ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL:

DETECCIÓN POR CITOMETRÍA DE FLUJO

Bioq. Elisa Sajaroff

Laboratorio de Inmunología Celular Servicio de Inmunología y Reumatología

Hospital de Pediatría Dr.J.P.Garrahan

ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR)

DEFINICIÓN: DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CANTIDADES MÍNIMAS DE BLASTOS (NO DETECTABLES POR OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA) EN MÉDULA ÓSEA.

MÉTODOS DISPONIBLES:

CITOMETRÍA DE FLUJO

BIOLOGÍA MOLECULAR

EMR: MÉTODOS DISPONIBLES

Citometría de flujo (CF) Biología molecular

Fundamento -Inmunofenotipo aberrante. -Rearreglos de Ig/TCR.

-Genes de fusión

Ventajas -Cuantificación directa.

-Menor cantidad de células.

-Más económico. Resultados más rápidos

-Mayor sensibilidad.

-Target paciente específico.

Limitaciones -Posibles falsos negativos por cambios inmunofenotípicos.

-Sensibilidad limitada.

-Posibles falsos negativos por pérdida del target.

-Mayor cantidad de células.

-Muy laborioso.

EMR por citometría de flujo (CF) La identificación de los blastos se basa en su

inmunofenotipo diferente al de la célula normal de médula ósea.

FENOTIPO ABERRANTE DE LOS BLASTOS

ASINCRONISMO MADURATIVO

ANTÍGENOS DE OTRO LINAJE

NIVEL DE EXPRESIÓN ANTIGÉNICA DIFERENTE

AL NORMAL

LLA-B: CD20+CD34+

LLA-B: CD13+CD33+ CD117+

LLA-T: CD79a+CD33+

LLA-B: SUB-EXPRESIÓN CD10, CD45, CD38 SOBRE-EXPRESION CD10, CD58, CD19

LLA-T:

SOBRE-EXPRESIÓN CD99, CD7

SUB-EXPRESIÓN CD3, CD5

EXPRESIÓN ECTÓPICA

LLA-T CD3CITO+Tdt+

Detección de eventos poco frecuentes por CF:

DEPENDE DE DOS VARIABLES:

* Diferencia fenotípica entre blastos y células normales

* Número de células analizadas.

SENSIBILIDAD:

*Condiciones ideales (células con inmunofenotipo muy

diferente y adquiriendo > 107 células): 1 en 106

*Habitualmente: 1 en 104 / 105

Que debemos saber antes de hacer EMR: 1. Inmunofenotipo normal de células hematopoyéticas en médula ósea.

2. Inmunofenotipo de la leucemia al debut.

Panel para EMR LLA-B en 4 colores

Tubo FITC PE PerCP APC

1 Syto-16 CD10 CD45 CD19

2 CD20 CD10 CD34 CD19

3 CD58 CD10 CD45 CD19

4 CD10+

CD20

CD38 CD45 CD19

Tubo

FITC PE PerCP PE-Cy7

APC APC-H7

1 Syto-16

CD10 CD45 CD19

2 CD20 CD10 CD34 CD19

CD45

3 CD58 CD10 CD45 CD34

CD19 CD45

4 CD10+

CD20

CD38 CD45 CD34

CD19

Panel para EMR LLA-T en 4 colores

Tubo FITC PE PerCP APC

1 Syto-16 CD7 CD45 CD3

2 CD99 CD7 CD5 CD3

3 Tdt CD7 CD3 CITO

CD3

4 CD4 CD8 CD45 CD3

Perfil normal de expresión antigénica en MO. Linaje linfoide B.

Diagnóstico Día 15 Día 33

Sem 12 MO normal

M.O. Normal linaje B regenerativo

LLA-B día 15

Blastos CD45 negativo-tenue y CD38 negativo, ambos hallazgos aberrantes.

M.O. Normal LLA-T dia 15

Los blastos muestran > expresion de CD99 y CD7 que los normales y CD3 superficie parcial

Normal #1 Normal #2

LLA-B dia 33 Negativa,

solo se observan LB

maduros.

Ejemplo de día 33 sin blastos

Médula regenerativa con blastos

Médula regenerativa con blastos

CAMBIOS INMUNOFENOTÍPICOS: 16/31 casos (2010) (52%)

<CD34 >CD20 >CD45

PORQUE HACER EMR EN LLA?

Asignación de grupos de riesgo (GR) en LLA

pediátrica

Edad

Características biológicas al Dx WBC Alteraciones citogenéticas y/o moleculares Rta. a la prednisona en SP MO día 15

Respuesta temprana al tratamiento -Protocolo ALLI-2002 Morfológica (<5%, 5-25%, >25%) - Protocolo ALLIC-2009 EMR por CF al Día 15 (<0.1%, 0.1-10%, >10%)

Estratificación en grupos de riesgo ALLIC 2009

Diagnóstico y Día 8

Edad 1 - 5 años WBC < 20000/ul

Blastos D8 1000/ul

Edad <1 y 6 años ó WBC 20000/ul

Blastos D8 1000/ul

Blastos D8 1000/ul t (9;22) ó t(4;11) ó

hipodiploidía < 45Cr

EMR D15 <0.1% >0.1 y <10% >10%

RIESGO ESTÁNDAR

<10% >10%

RIESGO INTERMEDIO

RIESGO ALTO

Todos los resultados

Cosas importantes a tener en cuenta:

Muestra: sangre periférica vs MO

Momento del tratamiento.

Método

Impacto pronóstico

APLICACIONES CLÍNICAS DE LA EMR

OBJETIVO

Evaluar el impacto pronóstico de la determinación de EMR por CF al día 15 en los pacientes de AEIOP 2000 en los que se asignó grupo de riesgo por BM D33 y D78.

% ptes. % MRD SLE 5 años

IAR 5 años

GR

42% <0.1% 89.9 % 7.5% RS

47% 0.1-10% 79.3 % 17.2% RI

11% ≥10% 46.1 % 47.2% RA

Determinación de los valores de EMR CF para la asignación de GR

EMR por CF al día 15 en MO

Identificar pacientes con alto y bajo riesgo de recaída

Ajustar la intensidad del tto para evitar la recaída

• EMR al Dia 15 por CF factor pronóstico

independiente más importante disponible en

este momento del tto.

• En un análisis multivarianza la EMR por CF al

día 15 ≥10% resultó ser un factor de riesgo

de recaída independiente aún en los

pacientes que habían sido estratificados en

base a la EMR por BM al día 33 y 78.

Resumiendo…

Riesgo estándar EMR <0.1% RE

EMR 0.1-10% RI

EMR >10% RA

Riesgo intermedio EMR <10% RI

EMR >10% RA

Riesgo alto cualquier valor EMR RA

ALLIC 2009 (Acute Lymphoblastic Leukemia Intercontinental

2009)

EMR por CF es incorporada como criterio de estratificación sólo después de que haya

sido estandarizada y evaluada para los laboratorios participantes.

PAUTAS ALLIC 2009

PAUTAS ALLIC 2009 para obtener la habilitación del laboratorio para EMR-CF

*Monitoreo Intralaboratorio: -Control estricto de calibración y mantenimiento del citómetro. -Estandarización de metodologías.

*Monitoreo Interlaboratorios: -Entrenamiento: Transferencia de pautas de trabajo en el laboratorio sponsor AIEOP-BFM -Control de calidad: I.-Los laboratorios participantes deben completar exitosamente 2 rondas de análisis de datos. II.- Control de calidad externo UK-NEQAS. III.-Control de resultados de EMR en laboratorio sponsor:

-Envío copia del análisis y resultado alcanzado de EMR D15. -Evaluación por el sponsor. -Conclusión final del análisis y ratificación del resultado.

Pautas ALLIC 09. Marcación y adquisición.

• Muestra: Médula ósea del Día 15.

• Marcación y adquisición:

– Marcación seguida de lisis ( salvo en casos de hipocelularidad extrema donde se lisa primero).

– Adquirir al menos 300000 células nucleadas (cél syto +), y que representen el 30% de la celularidad de la médula (%syto+ ≥30%)

– Cargar al menos 700,000 céls/tubo.

– Nosotros normalmente marcamos 2x106 cél para adquirir 1x106 cells

Criterios evaluabilidad:

1. Eritroblastos >2% (células syto+CD45- FSC/SSC

adecuado)

2. Syto + >30% y >300000 células nucleadas

3. Cluster EMR de al menos 30 células (30 cél

patológicas en 300000 totales para alcanzar la

sensibilidad de 0,01% requerida para la EMR)

Reporte • Identificación del paciente

• Panel utilizado,

• # y % células nucleadas,

• % eritroblastos,

• % EMR.

• Si hay discrepancia en el valor entre los

tubos, se reporta el valor más alto del tubo

donde se ve con mayor claridad la población.

Nuestra experiencia

RESULTADOS – (Presentado en BFM, Kiel, 2013) EMR AL DÍA 15 por CITOMETRÍA DE FLUJO

EMR D15 ALLIC-09 (pac elegibles n=163, jul´11-mayo 13)

n (%) Pacientes (n) reasignados de GR por EMR D15 CF

No evaluables 8 (5)

< 0.1% 43 (26.5)

≥ 0.1-10% 87 (53.7) 19

≥ 10% 24 (14.8) 10 (8 RI a RA y 2 RE a RA)

La EMR D15CF permitió reasignar a 29 pacientes (18%) a un grupo de mayor riesgo con la consiguiente

adecuación de la intensidad del tratamiento.

Asignación de Grupos de Riesgo

GR

inicial

(n)

GR con

EMR (n)

% GR

GRE 38 17 10.4

GRI 96 107 65.7

GRA 29 39 23.9

Demográfica de los grupos de riesgo

GRE

(n=17)

GRI

(n=108)

GRA

(n=39)

B-ALL 17 (100%)

14 com

3 preB

100 (93%)

3 undetermined

3 BI, 70 BII

23 BIII, 1 B IV

22 (56%)

2 BI, 14 BII

4 BIII

2 Bcp with eos

T-ALL 0 7

2 TI

5 TIII

1 early

17

1 TI , 1 TII

8 TIII, 6 TIV

1 early

LALA 0 1

B-My

0

Grupo de alto riesgo (n=31)

• Por Biología molecular/citogenético (n=9) • 2 t(5;14) (EMR<10%)

• 4 BCR-ABL (1 con EMR>10%)

• 3 MLL rearreglado (EMR 2>10% y 1<0,1%, 2 con MRP)

• Por mala rta a la prednisona (n=16)

• 9 con EMR>10%

• 6 con EMR 0,1-10%

• 1 con EMR detectable <0,1% • (Marian y paiva mll con mala rta, estan en bm)

• Por EMR >10% (n=6)

Nivel de EMR durante el tto

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Día 15 Día 33 Sem 12

no evaluable >10% 0.1-10% <0.1%

PROTOCOLO PILOTO

• Noviembre 2009 a Junio 2011 (Sólo HPG)

• PACIENTES INGRESADOS: 130

• PACIENTES ELEGIBLES: 105

– 19% CAMBIO GRUPO DE RIESGO POR EMR D15

– 20% DE RECAÍDAS

pSLE global del PILOTO

pEFS (SE) (n=105): 72 (5)%

pSLE en los GR del PILOTO

GRE (n=15).pEFS (SE): 100 (0)%

GRI (n= 64).pEFS (SE): 74 (7)%

GRA (n=26).pEFS (SE): 50 (10)%

p-value: 0.0006

Análisis de las recaídas según EMR día 33 y 78

• EMR+(CF y/o Rq-PCR, día 33 y/o 78) >0,1%

• 27 casos • Recaídas: n=13

• EMR– (CF y/o Rq-PCR, día 33 y/o 78) <0,1%

• 78 casos • Recaídas: n=7

p<0,00001

pSLE según EMR+/- (día 33, CF y/o Rq-PCR n= 103)

MRD + (n=26): pEFS (SE): 44 (10)%

MRD – (n=77): pEFS (SE): 82 (5)%

Log-rank test: p= 0,0001

Análisis de concordancia al día 33 y 78 en la EMR por CF y BM (cut off 0.01%)

n=24

0.000

0.001

0.010

0.100

1.000

10.000

100.000

0.000 0.001 0.010 0.100 1.000 10.000 100.000

FC MRD

RqP

CR

MR

D

n=29 R2=0.8579

n=11 (9<0.1%)

n = 182 179 neg/neg

PAUTAS INDISPENSABLES PARA LA PUESTA A PUNTO DE LA EMR

• Estandarización metodológica.

• Entrenamiento y desarrollo de criterio adecuado

del operador.

• Conocimiento del inmunofenotipo normal de

células hematopoyéticas en médula ósea.

• Panel completo al diagnóstico que permita definir

el panel de seguimiento.

• Evaluación de posibles cambios fenotípicos.

La EMR por CF:

•Especialmente útil en etapas tempranas del

tratamiento.

•Es indispensable para la correcta adecuación del

tratamiento en los protocolos actuales de LLA.

CONCLUSIONES

Algunos casos clínicos

Ojo syto+ < 30% y < 300000 eventos syto+ La muestra es no evaluable!!! la EMR lo reasignaría a un grupo de mayor Riesgo. EMR=0,07*100/22,2= 0,32%

Al repetir syto 60,3% y 424501 eventos syto+ EMR = 0,2*100/60,3= 0,33% Ahora podemos informar este resultado!

Day 0

Day 15

Syto 88,1%

EMR

5,8*100/88,1=6,67%

Day 33

EMR D33

0,04*100/79,3=0,05%

Day 78

EMR D78=

0,03*100/66=0,045%

Day 15 Syto 97% - 679343 events styo+ Normoblasts 49% - MRD 0.71%

Day 33 Syto 73% 736174 events styo+ Normoblasts 37% MRD % 0.04%

Hospital de Pediatría Dr. J.P. Garrahan Servicio de Inmunología y Reumatología Dr. Ricardo Russo Laboratorio de Inmunología Celular

Bioq. Jorge Rossi Bioq. Andrea Bernasconi Téc. Marianela Sanz Bioq. Elisa Sajaroff Bioq. Carolina Carrara

Muchas gracias por su atención…