4.16: Vpliv temperature in tlaka na začetno hitrost encimske sinteze BL v SC CO2. 39

Slika 4.17: Vpliv dodatka n-heksana na izkoristek D,L-MK po 24 h reakcije v SC CO2 pri 55 °C in 7,5 MPa. .......................................................................................... 40

Slika 4.18: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435/n-heksan/SC CO2. ............................................................................................................... 41

Slika 4.19: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v SC CO2 pri 35 °C ob dodatku n-heksana... 41

Slika 4.20: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 pri 35 °C ob dodatku n-heksana. ........................................................................................................ 42

Slika 4.21: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v SC CO2 pri 55 °C ob dodatku n-heksana... 43

Slika 4.22: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 pri 55 °C ob dodatku n-heksana. ........................................................................................................ 43

Slika 4.23: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na izkoristek D,L-MK v SC CO2 ob dodatku n-heksana. ....................................................................................... 44

Slika 4.24: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 ob dodatku n-heksana. ........................................................................... 45

Slika 4.25: Vpliv temperature in tlaka na začetno hitrost BL v SC CO2 ob dodatku n-heksana. ........................................................................................................ 45

Slika 4.26: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435/CYPHOS IL-201/ SC CO2. ......................................................................................................... 46

Slika 4.27: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na izkoristek D,L-MK v SC CO2 pri 65 °C in 10 MPa. ..................................................................................................... 47

Slika 4.28: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na produktivnost pri sintezi BL v SC CO2 pri 65 °C in 10 MPa........................................................................................ 48

Slika 4.29: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na začetno hitrost sinteze BL v SC CO2 pri 65 °C in 10 MPa . ...................................................................................... 49

Slika 4.30: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na vsebnost MK1, MK2 in MK3 ter izkoristek D,L-MK po 1 h in 24 h sinteze BL v SC CO2 pri 65 °C in 10 MPa. .. 50

Slika 4.31: Vpliv temperature na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. ......................................................................................................... 51

Slika 4.32: Vpliv temperature na produktivnost pri sintezi BL v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. ......................................................................................... 52

Slika 4.33: Vpliv temperature na začetno hitrost sinteze BL v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. ......................................................................................... 53

Slika 4.34: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 65 °C. ...................................................................................................................... 54

Slika 4.35: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 65 °C. ....................................................................................................... 54

XI

Slika 4.36: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 155 °C. ...................................................................................................................... 55

Slika 4.37: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 155 °C. ..................................................................................................... 55

Slika 4.38: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 65 °C in 155 °C. ..................................................... 56

Slika 4.39: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na produktivnost pri sintezi BL v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 65 °C in 155 °C. .................................. 57

Slika 4.40: Vpliv tlaka in temperature na začetno hitrost sinteze BL v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201. .................................................................................... 57

Slika 4.41: Vpliv dodatka encima na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CO2/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. .................................................................................................... 58

Slika 4.42: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435 v treh različnih SCFs pri 35 °C in 20 MPa. ............................................................................. 59

Slika 4.43: Vpliv SCF na izkoristek D,L-MK. ..................................................................... 60

Slika 4.44: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435/SC CHF3. ........ 60

Slika 4.45: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v SC CHF3 pri 35 °C. ................................... 61

Slika 4.46: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CHF3 pri 35 °C. ..................... 62





Slika 4.51: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na izkoristek D,L-MK v SC CHF3. . 66

Slika 4.52: Vpliv temperature in tlaka po 24 h reakcije na produktivnost pri sintezi BL v SC CHF3. ............................................................................................................. 66

Slika 4.53: Vpliv temperature in tlaka na začetno hitrost encimske sinteze BL v SC CHF3. ...................................................................................................................... 67

Slika 4.54: Vpliv dodatka n-heksana na izkoristek D,L-MK po 24 h v SC CHF3 pri 65 °C in 10 MPa. ......................................................................................................... 67

Slika 4.55: Vpliv temperature na izkoristek D,L-MK v SC CHF3 pri 10 MPa ob dodatku n-heksana. ........................................................................................................ 68

Slika 4.56: Vpliv temperature na produktivnost pri sintezi BL v SC CHF3 pri 10 MPa ob dodatku n-heksana. ....................................................................................... 69

Slika 4.57: Vpliv temperature na začetno hitrost encimske sinteze BL v SC CHF3 ob dodatku n-heksana pri 10 MPa. ..................................................................... 70

Slika 4.58: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435/n-heksan/SC CHF3. ............................................................................................................. 70

Slika 4.59: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v SC CHF3 pri 55 °C ob dodatku n-heksana. 71

Slika 4.60: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v SC CHF3 ob dodatku n-heksana pri 55 °C. ............................................................................................................ 71

XII

Slika 4.61: Vpliv tlaka na začetno hitrost encimske sinteze BL v SC CHF3 ob dodatku 11 % n-heksana pri 55 °C. ............................................................................. 72

Slika 4.62: Vpliv tlaka na vsebnost MK1, MK2 in MK3 ter izkoristek D,L-MK po 1 h in 24 h sinteze BL v SC CHF3 pri 55 °C ob dodatku 11 % n-heksana. ....................... 73

Slika 4.63: Fazno obnašanje za sistem D,L-MK/n-butanol/Novozym 435/CYPHOS IL-201/SC CHF3. ................................................................................................ 74

Slika 4.64: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na izkoristek D,L-MK v SC CHF3 pri 55 °C in 10 MPa. ..................................................................................................... 75

Slika 4.65: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na produktivnost pri sintezi BL v SC CHF3 pri 55 °C in 10 MPa........................................................................................ 75

Slika 4.66: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na začetno hitrost sinteze BL v SC CHF3 pri 55 °C in 10 MPa........................................................................................ 76

Slika 4.67: Vpliv koncentracije CYPHOS IL-201 na vsebnost MK1, MK2 in MK3 ter izkoristek D,L-MK po 1 h in 24 h sinteze BL v SC CHF3 pri 55 °C in 10 MPa. 77

Slika 4.68: Vpliv temperature na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. .................................................................................................... 78

Slika 4.69: Vpliv temperature na produktivnost pri sintezi BL v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. ......................................................................................... 78

Slika 4.70: Vpliv temperature na začetno hitrost encimske sinteze BL v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 10 MPa. ................................................................ 79

Slika 4.71: Vpliv tlaka na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 55 °C. ...................................................................................................................... 80

Slika 4.72: Vpliv tlaka na produktivnost pri sintezi BL v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 55 °C. ....................................................................................................... 80

Slika 4.73: Vpliv tlaka na začetno hitrost sinteze BL v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 55 °C. ....................................................................................................... 81

Slika 4.74: Vpliv tlaka na vsebnost MK1, MK2 in MK3 ter izkoristek D,L-MK po 1 h in na vsebnost MK1 in MK2 ter izkoristek D,L-MK po 24 h sinteze BL v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 55 °C. ................................................................... 82

Slika 4.75: Vpliv dodatka encima na izkoristek D,L-MK v sistemu SC CHF3/CYPHOS IL-201 pri 55 °C in 10 MPa. ................................................................................ 83

Slika 4.76: Cona inhibicije rasti E. coli po 48 h inkubaciji. ................................................ 85

Slika 4.77: Cona inhibicije rasti P. fluorescens po 24 h inkubaciji. .................................... 85

Slika 4.78: Cona inhibicije rasti B. cereus po 24 h inkubaciji. ........................................... 86

Slika 4.79: Rast glive S. cerevisiae po 7 d inkubaciji (kontrola) ob dodatku standarda BL, vzorca BL in D,L-MK. ..................................................................................... 87

Slika 4.80: Rast glive A. niger po 48 h inkubaciji (kontrola) ob dodatku standarda BL, vzorca BL in D,L-MK. ..................................................................................... 88

Slika 4.81: Rast glive T.viride po 72 h inkubaciji (kontrola) ob dodatku standarda BL, vzorca BL in D,L-MK. ..................................................................................... 88

Slika 4.82: Rast glive P. cyclopium po 7 d inkubaciji (kontrola) ob dodatku standarda BL, vzorca BL in D,L-MK. ..................................................................................... 89

XIII

Slika 5.1: Optimalni tlak in temperatura za sintezo BL v SC CO2 in SC CHF3 po 24 h reakcije. ......................................................................................................... 91

Slika 5.2: Optimalni tlak in temperatura za sintezo BL v SC CO2 in SC CHF3 ob dodatku n-heksana po 24 h reakcije. .............................................................................. 91

Slika 5.3: Optimalni tlak in temperatura za sintezo BL v SC CO2 in SC CHF3 ob dodatku CYPHOS IL-201 po 24 h reakcije. ................................................................. 92

XIV

SEZNAM TABEL

Tabela 2.1: Nekaj primerov lipaz pridobljenih iz mikroorganizmov. ....................................5

Tabela 2.2: Podatki o kritičnih temperaturah in tlakih za nekatere vrste superkritičnih fluidov. .............................................................................................................9

Tabela 2.3: Fizikalno-kemijske lastnosti ogljikovega dioksida (CO2) in trifluorometana (CHF3). ............................................................................................................9

Tabela 2.4: Primeri anionov, ki skupaj s tetraalkifosfonijevim kationom tvorijo ionske tekočine. ........................................................................................................ 11

Tabela 2.5: Lastnosti CYPHOS IL-201. ............................................................................ 12

Tabela 2.6: Ime, formula in molska masa za nekaj laktatnih estrov. ................................. 15

Tabela 2.7: Fizikalne in kemijske lastnosti butil laktata. .................................................... 15

Tabela 3.1: Preglednica za gradientno HPLC metodo za n-butil laktat. ............................ 23

Tabela 4.1: Doseženi izkoristki po 6 h, 24 h in 48 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK z različnimi množinskimi razmerji substratov v SC CO2 pri 35 °C in 7,5 MPa. ........................................................................................................ 27

Tabela 4.2: Doseženi izkoristki po 24 h in 48 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK z različnimi koncentracijami molekularnih sit v SC CO2 pri 35 °C in 7,5 MPa. ... 29

Tabela 4.3: Doseženi izkoristki po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK z različnimi hitrostmi mešanja v SC CO2 pri 35 °C in 7,5 MPa. ......................... 30

Tabela 4.4: Doseženi izkoristki po 24 h in 48 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK po večkratni uporabi imobiliziranega encima v SC CO2 pri 35 °C in 7,5 MPa. ..... 31

Tabela 4.5: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK v SC CO2, 35 °C in pri različnih tlakih. .............................................. 34



Tabela 4.8: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK ob dodatku n-heksana v SC CO2, 35 °C in pri različnih tlakih. ........... 42

Tabela 4.9: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK ob dodatku n-heksana v SC CO2, 55 °C in pri različnih tlakih. ........... 44

Tabela 4.10: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 1 h in 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK ob različnih dodanih koncentracijah CYPHOS IL-201 v SC CO2, 65 °C in 10 MPa. ............................................................................. 48

Tabela 4.11: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 1 h in 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri različnih temperaturah v SC CO2, 10 MPa in ob dodatku 18,3 % CYPHOS IL-201. .................................................................. 52

XV

Tabela 4.12: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri različnih tlakih v SC CO2, 65 °C in ob dodatku 18,3 % CYPHOS IL-201. ............................................................................................................... 53

Tabela 4.13: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri različnih tlakih v SC CO2, 155 °C in ob dodatku 18,3 % CYPHOS IL-201. ........................................................................................................... 56

Tabela 4.14: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK v SC CHF3, 35 °C in pri različnih tlakih.............................................. 62



Tabela 4.17: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri različnih temperaturah v SC CHF3, 10 MPa in ob dodatku 11 % n-heksana. ........................................................................................................ 69

Tabela 4.18: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri različnih tlakih v SC CHF3, 55 °C in ob dodatku 11 % n-heksana. 72

Tabela 4.19: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 1 h in 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK v SC CHF3, 10 MPa, 55 °C in različnih koncentracijah CYPHOS IL-201. ........................................................................................... 74

Tabela 4.20: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 1 h in 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri dveh različnih temperaturah v SC CHF3, 10 MPa in ob dodatku 44 % CYPHOS IL-201. ..................................................................... 77

Tabela 4.21: Doseženi izkoristki in produktivnosti po 1 h in po 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK pri tlakih v SC CHF3, 55 °C in ob dodatku 44 % CYPHOS IL-201. ........................................................................................................... 81

Tabela 4.22: Doseženi izkoristki po 1 h in 24 h reakcije encimske esterifikacije D,L-MK z in brez dodatka encima v SC CHF3 pri 10 MPa, 55 °C in ob dodatku 44 % CYPHOS IL-201. ........................................................................................... 83

Tabela 4.23: Antibakterijska aktivnost testiranih vzorcev na izbrane bakterije. ................. 84

Tabela 4.24: Antiglivna aktivnost testiranih vzorcev na izbrane glive. .............................. 87

XVI

UPORABLJENE KRATICE

A. flovus Aspergillus flovus A. niger Aspergillus niger Asp aspartat B n-butanol B. cereus Bacillus cereus BL n-butil laktat B. megaterium Bacillus megaterium C. antarctica Candida antarctica CLEAS zamreženi encimski skupki C. rugosa Candida rugosa D,L-MK D,L-mlečna kislina DNK deoksiribonukleinska kislina E. coli Escherichia coli EPA Ameriška organizacija za okolje FDA Zvezna agencija za hrano in zdravila FT-IR Fourier transformirana infrardeča spektroskopija GC plinska kromatografija Glu glutamat GRAS splošno priznane kot varne His histidin HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti IL ionska tekočina IUB Mednarodno združenje za biokemijo LE laktatni estri MF A mobilna faza A MF B mobilna faza B MK mlečna kislina MK1 monomera mlečne kisline MK2 dimera mlečne kisline MK3 trimera mlečne kisline M. miehei Mucor miehei M. javanicus Mucor javanicus P. camambertii Penicillium camambertii P. cyclopium Penicillium cyclopium P. fluorescens Pseudomonas fluorescens PMK polimer mlečne kisline S. aereus Staphlococcus aereus S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SCF superkritični fluid SC C2H6 superkritični etan SC CHF3 superkritični trifluorometan SC CO2 superkritični ogljikov dioksid SD standardni odklon SEM vrstična elektronska mikroskopija

XVII

Ser serin T. viride Trichoderma viride U$ Ameriški dolar ZDA Združene države Amerike

XVIII

UPORABLJENI SIMBOLI

A absorbanca vzorca (brezdimenzijsko) cCYPHOS IL-201 koncentracija ionske tekočine % cE koncentracija encima % cHEKSAN koncentracija heksana % cmol.sit koncentracija molekularnih sit % Mw molska masa g/mol masa n-butil laktata mg masa encima na začetku reakcije g masa D,L-mlečne kisline na začetku reakcije g n hitrost mešanja obr/min množina n-butil laktata mmol množina monomere D,L-mlečne kisline mmol

p tlak MPa pc kritični tlak MPa pmax maksimalni tlak MPa qBL produktivnost pri sintezi n-butil laktata (mgBL/gMK)/gE T temperatura °C Tc kritična temperatura °C Tmax maksimalna temperatura °C t čas h vi začetna hitrost sinteze n-butil laktata ((mgBL/gMK)/gE)/h Vmax maksimalni volumen mL wMK1 vsebnost monomere D,L-mlečne kisline % wMK2 vsebnost dimere D,L-mlečne kisline % wMK3 vsebnost trimere D,L-mlečne kisline % wVODA vsebnost vode % YMK izkoristek D,L-mlečne kisline %

UVOD 1

1 UVOD

S procesom encimske esterifikacije smo sintetizirali ester mlečne kisline. Estri mlečne kisline oz. laktatni estri (LE) so med najbolj pomembnimi derivati mlečne kisline.[1] LE se vedno bolj pogosto uporabljajo v prehrambeni (naravne arome), kozmetični (dišave) in farmacevtski (farmacevtski pripravki) industriji, saj so higroskopni in imajo emulgatorne lastnosti.[1,2] Estri mlečne kisline se uporabljajo v farmacevtski in kozmetični industriji, saj za razliko od proste mlečne kisline (MK) ne dražijo človeške kože.[3] Z odličnimi lastnostmi se LE, vključno z n-butil laktatom (BL), uporabljajo kot topila.[4]

Na področju sinteze LE so v ospredju sinteze v organskih topilih, katalizirane z lipazami, saj imajo številne prednosti v primerjavi s konvencionalnimi kemijskimi metodami. Slabost encimsko katalizirane sinteze v organskem topilu je omejena uporaba strupenih organskih topil v prehrambeni in farmacevtski industriji, kjer celo sledovi nekaterih topil v produktih niso dovoljeni.[5] Zanimivo alternativo organskim topilom predstavljajo superkritični fluidi (SCFs), predvsem superkritični ogljikov dioksid (SC CO2).[6–8] Prednosti le tega so netoksičnost, nevnetljivost in nizka cena ter nizka kritična temperatura (31,1 °C) in tlak (7,38 MPa). Enostavno ga lahko ločimo iz reakcijske zmesi in ne pušča sledov v produktu, kar je še posebnega pomena v prehrambeni in farmacevtski industriji. Ker so difuzivnosti visoke, viskoznosti in površinske napetosti pa nizke, nastopijo nižje notranje omejitve prenosa snovi za heterogene kemijske in biokemijske katalizatorje, zaradi česar so reakcijske hitrosti višje. Topnost substratov v SCF je močno povezana z gostoto SCF, ki jo lahko spreminjamo z majhnimi spremembami temperature in/ali tlaka.[6] Pri visokih tlakih porast v temperaturi navadno vodi k večji topnosti substance v SCF, kajti z naraščanjem parnega tlaka komponent, ki jih želimo raztopiti, premagamo redukcijo v gostoti.[9]

Prav tako kot SCFs so tudi ionske tekočine (ILs) zanimiva alternativa organskim topilom.[10] ILs so razred spojin, ki so vsebolj zanimive od njihovega odkritja leta 1914.[11] Leta 1980 je bilo le nekaj patentnih prijav na temo ILs, v letu 2000 se je število patentnih prijav povečalo na 100 in na koncu leta 2004 je bilo teh prijav več kot 800. To je jasna indikacija visoke uporabnosti ILs na akademskem področju in v industriji.[12] So soli, sestavljene iz ionov, ki so tekočine pri sobni temperaturi in imajo lastnosti, kot so nizek parni tlak, nevnetljivosti, široko elektrokemično območje, visoko kemijsko in toplotno stabilnost. Te zanimive lastnosti ILs so bistvenega pomena, saj se termodinamika in kinetika reakcij, ki se izvajajo v ILs, razlikujeta od tistih v običajnih molekularnih topilih.[11]

Za sintezo naravnih in farmacevtskih produktov, finih kemikalij ter dodatkov v prehrambeni industriji se v zadnjem času vse pogosteje uporabljajo biokatalizatorji - encimi. Ker je področje biokatalize čedalje bolj raziskano, je bilo ugotovljeno, da encimi kot biokatalizatorji niso tako občutjivi, kot je bilo sprva pričakovano. Encimi niso topni v SCFs, zato so encimsko katalizirane reakcije v SCFs vedno heterogene. Imobilizirani encimi imajo vrsto prednosti pred ne-imobiliziranimi encimi. Ena izmed teh je ta, da jih lahko večkrat ponovno uporabimo in s tem znižamo stroške proizvodnega procesa.[13] Hasegawa idr. so ugotovili, da je najbolj aktiven in stabilen encim za encimsko esterifikacijo MK lipaza iz Candida antarctice (C. antarctica).[3] Publikacije o encimsko katalizirani reakciji MK opisujejo v večini primerih sintezo etil laktata. V manjši meri je pri teh sintezah produkt BL.

2 UVOD

V industriji je dandanes v ospredju varstvo okolja. BL je biološko razgradljivo zeleno topilo s številnimi aplikacijami (nadomešča halogena topila in strupena topila iz nafte).[14] Prizadevamo si razviti okolju prijazne tehnologije, zato smo za sintezo BL izvedli encimsko katalizirano esterifikacijo D,L-mlečne kisline (D,L-MK) z n-butanolom v SCF uspešno uporabili kot biokatalizator imobilizirano lipazo B iz C. antarctice (Novozyme 435). D,L-MK in n-butanol sta okolju prijazna materiala, tako kot tudi encim. Reakcije smo izvajali v visokotlačnem mešalnem šaržnem reaktorju v treh različnih SCFs (SC CO2, superkritični trifluorometan (SC CHF3) in superkritični etan (SC C2H6)). Najbolj podrobno smo raziskali sintezo BL v SC CO2. Za encimsko esterifikacijo D,L-MK z n-butanolom v SC CO2 in SC CHF3 smo določili vpliv tlaka, temperature in koncentracijo n-heksana na izkoristek D,L-MK, produktivnost in začetno hitrost tvorbe estra BL. Dodatno smo še v SC CO2 proučili vpliv razmerja substratov (D,L-MK:n-butanol), koncentracije molekularnih sit, hitrosti mešanja in večkratne uporabe encima na izkoristek D,L-MK. V nadaljevanju smo reakcijski zmesi dodali IL (CYPHOS IL-201) in določili optimalne reakcijske parametre (vpliv koncentracije IL CYPHOS IL-201, temperature, tlaka in dodatek encima na potek reakcije) za encimsko katalizirano esterifikacijo D,L-MK v SC CO2 in SC CHF3. Proučevali smo še antimikrobno aktivnost encimsko sintetiziranega BL na različne testne mikroorganizme.

TEORETSKE OSNOVE 3

2 TEORETSKE OSNOVE

2.1 Biokataliza

Biokataliza je uporaba naravnih katalizatorjev, kot so encimi, za izvajanje kemijske transformacije organskih spojin. Kot biokatalizator se uporabljajo izolirani encimi in encimi, ki se nahajajo v živih celicah.[15] V zadnjih 30 letih se je obseg biokatalize razširil zaradi napredka na večih tehnoloških področjih. Razvite so bile raznovrstne tehnike, kot so strukturna izboljšava encima (npr. encimski inženiring), inženirski pristop (npr. uporaba ILs, SCFs) in fizikalna stabilizacija (npr. imobilizacija, zamreženi encimski skupki (CLEAS)). Te tehnike so močno orodje za izboljšanje biotransformacij in za sintezo novih proizvodov. Encimi imajo zapletene molekularne strukture kar pomeni drago pridobivanje le teh. Poleg tega je eden glavnih problemov encimske biokatalize nizka operativna stabilnost. Veliko dodatne strategije je bilo razvite, da se je izboljšala zmogljivost encimov. Encimski inženiring temelji bodisi na fizikalni modifikaciji proteina ali deoksiribonukleinske kisline (DNK). Najnovejši razvoj proizvodnje encimov z visokotehnološko fermentacijo omogoča proizvodnjo cenejših in odpornejših encimov za industrijsko uporabo. To odpira povsem nove priložnosti uporabe na področju hrane in pralnih sredstev, kot tudi za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, kozmetike, kmetijskih kemikalij in finih kemikalij. Na stotine encimov se uporablja v industrijske namene od tega jih je več kot polovica iz gliv, več kot tretjina iz bakterij in preostali izvirajo iz živali (8 %) in rastlin (4 %). Več kot 500 komercialnih izdelkov je sintetiziranih z uporabo encimov. Industrija encimskega trga je dosegla 1,6 bilijonov U$ v letu 1998 in v letu 2009 5,1 bilijona U$. V letih 1980 in 1990 so mikrobni encimi nadomestili mnogo rastlinskih in živalskih encimov in so našli uporabo v industriji hrane, detergentov, tekstila, usnja, celuloze, papirja in diagnostike.[16]

Encimsko inženirstvo uporablja računalniške tehnike, usmerjeno mutagenezo in direktno (molekularno) evolucijsko tehniko kot močno orodje za proizvodnjo encimov z optimiziranimi funkcijami, kot so aktivnost, selektivnost (enantio- , regio- in kemo-), stabilnost, specifičnost do substrata, topnosti v topilih in pH optimum. Ti pristopi so pomembni za proizvodnjo biokatalize v velikem obsegu.[16]

2.1.1 Encimi

Encimi (grško ενζυμον - v kvasu) so snovi, ki katalizirajo kemijske reakcije. Skoraj vsi znani encimi so proteini (beljakovine), čeprav nekateri vsebujejo nukleinske kisline. Encimi so na voljo v vsaki živi celici v živih rastlinah in živalih, vključno s človeškim telesom. Skoraj vsi procesi v biološki celici potrebujejo encime. Čeprav so encimi običajno veliki jih je le majhen delež (okoli 3 do 4 aminokisline) v bližini ali v neposrednem stiku s substratom in so neposredno vključeni v katalizo. Del encima, ki vsebuje katalitične ostanke in je vezan na substrat, je znan kot aktivno mesto.

Zaporedje aminokislin v encimu določa proteinsko strukturo, ki je bistvenega pomena za encimsko aktivnost in specifičnost. Če je encim izpostavljen spremembam, kot so nihanja temperature ali pH, se lahko proteinske strukture spremenijo (denaturirajo) in izgubijo svojo katalitično sposobnost. Denaturacija je včasih, vendar ne vedno, reverzibilna.[17]

4 TEORETSKE OSNOVE

Encimi so biokatalizatorji z odličnimi lastnostmi, kot so visoka aktivnost, specifičnost in selektivnost in lahko katalizirajo pri blagih in okolju prijaznih pogojih.[18] Encimi so razvrščeni po podatkih Mednarodnega združenja za biokemijo (IUB) v šest glavnih skupin glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo:

(i) oksidoreduktaze (dehidrogenaze, reduktaze, oksidaze, oksigenaze) – katalizirajo prenos elektronov iz ene molekule (reducent) na drugo (oksidant);

(ii) transferaze (kinaze, aminotransferaze) – katalizirajo prenos funkcionalne skupine iz ene molekule (donor) na drugo (akceptor);

(iii) hidrolaze (peptidaze, glikozidaze, lipaze, fosfataze) – katalizirajo reakcijo hidrolize;

(iv) liaze (sintaze, dekarboksilaze, hidroliaze) - katalizirajo prekinitve različnih kemijskih vezi z drugimi ali s hidrolizo ali z oksidacijo, pogosto tvorijo novo dvojno vez ali novo ciklično strukturo;

(v) izomeraze (izomeraze, mutaze) – katalizirajo strukturno prerazporeditev izomerov;

(vi) ligaze (sintetaze, karboksilaze, polimeraze) – katalizirajo spojitev dveh velikih molekul s tvorbo nove kemijske vezi.[16,17]

Najbolj raziskani so encimi iz skupine hidrolaz (lipaze), sledijo oksidoreduktaze. Encimi iz preostalih skupin pa so vključeni v zelo majhen del raziskav.[18]

2.1.1.1 Lipaze

Lipaze ali triacilglicerol-hidrolaze so vodotopni encimi, ki katalizirajo hidrolizo estrske vezi.[17] Lipaze so encimi, ki v naravi katalizirajo hidrolizo olj in maščob.[19] So zelo razširjeni encimi s precejšnjim fiziološkim pomenom in opravljajo ključne naloge v prebavi, prenosu in predelavi dietnih lipidov v večini živih organizmov. Lahko so pridobljene v zadovoljivih donosih iz živalskih, rastlinskih in naravnih virov ali rekombinantnih mikroorganizmov.[17,20] V obilju jih lahko najdemo v bakterijah, glivah in kvasu. Tabela 2.1 prikazuje nekaj primerov lipaz dobljenih iz mikroorganizmov.[17]

Tako kot skoraj vsi encimi so tudi lipaze kroglaste/globularne beljakovine/proteini. Večina lipaz je zelo velika v primerjavi s substratom s katerim reagira. Lipaze so dolge, linearne verige aminokislin, ki dajejo tridimenzionalni produkt. Skupna značilnost vseh lipaz je, da je aktivna stran encima sestavljena iz treh aminokislin: serina (Ser), aspartata (Asp) ali glutamata (Glu) in histidina (His). Večina lipaz ima površinsko vijačnico, ki zajema aktivno mesto lipaze.[17]

Lipaze se vse bolj uporabljajo v organski kemiji zaradi svojih odličnih lastnosti. Prva izmed teh lastnosti je razpoložljivost lipaz kar jih naredi zelo privlačne. Lipaze je mogoče dobiti z izolacijo iz več mikroorganizmov (Tabela 2.1) in jih je danes mogoče kupiti od številnih komercialnih ponudnikov. S tehnikami rekombinantne DNK je možno dobiti lipaze zelo visoke čistosti, zaradi tega so idealne za uporabo v organski kemiji. Druga prednost lipaz je njihova visoka stabilnost. Veliko lipaz prenese visoko temperaturo in izpostavljenost več organskim topilom. Lipaze se lahko uporabijo kot biokatalizator za sintezo produktov pri katerih se lahko uporabi široka paleta nenaravnih substratov. Poleg tega lipaze katalizirajo na regio- in stereoselektivni način. Lipaze iz različnih virov imajo različne enantioselektivne lastnosti in različno specifičnost do substrata. Zato je običajno potrebno izbrati pravi encim za specifično sintezo iz velike baze lipaz. Končna prednost lipaz je njihova sposobnost, da katalizirajo več različnih vrst reakcij.[17]

TEORETSKE OSNOVE 5

Tabela 2.1: Nekaj primerov lipaz pridobljenih iz mikroorganizmov.[17]

Vir Rod Vrsta

bakterije

Bacillus B. megaterium

B. cereus

Staphylococcus S. aereus

Pseudomonas P. fluorescens

glive

Aspergillus A. flovus

A. niger

Penicillium P. cyclopium

P. camambertii

Mucor M. miehei

M. javanicus

kvasovke Candida C. rugosa

C. antarctica

Lipaze so uporabljene v številne namene, na primer kot dodatek detergentom, pri predelavi hrane ali pri sintezi kozmetike, farmacevtskih izdelkov in raznih kemikalij. Vendar je treba dodati, da detergent za perilo vsebuje lipazo, ki mora prenašati pralne pogoje (30-60 °C), proteaze in površinsko aktivne snovi (ki so sestavine številnih čistilnih sredstev). Pri predelavi hrane z visoko vsebnostjo maščob so bile uporabljene lipaze za nadomestitev nezaželene maščobe.[17,21] Undurraga idr. so uporabili lipazo Lipozyme od podjetja Novo-Nordisk za reakcijo transesterifikacije s katero so zamenjali palmitinsko kislino v palmovem olju s stearinsko kislino za proizvodnjo nadomestka kakavovega masla.[17,22] Kozmetična, farmacevtska in kemična industrija uporabljajo lipaze kot katalizatorje za proizvodnjo enantioselektivnih produktov.[17]

Čeprav so bile lipaze raziskane že pred desetletji, se je v zadnjih letih razširila njihova uporaba v oleokemijski in mlečni industriji. Lipaze lahko katalizirajo veliko sintetičnih organskih reakcij. Poleg tega so lipaze uporabljene pri pripravi mnogih estrov arom in dišav pod pogoji, ki so blažji od tistih uporabljenih v klasični industriji. Robustna lipaza B iz C. antarctice, uporabljena v organskih sintezah, kaže visoko katalitično učinkovitost zlasti pri resoluciji kiralnih estrov in aminov dobljenih z esterifikacijo, transesterifikacijo, aminolizo in amonolizo vključujoč regio-, kemo- in geometrijsko selektivnost.[23]

Reakcije esterifikacije, katalizirane z lipazami, so med najbolj pomembnimi biokemijskimi procesi v industriji. Lipaze katalizirajo reakcije hidrolize, kot tudi reakcije esterifikacije. Encimsko katalizirana esterifikacija je pridobila veliko pozornosti v številnih aplikacijah predvsem zaradi pomena pridobljenih proizvodov. V zadnjem desetletju so esterifikacije katalizirane z lipazami pritegnile raziskovalni interes, zaradi povečane uporabe organskih estrov v biotehnologiji in kemični industriji. Lipaze so zelo stabilni encimi, ki ostanejo aktivni tudi v neugodnih razmerah. Kot pomebni biokatalizatorji se lipaze uporabljajo v prehrambeni in farmacevtski industriji in drugih tehnoloških procesih.[20,24] Fiziološka vloga lipaz je kataliza tri-gliceridov v di- ali mono-gliceride, glicerol in maščobne kisline.

6 TEORETSKE OSNOVE

Številne lipaze ne morejo hidrolizirati estrskih vezi na sekundarnih položajih, kot jih lahko večina mikrobnih lipaz. Medtem ko druga skupina teh encimov hidrolizira primarne in sekundarne estre. Tretja skupina lipaz cepi estersko vez posameznih vrst maščobnih kislin.[24,25] Lipaze, ki so Ser hidrolaze, imajo precejšnji industrijski potencial in katalizirajo reakcije esterifikacije, interesterifikacije in transesterifikacije v nevodnih medijih (organska topila in SCF). Lipaze katalizirajo tudi reakcije alkoholize, acidolize in aminolize kot tudi hidrolizo organski karbonatov.[20,24] Kljub temu je treba poudariti, da na kateri koli postopek (vključno s sintezo), ki ga katalizira lipaza, vplivajo stabilnost lipaze, selektivnost, prenos snovi in drugi dejavniki.[24,26] Ena izmed teh lastnosti vpliva na izbiro oblike lipaze uporabljene kot biokatalizator. Lahko izbiramo med različnimi oblikami lipaz, to so: (a) znotrajcelične lipaze (lipaze so znotraj gostiteljske celice), (b) tekoče lipaze (lipaze raztopljene v vodnih raztopinah) in (c) imobilizirame lipaze (lipaze imobilizirane na trdnih matricah) bodisi z zamreženjem, inkapsulacijo, adsorbcijo in/ali kovalentno vezavo na matrico.[24]

Med pomembnimi faktorji, ki vplivajo na dobit estra z esterifikacijo katalizirano z lipazami, so koncentracija encima in substratov, molsko razmerje substratov, pH reakcijskega medija, tempretura, hitrost mešanja in vsebnost vode.[24]

Encimi v prosti, naravni obliki imajo odlične katalitične lastnosti, vendar pa večina od njih ne kaže teh značilnosti v organskih topil in zlahka denaturira pri industrijskih pogojih (visoke temperature, vpliv topil, mehanske sile, itd.). Ponovna uporaba encimov iz reakcijskih zmesi in ločitev encimov iz substratov in produktov je na splošno težak postopek. Vse te pomanjkljivosti povzročajo razmeroma redko uporabo teh biokatalizatrojev v industriji. Pomemben način za izboljšanje predstavlja imobilizacija encima. Imobilizacija encima je lokalizacija encima, tj. omejena mobilnost encima. Nekateri od prvih poskusov so bili opisani v prejšnjem stoletju. Vendar se je adsorpcija encimov na aktivno oglje izkazala za zelo nestabilno. Okoli leta 1950 je več skupin raziskovalo imobilizacijo encimov na druge nosilce. Georg Manecke je bil eden izmed prvih, ki je uspešno pripravil relativno stabilne sisteme beljakovin na polimernih nosilcih. Prve industrijske aplikacije, ki so uporabljale imobilizirane encime, so bile v proizvodnji optično čistih aminokislin in pri hidrolizi penicilina G (prvi odkriti naravni antibiotik). Od takrat je bilo izvedenih veliko raziskav.[17,27–29]

Glavna prednost imobilizacije je enostavna odstranitev encima po reakciji. To omogoča ponovno uporabo encimov tudi v drugi vrsti reakcije. Druga prednost je povečana aktivnost in predvsem povečana stabilnost encima. Nekateri imobilizirani encimi [30,31] kažejo večjo odpornost na temperaturo in do organskih topil.[17]

Druge lastnosti encima, ki določajo parametre imobiliziranega encima, so tip reakcije in kinetika reakcije, ki jo encim katalizira. Specifična aktivnost, kinetični parametri za aktivacijo in inhibicijo, pH, temperatura, topila in nečistoče, imajo prav tako velik vpliv na imobilizacijo encima. Značilnosti nosilnega materiala tudi vplivajo na lastnosti imobiliziranega encima. Eden od najbolj pomembnih značilnosti nosilca je kemijska struktura, ki določa interakcije z encimi. Če je nosilni material zelo porozen, igrata velikost por in porazdelitev velikosti por pomembno vlogo pri določanju lastnosti imobiliziranih encimov. Majhna velikost por lahko povzroči omejitev difuzije in povzroči strukturno preurejenost encimov in kasneje neaktivnost. Vendar pa lahko zelo velike pore encima povzročijo skupke encimov in s tem izgubijo aktivnost. Mehanske lastnosti nosilnih materialov so ključnega pomena pri uporabi imobiliziranega encima. Ko je imobiliziran encim uporabljen v mešalnem reaktorju, ima lahko drugačne lastnosti, kot takrat ko je uporabljen v koloni. V mešalnem reaktorju, morajo biti nosilni materiali odporni na abrazijo, medtem ko pri uporabi v koloni na upor pretoka. Velikost nosilnih delcev je prav tako pomembna.[24]

TEORETSKE OSNOVE 7

2.1.1.2 Lipaza B iz Candida antarctice

Lipaza B iz C. antarctice je najbolj pogosto uporabljena lipaza v biokatalizi.[19,32,33] Je vsestransko uporabljen encim za enantio- in regioselektivne transformacije v mnogih nizko molekularnih in polimernih substratih. Ugotovljeno je bilo, da ima širok spekter katalitične aktivnosti za kemijske sinteze. Ta encim ima številne prednosti: (i) stabilnost v kislem območju pH, (ii) kakovost končnega produkta, (iii) manj stranskih produktov in (iv) uporabo pri visokih temperaturah.

Struktura lipaze B iz C. antarctice je bila pojasnjena leta 1994.[34] Sestavljena je iz 317 aminokislinskih ostankov (33 273 Da). Lipaza B iz C. antarctice je globularna α/β vrsta proteina okvirnih dimenzij 30 Å x 40 Å x 50 Å, merjeno z rentgensko kristalografijo. Slika 2.1 prikazuje strukturo in površino lipaze B iz C. antarctice. Iz struktur ugotovljenih za druge lipaze, lipaza B iz C. antarctice najverjetneje vsebuje Ser-His-Asp/Glu katalitsko triado (aktivno mesto je poudarjeno na Sliki 2.1).

Slika 2.1: Struktura lipaze B iz C. antarctice.[35]

V zadnjem času je bil ta biokatalizator predmet več strukturnih sprememb s pomočjo genetskega inženiringa, da bi se izboljšala selektivnost [17,36], in za ustvarjanje novih sintetičnih aplikacij.[17,32,37] Zaradi številnih prednosti uporabe imobiliziranega encima namesto prostega, so se mnogi raziskovalci odločili za izboljšanje lastnosti lipaze B z encimsko imobilizacijo.[38] Lipaza B iz C. antarctice, imobilizirana na makroporozne akrilne polimerne smole (VP OC 1600, Bayer), je najpogosteje uporabljena lipaza za sintezo specifičnih kemijskih proizvodov. Komercialno dostopna pripravka imobiliziranega encima sta: Novozyme 435 (Novozymes A/S) in Chirazyme (Roche Molecular Biochemicals).[17,39]

2.2 Superkritični fluidi

V zadnjih nekaj letih je izredno naraslo zanimanje za uporabo SCFs, predvsem kot topila, v industrijskih procesih in znanstvenih raziskavah. Leta 1985 so bili SCFs prvič raziskani

8 TEORETSKE OSNOVE

kot nevodna topila za encimsko katalizirane reakcije.[40] Konvencionalna topila lahko zamenjamo s SCFs in s tem povečamo hitrost reakcije.

Kadar sta tlak in temperatura plina nad kritičnima vrednostnima (T > Tc, p > pc), govorimo o plinu v superkritičnem stanju. Slika 2.2 prikazuje fazni p – T diagram za čisto komponento. Iz faznega diagrama za čisto komponento so razvidna tri področja (trdno, tekoče in plinasto), ki jih delijo tri krivulje. Dve fazi sta v ravnotežju na črti, vse tri faze pa so v ravnotežju v trojni točki. Nad kritično točko je topilo v superkritičnem stanju in ga opišemo kot SCF. Z majhnimi spremembami tlaka in/ali temperature v tem območju se termofizikalne lastnosti bistveno spremenijo.[41]

Slika 2.2: Fazni diagram za čisto komponento.

SCF imajo gostoto reda velikosti tekočin in s tem moč dobrega raztapljanja ter dobro stisljivosti, ker imajo viskoznost reda velikosti plinov. Difuzifnost je višja od difuzivnosti tekočin in nižja od difuzivnosti plinov. Tako nizka viskoznost in visoka difuzivnost omogočata boljše transportne lastnosti fluida in s tem boljše reakcijske pogoje.[42]

V Tabeli 2.2 so navedeni kritični pogoji za različne spojine, katere delimo na anorganske in organske in jih lahko uporabljamo kot SCFs.

SCFs se največkrat uporabljajo kot medij pri ekstrakcijah v prehrambeni, kozmetični, farmacevtski in kemijski industriji, za kromatografske postopke, v industrijskem merilu pa tudi za izolacijo snovi iz trdnih ali tekočih zmesi, kot medij za kemijske in biokemijske reakcije in kot topilo v procesih mikronizacije in kromatografije.[41,46,48] Uporaba SCFs za kemijske in biokemijske reakcije ima vrsto prednosti iz okoljevarstvenega, zdravstvenega, varstvenega, procesnega in kemijskega vidika.[41]

Kadar izvajamo encimske reakcije v SCFs moramo pri načrtovanju encimsko kataliziranih reakcijah upoštevati številne parametre, ki lahko vplivajo na aktivnost in stabilnost encimov. Stabilnost in aktivnost encima sta odvisni od vrste encima, vrste SCF, vsebnosti vode v reakcijski zmesi in od temperature in tlaka v reakcijskem sistemu.[41]

Tabela 2.3 prikazuje fizikalno-kemijske lastnosti nepolarnega ogljikovega dioksida (CO2) in polarnega trifluorometana (CHF3). Uporaba SC CO2 ali SC CHF3 kot reakcijskega medija omogoča enostavno ločitev le-tega od reakcijske zmesi po končani reakciji, saj sta CO2 in CHF3 pri standardnih pogojih v plinastem stanju. To je še posebnega pomena v prehrambeni in farmacevtski industriji.

TEORETSKE OSNOVE 9

Tabela 2.2: Podatki o kritičnih temperaturah in tlakih za nekatere vrste superkritičnih fluidov.[41,43,44]

Anorganske spojine Organske spojine

Snov Molekulska

formula Tc

(°C) pc

(MPa) Snov

Molekulska formula

Tc (°C)

pc (MPa)

ogljikov dioksid

CO2 31,1 7,38 trifluorometan CHF3 25,9 4,82

vodikov klorid

HCl 51,5 8,26 metan CH4 -82,6 4,60

vodikov bromid

HBr 90,0 8,55 eten C2H4 9,2 5,04

voda H2O 374,0 22,06 etan C2H6 32,2 4,87

amoniak NH3 132,4 11,32 propen C3H6 91,8 4,60

didušikov oksid

N2O 36,4 7,25 propan C3H8 96,7 4,25

žveplov heksafluorid

SF6 45,5 3,76 metanol CH3OH 239,5 8,08

ksenon Xe 16,6 5,83 izopropanol C3H7OH 235,0 4,70

Tabela 2.3: Fizikalno-kemijske lastnosti ogljikovega dioksida (CO2) in trifluorometana (CHF3).[45–47]

Kemijska formula CO2 CHF3

Molekulska masa (g/mol) 44,01 70,01

Barva brez brez

Vonj brez rahlo eterični vonj pri

koncentraciji nad 20 %

Gorljivost ni gorljiv ni gorljiv

Tališče (°C) -56,6 -155,2

Vrelišče (°C) -78,5 -82,1

Temperatura trojne točke (°C) -56,6 -155,1

Kritična temperatura (°C) 31,1 25,9

Kritični tlak (MPa) 7,38 4,82

Kritična gostota (kg/m3) 464 525

Polarizabilnost (Ǻ3) 2,65 2,65

SC CO2 nudi številne prednosti pred konvencionalnimi organskimi topili in pred drugimi SCFs. Njegove glavne prednosti se kažejo v tem, da ima sorazmerno nizko Tc in pc, ni

10 TEORETSKE OSNOVE

toksičen, ni vnetljiv, ne povzroča korozije, je fiziološko neškodljiv, deluje baktericidno in je dostopen v velikih količinah po nizki ceni.[41,46,49]

Polarnost SC CHF3 se zelo spreminja s tlakom in temperaturo.[50] Ker CHF3 nima bromidnih ali kloridnih atomov, ne spada med florokarbonate, ki povzročajo povečevanje ozonske luknje in ga zato lahko uporabljamo v postopkih recikliranja in obnavljanja.[51]

2.3 Ionske tekočine

Več kot dve desetletji se je na široko razpravljalo in izvajalo biokatalizo v vodnih medijih namesto v nevodnih medijih. V zadnjih letih se je pojavil nov privlačen nevodni reakcijski medij za biokatalizo in sicer ILs.[52] Z raznoliko paleto uporabe so ILs v zadnjih desetletjih pritegnile vedno več zanimanja. Na razpolago je več vrst ILs, ki so se razširile na nove družine in generacije ILs z bolj specifičnimi in ciljnimi lastnosti.[11] ILs so na splošno priznana kot zelena topila zaradi zanemarljivega parnega tlaka. Uporaba ILs kot medija za biokatalitične reakcije pridobiva na vedno večjem pomenu ter kaže izjemne rezultate. V zadnjem desetletju se ILs vedno več uporabljajo kot nadomestilo za tradicionalna organska topila v kemijskih reakcijah. ILs so organske soli, ki so tekočine pri sobni temperaturi. Za razliko od običajnih topil, ki so lahko opisana kot molekularne tekočine, so ILs sestavljene iz ionov. Njihove edinstvene lastnosti, kot so nehlapnost, nevnetljivost, odlična kemijska in termična stabilnost, so dobra alternativa organskim topilom. ILs imajo nizko tališče (

TEORETSKE OSNOVE 11

ILs se običajno ne mešajo z organskimi topili (heksan ali eter). Mešljive so s polarnimi topili, kot so alkoholi s krajšo verigo, ketoni, metilen kloridom in tetrahidrofuranom.[54] Tvorijo dvofazni sistem v primeru, ko se ne mešajo z vodo ali organskimi topili. ILs se ne mešajo s SC CO2, vendar je le-ta dobro topen v nekaterih ILs.[55]

Zaradi pozitivno fizikalno-kemijskih lastnosti in širokega spektra uporabe v kemiji, biotehnologiji, kemijskem in elektrokemijskem inženirstvu, je v zadnjih letih naraslo zanimanje za ILs.[56] Glavna področja uporabe ILs so kot zamenjava topila pri čiščenju plinov, heterogena in homogena kataliza in reakcije v bioloških medijih. Uporabnost ILs nam prikazuje Slika 2.4.[57]

ILs se lahko uporabljajo za različne vrste encimsko kataliziranih reakcij, kot so esterifikacija, transesterifikacija, hidroliza, alkoholiza, …, in pri tem njihova uporaba nudi različne prednosti.[41] Glavne prednosti so zanemarljiv parni tlak in nevnetljivost ILs [58], višje reakcijske hitrosti [59,60], izboljšana selektivnost biokatalizatorja [56] ter lažja separacija biokatalizatorja iz reakcijske zmesi.[61] Ker so ILs precej dražja topila v primerjavi s konvencionalnimi organskimi topili, je njihova zelo pomembna lastnost tudi ta, da jih lahko recikliramo in večkrat uporabimo.[54] Pri načrtovanju encimsko kataliziranih reakcijah v ILs moramo biti pozorni na številne parametre, ki lahko vplivajo na aktivnost, selektivnost in stabilnost encimov v ILs.[41,52]

Tabela 2.4: Primeri anionov, ki skupaj s tetraalkifosfonijevim kationom tvorijo ionske tekočine.[53]

tetrafluoroborat dicianamid bis(trifluorometansulfonil)-

amid

tozilat karboksilat fosfinat

dialkilfosfat alkilsulfat heksafluorofosfat

12 TEORETSKE OSNOVE

Tabela 2.5: Lastnosti CYPHOS IL-201.[53]

Kemijsko ime tributil(tetradecil)fosfonijev dodecilbenzensulfonat

Tržno ime CYPHOS IL-201

Molekulska formula C44H85O3PS

Kemijska formula [(C4H9)3(C14H29)P]+[(C12H25C6H4SO3]

-

Molska masa (g/mol) 725,18

Agregatno stanje tekoče

Potencialna uporaba separacija organskih materialov iz vode

Barva svetlo rumena

Topnost v vodi netopen

Slika 2.4: Uporabnost ionskih tekočin.[57]

2.4 Laktatni estri

2.4.1 Lastnosti in uporaba

MK (2-hidroksipropanojska kislina) je najpogosteje najdena karboksilna kislina v naravi. Je šibka kislina s tremi ogljikovimi atomi s kemijsko formulo C3H6O3.[62] Prvi jo je izoliral švedski znanstvenik Sheele leta 1780. Leta 1881 pa je bila prvič proizvedena v komercialne namene.[63] MK je kiralna spojina in ima dve optični izomeri (Slika 2.5).[62] Uporablja se v živilski, farmacevtski in kozmetični industriji kot konzervans, vlažilno sredstvo in emulgator [3] ter v tekstilni in usnjarski industriji.[63]

Racemat MK (D,L-MK) je ponavadi proizveden s kemijsko sintezo iz petrokemijskih surovin. Optično čiste izomere L(+) ali D(-) MK lahko pridobivamo z mikrobno fermentacijo

TEORETSKE OSNOVE 13

ali iz obnovljivih virov, ki vsebujejo primerne mikroorganizme za proizvodnjo posamezne izomere. V zadnjem času je v ospredju biotehnološka proizvodnja MK, saj ponuja okolju bolj prijazno obliko v primerjavi s petrokemično industrijo (onesnaževanje okolja in omejen vir petrokemičnih surovin). Biotehnološki postopki za proizvodnjo MK navadno vključujejo fermentacijo MK in predelavo ali čiščenje produkta. Pri tem so uporabljene poceni surovine, kot so škrobni in celulozni materiali, sirotka in melasa. Monomerna oblika MK je zelo uporabna surovina za številne kemijske pretvorbe, ker vsebuje dve reaktivni funkcionalni skupini, karboksilno skupino in hidroksilno skupino. Optično čista MK lahko polimerizira v polimere MK (PMK) z visokimi molekulskimi masami.[14]

Slika 2.5: L in D izomera mlečne kisline.

Kot zelo učinkovito metodo za čiščenje MK pridobljene iz fermentacijske brozge (juhe) se lahko uporablja esterifikacija MK z alkoholom. Ta metoda se uporablja kadar želimo dobiti koncentrirano MK. Koncentrirana MK (

14 TEORETSKE OSNOVE

Slika 2.7: Tvorba trimere mlečne kisline (MK3).

Slika 2.8: Dimere laktida.

LE so eni najpomembnejših derivatov MK.[1] Še posebej so poznani metil, etil in BL. Ti se uporabljajo kot topila za lake, nitrocelulozo in spojine na osnovi polivinila.[66] LE se pogosto uporabljajo v prehrambenih, kozmetičnih in farmacevtskih pripravkih, so higroskopni in imajo emulgatorne lastnosti.[2] V prehrambeni industriji se LE uporabljajo za namene konzerviranja in aromatičnosti.[67] Estri MK se uporabljajo v farmacevtski in kozmetični industriji, saj za razliko od proste MK ne dražijo človeške kože.[3] LE, kot so etil, propil in BL laktat, se uporabljajo kot okolju prijazna topila.[68] Ta topila imajo visoko vrelišče, so nestrupena in so biološko razgradljiva.[62,69] Nekateri estri se uporabljajo že mnogo let kot topila za nitro in etil celulozo, gume, olja in barvila.[70] Estri so lahko alternativna topila za glikol etre in ne tanjšajo ozonskega plašča.[71] Podjetje Purac Inc. trži LE v elektroniki in za precizna čiščenja. Ameriška organizacija za okolje (EPA - US Environmental Protection Agency) je označila etil laktat in BL kot razred 4A (inertna sestavina za uporabo v formulaciji pesticidov in drugih bioaktivnih sestavinah/spojinah). Oznaka razreda 4A je podana za spojine, ki so pokazale zanemarljivo toksičnost in so okolju prijazna.[68] LE imajo dve enantiomerni izomeri in sicer L- in D-izomero. Pogosto sta obe izomeri združeni in dajeta racematno D,L-obliko. Nekaj LE je zbranih v Tabeli 2.6, ki prikazuje ime, formulo in molsko maso posameznega LE.[71]

BL je pri sobni temperaturi tekočina z blagim vonjem. Je mešljiv z mnogimi topili za lake, razredčila in olja. Je slabo topen v vodi (4,5 g/100 mL) in dobro topen v alkoholih in etrih. Njegove fizikalne in kemijske lastnosti prikazuje Tabela 7.7. BL se uporablja kot topilo za nitrocelulozo, etil celulozo, olja, barvila, naravne gume, veliko sintetičnih polimerov, lake, barve, paste in lepila. Prav tako se uporablja v kozmetičnih izdelki z najvišjo dovoljeno koncentracijo 0,03 %. S strani uprave ZDA za hrano in zdravila (FDA – Food and Drug Administration) je bil BL odobren za uporabo v živilih.[71] BL visoke čistosti se uporablja kot čistilo, topilo za fine kemikalije in pri sintezi kiralnih intermediatov uporabljenih za zdravila in pesticide.[70]

TEORETSKE OSNOVE 15

Tabela 2.6: Ime, formula in molska masa za nekaj laktatnih estrov.[71]

Laktat Formula Mw/(g/mol)

metil C4H8O3 104,1

etil C5H10O3 118,1

izopropil C6H12O3 132,2

propil C6H12O3 132,2

sec-butil C7H14O3 146,2

izobutil C7H14O3 146,2

n-butil C7H14O3 146,2

izoamil C8H16O3 160,2

amil C8H16O3 160,2

2-etil heksil C11H22O3 202,3

n-oktil C11H22O3 202,3

n-decil C13H26O3 230,3

lauril C15H30O3 258,4

miristil C17H34O3 286,5

cetil C19H38O3 314,5

Tabela 2.7: Fizikalne in kemijske lastnosti butil laktata.[71]

Tališče (°C) - 43

Vrelišče (°C) 187

Plamenišče (°C) 79

Gostota (g/mL) 0,984 (20 °C)

Parni tlak (kPa) 0,03 (20 °C); 4,7 (100 °C)

Porazdelitveni koeficient (log Poktanol/voda) 1,10

2.4.2 Encimska sinteza laktatnih estrov

Esterifikacija je zelo poznana reakcija in je uporabljena v številnih industrijski procesih za sintezo pomembnih kemikalij kot so metil, etil in butil estri ter alkil t-butil estri. Prav tako je esterifikacija uporabljena v živilski industriji in v pripravi biodizla iz nižje kakovostnih surovin. Derivati nekaterih estrov so uporabljeni kot kemijski intermediati, monomeri za smole in polimere z visoko molekulsko maso. Zelo raziskana je esterifikacija karboksilne kisline z alkoholi v prisotnosti kislih katalizatorjev. Uporabljeni so tipični homogeni katalizatorji kot so H2SO4, HCl in ClSO3OH. Ker so omenjeni katalizatorji mešljivi v reakcijski zmesi, je problem odstranitve le teh in posledično tudi ponovna uporaba katalizatorja.[67] Zato ima uporaba imobiliziranega encima prednost pred homogenimi

16 TEORETSKE OSNOVE

kislimi katalizatorji, saj lahko le tega odstranimo iz reakcijske zmesi in ponovno uporabimo.

Z lipazo katalizirana esterifikacija MK je doslej dosegla le omejen uspeh, zaradi visoke kislosti in polarnosti MK. Kislina inaktivira encime in MK je nemešljiva s hidrofobnimi organskimi topili, ki se običajno uporabljajo za nevodne encimske reakcije. Kot rekcijski medij za encimsko esterifikacijo MK z etanolom so bili uporabljeni hidrofobni etri in ketoni. Obe skupini topil sta mešljivi z MK in njuna bazičnost omili kislinsko inaktivacijo encima. Kljub temu pa so ta topila manj škodljiva za encim kot polarna topila, zaradi njihove hidrofobnosti. Z uporabo teh topil je bil encimsko sintetitiziran BL z uporabo višjih koncentracij MK.[3]

V okviru raziskovalnega dela doktorske disertacije smo izvedli encimsko katalizirano esterifikacijo D,L-MK z n-butanolom v različnih SCFs. Njen shematski prikaz je prikazan na Sliki 2.9.

Slika 2.9: Shematski prikaz encimsko katalizirane esterifikacije D,L-MK z n-butanolom v SCF.

2.4.3 Antimikrobna aktivnost

Širok spekter razkužil in biološko razgradljivih in okolju prijaznih čistil vsebuje estre nastale iz organskih alkoholov in nenasičenih maščobnih kislin. Estri (v nadaljevanju aktivne spojine) imajo antimikrobno aktivnost proti številnim mikroorganizmom, vključno z njihovimi najbolj odpornimi oblikami t.j. sporami. Pripravki, ki vsebujejo omenjene aktivne spojine, se lahko uporabljajo v zdravstvu, predelavi hrane, osebni negi in drugih industrijskih panogah, kjer je uporaba težkih oksidantov nezaželena.[72]

Razrast mikroorganizmov je primarni vzrok za kvarjenje različnih vrst živil in je pogosto vzrok za izgubo kakovosti in varnosti živil. Zaradi povečanega števila z mikroorganizmi povzročenih zastrupitev, se povečuje skrb zaradi pojavnosti najrazličnejših patogenih mikroorganizmov in kvarljivcev v živilih.[73] Antimikrobne spojine zavirajo rast in razmnoževanje mikroorganizmov in povzročijo njihovo smrt, hkrati pa ne prizadenejo gostiteljske celice.

Najpogostejši izdelki z antimikrobnim delovanjem, kot so klor, klorov dioksid, peroksiocetna kislina, ozon, vodikov peroksid, ki se uporabljajo za zmanjšanje mikroorganizemskih populacij v živilih in na drugih stičnih površinah, imajo visoko oksidativnost in velikokrat uničujoče lastnosti. Te oksidativne molekule in fizikalni dejavniki onesposobijo mikroorganizme tako, da povzročijo reakcijo s svojim organskim materialom. Omenjeni izdelki nimajo lastnosti detergenta ali čistilnih lastnosti. Nekateri drugi preparati za čiščenje, ki so dovoljeni v živilskih obratih, bodisi nimajo zadostne antimikrobne in mikrobicidne učinkovitosti ali pa niso dovolj varni, ker vsebujejo sestavine, ki jih FDA ne šteje kot GRAS (Generally Recognized As Safe – splošno priznane kot varne). V tovrstne izdelke za čiščenje je zaželjeno vključiti antimikrobne spojine.

TEORETSKE OSNOVE 17

Občutljivost bakterij in gliv za antimikrobne spojine največkrat preverjamo z in vitro metodami. Izbira metode je odvisna od različnih dejavnikov med njimi so pomembni enostavnost metode, fleksibilnost, uporaba avtomatiziranih naprav za testiranje in evalvacijo rezultatov. V razikovalnem delu doktorske disertacije smo testirali antimikrobno delovanje BL (standarda in vzorca, ki smo ga sami sintetizirali) in D,L-MK na različne testne mikroorganizme; štiri glive (Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Aspergillus niger (A. niger), Trichoderma viride (T. viride) in Penicillium cyclopium (P. cyclopium)), dve Gram-negativni bakteriji (Escherichia coli (E. coli) in Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens)) in Gram-pozitivno bakterijo (Bacillus cereus (B. cereus)). Za glive smo uporabili metodo vnosa testne komponente v hranilni agar in za bakterije disk difuzijsko metodo. Antimikrobno aktivnost smo spremljali tako, da smo merili inhibicijo rasti mikroorganizma.

2.4.3.1 Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae sodi v razred kvasovk, ki so netaksonomska kategorija gliv. S. cerevisiae je elipsoidne oblike z velikim premerom od 5 µm do 12 µm ter manjšim premerom od 1 µm do 7 µm in je približno desetkrat večja kot E.coli.[43] Je najbolj raziskan eukariotski organizem ter primeren za različne študije zaradi svoje preprostosti in enostavnega načina gojenja. Posnetek glive S. cerevisiae narejen z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM) prikazuje Slika 2.10.

Slika 2.10: SEM posnetek glive S. cerevisiae.[74]

2.4.3.2 Aspergillus niger

A. niger je najpomembnejša vrsta iz rodu Aspergilus (Slika 2.11) in je v našem okolju prisotna skoraj povsod. Povzroča bolezen, imenovano črna plesen, na nekaterih vrstah sadja in zelenjave (grozdje, čebula).[54] Je hitro rastoča gliva, ki prerašča različne organske substrate. Pogosto je kvarljivec živil.[75] Nekateri sevi A. niger proizvajajo močne toksine (aflatoksine). To rakotvorno snov lahko najdemo v zrnih pšenice, mleku in v vinskih proizvodih. Poleg tega je ta gliva opurtunist, ki povzroča hudo pljučno bolezen (aspergilozo), zlasti pogosta je pri vrtnarjih. A. niger je eden od najpogostejših vzrokov za otomikozo (okužbo ušesa), ki lahko povzročijo bolečine, začasno izgubo sluha in v hudih primerih poškodbe sluhovoda.[76]

18 TEORETSKE OSNOVE

Slika 2.11: Rast glive A. niger na trdnem gojišču.

2.4.3.3 Trichoderma viride

T. viride je filamentozna gliva razširjena v zraku, vodi, prsti in razpadajočem rastlinskem materialu. Uporablja se za semena in obdelavo tal za zatiranje različnih bolezni, ki jih povzročajo patogene glive. Prav tako je patogena sama po sebi, zaradi česar povzroča gnitje čebule, zeleno plesen.[77] Kolonije so hitro rastoče pri temperaturi 25 °C. Konidiji so modrozeleno ali rumenozeleno pigmentirani (Slika 2.12).[78] Do okužb s to glivo pride v redkih primerih in sicer pri imunsko oslabljenih bolnikih po transplantacijah, s kronično odpovedjo ledvic ali kroničnimi pljučnimi boleznimi.[79]

Slika 2.12: Rast glive T. viride na trdnem gojišču.[80]

2.4.3.4 Penicillium cyclopium

Nitasta gliva P. cyclopium je glavni kontaminant v pridelavi semen še preden semena poberejo in shranijo. Proizvaja več kot 20 mikotoksinov.[81] Driska, omotica in splošno slabo počutje so glavni simptomi zastrupitve s hrano okuženo s P. cyclopium (inkubacijska doba od 2 do 6 ur). Ti simptomi ponavadi izzvenijo v roku 2-3 dni.[82]

2.4.3.5 Escherichia coli

E. coli je Gram-negativna nesporogena paličasta bakterija s premerom od 1,1 µm do 1,5 µm in dolžine od 2,0 µm do 6,0 µm. Ime je dobila po odkritelju, bakteriologu Theodoru Escherichu. Spada v družino enterobakterij, v deblo proteobakterij.[83] Večinoma je gibljiva s pomočjo peritrihnih bičkov ali flagelov in pritrjevalnih pilov ali fimbrijev (Slika 2.13). E. coli je fakultativno anaerobna, kemoorganotrofna bakterija. Optimalno raste pri temperaturi 37 °C. Najdemo jo v črevesju človeka in drugih toplokrvnih živali, kjer je del normalne črevesne flore. Prisotna je tudi v tleh in vodi. Njen pomen za človeka in toplokrvne živali je v proizvajanju vitamina K in vitaminov iz skupine B.[84,85] Patogeni

TEORETSKE OSNOVE 19

sevi E. coli povzročajo različna obolenja. Najpogosteje povzročajo infekcije urinarnega trakta, sepso, krvave diareje, pljučnico, vnetje možganske ovojnice, potrebušnice in prsi.[86]

Slika 2.13: SEM posnetek bakterije E. coli.[87]

2.4.3.6 Pseudomonas fluorescens

Je aerobna Gram-negativna bakterija paličaste oblike, ki ščiti korenine nekaterih rastlinskih vrst pred zajedavci. Pogosto jo najdemo v razpadajočih organskih materialih kot so listi, prst, rastline in ne-vodnih površinah. Za gibanje uporablja migetalke.[45] Bakterije rodu P. fluorescens kvarijo živila živalskega izvora.[88] P. fluorescens raste tudi pri nizkih temperaturah in s tem zmanjšuje rok uporabnosti zamrznjene zelenjave in sadja. V redkih primerih pride do okužbe s to bakterijo pri zdravih ljudeh. Do okužbe s P. fluorescens pogosto pride pri hospitaliziranih rakavih bolnikih (bakterijska infekcija krvi).[89,90]

2.4.3.7 Bacillus cereus

Bakterije rodu Bacillus so sporogene in zelo razširjene v naravi (tla, zrak, voda, rastline) in jih pogosto izoliramo iz različnih živil. Med pomembnejše spada vrsta B. cereus, je sporogena Gram-pozitivna aerobna oziroma fakultativno anaerobna paličasta bakterija prikazana na Sliki 2.14. Patogenost le-te povezujejo s tvorbo toksinov. Poleg toksinov B. cereus proizvaja tudi hemolizine in fosfolipaze C, pa tudi številne encime (β-laktamaze, proteaze, kolagenaze, lipaze, amilaze in druge), zaradi česar so med najpogostejšimi povzročitelji kontaminacije živil.[91] B. cereus povzroča dva tipa sindromov zastrupitve z živili. Emetični sindrom (inkubacijska doba od 1 do 5 ur) je posledica zaužitja emetičnega toksina (cerevlid – ciklični peptid) z živilom. Zastrupitev spremljajo slabost in bruhanje. Diarealni sindrom oz. bruhanje (inkubacijska doba od 4 do 16 h) je posledica zaužitja celic B. cereus v hrani in se kaže v obliki diareje in trebušnih krčev, saj med vegetativno rastjo celic bakterija proizvaja toksin v tankem črevesju.[92]

Slika 2.14: SEM posnetek bakterije B. cereus.[93]

20 EKSPERIMENTALNI DEL

3 EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 Materiali

Lipaza B iz C. antarctice (Novozym 435) imobilizirana na makroporozno akrilno smolo je bila dobljena v dar od podjetja Novo Nordisk AS (Copenhagen, Danska). D,L-mlečna kislina (90 %, w/w), n-butil L-laktat (≥97 % (GC)), natrijev klorid (99,9 %), D(+)-glukoza (99 % (GC)) in agar smo dobavili od Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Nemčija). Fosforno kislino (min. 85 %) in natrijev hidrogenkarbonat smo nabavili pri Kemika (Zagreb, Hrvaška). n-Butanol (99,5 %), acetonitril (≥99,8 %), mesni pepton, mesni ekstrakt in krompirjev agar smo dobavili od Merck (Darmstadt, Nemčija). n-heksan (95 %) je bil kupljen od podjetja Carlo Erba (Rodano, Italija). Molekularna sita (3 Å) smo nabavili pri Fluka (Buchs, Švica). Ionska tekočina tributil(tetradecil)fosfonijev dodecilbenzensulfonat (CYPHOS IL-201) (>95%) je bila kupljena od podjetja IoLiTec GmbH (Heilbronn, Nemčija). Trifluorometan 2.8 (99,8 %) in etan (>99 %) sta bila kupljena v Linde plin (Celje, Slovenija) ter helij 6.0, dušik 5.0, sintetični zrak 5.0 in vodik 5.0 za plinsko kromatografijo od podjetja Messer MG (Ruše, Slovenija). Liofilizirane kulture mikroorganizmov (Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Penicillium cyclopium, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens in Bacillus cereus) so bile pridobljene iz madžarske državne zbirke kmetijskih in industrijskih mikroorganizmov NCAIM (The National Collection of Agricultural and Industrial

Documents

ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V …Doktorska disertacija ENCIMSKA SINTEZA LAKTATNIH ESTROV V NEKONVENCIONALNIH TOPILIH Sabina KAVČIČ Maribor, september 2014