50
Enfermedad Inflamatoria Enfermedad Inflamatoria Intestinal Intestinal Estudios complementarios Una década de experiencia” Dr. Oscar Venegas R Médico Inmunólogo Médico Inmunólogo Dpto. Pediatría Dpto. Pediatría Fac. de Medicina Fac. de Medicina Univ. de Concepción Univ. de Concepción …1996 -------------------------------- 2006……….

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Enfermedad Inflamatoria Enfermedad Inflamatoria IntestinalIntestinalEstudios complementarios

“ Una década de experiencia”

Dr. Oscar Venegas RMédico InmunólogoMédico Inmunólogo

Dpto. PediatríaDpto. Pediatría

Fac. de MedicinaFac. de Medicina

Univ. de ConcepciónUniv. de Concepción

…1996 --------------------------------���� 2006……….

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0 13 24 71 113223

481 611811940

10771234

1505

1861

22722413

27462919

35753518

357636273899

4261

48555034

5384

5818

6243

6633

1731

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

1976

1977

1978

1979

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1985

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1988

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

PapersDatos Tomados de PubMed usando las palabras: “flow Cytometry”

Proyect ACHS -> ONCOINMUN

Citometría de Flujo : Publicaciones / año

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PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

Flow Cytometry Optics

Laser

1

2

3

4

Flow cell

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FITC Fluorescence

Mo1

CD4 CD8

CD8

CD45

leu11a

CD20 Tube

ID

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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas iniciales

� Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias

� Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas

� Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular

� Estudio de HLA-B27

� Estudio de Células Progenitoras (CD34)

� Estudio de Citokinas Intracelulares

1996

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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respirato rio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Microbiología• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

2006

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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Espectro de presentación.

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Alteración de la Alteración de la inmunoinmuno--regulación regulación de mucosa intestinalde mucosa intestinal

…1996……1997…..1999….2006--------����

Gastroenterología ----- Inmunología ------ Patología

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Citometría de Flujo

Clínica Investigación

E I IE I I

Patología---Gastroenterología---Inmunología

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CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO Gastroenterología: E I I y CáncerGastroenterología: E I I y Cáncer

�� Inmunología y pólipos de colon.Inmunología y pólipos de colon.

�� Enfermedad Inflamatoria Intestinal.Enfermedad Inflamatoria Intestinal.

� Tumores sólidos:

�Ciclo celular y Ploidía de ADN.

�Proteínas del ciclo celular

�Oncogenes

� Cáncer de Esófago

� Linfoma

2006

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COLITIS ULCEROSA ENFERMEDAD DE CROHN

Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon

Afecta a todo el tracto digestivo

Inflamación superficial de la mucosa

Proceso transmural y granulomatoso

Compromiso de mucosa discontinuo

Presencia de pseudopólipos

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Colon normal

CrohnCrohn

C.U.

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A- Colon normal. B- Enferm. Crohn. C- coliti s ulcerosa.

Mucosa del colonDiferencias histológicas en la micro-arquitectura e infiltrado inflamatorio leucocitario

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� Auto-reconocimento

� Beneficios:

� Protección de invasores

� Eliminación de Tej. Alteredos

� Deterioros:

� Molestias (inflamación)

� Daño a tejidos (autoinmunidad)

� Auto-reconocimento

� Beneficios:

� Protección de invasores

� Eliminación de Tej. Alteredos

� Deterioros:

� Molestias (inflamación)

� Daño a tejidos (autoinmunidad)

Consecuencias de la RespuestaInmune

ConsecuenciasConsecuencias de la de la RespuestaRespuestaInmuneInmune

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AUTOINMUNIDAD

Tolerancia Tolerancia TisularTisular

� “Inmunodeficiencia de la Regulación”

Intolerancia Tisular

Fisiológico

Patológico

Fenómenos Activos

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Implicancias

fisiológicas y

patológicas

del “homing”

celular linfoide

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Implicancias

clínicas e

inmunopatológicas

del “homing”

celular en la

inflamación

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SISTEMA INMUNE MUCOSALSISTEMA INMUNE MUCOSAL

� Estructura, ontogénesis y fisiología.

� Sistema inmune mucosal.

� Fisiopatología e implicancias clínicas.

� Tolerancia / Autoinmunidad

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� El sistema inmune de mucosas asociado al tracto gastrointestinal brinda los mecanismos protectores contra la invasión de patógenos potenciales y a su vez pe rmite la tolerancia de productos inmunogénicos de la digesti ón y de la flora microbiana intestinal normal.

� Numerosas alteraciones de la inmunidad de la mucos a intestinal involucran disturbios con mecanismos de daño inmune activos ( tipo I, II, III y IV ).

� Estos mecanismos de daño activados, se manifiestan en modelos inmunopatogénicos clásicos: Hipersensibilidad, autoinmunidad e inmunodeficiencia.

Implicancias clínicasImplicancias clínicas

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Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal

• Alt. Tolerancia Inmunológica a Ags. Lumen• Predisposición genética• Epitelio intestinal:

• Permeabilidad aumentada• Secreción de citoquinas• Actúa como CPA

• Macrófagos de la lámina propia:• Perpetúan proceso inflamatorio, al expresar

moléculas de superficie ausentes en mucosa intestinal normal

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Macrófagos intestinales:

• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.

• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares

de la lamina propia.

• Detección de su fenotipo:

• Inmunohistoquímica

• Citometría de Flujo

• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos

encontrados en mucosa de EII y en personas que no la

presentan

Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44

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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Espectro de presentación.

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Alteración de la Alteración de la inmunoinmuno--regulación regulación de mucosa intestinalde mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):

• Células epiteliales C.P.A.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamatio nFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

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Marcadores de superficie que se Marcadores de superficie que se encuentran alterados en EIIencuentran alterados en EII

CD - 16 Receptor de IgG (Fcγγγγ RIII)

HLA - DR Se expresan en: • Linf. B• Monocitos

• Macrófago

• Céls. dendítricas

Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Academic Publishers 1999 pps.:111-113

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Permeabilidad epitelial incrementada y desarrollo de inflamación crónica intestinal mediada por linfocit os T activados por citocinas TNF α, INFγ.

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“Expresión de HLA-DR y CD16 en Macrófagos intestinales de pacientes con Enfermedad Inflamatoria Intestinal”

Dr. Fernando Kawaguchi P.Dr. Oscar Venegas R.TM MsC Juan Luis Castillo N.TM MsC Marcelo Castillo N.Dr. Jaime Madariaga B.

Fono: 402138 / 329454 / 09-8463346Email: [email protected]/ [email protected]

www.citometria.co.cl / www.oncoinmun.co.cl

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• Determinar mediante CF, el porcentaje de MI que expresan la molécula HLA-DR y/o CD16 en pacientes con EII y con mucosa intestinal normal.

• Establecer si el fenotipo de MI HLA-DR(+), CD16(+), permite diferenciar pacientes con EII de aquellos sin EII.

• Cálculo de especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y valor global.

Objetivos

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�� Estudio de corte analítico con grupo testigo, Estudio de corte analítico con grupo testigo,

doble ciego.doble ciego.

�� Pacientes atendidos en Unidad de Pacientes atendidos en Unidad de

Gastroenterología, Hospital del Trabajador, Gastroenterología, Hospital del Trabajador,

Concepción, Chile.Concepción, Chile.

�� Consentimiento informadoConsentimiento informado

Método

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�� Expresión HLAExpresión HLA --DR y CD16 Concordante con DR y CD16 Concordante con EII según EII según RoglerRogler G. et al. (G. et al. ( EurEur J J GastroenterolGastroenterolHepatolHepatol 1997;9:8931997;9:893 --9)9)

�� MI definidos en función CD33(+), CD3(MI definidos en función CD33(+), CD3( --)/CD19 )/CD19 ((--))

�� Anticuerpos:(Anticuerpos:( BectonBecton DickinsonDickinson ))�� CD33CD33--PEPE

�� HLAHLA --DRDR--FITCFITC

�� CD16CD16--FITCFITC

�� Análisis estadístico: Análisis estadístico: Chi Cuadrado con corrección Chi Cuadrado con corrección

de Yates, de Yates, testtest de de FischerFischer p < 0.05p < 0.05

Método

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�� Existen diferencias significativas (p<0.05) Existen diferencias significativas (p<0.05) en los fenotipos de MI entre pacientes con en los fenotipos de MI entre pacientes con EII y pacientes sin EII.EII y pacientes sin EII.

�� En MI, el fenotipo HLAEn MI, el fenotipo HLA --DR(+) se expresa DR(+) se expresa en mayor porcentaje en pacientes con EII en mayor porcentaje en pacientes con EII (p<0.001).(p<0.001).

�� En MI, el fenotipo CD16(+) se expresa en En MI, el fenotipo CD16(+) se expresa en mayor porcentaje en pacientes con mayor porcentaje en pacientes con cuadros concordantes con EII, clcuadros concordantes con EII, cl íínica y nica y endoscendosc óópicamentepicamente activos. activos.

Conclusiones

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El estudio inmunofenotípico de Macrófagos Intest. demuestra ser un examen eficiente para diferenciar pacientes con EII de aquellos sin EII.

Conclusiones

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Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34

Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:111-113

Mucosa

• HLA-DR• CD16

• CD54

• CD25

• CD68• CD80, CD86• CD11b

Normal

20-30%Ausente

7%

Ausente

AusenteAusente

5%

EII

PresentePresente

C.U. 70%Crohn 46%

C.U. PresenteCrohn ausente

PresentePresentePresente

Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales (Histológicamente normales)

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> 5 %> 30 %Inflamación crónica activaInflamación crónica activa

< 5 %> 30 %Inflamación crónica con Inflamación crónica con escasa actividadescasa actividad

> 5 %< 30 %Inflamación AgudaInflamación Aguda

< 5 %< 30 %NormalidadNormalidad

CD16HLA-DRSituaciónSituación

Alteraciones del Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales

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Ejemplo de Macrófagos Intestinales

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Conclusiones:

• Existe una clara relación entre el fenotipo de macrófagos intestinales crónicamente activos con la severidad clínica de la EII.

• El estudio fenotópico de M.I. crónicamente activos (HLA-DR+/CD16+) podría ser una herramienta eficaz para la categorización clínica de los pctes. con EII.

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ζζζζCD3 CHAINS EXPRESION IN PERIPHEREAL T LYMPHOCYTES OF PATIENTS WITH

ADENOMATOUS POLYPS OF THE COLON

(*) Castillo JL 2, Kawaguchi F.1,2, Venegas O.1,2, Castillo M.1,2, Madariaga J.1,2, Ortiz C2 ,

Riquelme F.2, Yañez CG.2, Vega E.2,.

(1) Medicine Faculty, University of Concepción, Chile. (2) Flow Cytometry and Gastroenterology Unit,

Worker Hospital, Concepción, Chile.

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

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• Total T lymphocytes :CD3(+)

• T Helper lymphocytes :CD3(+)CD4(+)

• T citotoxic lymphocytes :CD3(+)CD8(+)

• B lymphocytes :CD3(-)CD19(+)

• Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)

• T CD4/CD8 ratio

ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous

polyps of the colon

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

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ANTIGEN/MHCANTIGEN/MHC

CD4CD4

TCR/CD3TCR/CD3

LckLck

ZAPZAP--7070

PTK PTK SrcSrcζζζζζζζζ CHAINSCHAINS

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• Low ζζζζCD3 expression in:• Colon cancer • Prostate cancer • Renal cells cancer

• Related:• Disease stages • Prognosis• Death

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

• Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).• Healy C. et al . Cytometry32:109-119 (1998).

ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon

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• It has been proposed that thedetermination of ζζζζCD3 expresion y tumoral and peripheral T lymphocytes, may be a neoplastic disease progresionmarker.

Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).Healy C. et al . Cytometry32:109-119 (1998).Nakagomi H. et al. Cancer Research53, 5610-12,1993.

ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

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Objetive: Evaluate the expression of ζζζζCD3 chains in periphereal T lymphocytes by flow cytometry in patients with colon polyps

Patients: 24 reference subjects 19 Patients with adenomatous polips of the colon (APC) 10 Patients with hiperplasic polyps (HP) 5 Patients with recurrent oral thrush (ROT)

Sample type: Periphereal blood

ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

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% LT ζζζζ(+)

% LCD4 ζζζζ(+)

% LCD8 ζζζζ(+)

Controln = 24

APCn = 19

HPn = 10

87.291 19.558(P=0.000)

72.948(P=1.000)

87.01987.01987.01987.019 16.404(p=0.000)

77.726(p=1.000)

87.823 17.903(p=0.000)

69.601(p=1.000)

88.640(p=1.000)

88.814(p=1.000)

90.601(p=1.000)

ROTn = 5

Percentage ofζζζζCD3 expression in T lymphocytes. p<0.05

ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

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Conclusion:

ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon

1) The diminution of ζζζζCD3 expression is related with the APC in patients without antecedents of any

others neoplasia.

2) There are significant differences in ζζζζCD3 expression between the APC and HP groups (p<0.05).

3) The diminution of ζζζζCD3 in periphery may be suggestive of the APC in absence of any others

neoplasia.

Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.

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3

123

89

18

0

154

80

101

12

171

36

119

8

45

7

31

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

2003 2004 2005 2006

AÑO

Nº Examenes Citometría de Flujo: Inmunopatología

Observación. Linfoma

Macrófagos Intestinales

Ciclo celular

Macrófagos + Ciclo celular

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5

8

4

9

1

11

1

5

3

2

0 0

0

2

4

6

8

10

12

2005 2006

AÑO

Nº Examenes Citometría de Flujo: Pacientes con 2 o más controles

Subpoblaciones

Estallido Respiratorio

Subpoblaciones + estallidorespiratorior

Macrófagos intestinalesr

Ciclo celular

Macrófagos intestinales + Ciclocelular

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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Espectro de presentación

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

Congestión ulcerativa Granulomatosa

¿Cáncer? …..2006

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www.oncoinmun.co.cl