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Cinética enzimática, factores que afectan, inhibición enzimática, regulación y organización.
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Pedro Coila
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA
•Cinética enzimática
•Medición de la Actividad Enzimática (AE)
•Factores que afectan la AE
•Inhibición enzimática
•Regulación enzimática
•Problemas
Estudia la velocidad de las reacciones enzimáticas y los factores que la afectan.
La Velocidad o Actividad Enzimática (AE) puede ser determinado midiendo la cantidad de S consumido (o P formado) en una unidad de tiempo bajo condiciones adecuadas de Tº y pH.
Cinética enzimática
En la práctica es muy difícil determinar la cantidad de enzima, ya que se encuentran en cantidades muy pequeñas y por que la mayoría se encuentran formando complejos. También pueden existir enzimas que no estén catalizando.
Por eso es más fácil determinar la AE ya que es directamente proporcional a su concentración.
La AE o velocidad de las enzimas puede ser expresado de las siguientes formas:
Expresiones de Actividad Enzimática (AE)
Nomenclatura comúnUnidades Internacionales de AE (UI o U).- Son los micromoles de S transformado (o P formado) en un minuto (μmol/min).
Nomenclatura SI Katal (kat).- Son los moles de S transforma-do (o P formado) en un segundo (mol/s). Se pueden usar prefijos SI.
Problema: Cierta enzima cataliza a una velocidad inicial (vo) de 5,7 x 10-5 UI, exprese esta velocidad en katales y microkatales.
Es el número de moléculas de S transformado por una sola molécula de enzima en un tiempo dado (min o s).
Actividad molecularACTIVIDAD MOLECULAR = NUMERO DE RECAMBIO = CONSTANTE CATALITICA (Kcat)
Catalasa H2O2
Anihidrasa carbónica HCO3-
Acetilcolinesterasa Acetilcolina
40,000,000
400,000
140,000
b-Lactamasa Benzilpenicilina 2,000
Fumarasa Fumarato 800
Proteína RecA (ATPasa) ATP 0.4
Enzimas Sustrato kcat (s-1)
1. Temperatura
2. pH
3. Concentración de enzima
4. Tiempo de incubación
5. Inhibidores
6. Electrolitos y fuerza iónica
7. Sustancias químicas
8. Concentración de sustrato
Factores que afectan la AE
Numerosos factores influyen en la velocidad de las enzimas, entre ellas:
1. Efecto de la temperatura
0 10 20 30 40 50 60 70
Temperatura (ºC)
Velo
cid
ad d
e r
eacció
n
Tº óptima
Vmáx
Des
na
tura
liza
ció
n
de
la e
nzim
a
A medida que aumenta la Tº la AE también sube, pero solo hasta cierto grado, más allá de ese límite, la enzima se desnaturaliza.
Cada enzima tiene su propia Tº óptima, al cual tiene máxima AE.
Para la mayoría de enzimas de mamíferos la Tº óptima está entre 35 y 40ºC.
2. Efecto del pH
4 5 6 7 8 9 10 11
pH
Velo
cid
ad d
e r
eacció
n
pH óptimo
Vmáx
Cada enzima tiene un pH óptimo, al cual tiene máxima actividad. Por debajo y encima de este pH la actividad declina.
Los pH extremos generalmente inactivan a las enzimas.
Algunas enzimas tienen un pH óptimo amplio. P. ej. Sacarasa: 3 -7,5 de pH
¿Cómo afecta el pH?
Modifica la ionización de ciertos grupos del sitio activo, del S o de ambos.
3. Efecto de la [E]
0 10 20 30 40
Concentración de enzima (mM)
Velo
cid
ad d
e r
eacció
n
50
10
0
15
0
Bajo condiciones saturantes de S,
la velocidad de reacción, es
directamente proporcional a la
[E].
Problema: Si una enzima cataliza a una vo = 2,7 x 10-3 UI ¿Cuál será su velocidad si la [E] se triplica?
Luego, la recta declina debido a:
- Depleción del S
- Inhibición por el P
0 10 20 30 40
Tiempo (min)
Velo
cid
ad d
e r
eacció
n4. Efecto del tiempo de incubación
En los momentos iniciales, la AE es directamente proporcional al tiempo de incubación, pero solo hasta cierto límite.
Luego, la AE declina debido a:
- Agotamiento del S
- Desnaturalización de la E
- Inhibición por el propio P
VO α tiempo
5. Inhibidores enzimáticos
Los inhibidores son sustancias orgánicas o inorgánicas que unidos a la enzima disminuyen su AE.
6. Electrolitos y fuerza iónicaLos iones (p.e. cationes) muchas veces son requeridos en el sitio activo de la E.
La fuerza iónica de la solución en donde está la E influye en la AE (salting in y sallting out)
7. Sustancias químicas
La presencia de diversos químicos afectan la AE, sobre todo:
-Agentes quelantes y
-Agentes reductantes
8. Efecto de la [S]
En 1912, en la Universidad de Berlín, los investigadores que realizaron el primer estudio (cinético y matemático) del efecto de la [S] sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas, fueron:
Leonor Michaelis y MaudMenten
Ellos observaron que cuando se mantenía constante la [E], y se aumentaba progresivamente la [S] se obtenía una gráfica hiperbólica.
21 3 4 5 6 7 80
0 2 4 6 8
Sustrato (μmol)
AE
(UI)
80
60
40
20
0
S
+
E
↓
P
EXPERIMENTO DE MICHAELIS-MENTEN
Inicialmente, la v aumenta proporcionalmente a la [S] (cinética de primer orden), luego va disminuyendo (cinètica de orden intermedio) hasta que la velocidad se hace constante, así haya fuerte [S] (cinética de orden cero).
Gráfica y ecuación matemática de la
hipérbola rectangular
Constante de
Michaelis-Menten
Gráfica y ecuación enzimática de la
hipérbola rectangular
Curva de Michaelis-Menten
Ecuación de
Michaelis-Menten
Velocidad máxima (Vmáx)
Es la máxima velocidad de una reacción enzimática.
En este momento, todas las enzimas están “trabajando” (no hay enzima disponible).
Si el Km es alto: menor velocidad
Si el Km es bajo: mayor velocidad
Constante de Michaelis-Menten (Km)
Funcionalmente, es la [S] al cual se alcanza el 50% de la Vmáx.
Es una medida de la afinidad de la enzima por un determinado S.
Todas las reacciones enzimáticas tienen su Km característico.
Cuanto > es la afinidad < es el valor de Km (y viceversa)
Problema: ¿Cuál es el S preferido para la hexokinasa, cuyos sustratos y Km se muestran en la siguiente tabla?
Sustrato Km (M)
Galactosa 1 x 10-1
Fructosa 1,6 x 10-3
Glucosa 8 x 10-6
Manosa 5 x 10-6
NOTA: Los valores Km de muchas enzimas son próximos
a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de
forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer
grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.
En todo estudio enzimático, los dos parámetros cinéticos
que deben ser determinados son: Vmáx y el Km.
La curva hiperbólica realmente nunca llega a contactar con la asíntota de la curva (que es el valor de la Vmáx).
Y, si no se conoce el verdadero valor de la Vmáx, tampoco se podrá determinar el verdadero valor de Km.
Pero en la práctica, estos
dos parámetros no
pueden ser
determinados, en forma
exacta, utilizando la
gráfica de Michaelis-
Menten, debido a:
El Ploteo de Lineweaver-Burk
El ploteo de Eddie-Hofstee
El ploteo de Hanes-Woolf
El ploteo de Eisenthal y Cornish
Programas computarizados
Métodos disponibles en:
Entonces, ¿Cómo poder determinar exactamente estos dos
parámetros enzimáticos (Km y Vmax)?
Frente al problema, muchos investigadores plantearon métodos matemáticos (conocidos como ploteos) para resolver este problema, entre ellos:
http://www.sbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html
Ploteo de Lineweaver-Burk (1934)También conocido como el ploteo del doble recíproco.
El método consiste en aplicar el recíproco (inverso) a la ecuación de Michaelis-Menten (1/vo versus 1/[S]), obteniéndose una recta.
Ploteo del doble recíproco
Vmax
Km S
vo
1/S
1vo
Doble recíprocoPloteo directo
1
Vmax
- 1
Km
1/2
Dato
s
No
1
2
3
4
0.25
0.50
1.0
2.0
0.42
0.72
0.80
0.92
Absorbance v (mmole/min)[S]
0.21
0.36
0.40
0.46
(1) El producto fue medido por espectrofotometría a 600 nm para 0.05 por mol
(2) El tiempo de reacción fue de 10 min
VelocidadSustrato Producto Doble recíproco
1/S 1/v
4
2
1
0.5
2.08
1.56
1.35
1.16
→
→
→
→
1.0
0.5
0
v
Plo
teo
Dire
cto
Do
ble
re
cíp
roco 2.0
1.0
0
1/v
-4 -2 0 2 41/[S]
0 1 2[S]
1.0
-3.8
Ejemplo de cinética enzimática y ploteo de Lineweaver-Burk
Los inhibidores son sustancias (orgánicas o inorgánicas) que al ser añadidos al medio donde está actuando una E determinan su menor AE.
Inhibición enzimática
El estudio de los inhibidores es importante por que proporciona información sobre: El mecanismo de catálisis enzimática La especificidad de la enzima La naturaleza de los grupos funcionales del sitio activo
Los inhibidores se unen a la enzima lo que ocasiona la pérdida parcial o total de la AE formando los complejos EI o ESI
Aplicaciones
Modo de acción de los inhibidores
Aplicaciones del estudio de inhibidores:
Muchos compuestos actúan inhibiendo ciertas reacciones enzimáticas; y, por lo tanto, de toda una vía metabólica. Entonces, tiene aplicación en:
Medicina.- Antiinflamatorios, analgésicos, antibióticos, interferones, anticancerígenos, etc
Agricultura.- Herbicidas, insecticidas, plaguicidas, etc.
Guerras biológicas.- Gases nerviosos, venenos, etc.
Industria alimentaria
Biotecnología, ect.
1. Inhibición Irreversible.- Al retirar del medio el inhibidor, la enzima no recupera su AE. Entonces, el inhibidor ha destruido algún grupo funcional necesario para la actividad catalítica de la E. A menudo la unión la EI es covalente. Ejemplos:
- Los organofosforados inhiben a la acetilcolinesterasa.
- Agentes alquilantes como el yodoacetato (se unen a –SH)
- La penicilina inhibe enzimas que sintetizan la pared bacteriana
- Los metales pesados (Pb, As, Hg) .
Tipos de Inhibición
2. Inhibición Reversible.- Si el inhibidor es retirado del medio (por diálisis u otros medios) en donde está actuando, la enzima recupera su AE. Entonces, se dice que la E se ha reactivado. La unión EI es laxa. Existen 3 subtipos:
-Competitiva
-No Competitiva
-Acompetitiva
Tipos de Inhibición
Inhibición reversible (Mecanismo)
I
I
S
S
S I
I
I II
S
Competitiva No competitiva Acompetitiva
E
E
Diferente sitioCompiten porel sitio activoInhibidor
Sustrato
Esq
ue
ma
sE
cuac
íone
s y
Des
crip
cion
es
[I] sólo se une a [E] libre,
y compite con el [S];
incrementando la [S] se
revierte la Inhibición.
[I] se une a [E] libre o al
complejo [ES] ; aumentando
la [S] no se revierte la inhib.
[I] sólo se une al complejo
[ES], aumentando la [S] se
favorece la inhibición.
E + S → ES → E + P
+I
↓
EI
←
↑
E + S → ES → E + P
+ +I I
↓ ↓
EI+ S →EIS
←
↑ ↑
E + S → ES → E + P
+I
↓
EIS
←
↑
E
I
S
Km
Inhibición enzimática (Ploteos)
I II Competitiva No competitiva Acompetitiva
Plo
teo
dir
ecto
Plo
teo
de
Lin
ew
ea
ve
r-B
urk
Vmax Vmax
Km Km’ [S], mM
vo
[S], mM
vo
I I
Km [S], mM
Vmax
I
Km’
Vmax’Vmax’
Vmax no cambiaKm aumenta
Vmax disminuyeKm no cambia Vmax y Km disminuyen
I
1/[S]1/Km
1/vo
1/Vmax
I
Dos líneasparalelas
I
Intersect en el eje X
1/vo
1/Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/Vmax
1/vo
Intersect en el eje Y
= Km’
Ejemplo de un inhibidor competitivo
-COOHH2N-
-SONH2H2N-
PrecursorAcidofólico
Acidotetrahidrofólico
Sulfanilamida
Acido para-aminobenzoico (PABA)
La bacteria requiere PABA para
la biosíntesis de ácido fólico
Las sulfas tienen similar
estructura con el PABA e
Inhiben el crecimiento de
la bacteria..
Domagk (1939)
Droga Uso terapéutico Enzima afectada Tipo de inhibidor
Lovastatina Hipercolesterolemia HMGCoA reductasa Competitiva
5-fluouracil Cáncer Timidilato sintetasa Irreversible
Metrotexate Cáncer Dihidrofolato reductasa Competitiva
Alopurinol Gota Xantino oxidasa Irreversible
Cumadin Anticoagulante Glutamil carboxilasa Competitiva
Aspirina Antiinflamatorio Ciclooxigenasa Irreversible
Captopril Hipertensión art. Enz.convert.angiotensina Competitiva
Ejemplo de algunos inhibidores
aplicados en medicina
El funcionamiento celular u orgánico requiere que todas las reacciones estén controlados, de modo que las vías metabólicas estén activas en ciertos momentos e inactivas en otros.
Regulación enzimática
Todas las enzimas pueden ser reguladas por factores como Tº, pH, [S], [E], cofactores, etc. Pero estos factores en el organismo animal son casi constantes, por lo que poco influyen en la regulación.
Existen otros mecanismos intracelulares que permiten la regulación de la velocidad de las reacciones enzimáticas
La regulación enzimática se refiere a la posibilidad que tienen las enzimas de variar la velocidad de las reacciones que catalizan al producirse determinados cambios en el medio.
Existen dos tipos de enzimas especializadas denominadas enzimas regulatorias (o moduladoras) que intervienen en la regulación del metabolismo y están ubicadas estratégicamente en las vías metabólicas:
1. Las enzimas alostéricas Regulación Alostérica
2. Las enzimas reguladas por unión covalente Regulación Covalente
Ubicación de las enzimas regulatorias
Generalmente, catalizan las primeras reacciones, permitiendo una regulación de una vía desde el inicio (principio de máxima economía)
Las enzimas alostéricas presentan 2 sitios de unión funcionalmente distintos y separados:
-Sitio activo.- Con actividad catalítica, sierve la unión con el S.
-Sitio alostérico o regulador.- Sin actividad catalítica, sirve para la unión con una molécula efectora (= efector, modulador o regulador) por enlaces no covalentes.
1. Regulación alostérica
1. Efectores negativos o inhibidores.- Disminuyen la AE
2. Efectores positivos o activadores.- Aumentan la AE
Tipos de efectores
Si la enzima posee:
-Un solo efector (+ ó -) = monovalente
-Dos o más efectores (+ ó -) cada uno con su sitio = polivalente
Características de las enzimas
alostéricas
1. Generalmente, son poliméricas Alto PM
2. No cumplen la clásica cinética micheliana.
3. Presentan 2 estados interconformacionalesinterconvertibles. Ambos están en equilibrio.
- R (relajado).- Es activo. Tiene alta afinidad por el S
- T (tenso).- Es inactivo. Baja afinidad por el S
4. Pueden ser homeotrópicas (si su propio S actúa como efector) o heterotrópicas (si el efector es una molécula distinta al S)
6. Son bastante inestables o lábiles
T
T
R
T
[S]
vo
Mecanismo y ejemplo de regulación alostérica
SS
R
R
SS
R
S
A
I
T[S]
vo
[S]
vo
(+)
(-) XX
X
R = Relajado
(activo)
T = Tenso
(inactivo)
Sitio alostérico
Homotrópico
(+)
Concertado
Heterotrópico
(+)
Secuencial
Heterotrópico
(-)
Concertado
Sitio alostérico
Cinética CooperaciónModelos
(-)
(+)
(+)
En la mayoría de los casos, las 2 formas de la enzima sólo se diferencia en la presencia de un grupo fosfato el cual se une covalentemente a la proteína. Entonces, las formas serían:
2. Regulación covalente
1. Forma fosfatada o forma a
2. Forma no fosfatada o forma b
Son enzimas que presentan 2 formas interconvertibles, con diferente composición, lo que origina cambios conformacionales en la molécula (estructura 3ria o 4ria).
Las kinasas: Son enzimas que agregan el grupo fosfato proveniente del ATP.
Las fosfatasas: Son las enzimas que retiran el grupo fosfato.
Las 2 formas difieren en su grado de actividad, siendo una muy activa y la otra poco activa. Algunas veces la forma a es la activa y en otros casos la forma b.
Regulación covalente (por fosforilación)
ConformationalChangeFosfatasa
(defosforilación)
P
Protein
OH
Active Inactive
Inactive Active
Glycogen phosphorylase b Glycogen phosphorylase a
Fischer, Kreb (1978)
Kinasa(fosforilación)