1

Engineering antibodyEngineering antibody

• http://home.dlmedu.edu.cn/documents/immuno/yjs_05.ppt#358,2, 幻灯片 2

2

Emil von Behring, 1901, antitoxins

Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody

Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene

Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody

Paul Ehrlich , 1908, production of antibody

Nobel Prize winners

3

免疫学背景知识

免疫——抗原物质进入机体，激发免疫系统发生一系列反应以排除抗原的过程。

先天免疫：是指机体对进入体内的抗原物质的一种无选择性排斥、 清除功能。这是生物体在种系发育的长期过程中逐步建立起来的。

适应性免疫：适应性免疫是被 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞介导的免疫，其特征为特异性和记忆性。

体液免疫： B 细胞活化产生特异性抗体发挥免疫效应。

细胞免疫：特异性 T 细胞活化发挥免疫效应。

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完全抗原、不完全抗原

完全抗原——具有免疫原性，同时又具有反应原性的物质称为完全抗原，如异种血清蛋白。

不完全抗原——只有反应原性而无免疫原性的物质称为半抗原或不完全抗原。半抗原分子量很小，本身没有免疫原性，但与蛋白载体结合后可获得免疫原性。

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免疫原性和反应原性

免疫原性（ immunogenicity ）——指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。

反应原性又称抗原性——指能与由它刺激所产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应。

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TD 、 TI 抗原

• 根据抗原刺激 B 细胞产生抗体是否而要 T 细胞协助分类，可分为胸腺依赖性抗原（ TD-Ag ）和胸腺非依赖性抗原（ TI-Ag ）。

• TD-Ag 是指需要 T 细胞辅助和巨噬细胞参与才能激活 B 细胞产生抗体的抗原性物质。 TD 抗原免疫应答特点：能引起体液免疫应答也能引起细胞免疫应答；产生 IgG 等多种类别抗体；可诱导产生免疫记忆。

• TI-Ag 是指无需 T 细胞辅助可直接刺激 B 细胞产生抗体的抗原，特点：只能引起体液免疫应答；只能产生 IgM 类抗体；无免疫记忆。

7

B 细胞对不同抗原应答的区别

TI-1 抗原 TI-2 抗原 TD 抗原抗原

APC 提呈抗原识别receptor活化 B细胞

LPS 不需要Mitogen receptor

B1

多糖等不需要

BCR （ B cell receptor ）

B1

蛋白質需要BCR

B2

类别转换 无 少数有 有记忆 B细胞 无 个别有 有T细胞辅助 - - +

TI-1 、 TI-2 和 TD 抗原体液免疫应答的区别T 细胞 ( 胸腺）非依赖性抗原 _TI； thymus-dependent antigen, TD抗原

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抗体分子结构抗体——免疫球蛋白（ immunoglobulin ）， B 淋巴细胞产生；

免疫球蛋白可以分为 IgG 、 IgA 、 IgM 、 IgD 、 IgE 五类；

IgG ， IgD ， IgE 均为单体，分泌液中 IgA （ SIgA ）是双体，IgM 是五聚体；

Ig 重链的分子质量为 50—75kh ，由 450 ～ 550 个氨基酸残基组成。重链有 5 种，分别是 μ 、 δ 、 γ 、 α 和 ε 链，这五种重链决定了 Ig 的类别或同种型，即 IgM 、 IgD 、 IgG 、 IgA 和 IgE 。

Ig 轻链的分子质量约 25kDa ，约含 210 个氨基酸残基。轻链有两种： κ 链和 λ 链，这两种轻链决定了 Ig 的型别。

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Fab( 结合抗原 ) 片段

10

Fc （ fragment crystalizable, 可结晶片段）。

Fab( 结合抗原 ) 片段

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重链可变区 (VH) ，重链恒定区 (CH) ；轻链可变区 (VL) ，轻链恒定区 (CL) 。

12

CDR: 互补决定簇

Complement Determinant Region

Ag-Ab reactions is one of a key (i.e. the Ag) which fits into a lock (i.e. the Ab).

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the antibody molecular surface, with the PorA antigen superimposed.

Close up of a hydrogen bond – The Tyr 101 of the antibody forms a hydrogen bond with the Gln 121 of the antigen

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Representation of the disassociation of an antibody (top) and antigen (botton) molecule.

CDR

Epitope

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Ig Class (Isotype) Switching

Plasma cells

IgM

IgE orIgG2

IgA orIgG2b

IgG2 orIgG3

IgM/IgD

Activated B cell(centroblast)

Proliferating B cell(centrocytes)

Proliferation cytokinesIL-2,IL-4,IL-5

Differention cytokinesIL-2,IL-4,IL-5,IFN-,TGF-

IL-2IL-4IL-5

IL-2IL-4IL-5

IL-4

IFN-

TGF-

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• Ig 类型转换 (class switch ）或称同种型转换 (isotype switch) 是指一个 B 淋巴细胞克隆在分化过程中 VH ( 重链可变区 )基因片段保持不变，而发生 CH( 重链恒定区 ) 变化。

• RNA 的不同剪接：除 DNA 水平的 Ig 类型转换形式外， RNA 水平的不同剪接（ alternative RNA splicing) 也可产生不同的 Ig 类型。

17Ig 类转换

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抗体基因重排http://www.med126.com/edu/200712/18453.shtml

抗体的 L 链是由 C 、 V 、 J 三个基因簇编码的，

H 链由 C 、 V 、 D 、 J 四个基因簇编码的。

V 是编码可变区，有 300 个种类；D 编码高变区 , 有 15 ～ 20 个种类；J 编码连接 V 、 C 的结合区，有 4 ～ 5 个种类；C 编码恒定区，仅有一种。

这些外显子通过多种多样的重排，所合成出的肽链，还要再进一步进行 L 和 H 链组合，这样最后生成的抗体种类就非常多了。

抗体基因重排是发生在淋巴细胞分化的时候。

19

20

抗体的生物学活性

（ 1 ）特异性结合抗原：抗体本身不能直接溶解或杀伤带有特异抗原的靶细胞，通常需要补体或吞噬细胞等共同发挥效应以清除病原微生物或导致病理损伤。抗体可通过与病毒或毒素的特异性结合直接发挥中和病毒的作用。

（ 2 ）激活补体： IgM 、 IgG1 、 IgG2 和 IgG3 可通过经典途径激活补体，凝聚的 IgA 、 IgG4 和 IgE 可通过替代途径激活补体。

补体：可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用的血清蛋白。

（ 3 ）结合细胞：不同类别的免疫球蛋白可结合不同种的细胞参与免疫应答。。

（ 4 ）可通过胎盘及粘膜： IgG 能通过胎盘进入胎儿血流中使胎儿形成自然被动免疫。 IgA 可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。

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（ 5 ）具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。

（ 7 ）通过与细胞 Fc受体结合发挥多种生物效应 :

调理作用 —— IgG 、 IgM 的 Fc 段与吞噬细胞表面的 Fcγ

R 、 FcμR 结合，增强其吞噬能力，通常将抗体促进吞噬细胞吞噬功能的作用称为抗体的调理作用 （ opsonization ）。

细胞毒作用—— 发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。

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发现抗体意义

1. 证明适应性免疫应答具有记忆性； 2.是疫苗接种的理论基础； 3. 治疗和检测疾病。

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二、细胞工程抗体和基因工程抗体

第一代：多克隆抗血清

第二代：细胞工程抗体 ( 单克隆抗体 )

第三代：基因工程抗体

抗体技术的发展经历了三个阶段

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1 多克隆抗血清

对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（ a ）和免疫后 10 天 （ b ）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的 g 球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。

1 2

白蛋白 球蛋白

（ c ）

（ a ）

（ b ）

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多价抗原

（致敏的 B 细胞）多克隆抗体

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2 单克隆抗体

基本原理

细胞工程抗体——杂交瘤 - 单克隆抗体

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骨髓瘤细胞

致敏的 B 淋巴细胞

杂交瘤

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HAT: 次黄嘌呤 (H), 氨基喋呤 (A) 和胸腺嘧啶核苷 (T) HGPRT ：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶

氨基喋呤阻断 DNA 合成

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• 第一次筛选的原理与方法：

• 细胞中的 DNA 合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“ D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为 DNA 分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而 HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断 DNA 合成的“ D途径”。

• 另一条途径是应急途径或补救途径（“ S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（ HGPRT ）和胸腺嘧啶核苷激酶（ TK ）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。

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在 HAT培养液中，未融合的效应 B 细胞和两个效应 B细胞融合的“ D途径”被氨基喋呤阻断，虽“ S途径”正常，但因 B 细胞缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般 10d左右会死亡。

骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（ HGPRT ）细胞，因此自身没有“ S途径”，且“ D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在 HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。

惟有骨髓瘤细胞与效应 B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应 B 细胞的“ S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。

31

• 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且每种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应 B 淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应 B淋巴细胞的特异性是不同的，经 HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。

• 通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上 30%的孔中细胞数为 0 时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

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33

多克隆抗体临床治疗的问题

1. 鼠源性——导致人产生抗体， 药物耐受；

2. 用于检测比较好。

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3 基因工程抗体

通过基因重组改良抗体性能

通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体

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(1) 小分子抗体

1

2

3

Fab( 结合抗原 ) 片段

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免疫球蛋白基因载体的构建

H 链表达载体 L 链表达载体

共转染细胞

Pr VH CH1 Pr VL CL

图 5 Fab 抗体分子的制备

I Fab antibody molecule

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抗体分泌细胞

VH VL

CL-S-S-

CH1

图 5 Fab 抗体分子的制备

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VH VL

接头 DNA (Gly4Ser)3

VH 引物

PCR

VH 接头 DNA

酶切、克隆

图 7 ScFv (single chain Fv,scFv ) 的构建

变性、复性

VL 引物

(2) Sc-Fv

VL

39

40

41

(2) 抗体融合蛋白 抗原结合部位与生物活性蛋白结合

免疫导向免疫桥连嵌合受体

含 Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、

延长血清中半寿期 生物学效应功能

Fc （ fragment crystalizable, 可结晶片段）。

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Fcprotein

SPAthrombin

Fc 的作用：检测、纯化、

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G-CSF Fc

Fusion Protein

DNA ligation

expression

Fc 的作用：延长血清中半寿期

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嵌合抗体（ chimeric antibody） :在基因水平上将小鼠的 Ig 可变区与人的 Ig 恒定区嵌合在一起，所产生的抗体含有 70-80%的人 Ig 分子的序列，在很大程度上减少了单克隆抗体的免疫原性，但这种抗体尚存 20-30%的鼠源成分，在实际应用过程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。

人 - 鼠嵌合抗体

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Pr 鼠 VH 人 CH Pr 鼠 VL 人 CL

免疫球蛋白基因载体的构建

H 链嵌合载体 L 链嵌合载体

共转染细胞

启动子

人 - 鼠嵌合抗体基因工程改造策略

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鼠 VH 鼠 VL

人 CL

人 CH

抗体分泌细胞

人 - 鼠嵌合基因工程抗体

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鼠单克隆抗体 V 区的人源化

人改型抗体（ CDR 移植）

人源化抗体（ humanized antibody）又称 CDR移植抗体（ CDR grafting antibody）

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CDR 序列 CDR 序列

鼠单克隆抗体 人抗体

人源化抗体（改型抗体）

图 4 鼠单克隆 V 区人源化（ CDR移植）

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抗体库技术 抗体库——在原核系统功能性表达多样性抗体

基因 (repertoire) 通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因

三 基因工程方法研制新的单抗

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抗体库技术产生的三项技术基础

RT-PCRRT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因：能够克隆全套抗体可变区基因

抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达

噬菌体展示技术（噬菌体展示技术（ phage display)phage display)

51

52

53

54

接头 DNA

VH VL

图 2 噬菌体表面呈现的小分子抗体

基因 III 或基因 VIII

外壳蛋白 VH

VL

55

56

噬菌体抗体图示

57

抗体库的构建

58

抗体库的富集筛选

59

60

抗体库技术的应用抗体库技术的应用

● 人源抗体的制备

● 抗体性能的改良

● 不经免疫制备抗体

61

四、抗体药物的临床应

用

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抗血清

单克隆抗体

基因工程抗体

破伤风抗血清

抗肿瘤 (鼠 , 人 -鼠 )

抗肿瘤 , 自身免疫病

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急性感染 (diphtheria, tetanus, measles, rabies, etc.), 中毒 (insects, reptiles, botulism), 预防措施 (hypogammaglobulinemia).

破伤风抗毒素( 马血清 )

异源 Heterologous

同源 Homologous

人工被动免疫

人工注射人的球蛋白（ gamma-globulins ）或免疫动物的球蛋白。

I 抗血清

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1 治疗用动物免疫血清：马血清抗毒素

马血清抗毒素的两重性：

(1) 特异性抗体 ---- 中和毒素(2) 异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体。

是最理想的同源性免疫球蛋白，但具有传播肝炎和爱滋病的风险。

具有立即提供保护的优势，但异种 gamma- 球蛋白只是短期有效，常常导致病理合并症（血清病）和过敏反应。

2 人的 gamma-球蛋白

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类毒素毒素

马血清

抗毒素

超敏反应抗体

抗原

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Tumor cell

enzyme

抗体与酶分子偶联

prodrug

drug

enzyme

67

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Herceptin ( 抗体名称 )

人源化抗体

HER-2

乳腺癌 cell

69

Tumor necrosis therapy utilizes monoclonal antibodies targeting intracellular tumor antigens on necrotic (dead) tissue. This method overcomes some of the limitations of current antibody-based therapeutic approaches.

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Bright field micrograph sequence indicating the point of rupture of the cell membrane after treatment with a photosensitizer, and illumination with laser -light

Development of Novel Therapeutics Based on Antibody Targeted Photolysis

for the treatment of certain types of cancer

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表 已批准上市的治疗性单抗

2001淋巴瘤CD52人源化抗体Campath

2000淋巴瘤CD33人源化抗体化疗药物交联物

Mylotarg1998移植排斥兔多抗Thymogloblin1998RSV 感染RSV F 蛋白人源化抗体Synagis

1998乳腺癌HER-2人源化抗体Herceptin

19981999

炎症性肠病类风湿关节炎

TNF-α人 - 鼠嵌合抗体

Remicade

1998移植排斥CD25人 - 鼠嵌合抗体

Simulect

1997淋巴瘤CD20人 - 鼠嵌合抗体

Rituxan

1997移植排斥CD25人源化抗体Zenapax

1994冠心病血小板受体Ⅱ baⅢ

人 - 鼠嵌合 FabReoPr o1995大肠癌17-1A鼠单抗Panorex

1986移植排斥CD3鼠单抗OKT3

批准日期适应症靶向抗原抗体种类抗体名称

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Lymphatic vessels staining with a monoclonal antibody specific for D6.

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Antinuclear antibodies (green, FITC-labeled) from systemic lupus patients attacking human epithelial cells (HEp-2), counterstained with Evans' Blue (red).

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Pancreas stained with monoclonal antibody to NSE

Colon stained with monoclonal antibody to p53 protein.

Lymphopma stained with monoclonal antibody to CD68, macrophage

Breast carcinoma stained with HercepTest.

Intraductal breast carcinoma stained with Estrogen Receptor, clone 1D5

                     

Colon stained with Alpha Smooth Muscle Actin, clone 1A4.

Non-Hodgkin's Lymphoma stained with Bcl-2 Oncoprotein, clone 124

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