Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae Comprende più di 40 generi con un vasto numero di specie

batteriche il cui habitat naturale è rappresentato

dall’intestino dell’uomo e degli animali, ma anche dal suolo,

acque, piante, materiali in decomposizione.

CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE:

bacilli Gram negativi, mobili o immobili, asporigeni, quasi sempre capsulati, provvisti di pili

CARATTERISTICHE METABOLICHE:

aerobi anaerobi facoltativi

Fermentano il glucosio, in anaerobiosi è frequente la produzione di gas;

ossidasi negativi per l’assenza del citocromo C

catalasi positivi

CARATTERISTICHE COLTURALI:

poco esigenti: crescono nei comuni terreni di coltura.

CLASSIFICAZIONE

GLI ENTEROBATTERI VENGONO SUDDIVISI IN NUMEROSI GENERI IN BASE A:

• Caratteristiche biochimiche

• Caratteristiche antigeniche

• Caratteristiche genotopiche studi di ibridazione DNA-DNA sequenziamento rRNA16S

Caratteristiche biochimiche

• capacità di utilizzare particolare substrati come fonte di carbonio es. acidi organici o loro sali

• presenza di alcuni enzimi es. ureasi, lisina e ornitina-decarbossilasi, fenilalanina-deaminasi etc.

• produzione di specifici prodotti metabolici es. idrogeno solforato, indolo, acetoino etc.

• capacità di fermentare taluni zuccheri

CARATTERI ANTIGENI Antigene O di natura polisaccaridica (catene laterali dell'LPS) stabile al calore Antigene K posto più superficialmente rispetto all’antigene O è rappresentato dai polisaccaridi acidi che compongono lo strato mucoso stabile al calore Antigene Vi solo nelle salmonelle l’antigene K è indicato come antigene Vi Antigene H è rappresentato dalle proteine flagellari, quindi è presente nelle specie mobili

FATTORI DI VIRULENZA

polisaccaridi dello strato mucoso o della capsula azione antifagocitaria

endotossina azione tossica del lipide A

adesine

sistema di secrezione di tipo III rilascio di fattori di virulenza nelle cellule ospiti

tossine proteiche

variazione di fase e antigenica

Salmonella

>2400 sierotipi di bacilli Gram negativi, mobili per flagelli peritrichi, non fermentanti il lattosio

Descritto per la prima volta da Theobald Smith (1859-1934) e da Daniel Elmer Salmon (Salmonella choleraesuis) nel 1885

ANTIGENI

I sierotipi sono identificabili sulla base di tre tipi di Ag:

ANTIGENI O o somatici

ANTIGENI H o flagellari (presenti in tutti i sierotipi ad eccezione di S. gallinarum e S. pullorum)

Possono esistere in due forme FASE 1 e FASE 2; una data cellula esprime un Ag di fase per volta ed i due antigeni corrispondono a due diverse molecole di flagellina (es. di variazione antigenica)

ANTIGENI Vi o capsulari

Sono polisaccaridici

Sembrano associati alla virulenza

Classificazione di Kauffman e White

2 specie

S. enterica (2443 sierotipi)

S. bongori (20 sierotipi)

S. typhi S. enterica subsp. enterica serovar Typhi

S. paratyphi S. enterica subsp. enterica ser. Paratyphi

S. choleraesuis S. enterica subsp. enterica ser. Choleraesuis

S. typhimurium S. enterica subsp. enterica ser. Typhimurium

S. enteritidis S. enterica subsp. enterica ser. Enteritidis

enterica (>95% sierotipi repertabili

in materiali patologici umani)

salamae

arizonae

diarizonae

houtenae

indica

studi ibridazione

DNA-DNA

subspecies

Forme cliniche di salmonellosi

• enterite

• febbre tifoide e paratifoide

• setticemia

• colonizzazione asintomatica

• enterite

Forme cliniche di salmonellosi

è la forma più comune

• enterite

• febbre tifoide

• setticemia

• colonizzazione asintomatica

Forme cliniche di salmonellosi

•

• 6-48 h dall’ingestione di acqua o cibo contaminato

• nausea, vomito, diarrea

• febbre, dolori addominali, mialgia, cefalea

IL-8

Forme cliniche di salmonellosi

febbre tifoide

• febbre tifoide

Forme cliniche di salmonellosi

ingestione di batteri con alimenti o acqua

stomaco intestino linfonodi mesenterici circolo ematico sistema reticolo-endoteliale di fegato, milza, midollo osseo

moltiplicazione batterica

reinvasione del circolo ematico

diffusione ad altri organi

concentrazione nella cistifellea bile intestino

escrezione con le feci

cefalea, mialgia, malessere, anoressia stato stuporoso febbre alta sub-continua (39-40°C)

fine del periodo d’incubazione (10-14 giorni)

? IL-8

Shigella

Shigella

La denominazione deriva dallo scopritore Shiga che identificò tali batteri nel 1898. Sono bacilli Gram-negativi, immobili.

CLASSIFICAZIONE

Sono distinte in 4 specie o sottogruppi:

Shigella dysenteriae o sottogruppo A

Shigella flexneri o sottogruppo B

Shigella boydii o sottogruppo C

Shigella sonnei o sottogruppo D

BIOTIPI di ESCHERICHIA COLI

Shigella

L’uomo è l’ospite naturale (NO serbatoio animale)

La trasmissione della malattia avviene direttamente

da persona a persona per via oro-fecale e, meno

frequentemente, attraverso acqua e cibi

contaminati; anche le mosche possono fungere da

agenti vettori.

Le Shigelle sono in grado di dare malattia anche con

una minima carica infettante (2x102 microrganismi)

Shigella Passing Through the Mucous Membrane

and Invading Mucosal Epithelial Cells

A proposed model for invasion of epithelial cells of the colon.

1) The Shigella first cross the mucosa by passing through specialized cells called M cells. The M

cell passes the Shigella on to a macrophage from which it subsequently escapes - possibly by

inducing apoptosis, a programmed cell suicide.

2) The Shigella then uses its invasins to enter the mucosal epithelial cells from underneath. The

invasins cause actin polymer rearrangements in the cell's cytoskeleton resulting in the bacterium

being engulfed and placed in an endocytic vesicle in a manner similar to phagocytic cells. Once

inside, the Shigella escape from the vacuole into the cytoplasm and multiply.

3) The Shigella are able to move through the host cell and spread to adjacent host cells by a

unique process called actin-based motility. In this process, actin filaments polymerize at one end

of the bacterium, producing comet-like tails that propel the Shigella through the cytoplasm of the

host cell.

4) When they reach the boundary of that cell, the actin filaments push the Shigella across that

membrane and into the adjacent cell.

Sistema di secrezione

di tipo III IpaA, IpaB,

IpaC, IpaD

DISSENTERIA BACILLARE

è una malattia assai comune nei climi caldi e si associa a basse condizioni igienico-sanitarie. Maggiormente diffusa nelle collettività e in ambito pediatrico.

Il periodo d’incubazione è 2-4 gg.

I bacilli, penetrati per os, raggiungono l’intestino penetrando nelle cellule epiteliali della mucosa (ileo distale e colon) e moltiplicandosi nella sottomucosa, con formazione di microascessi e successive necrosi e ulcerazioni superficiali. Abitualmente non viene invaso il circolo ematico.

Sintomatologia da moderata a grave. Diarrea solitamente acquosa all’inizio (produzione di 2 enterotossine, ShEt1 e ShEt), successivamente compaiono sangue e muco.

• Nelle forme sostenute da Shigella dysenteriae tipo 1, produttrice della tossina di Shiga, sono possibili complicanze quali: colite emorragica, sindrome uremico- emolitica.

Terreno di Amies Selenite Broth

18-24 h 35°C

Hektoen Enteric Agar

Xylose-Lysine-Desoxycholate (XLD) Agar

SS Agar

18-24 h 35°C

18-24 h 37°C

18-24 h 35°C

Protocollo diagnostico Salmonella e Shigella nelle feci

ARRICCHIMENTO

Terreni selettivi e differenziali

ENTEROBATTERI

subcolture

Test biochimici

Reazioni sierologiche

(ricerca antigeni O per Shigella, ricerca antigeni O e antigeni H per Salmonella)

IDENTIFICAZIONE COMPLETA DI SPECIE

S. typhi

Escherichia coli

Bacillo Gram negativo mobile lattosio-

fermentante

Fa parte della normale flora intestinale umana

(rappresenta la specie aerobia facoltativa

predominante della comunità batterica residente

a livello dell’intestino crasso)

Escherichia coli

Escherichia coli

È causa di:

• Infezioni urinarie

• Setticemie

• Meningiti neonatali

• Gastroenteriti

infezioni endogene

infezioni esogene

Escherichia coli

Patotipi:

• Enteritogeni

• Extraintestinali

Enteropatogeni Enterotossigeni Enteroemorragici Enteroinvasivi Enteroaggreganti Diffusamente aderenti

Uropatogeni Causa di meningiti neonatali Aderenti invasivi Necrotossigeni Cell detaching E. coli

Escherichia coli

Sequenziamento ceppi E. coli isolati:

• core genome: circa 2200 geni

• pan-genome: circa 13000 geni

• genoma maggior parte E. coli patogeni:

circa 5000 geni

SETTICEMIA

E. coli è il bacillo Gram-negativo più frequentemente isolato da pazienti setticemici.

La setticemia generalmente origina da un’infezione delle vie urinarie o del distretto gastroenterico. È favorita dalla presenza di una patologia di base del paziente (diabete, neoplasie, emopatie) o da condizioni di immunocompromissione.

Escherichia coli

UPEC

adesine: pili tipo 1, pili P, pili S

siderofori: enterobactina, aerobactina

Tossine: emolisina formante-pori; tossina autotrasporter

secreta (Sat)

IBC: intracellular bacterial communities

Escherichia coli

STIPITI ENTERITOGENI

•E. coli enteropatogeni (EPEC)

•E. coli enterotossigeni (ETEC)

•E. coli enteroemorragici (EHEC)

•E. coli enteroinvasivi (EIEC)

•E. coli enteroaggregativi (EAEC)

•E. coli diffusamente aderenti (DAEC)

ETEC O6 H16

O8 H9

O11 H27

O15 H11

O20 NM

O25 H42, NM

O27 H7

O78 H11, H12

O128 H7

O148 H28

O149 H10

O159 H20

O173 NM

EPEC O55 H6, NM

O86 H34, NM

O111 H2, H12, NM

O119 H6, NM

O125ac H21

O126 H27, NM

O127 H6, NM

O128 H2, H12

O142 H6

Classificazione secondo Kauffman

e White

ENTEROPATOGENI (EPEC)

Rappresentano la causa più frequente di diarrea infantile nei paesi in via di sviluppo.

Sono responsabili di diarrea acquosa, anche persistente, spesso associata a vomito e febbre.

Privi di potere tossinogeno o invasivo, sono dotati di un

particolare carattere di adesività localizzata alle cellule

dell’intestino tenue, mediata inizialmente da pili a fasci

(Bfp) e quindi dall’intimina il cui recettore (Tir) viene

inserito nella membrana della cellula epiteliale

attraverso un sistema di secrezione di tipo III.

L’adesione degli EPEC ai microvilli ne causa la distruzione

con conseguente diarrea da malassorbimento.

microcolonie

http://jb.asm.org/content/vol187/issue2/images/large/zjb002054364002c.jpeg

Immagine al microscopio elettronico che mostra EPEC aderenti all’orletto a spazzola delle cellule della mucosa intestinale con evidente distruzione localizzata dei microvilli.

ENTEROTOSSIGENI (ETEC)

Importante causa batterica di diarrea infantile nei paesi in via di sviluppo, più comune causa di diarrea del viaggiatore.

Causano una tipica diarrea acquosa con nausea, crampi addominali e febbre di modesta entità.

Nella patogenesi delle lesioni indotte dagli stipiti ETEC, che aderiscono (Colonization Factor Antigen 1 and 2 (C.F.A.)) a specifiche regioni della membrana delle cellule epiteliali del’intestino tenue, svolge un ruolo fondamentale la produzione di:

• enterotossina termolabile (LT-1 e LT-2) meccanismo d'azione simile alla tossina colerica (diarrea per aumento dell'AMPc)

• enterotossina termostabile (ST-a e ST-b) meccanismo d'azione diverso da quello della LT ma con effetto finale molto simile (diarrea per aumento di GMPc)

ENTEROEMORRAGICI (EHEC)

Bassissima carica infettante (circa 50 batteri)

La maggior parte dei casi di malattia è stata attribuita al consumo di carne macinata di manzo contaminata durante la lavorazione e consumata poco cotta (MALATTIA DELL’HAMBURGER); consumo di acqua o di latte o succhi di frutta non pastorizzati, verdura cruda, frutta.

Principalmente appartenenti al sierotipo O157:H7, riconosciuto una causa crescente di infezioni acquisite per via alimentare. Sono i ceppi più comunemente responsabili di malattia nei Paesi industrializzati.

ENTEROEMORRAGICI (EHEC)

Dopo aver aderito alla mucosa dell’intestino crasso, producono 2 potenti citotossine (Verotossine o Shiga-like toxin (Stx) 1 e 2) una delle quali (Stx-1) identica alla tossina di Shiga prodotta da Shigella dysenteriae sierotipo 1, mentre la Stx2 presenta il 60% di omologia.

Sono tossine di tipo AB; il frammento attivo si lega ad uno specifico glicolipide sulle cellule bersaglio (globotriaosilceramide) particolarmente abbondante sulle cellule intestinali e sulle cellule endoteliali renali. La porzione attiva della tossina una volta all’interno delle cellule si lega all’rRNA 28S bloccando la sintesi proteica con conseguente distruzione dei villi intestinali, malassorbimento ed escrezione di fluidi. Gli effetti a distanza ad esempio sul rene sono conseguenti all’entrata in circolo.

Manifestazioni cliniche associate agli stipiti EHEC molto varie:

diarrea

colite emorragica (30-60% dei casi)

sindrome uremica emolitica (5-10% bambini <10 anni infetti)

insufficienza renale acuta

piastrinopenia

anemia emolitica microangiopatica

ENTEROEMORRAGICI (EHEC)

ENTEROINVASIVI (EIEC)

colonizzano la mucosa del colon e ne invadono le cellule attraverso un meccanismo di endocitosi; lisano il vacuolo endocitotico, si moltiplicano all’interno della cellula che viene uccisa, e diffondono alle cellule adiacenti provocando distruzione tissutale e un’intensa risposta infiammatoria.

La loro patogenicità è legata ad una ISOLA DI INVASIVITÀ che include numerose proteine della membrana esterna tutte codificate da un plasmide.

Sono responsabili clinicamente di una forma dissenterica simile a quella causata dalle Shigelle caratterizzata da:

febbre, crampi addominali, malessere

emissione di feci prima acquose poi mucosanguinolenti, ricche di PMN

ENTEROAGGREGANTI (EAEC)

Derivano il loro nome dalla caratteristica modalità di adesione alle colture tissutali, consistente nella formazione di aggregati a “pila di mattoni”.

ENTEROAGGREGANTI (EAEC)

Colonizzano l’intestino tenue, provocando diarrea acquosa persistente specialmente infantile nei Paesi in via di sviluppo; possono causare diarrea cronica con ritardo della crescita.

Potrebbero essere una causa importante sottostimata di diarrea infantile nei Paese industrializzati.

Aderiscono mediante fimbrie di adesione aggreganti (AAF/I, AAF/II, AAF/III) e stimolano la produzione di muco da parte delle cellule della mucosa intestinale, da cui i batteri risultano inglobati formando un biofilm.

Producono 2 tipi di tossine:

tossina enteroaggregante termostabile

tossina plasmidica

DIFFUSAMENTE ADERENTI (DAEC)

Aderiscono alle colture tissutali senza formazione di aggregati. Stimolano l’allungamento dei microvilli.

E. coli enteritogeni: meccanismi patogenetici

Nataro J. P. and Kaper J. B. Clinical Microbiology Reviews. 1998

Protocollo diagnostico UPEC

McConkey Agar

Colonie rosa acceso

Identificazione biochimica e antibiogramma

Protocollo diagnostico NMEC

McConkey Agar

Colonie rosa acceso Identificazione biochimica e antibiogramma

Protocollo diagnostico EPEC

Eosin Methylene Blue (EMB) Agar, Levine

Tipizzazione sierologica

Terreno di Amies

24 h, 37°C

Colonie verde-metallico, confluenti

McConkey Agar

Colonie rosa acceso

Eosin Methylene Blue (EMB) Agar, Levine

Tipizzazione sierologica

Terreno di Amies

ricerca produzione di enterotossina

(test immunologici per LT, prove biologiche per ST,

sonde genetiche per i geni LT e ST)

24 h, 37°C

Colonie verde-metallico, confluenti

Protocollo diagnostico ETEC

Diarrea infantile e dei viaggiatori

Protocollo diagnostico ETEC

Terreno di Amies

Sorbitol Mac Conkey Agar

Tipizzazione sierologica O157:H7

24 h, 35°C

Colonie sorbitolo-ramnoso negative

HUS (Sindrome emolitica uremica)

Protocollo diagnostico EHEC

ricerca produzione tossina Shiga-like (test immunologici, biologici o molecolari)