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A.A. Propiedades generales de las enzimasPropiedades generales de las enzimas
B. Principios fundamentales de su acción catalítica
Enzimas
C. Introducción a la cinética enzimática
D. Enzimas regulador
A) Propiedades generales de las enzimas
1. Son los catalizadores de las reacciones químicas en
los sistemas biológicos
2. Aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones
(106 – 1014 veces).(10 – 10 veces).
3. La actividad
catalítica
depende de la
integridad de la
estructura
nativa
SITIO ACTIVO: SITIO ACTIVO:
Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate
Interacciones no covalentes
Cambios conformacionales
Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-formingreactions involved)
HoloenzimaHoloenzima: : ApoenzimaApoenzima (parte (parte proteica, inactiva) +proteica, inactiva) +
Grupo prostético : hemo en los citocromos(unión fuerte, covalente)
Carácter inorgánico (iónes metálicos)
Cofactor (unión debil)
Carácter orgánico (NADH, FAD, Vitaminas, etc): Coenzimas
http://www.biorom.uma.es/contenido/cibertexto/enz/en z3.htm#mm
depa.pquim.unam.mx/proteinas/enzimas/img17.html
4. ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO4. ESPECIFICIDAD DE SUSTRATOComplementariedad GeométricaComplementariedad GeométricaComplementariedad electrónica Complementariedad electrónica (grupos(gruposde los de los aaaa que forman el sitio de unión)que forman el sitio de unión)Absolutamente específicaAbsolutamente específicaSólo actúa sobre un sustratoGrupo específicaGrupo específicaActúa sobre moléculas que compartenuna característica estructural una característica estructural (gpo. funcional)Enlace específicaEnlace específicaCataliza una combinación específica deenlacesLas E son Las E son estereoespecíficasestereoespecíficas(en virtud de su (en virtud de su quiralidadquiralidadinherente a L inherente a L aaaa forman sitios activos asimétricos)forman sitios activos asimétricos)Actúa sólo sobre uno de los estereoisómeros(D o L)Las E varían en especificidad geométrica
5. La ACTIVIDAD de las E depende no solo del
mantenimiento de su estructura nativa sino del pH,
temperatura
6. Control regulatorio: 6. Control regulatorio:
Efecto sobre la actividad catalítica por un efector (activador o inhibidor) hasta el control de la expresión y el turnover de proteínas
Las enzimas alteran las velocidades de reacción pero no los equilibrios
(B) E + S ES EP E + P
(A) S P
energia de activación, v
(A) (B) Cambio de energia libre (equilibrio)
∆G fijación
Un equilibrio viene descripto por una constante de equilibrio
K´eq= [P]/ [S]
∆G’° = -RT ln keq
La constante de equilibrio es un reflejo de la variación de energía libre estandar gobal de la reacción
Para una reacción unimolecular la velocidad de una reacción viene Para una reacción unimolecular la velocidad de una reacción viene determinada por la concentración de sustrato (reactivos) y por una constante de velocidad (s-1)
V= k [S]
Si una reacción de primer orden tiene una constante de velocidad de 0,03 se puede interpretar que el 3% de sustrato será convertido en producto en un segundo
De donde De donde viene la viene la energía que energía que proporciona el proporciona el
Interacciones débiles no covalentes entre la
E y el S: puente hidrógeno,
interacciones iónicas e hidrofóbicas
Energía de fijación: es la principal fuente de energía libre utilizada utilizada por las
enzimas para disminuir la energía de activación de las reacciones
Disminuye la entropía
Disminuye la solvatación
Ayuda a la redistribución electrónicaCambios conformacionales: teoría del encaje inducido
Los grupos
La energía obtenida a partir de la formación de una sola interacción debil es entre 4-30 KJ/mol
proporciona el proporciona el descenso descenso espectacular espectacular de la Energía de la Energía de activaciónde activación
Interacciones covalentes entre la E y el S reducen la energía de activación:
Los grupos funcionales catalíticos
pueden formar enlaces covalentes
transitorios
Los grupos funcionales del S pueden transferirse
transitoriamente a la Enzima
La energía de fijación entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacción y
catálisis
30 KJ/molPara una reacción global se necesitan 60-100 kJ/mol
SITIO ACTIVO: SITIO ACTIVO:
Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate
Interacciones no covalentes
Cambios conformacionales
Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-formingreactions involved)
Mecanismos Mecanismos catalíticoscatalíticos
Catálisis ácidoCatálisis ácido--basebase
Catálisis covalente o Catálisis covalente o nucleofílicanucleofílica
Intermediario cargado inestableIntermediario cargado inestable
Descomponer en sus Descomponer en sus especies reactivasespecies reactivas
Se puede estabilizar Se puede estabilizar transfiriendo protones transfiriendo protones (agua, (agua, aaaa, , acidosacidosorgánicos)orgánicos)
A-B A + BH2O
A-B + E-X: A-X + B A+X: + BH2O
Catálisis de iones metálicosCatálisis de iones metálicos
Efectos de proximidad y Efectos de proximidad y orientaciónorientación
Unión preferencial del complejo del estado Unión preferencial del complejo del estado de transiciónde transición
1. Por unión a sustratos para orientarlos adecuadamente2. Por mediación de reacciones de oxidoreducción3. Por estabilización electrostática o protección de las cargas negativas
La mayoria de las enzimas utilizan una combinación de estrategias catalíticas para conseguir un incremento de la velocidadGrupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis
Catálisis covalente: ruptura de enlace peptidicoCatálisis básica: grupo hidroxilo actua como nucleófilo
* La presencia de restos aminoacídicos cargados en el centro activo puede estabilizar el estado de transición, y por tanto contribuir a la
catálisis enzimática.La catálisis enzimática debida a un mecanismo de catálisis ácido-base
concertada, es muy frecuente, y como ejemplo podemos ver la hidrólisis de un éster por una esterasa:
Variables o factores que influyen en la velocidad de unareacción enzimática
La cinética enzimática como método para comprender el mecanismo de acción de una enzima
1. Concentración de sustrato2. Concentración de enzima3. pH4. Temperatura5. Efectores (Activadores e Inhibidores)
La concentración de sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas
+ E + Buffer de pH apropiado
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:
Hipótesis de Michaelis - Menten
E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
- La primera parte del mecanismo,
La concentración de sustrato afecta la velocidad de una reacción catalizada por Enzimas
E + S ESk+1
k-1
Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:
ES E + Pk+2
Hipótesis de Michaelis - Menten
E + S ES E + Pk+1
k-1
k2
EQUILIBRIO RÁPIDO
La segunda reacción es la mas lenta. El paso que limita la velocidad de la reacción, es la descomposición del complejo ES
Significado de la constante Km
1. Constante de equilibriode disociación del complejo ES(en condiciones de equilibrio rápido)
2. Medida inversa de la afinidadde la enzima por el sustrato(en condiciones de equilibrio rápido)
3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)
4. Concentración de sustrato para la que la velocidad se haceigual a la mitad de la máxima (V0.5)
5. Se define para un complejo enzima-sustrato
6. Se mide en unidades de concentración
Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.
E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
Cuando k2 es menor que K-1Km = k-1/k+1
Entonces Km se define como una constante de disociación del complejo ESMuchas veces las reacciones enzimáticas transcurren en pasos múltiples después de la formación del complejo ES, en estos casosKm es una función compleja de muchas constantes de velocidad
� La quimiotripsina,por ejemplo, procede con un mecanismo de este tipo:
K1
Del primer complejo ES se libera velozmente un primer producto P1Mientras el complejo ES' tiende a acumularse en tanto la constantecinetica de trasformacion en E y P2 resulta mas pequeña que la constantecinetica de transformacion del complejo ES in ES' ( k4<<k3).
En este caso Vmax = K4 [Et]
Por ello es útil definir una constante de velocidad mas general: Kcat para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática en condiciones de saturación
[S] << Km v= kcat/km [E] [S]Velocidad de segundo orden
� La kcat es una constante de velocidad limitante de cualquier�reacción en condiciones de saturación.En un mecanismo simple de Michaelis-Menten o Briggs-Haldanekcat = k2 .
� La constanteconstante cataliticacatalitica kk catcat numeronumero dedeturnoverturnover oo recambiorecambio
Cuando la enzima es saturado por el sustrato es decir
[S] >> km :
La comparación de la eficiencia catalítica de diferentes enzimas requiere la selección de parámetros adecuados. La selección de Kcat no es totalmente satisfactoria. DOS E QUE CATALIZAN REACCIONES DIFERENTES PUEDEN TENER LA MISMA kcat
� Un parámetro mas útil es laconstante de especificidad
Para [S] << Km la Para [S] << Km la ecuaciónecuación VmaxVmax
asume la siguiente forma:
El cociente kcat/Km es una constante de velocidad aparente de segundo orden para la formación de E+P a partir de E+S cuando el proceso depende del encuentro de E con S ([S] << Km).
Límite superior de Kcat/Km 108 y 109 M-1 S-1 Perfección catalítica
= Vmax/Km [S]
Representación s -s/v(Eadie - Hofstee)
s/v
0.6
0.8
1.0
1.2
s-20 0 20 40 60 80 100 120
0.0
0.2
0.4
0.6
s
v Vs
K
Vmx
m
mx
= ⋅ +1
-Km
Representación v/s - v(Wong - Hanes)
v
80
100
v Kv
sVm mx= − ⋅ +
Vmax
v/s0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la
Efecto del pH
neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo.
COO-
CH2
CH2
COO-
+H3NC
NH
NH
CH
+H N
Arg
Lys
Succinato ycentro activo de SDHpH 7
+H3N
CH
Lys
COOH
CH2
CH2
COOH
+H3NC
NH
NH
CH
+
Succinato ycentro activo de SDH,pH 2
+H3N
CH
COO-
CH2
CH2
COO-
H2NC
NH
NH
CH
H NH2N
CH
Succinato ycentro activo de SDH,pH 13
Efecto de la temperaturaEfecto de la temperatura
Log V
1/T
1. Aceleración de la reacción por la T según la ecuaciónde Arrhenius
k = A exp (-Ea/RT)En condiciones definidas de pH, fuerza iónica y S
log v = log C – Ea/2,3RT
EfectoresEfectoresMuchas sustancias alteran la actividad de una E al combinarseMuchas sustancias alteran la actividad de una E al combinarsecon ella en una forma que influencia la unión con el S, su número con ella en una forma que influencia la unión con el S, su número de recambio o ambosde recambio o ambos
Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través De interacciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).
Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática
De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:
I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la
molécula, produciendo un cambio conformacional conrepercusión negativa en la actividad enzimática.
Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:
E + I E’
ES + I ESI
Inhibición reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato: Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lohaga o no el sustrato; el inhibidor, por tanto, no impide lafijación del sustrato a la enzima, pero sí impide la acciónfijación del sustrato a la enzima, pero sí impide la accióncatalítica: Inhibición No Competitiva
(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustratouna vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipose conoce como Inhibición Anticompetitiva
E ES
EI
I
S
E + P
Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:
K i = [E] [I]
[EI]
Inhibición Competitiva
EICaracterísticas:- Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes- A muy altasconcentraciones de sustrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químicodelsustrato.
-El inhibidor es tan específicocomo el sustrato--Un inhibidor competitivo reduce la [E] libre disponible para la unión Un inhibidor competitivo reduce la [E] libre disponible para la unión --con el Scon el S
inhibidor:K i = [EI]
Km aparente = α Km
α= Km aparente/km
α= 12/8 = 1,5
Problema 1: En ausencia de un inhibidor competitivo una E tiene un Km= 8 µ M y en presencia de 3 µ M de inhibidor tiene un km aparente de 12 µ M . Calcule Ki
α= 12/8 = 1,5
α= 1 + [ I ] / ki
Ki = [ I ] / α - 1
Ki = 3/1,5- 1 = 6 µM
Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de laKm, que aparece multiplicada por el factor (1 + I/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del sustrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potenciadel inhibidor competitivo.
COO-
CH2
CH
FAD FADH2COO-
CH
Succinato deshidrogenasa COO-
CH2
COO-
Malonato
Inhibidorescompetitivos
No puede CH2
COO-
CH
COO-
Succinato Fumarato
SDH
COO-
C O
CH2
COO-
Oxalacetato
No puede deshidrogenarse
Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)
- El inhibidor no es estrictamente análogo del sustrato,sino del Estado de Transición de la reacción.sino del Estado de Transición de la reacción.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, delorden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte quepuede considerarse irreversible
O2N OC
O
O
N+H3C
CH3
CH3
Sustrato
O2N OC
ON+
H3CCH3
CH3
-O O-
Estado de transición
H CO
O2N OP
ON+
H3CCH3
CH3
-O O-
O2N OH + ON+
H3C
CH3
CH3
C
O
HO Productos
Análogo deestado de transición
E ESI
S
E + PI
SInhibición
No Competitiva
Inhibición no competitiva
EI ESI
S No Competitiva
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-sustrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos
αααα’/Vmax
E ES
S
E + PI
Inhibición
Ks K3
KI
ESI
InhibiciónAnticompetitiva
El inhibidor sólo puede fijarse reversiblemente al complejo ES;el complejo ESI no es productivo
αααα’/Vmax
αααα´/Km
Inhibición Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupoquímico de la enzima, modificándola covalentemente
-Su acción se describe por una constante de velocidad k i:
E + I E’E + I E’
- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de losinhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacióndel inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamentetóxicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Reactivos de grupos -SH, 1
(a) Agentes alquilantes
E SH E S CH2 COO-
ICH2 COO- IHYodoacetato
(b) Compuestos insaturados
N CH2 CH3
O
O
E SHE S
N CH2 CH3
O
O
N-Etil maleimida (NEM)
Reactivos de grupos -SH, 2
(c) Formadores de mercáptidos
HOHg COO-
E SH E S Hg COO-
p-Hidroximercuribenzoato
E SH E S Hg COO-
(d) Oxidantes
Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro
Organofosfóricos
CH CH2 OHSer
PF O
CHCH3H3C
CH CH2 O P O
CH
CH
H3C CH3
CH3H3C
Ser
PF O
CHH3C CH3
DFP:diisopropilfluorofosfato
- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa- Neurogases
Ligandos de coordinación de metales
Es el caso del ion cianuro, CN-
Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.
Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad
Inhibidores suicidas(Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de maneraespecífica, igual que el sustrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma lamolécula en una especie química muy reactiva que modificacovalentemente a la enzima, inactivándola
- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivola especificidad del inhibidor competitivoy (b) la potencia de los inhibidores irreversiblesla potencia de los inhibidores irreversibles
E + I EI EI* E’ + I*
Modo de acción de los inhibidores suicidas
1 2 3
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o uninhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor Ien una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándolade forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
Ejemplos de inhibidores suicidas, 1
- Sistema de la ββββ-lactamasa bacteriana
La utilización masiva de antibióticos ββββ-lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son porproducir una enzima, la ββββ-lactamasa, que inactiva a los antibióticos ββββ-lactámicos.
R CO NH S
NO
CH3
CH3
COO-
ββββ-Lactamasa
Penicilina (activa)
R CO NH S
HN
CH3
CH3
COO-
CO
O-
ββββ-Lactamasa
Ác.peniciloico (inactivo)
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la ββββ-lactamasa, el ácido clavulánico
O
NO
COO-
CCH2OH
Hββββ-Lactamasa O
HN
COO-
CCH2OH
H
CO
O-
Ác.clavulánico COO
O
HN
COO-
CCH2OH
H
CO
OCH2CHSer
Esta moléculareacciona con la
serina activa de laββββ-lactamasa,
produciendo suinactivación
Ác.clavulánico
Reacciones Reacciones multisustratosmultisustratos
ATP: hexosa fosfotransferasa
Nombre sistemático:
Donador Aceptor
Grupo transferido
Sustrato Km
ATP 0,4
D-glucosa 0,05
D-fructosa 1,5
Grupo 1: OxidorreductasasCatalizan reacciones de oxidorreducción
Ared + Box Aox + Bred
Glucosa + OGlucosa + O2
Grupo 2: Transferasas
Catalizan reacciones de transferencia de grupo:
A-X + B A + B-X
Dador: Aceptor - Grupo transferido - transferasaDador: Aceptor - Grupo transferido - transferasa
ATP: D-Hexosa FosfotransferasaEC 2.7.1.1
Nombre común: hexokinasa
Grupo 6: Ligasas
Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensasde la hidrólisis de un enlace de alta energía.
A + B + ATP A-B + ADP + PiA + B + ATP A-B + ADP + Pi
O bien
C + D + ATP C-D + AMP + PPi
Mecanismos cinéticos de las reacciones con más Mecanismos cinéticos de las reacciones con más
de un sustratode un sustrato
11-- Desplazamiento simple: OrdenadoDesplazamiento simple: Ordenado-- al azaral azar
22-- Doble desplazamiento o ping pongDoble desplazamiento o ping pong
Desplazamiento simple ordenado
SS11= A= A
SS22=B=B
PP11= P= P
PP22= Q= Q
NAD Y NADPH NAD Y NADPH
(SUST.CONDUCTOR o (SUST.CONDUCTOR o
SUSTRATO ADELANTADO)SUSTRATO ADELANTADO)
DESHIDROGENASASDESHIDROGENASAS
AA BB PP QQ
EE
EAEA (EAB)(EAB)--(EPQ)(EPQ)EQEQ EE
AA PP BBQQ
EE
EAEA--EPEP FF FBFB--FQFQ EE
D-GALACTOSA+ATP-Mg+2D-GALACTOSA-1P +ADP -Mg+2
galactoquinasa
Desplazamiento simple al azarDesplazamiento simple al azar
PingPing--PongPong
E
E-N + R-OPO3-2 E-N-PO3
-2
R-OH
ENPO3-2 EN + R*-OPO3-
2
R*OH
fosfogliceromutasa
E-SH + CH3COSCoA E-SHCH3COSCoA ES-COCH3
HSCoA
ESH + RNHCOCH3
RNH2
COOH
CHH2N +
COOH
C O
COOH
CHH2N
COOH
C O +
Aminotransferasas (Transaminasas)
Catalizan la interconversión reversible de aminoácidosy cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor
EnzEnz--pirCHOpirCHO
2
R1 R2
CHH2N
R2
C O
R1
+
Su papel es importantísimo en el metabolismo deaminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:
EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)
COO-
CH+H3N
CH2
COO-
+
COO-
C O
CH2
CH2
COO-
COO-
C
CH2
COO-
O
COO-
CH
CH2
CH2
COO-
+H3N
+
Aspartato aminotransferasa, EC 2.6.1.1 (AST, GOT)
COOCOO-
COOCOO-
Aspartato α-Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato
Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metabólicamentemuy activos. Su nivel se eleva en el suero ante afeccioneshepáticas y miocárdicas.
Alanina aminotransferasa, EC 2.6.1.2 (ALT, GPT)
COO-
CH+H3N
CH3
+
COO-
C O
CH2
CH2
COO-
C
CH3
O
COO-
CH
CH2
CH2-
+H3N
+
COO- COO-
α-Cetoglutarato GlutamatoAlanina Piruvato
Enzima citosólica, de elevada concentración en el parénquimahepático. Se considera casi específica de lesión hepática.
CH3
N CH2 COOHCHN
NH2
ATP ADP CH3
N CH2 COCHN
NH2
O P O-
O-
O
Creatina Creatin fosfato
Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)
Creatina Creatin fosfato
Creatin fosfato es una forma de almacenamiento de enlacesricos en energía en el tejido muscular. Es el prototipo de loscompuestos conocidos como fosfágenos.
v =v =VVmaxmaxss
KKmm + s+ s
VV [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]
En un mecanismo de desplazamiento simpleEn un mecanismo de desplazamiento simple
v =v =VVmaxmax 11 [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]
KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]] + + K K ssAA K K mm
BB
En mecanismo al azar K K ssAA K K mmBB = K K ssBB K K mmAA
VV [[[[[[[[PP]]]]]]]][[[[[[[[QQ]]]]]]]]
PARA LA REACCION EN SENTIDO CONTRARIOPARA LA REACCION EN SENTIDO CONTRARIO
v =v =VVmaxmax 11 [[[[[[[[PP]]]]]]]][[[[[[[[QQ]]]]]]]]
KKmm QQ [[[[[[[[PP]]]]]]]] + + KmKmPP [[[[[[[[QQ]]]]]]]] + + [[[[[[[[PP][][][][][][][][QQ]]]]]]]] + + K K ssQQ K K mm
PP
En mecanismo al azar K K ssAA K K mmBB = K K ssBB K K mmAA
Para A variable y B constante y saturantePara A variable y B constante y saturante
REPRESENTACION GRAFICA DE 1/V EN F DE 1/A A CONCENTRACION FIJA DE B
v =v =VVmaxmax [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]
KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]] + + K K ssAA K K mm
BB
v =v =VVmaxmax [[[[[[[[AA]]]]]]]][[[[[[[[BB]]]]]]]]
KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]]
Doble desplazamiento o ping pongDoble desplazamiento o ping pong
KKmm BB [[[[[[[[AA]]]]]]]] + + KmKmAA [[[[[[[[BB]]]]]]]] + + [[[[[[[[AA][][][][][][][][BB]]]]]]]]
11
vv=
K mK mAA
VmaxVmax
11
[[[[[[[[AA]]]]]]]]++
11
VmaxVmax
((((((((1 + K m1 + K mBB))
[[[[[[[[BB]]]]]]]]
11
vv=
K mK mAA
VmaxVmax
11
[[[[[[[[AA]]]]]]]]++
11
VmaxVmax
((((((((1 + K m1 + K mBB))
[[[[[[[[BB]]]]]]]]
Mecanismo Producto inhibidor
Sustrato variable
A B
Ordenado P NC NC
Los mecanismos de reacción pueden caracterizarse además medianteestudios de inhibición por los productos de reacción
Ordenado P NC NC
Q C NC
Al azar P C C
Q C C
Ping-Pong P NC C
Q C NC
Enzimas reguladorasEnzimas reguladoras1. Enzimas 1. Enzimas alostéricasalostéricas
Son reguladas por unión noSon reguladas por unión no--covalente de covalente de moduladoresmoduladoresmoduladoresmoduladores
2. Enzimas reguladas por 2. Enzimas reguladas por modificación covalentemodificación covalente
Retroalimentación negativa en vías metabólicas, 1
Thr α-cetobutirato IleTreonina
desaminasa
Síntesis de Isoleucina
desaminasa
El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primeraenzima de la misma, Treonina desaminasa
Retroalimentación negativa en vías metabólicas
Asp + CP Carbamil aspartato CTP
Síntesis de pirimidinas
ATCasa
ATP+
ATCasa
El producto final de la vía, CTP (citidin trifosfato) inhibe a laprimera enzima de la ruta metabólica, Aspartato transcarbamilasa
Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activadapor ATP
Rutas metabólicas controladas por retroalimentación
Glicolisis Fosfofructokinasa ATPNeoglucogénesis FBP fosfatasa AMPBios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoA
Ruta Enzima Inhibidor
Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoABios. Colesterol HMGCoA reductasa ColesterolBios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP
1 2
1: Arogenato deshidratasa: inhibida por Phe y activada por Tyr
2: Arogenato deshidrogenasa inhibida por Tyr
En el estudio de las enzimas controladas por realimentaciónnegativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:
1. Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede
desensibilizarse a sus inhibidores por diversos métodos.3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor
de la K aparente, pero sin embargo no son análogos estructuralesde la Km aparente, pero sin embargo no son análogos estructuralesdel sustrato
Estas últimas características lleva al concepto de alosterismo:Una acción sobre la actividad enzimática que se desarrollafuera en el sitio de fijación fuera del sitio catalítico (Jacob y Monod, 1960)
Modelo de simetría- Modelo secuencial
s si
Centroactivo
Centroalostérico
Centroalostérico
Centroactivo
En ausencia de inhibidor,el sustrato se fija normal-mente al centro activo
Cuando el inhibidor ocupael centro alostérico, tienelugar un cambio conformacionalen el centro activo que impide lafijación del sustrato
Inhibición alostérica
Acción de un activador alostérico
(esquema de una subunidad)
Acción de un inhibidor alostérico
(esquema de una subunidad)
Otra característica importante de las enzimas alostéricases que presentan cinéticas anómalas, normalmentecinéticas sigmoides:
v
s
La presencia de unasigmoide implicala existencia decooperatividaden lafijación del substrato
Un incremento pequeño en la concentración de SSe pueden asociar con grandes cambios en la actividad De la E
La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de unamolécula de sustrato favorece la fijación del siguiente, y asíhasta ocuparse toda la molécula
s s s ss ss
ss s
+ + +
1 2 3s s s1 2 3
En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3
Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación deuna molécula de sustrato dificulta la fijación del siguiente.
El comportamiento cooperativo implica:
1. Que hay más de un sitio de fijación de sustratopor molécula de enzima (estr.cuaternaria)
2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación
Efecto de moduladores positivos y
Enzima homotrópica S es el efector
Efecto de moduladores positivos y negativos que no afectan la Vmax
Efecto de moduladores positivos y negativos que no afectan la K0,5 pero si la Vmax
Enzimas reguladoras
2. Modulación covalente reversible
• Fosforilación
• Adenililación
• Uridililación
• ADP-ribosilación
• Metilación
• Carbamilación
Formas de modificación covalente, 1
Fosforilación: Protein kinasas
Ser
ATP ADP
Ser
C
NC
C CH OHO
H
R H
H
CN
CC CH O
O
HR
P O-
O
H
H
Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr
Ser SerC
NC
CN
CH2OH
HO
R'H
H
H
CN
CC
N
CH2OH
OR'
H
P O-
O-
H
H
Formas de modificación covalente, 2
Defosforilación: Protein fosfatasas
Ser Ser
C
NCO
H
R HC
NCO
H
R
-
O
HH2O Pi
Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P
Ser Ser CN
CC
N
CH2OHH
OR'
H
H
H
CN
CC
N
CH2OH
OR'
H
P O-
O-
H
H
Formas de modificación covalente, 3
Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa
N N
N
H2NC
N
CO
HR
O
H
Tyr O
OH OH
N NC
CN
C
CN
O
H
O
R'H
CH2 O P
O-
O CH2H
H
Formas de modificación covalente, 4
ADP-ribosilación: actúa NAD+ como donador delgrupo ADP-ribosa
HH2N
CR H
H
H
O
OH OH
N
N N
N
+
CN
CC
NC
CN
OH
R
HO
R'H
NHC
NH2
N
O
OH OHCH2 O P O P O CH2
O O
O-O-H
Activación de la Rubisco por carbamilación
Formas de modificación covalente, 5
Rotura proteolítica:
Proteinasa
N C Zimógeno
Proteinasaespecífica
+N N CC
Enzima activada
Protrombina (II)
Protrombinasa
Precursores,vía intrínseca
Fase 1Fase 2
Fibrinógeno (I)Monómero
de fibrina (Ia)Polímerode fibrina
Trombina (IIa)
Precursores,vía extrínseca
Fase 3