Enzymatisk extrahering och konvertering av lignin för ...· 2 Teori Produktion av geler och plast

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Enzymatisk extrahering och konvertering av lignin för ...· 2 Teori Produktion av geler och plast

  • KANDIDATPROJEKTSRAPPORT 2015

    Enzymatisk extrahering och konvertering av ligninfr framtida bioraffinaderier

    KBTX01-15-14

    Christoffer Bckberg

    Arvid Hagelberg

    Rebecka Johansson

    Linn Kullberg

    Louise SamuelssonClara Sundstrm

    Handledare: Carl Johan Franzn och Sylvia KlaubaufInstitutionen fr Biologi och BioteknikAvdelningen fr Industriell bioteknik

    CHALMERS UNIVERSITY OF TECHNOLOGYGothenburg, Sweden 2015-05-16

  • Enzymatisk extrahering och konvertering av ligninfr framtida bioraffinaderier

    Christoffer Bckberg chrback@student.chalmers.seArvid Hagelberg arvidha@student.chalmers.seRebecka Johansson rebjoha@student.chalmers.seLinn Kullberg klinn@student.chalmers.seLouise Samuelsson lousamu@student.chalmers.seClara Sundstrm clarasu@student.chalmers.se

    Handledare: Carl Johan Franzn och Sylvia Klaubauf, Institutionenfr Biologi och Bioteknik

    Examinator: Eva Albers, Institutionen fr Biologi och Bioteknik

    Kandidatprojektsrapport 2015Institutionen fr Biologi och BioteknikAvdelningen fr Industriell bioteknikChalmers Tekniska HgskolaSE-412 96 GothenburgTelephone +46 31 772 1000

    Skriven i LATEXGteborg, Sverige 2015

    ii

  • AbstractEnzymatic Extraction and Conversion of Ligninfor Use in Future Biorefineries

    The current methods of producing organic chemicals and fuel from oil are not sustain-able in the long term. However, lignin based organic chemistry has the potential to be arenewable alternative to oil but is today an underused resource. This report contributesto research in this field by studying possible valorization of lignin, suitable enzymes forseparation of lignin and hemicellulose and by examining fungi which may potentiallydegrade lignin.

    Literature studies allowed for construction of a potential pathway from coniferyl alcoholto the pharmaceuticals L-dopamine and adrenalin. By dehydrogenation, amination anddemethylation, L-dopamine can be made from coniferyl alcohol. Adrenaline is made fromL-dopamine using enzymes found in the human biosynthesis pathway. The suggestedpathway may require modification of the catalysing enzymes. Production of these com-pounds requires further study, but could provide an economic incentive in the develop-ment of biorefineries.

    Phylogenetic studies showed that a hypothetical enzyme, DICSQDRAFT_107426, fromDichomitus squalens could be of interest for future studies of separation of lignin fromlignocellulose. Characterized glucuronoyl esterases capable of breaking ester bonds be-tween lignin and glucuronic acid residues in hemicellulose in organisms closely relatedto D. squalens makes this organism a good candidate for finding new enzymes able todegrade lignin. The organism is of further interest for Swedish industry as it usually growson coniferous trees, which are prevalent in Sweden. Protocols for characterization havebeen compiled.

    Plating of fungal samples collected from a wooded area in the vicinity of the ChalmersJohanneberg campus show good prospects of finding filamentous fungi capable of utili-zing lignin. Further studies may identify additional fungi and enzymes able to separate,purify and degrade lignin.

    Extraction of lignin will also impact availability of hemicellulose, which is of interest tothe polymer industry. This project can hopefully lay a foundation for future studies ondegradation and usage of lignin where the pathway can be tested and D. squalens studied.

    Keywords: lignin, enzymes, valorization, sustainability, phylogeny, field samples.

    iii

  • Sammanfattning

    Oljebaserad kemikalie- och brnsleframstllning r inte lngsiktigt hllbart. Ligninbaseradkemi har potential att vara ett frnyelsebart alternativ men r idag en underutnyttjadresurs. Denna rapport bidrar till forskningen inom detta flt genom att underska mjligvalorisering av lignin och lmpliga enzym fr separering av lignin och hemicellulosa samtgenom att testa olika svampar som har potential att bryta ned lignin.

    Utifrn studier av knda enzymkatalyserade reaktioner kunde en potentiell reaktionsvgfrn koniferylalkohol till lkemedelssubstanserna L-dopa och adrenalin tas fram. Viadehydrogenering, aminering och demetylering kan L-dopa bildas frn koniferylalkohol.Adrenalin fresls bildas ur L-dopa med hjlp av enzym frn den mnskliga biosyntesen.Denna reaktionsvg kan krva modifiering av de ingende katalyserande enzymen. Fram-stllning av L-dopa och adrenalin ur lignin krver fortsatta studier men kan komma att bliett ekonomiskt incitament fr utvecklingen av bioraffinaderier.

    Fr extraktion av lignin och hemicellulosa krvs en metod att bryta esterbindningar mellanlignin och glucuronsyror i hemicellulosa. Fylogenetiska studier visade att ett hypotetisktenzym, DICSQDRAFT_107426, frn Dichomitus squalens r lmpligt fr fortsatta studierkring separation av lignin frn lignocellulosa. Karakteriserade ligninnedbrytande glucu-ronoylsyraesteraser hos organismer nrbeslktade till D. squalens gr organismen till engod kandidat att hitta nya ligninnedbrytande enzym i. Organismen r av ytterligare viktfr svensk industri, d den vanligtvis vxer p barrtrd. Protokoll fr karakterisering avenzymet har sammanstllts.

    Uppodling av svampprover frn omrdet kring Chalmers Johanneberg visade att mjlig-heten att hitta filamentsa svampar som kan tillgodogra sig lignin r god. Fortsattastudier kan identifiera fler svampar och enzym med frmga att separera, rena och brytaner lignin.

    Extraktion av lignin pverkar ocks tillgngligheten av hemicellulosa, vilket r av intressefr polymerindustrin. Detta projekt kan frhoppningsvis vara en grund fr framtida studierkring nedbrytning av och anvndningsomrden fr lignin dr reaktionsvgarna kan testasoch D. squalens studeras.

    Nyckelord: lignin, enzym, valorisering, hllbarhet, fylogeni, fltprover.

    iv

  • Innehll1 Inledning 1

    1.1 Syfte och ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Bakgrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.3 Avgrnsningar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

    2 Teori 22.1 Lignin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.2 Enzym fr separation och valorisering av lignin . . . . . . . . . . . . . . 32.3 Fylogenetiska trd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.4 Ligninnedbrytande svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    3 Metod 73.1 Enzymatiska reaktionsvgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73.2 Separationsenzym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73.3 Ligninnedbrytande svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

    3.3.1 Insamling av prover . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.3.2 Agarplattor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.3.3 Odlingsbetingelser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.3.4 Utstryk av prover . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.3.5 Renstryk av kolonier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.3.6 Inokulering av renstrykta kolonier . . . . . . . . . . . . . . . . . 103.3.7 Identifiering av svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

    4 Resultat 104.1 Enzymatiska reaktionsvgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

    4.1.1 L-dopa och adrenalin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104.1.2 Konvertering av koniferylalkohol till L-dopa . . . . . . . . . . . . 114.1.3 Konvertering av L-dopa till adrenalin . . . . . . . . . . . . . . . . 13

    4.2 Separationsenzym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144.3 Ligninnedbrytande svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

    4.3.1 Uppodling av svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164.3.2 Identifiering av svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

    5 Diskussion 185.1 Enzymatiska reaktionsvgar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185.2 Separationsenzym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195.3 Ligninnedbrytande svampar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205.4 Slutsats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

    Kllfrteckning 22

    Bilaga A Agarplattor med lignin I

    Bilaga B Agarplattor med potatisextrakt och dextros III

    Bilaga C LB-media samt agarplattor med LB-media IV

    Bilaga D PCR-reaktion V

    Bilaga E Restriktion med EcoRI och XbaI VII

    Bilaga F Gelelektrofores VIII

    v

  • Innehll

    Bilaga G Upprening av DNA frn Agarosgel X

    Bilaga H Ligering med T4-ligas XII

    Bilaga I Transformation XIII

    Bilaga J Genuttryck XIV

    Bilaga K Proteinextraktion och 6x His-tag proteinrening XV

    Bilaga L SDS-PAGE XVII

    Bilaga M Bradfordanalys XX

    Bilaga N Detektion av aktivitet XXII

    Bilaga O Beskrivningar av svampkoloniernas utseende efter renstryk XXIII

    Bilaga P Foton av renstrykta kolonier XXXIII

    Bilaga Q Plasmidsekvens, aminosyrasekvens och fr E. coli kodonoptimeradnukleinsyrasekvens fr DICSQDRAFT_107426 XLV

    vi

  • 1 Inledning

    1 Inledning

    1.1 Syfte och ml

    Syftet med detta arbete r att bidra till forskning som mnar att erstta dagens oljebaseradeorganiska kemi med frnyelsebar ligninbaserad bioteknik. Inom detta projekt har tre mlsatts upp fr att bidra till denna forskning.

    1. Ta fram ett frslag p en enzymatisk reaktionsvg som kan anvndas fr att synte-tisera en vrdefull kemikalie frn lignin.

    2. Identifiera ett enzym som frmodas kunna bryta bindningar mellan lignin och hemi-cellulosa, samt planera arbetsgng fr att karaktrisa dess aktivitet.

    3. Identifiera svamparter frn fltprov som kan bryta ner lignin.

    1.2 Bakgrund

    Dagens samhlle r p flera stt beroende av olja. Framfrallt anvnd