EnzimiEnzimi

““Proteine che agiscono Proteine che agiscono da catalizzatori biologici da catalizzatori biologici aumentando aumentando enormemente la velocità enormemente la velocità delle reazioni delle reazioni biochimiche” biochimiche”

Alta specificitàAlta specificità dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico

Alta velocità di reazioneAlta velocità di reazione aumentano la velocità di reazione fino a 1012 volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da enzimi

Capacità di regolazioneCapacità di regolazione inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima

Agiscono in condizioni moderateAgiscono in condizioni moderate temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro

CatalizzatoriCatalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati

PROPRIETÀ DEGLI ENZIMIPROPRIETÀ DEGLI ENZIMI

Sintesi Sintesi proteicaproteica

Zimogeno

(precursore)

ApoenzimaApoenzima

(parte proteica)(parte proteica)

OLOENZIMAOLOENZIMA

coenzima (vitamina)

ione metallico

gruppo prostetico (legato covalentemente)

ApoenzimaApoenzima(inattivo)(inattivo)

CoenziCoenzimimi

Coenzima Precursore

Biocitina Biotina

5‘-Deossiadenosilcobalamina Vitamina B12

Flavin adenin dinucleotide Riboflavina (B2)

Acido lipoico Acido lipoico

Nicotinamide adenin dinucleotide Ac. Nicotinico

Piridossal fosfato Piridossina (B6)

Tetraidrofolato Folato

Tiamin pirofosfato Tiamina (B1)

Elementi inorganici che Elementi inorganici che servono come cofattori di servono come cofattori di

enzimienzimiCu2+ Citocromo ossidasi

Fe2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi

K+ Piruvato cinasi

Mg2+ Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi

Mn2+ Arginasi

Mo Dinitrogenasi

Ni2+ Ureasi

Se Glutatione perossidasi

Zn2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi

Velocità delle Velocità delle reazionireazioni

La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius:

Velocità = Ae - Ea/RT

Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1K-1) e T la temperatura assoluta

X + Y Z

Stato di transizione

S

P

Ene

rgia

Coordinte di reazione

ENERGIA DI ATTIVAZIONE

Ea

La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione

Come agiscono gli enzimi?Come agiscono gli enzimi?

Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione

Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto

Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione

Num

ero

di m

olec

ole

Energia cinetica delle molecole

Molecole con valori medi di energia

Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una

reazione catalizzata da un enzima

Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata

Distribuzione delle Distribuzione delle energie cinetiche energie cinetiche

E + S ES EP E+ P

S P

Reazione non catalizzata

Reazione catalizzata da un enzima

En

ergi

a

Coordinate di reazione

E + S

ES

EP

E + P

Stato di transizione

ΔG°

Stato di transizione

Stato di transizione Eatt (enzimatica)

Eatt (non enzimatica)

Profilo energetico di una Profilo energetico di una reazione catalizzata da un reazione catalizzata da un

enzimaenzima

Misura dell’attività Misura dell’attività enzimaticaenzimatica

Mi permette di determinare la Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un quantità di enzima presente in un

campione campione

Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione dell’enzima di catalizzare una reazione

Supponiamo di voler determinare la Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) quantità di Lattico deidrogenasi (LDH)

presente nel sangue di un pazientepresente nel sangue di un paziente

Piruvato + NADHPiruvato + NADH Lattato + NADLattato + NAD++LDHLDH

AB

SA

BS

Lunghezza d’ondaLunghezza d’onda

340 nm340 nm

NADHNADH

NADNAD++

TamponTamponee

SubstratSubstratoo

Miscela Miscela

tampone-substratotampone-substrato

Preparazione Preparazione testtest

Cuvetta (quarzo-Cuvetta (quarzo-vetro-plastica)vetro-plastica)

1 2 3

4 5 6

7 8 9

0

START

Scelta della lunghezza Scelta della lunghezza d’ondad’onda

STOP

0.000

minuti

AB

S

340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

SpettrofotometrSpettrofotometroo

Lunghezza Lunghezza d’ondad’onda

SpettrofotomeSpettrofotometrotro

Posizionamento Posizionamento della cuvetta nello della cuvetta nello spettrofotometrospettrofotometro

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

Aggiunta dell’enzima (cofattore o Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato)substrato)

Rapido Rapido mescolamenmescolamen

toto

1.546

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

Inizia la reazione Inizia la reazione enzimaticaenzimatica

1.516

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.493

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.479

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.449

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.411

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.390

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.343

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.317

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.289

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.274

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.245

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.224

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.189

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.156

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.123

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.098

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.053

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

1.012

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.994

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.964

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.938

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.910

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.889

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.868

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.861

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.844

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.821

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.803

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.789

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.777

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.759

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.719

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.690

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.657

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.634

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.611

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.592

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.558

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.528

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.499

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.459

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.425

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.399

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.384

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

0.380

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

La registrazione viene La registrazione viene bloccatabloccata

0.380

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

Determinazione dell’attività Determinazione dell’attività enzimaticaenzimatica

Occorre calcolare la velocità della Occorre calcolare la velocità della reazionereazione

Se vengono rispettate Se vengono rispettate determinate condizioni, la determinate condizioni, la velocità della reazione è velocità della reazione è

direttamente proporzionale alla direttamente proporzionale alla concentrazione di enzimaconcentrazione di enzima

?

E + S ES E + P

In condizioni di stato stazionarioIn condizioni di stato stazionario

Velocità= Velocità= kk33[ES][ES]

k1

k2

k3

kk11 >> k>> k22

kk11 ≥ k≥ k33

se la concentrazione di substrato se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevataè sufficientemente elevata

[E] [E] [ES] [ES]

E + S ES E + P

In condizioni di stato stazionarioIn condizioni di stato stazionario

k1

k2

k3

kk11 >> k>> k22

kk11 ≥ k≥ k33

Fino a quando Fino a quando

[E][E] >>[S]>>[S]

V = costanteV = costante

V = kV = k33[ES] [ES] [E] [E]

•

•

••

•

••

•••

••••

[S]

Vo

Andamento della velocità iniziale in Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di funzione della concentrazione di

substratosubstrato

L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten

V V maxmax

½ V½ Vmaxmax

KKmm

v=VVmaxmax [S] [S]

KKmm [S] [S]

0.380

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

Determinazione dell’attività Determinazione dell’attività enzimaticaenzimatica

Pendenza Pendenza A/minA/min

0.380

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

Determinazione dell’attività Determinazione dell’attività enzimaticaenzimatica

Velocità Velocità costantecostante

In condizioni di [S] In condizioni di [S] saturanti saturanti

In tali condizioni la velocità è In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla direttamente proporzionale alla

concentrazione di enzimaconcentrazione di enzima

0.380

minuti

ABS 340 nm

0.000

1.000

2.000

1 20

La velocità della La velocità della reazione non reazione non

aumenta aumenta all’aumentare all’aumentare

della della concentrazione di concentrazione di

substratosubstrato

Determinazione Determinazione dell’attività enzimaticadell’attività enzimatica

UI UI A VA Vtottot

d t Vd t Vcc

==

Variazione di Variazione di assorbimentoassorbimento Volume totale testVolume totale test

Coefficiente di Coefficiente di estinzione (mM o estinzione (mM o M) del substratoM) del substrato Cammino Cammino

otticoottico

TempoTempo

Volume Volume enzimaenzima

Unità Unità enzimaticenzimatic

hehe

L’attività di un enzima viene misurata in L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità termini di “Unità enzimatiche” o “Unità

Internazionali”Internazionali”

““Unità Unità enzimatica”enzimatica”

Quantità di enzima capace di Quantità di enzima capace di trasformare una micromole trasformare una micromole

((mole) di substrato in un minuto mole) di substrato in un minuto per ml di soluzioneper ml di soluzione

1 unità di enzima

2 unità di enzima

3 unità di enzima

Tempo

Vel

ocit

à

Incrementando la concentrazione di Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della enzima aumenta la pendenza della

rettaretta

In condizioni di [S] In condizioni di [S] saturanti saturanti

MetodiMetodiContinuoContinuo A tempo fissoA tempo fisso

L’operatore segue la reazione L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di effettivamente una misura di velocità iniziale velocità iniziale la velocità la velocità enzimatica deve rimanere enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da concentrazione dell’enzima da misuraremisurare

L’operatore fa partire la L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione un periodo di incubazione prescelto prescelto è essenziale è essenziale che durante tale periodo la che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero reazione sia di ordine zero relativamente alla relativamente alla concentrazione del concentrazione del substrato e la velocità substrato e la velocità enzimatica sia quindi enzimatica sia quindi sempre massimasempre massima

ContinuoContinuo

TempoTempo

AB

SA

BS

vv00

TempoTempo

AB

SA

BS

vv00

TempoTempovv00

AB

SA

BS

Problemi di Problemi di mescolamento, effetto mescolamento, effetto

diluizione….diluizione….

Soluzione concentrata di Soluzione concentrata di enzimaenzima

A tempo A tempo fissofisso

TempoTempo

AB

SA

BS

vv00

STOPSTOP

TempoTempo

AB

SA

BS

vv00

STOPSTOP

TempoTempo

vv00

STOPSTOP

Elevata concentrazione di Elevata concentrazione di enzimaenzima

Campione non mescolato, Campione non mescolato, precipitato…..precipitato…..

Tipologia di Tipologia di analisianalisi

Test sempliceTest semplice::Nella soluzione di reazione è Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La presente un solo enzima. La reazione può essere seguita reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per coenzima (NADH, NADPH per esempio)esempio)

Test accoppiato:Test accoppiato:Si rende necessario quando Si rende necessario quando nessuno dei composti che nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita con una seconda reazione definita “indicatrice”“indicatrice”

A + NADH + HA + NADH + H++ B + NADB + NAD++A

BS

AB

S

Lunghezza d’ondaLunghezza d’onda

340 nm340 nm

NADH o NADPHNADH o NADPH

NADNAD++ o NADP o NADP++

deidrogenasideidrogenasi

Test ottico Test ottico semplice (test di semplice (test di

Warburg)Warburg)

Test ottico Test ottico accoppiato accoppiato

D + NADH + HD + NADH + H++ E + NADE + NAD++deidrogenasideidrogenasi

A + BA + B C + DC + Denzimaenzima

Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATPCreatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATPcreatinfosfocinasicreatinfosfocinasi

Glucosio + ATPGlucosio + ATP Glucosio-6-P + ADP Glucosio-6-P + ADP

esocinasiesocinasi

Glucosio-6-P + NADPGlucosio-6-P + NADP++ Acido lattico + NADPH + H Acido lattico + NADPH + H++

Glucosio-6-PGlucosio-6-Pdeidrogenasideidrogenasi

Per effettuare un dosaggio enzimatico Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre:in maniera corretta occorre:

Uniformare la temperatura (30°C)Uniformare la temperatura (30°C)

Scegliere il valore di pH ottimaleScegliere il valore di pH ottimale

Escludere la presenza di inibitori (reversibili o Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)irreversibili)