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Enzyme
Prof. Dr. Albert Duschl
Katalyse Reaktionen laufen normalerweise nicht spontan
ab, auch wenn insgesamt dabei Energie gewonnen werden sollte. Es muß zunächst eine Aktivierungsenergie aufgebracht werden.
Katalysatoren verringern die benötigte Aktivierungsenergie, erhöhen also die Wahrscheinlichkeit daß die Reaktion abläuft.
Aktivierungsenergie wird normalerweise durch energiereiche Zusammenstösse mit anderen Molekülen zugeführt.
Im Verlauf der Reaktion entstehen Zwischen-zustände, die energetisch ungünstiger sind als der Ausgangszustand. Aktivierungsenergie wird benötigt um diese energieungünstigen Zwischenzustände herzustellen.
Aktivierungsenergie kann durch Erhitzen zugeführt werden (energiereiche Zusammenstösse!).
Alternativen sind technische Katalysatoren oder, im biologischen Bereich, Enzyme.
© Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell
Enzyme Fast alle Enzyme sind Proteine (Ausnahme: Einige katalytisch wirkende RNAs).
Sie sind spezifisch für bestimmte Substrate und katalysieren definierte Reaktionen.
Die Aktivität von Enzymen wird normalerweise reguliert.
Wie alle Katalysatoren nehmen auch Enzyme an einer Reaktion teil, gehen am Ende
aber wieder im Ausgangszustand daraus hervor. Ein Enzym wird also nicht
verbraucht wie ein Substrat.
Enzyme können verschiedene Formen von Energie nutzbar machen, beim
Sehvorgang z.B. Licht. Meistens wird jedoch chemische Energie in Form
energiereicher Bindungen verwendet. Das Enzym beschleunigt die Spaltung der
Bindungen, deren Energie dadurch frei wird. Ein häufig dafür verwendetes Molekül ist
Adenosintriphosphat (ATP).
© Stryer: Biochemistry
Reaktionsgleichgewicht Enzyme verschieben das Reaktionsgleichgewicht nicht. Sie
senken die Aktivierungsenergie für Hin- und Rückreaktion,
treiben also keineswegs die Reaktion in eine bestimmte
Richtung. Sie verändern nur die Geschwindigkeit, mit der sich
das Gleichgewicht einstellt.
Die Schnelligkeit der Gleichgewichtseinstellung hängt von der
Wechselzahl eines Enzyms ab. Die Wechselzahl gibt die Zahl
der Reaktionen an, die pro Sekunde katalysiert werden. Sie
kann sehr unterschiedlich sein - Lysozym hat 0.5, DNA-
Polymerase hat 15, Carboanhydrase hat 600.000, und Katalase
hat 40.000.000.
In biologischen Systemen werden in der Regel die
entstehenden Produkte sofort wieder als Substrate weiterer
Reaktionen genützt. Es stellt sich also nicht wie im Reagenzglas
ein einfaches Gleichgewicht ein, sondern viele Substanzen sind
über vernetzte Reaktionen miteinander verbunden. Sie stehen
in einem Fließgleichgewicht.
Für die Bestimmung der Eigenschaften einzelner Enzyme
verwendet man am besten Reaktionen in vitro.
in vitro "im Reagenzglas" – in vivo "im Leben"
© Löffler/Petrides:
Biochemie und Pathobiochemie
Definitionen
Coenzyme sind kleine organische Moleküle die für die
Funktion der Enzyme notwendig sind.
Cofaktoren ist eine allgemeine Bezeichnung für
solche assistierende Elemente in Enzymen, die auch
die häufig vorkommenden Metallionen umfasst.
Metalle wie Fe3+ oder Zn2+ sind z.B. oft für
Redoxreaktionen erforderlich.
Prosthetische Gruppen sind Cofaktoren die
dauerhaft an das Enzym gebunden sind und für die
Funktion wichtig sind.
Cosubstrat wäre dagegen angemessen wenn ein
Coenzym nur vorübergehend an das Enzym bindet.
Holoenzym ist ein katalytisch aktiver Komplex aus
Proteinanteil und Cofaktor.
Apoenzym ist nur der Proteinanteil dem der Cofaktor
fehlt, und der deswegen auch nicht funktionsfähig ist.
Aktives Zentrum der Carboanhydrase
© Voet/Voet/Pratt: Biochemie
[A] + [B] → [AB]
Eine Reaktion [A] + [B] → [AB] hängt von den Konzentrationen von A und B ab:
Je höher die Konzentrationen, umso häufiger finden sich die Partner.
Die Wahrscheinlichkeit eines Zerfalls [AB] → [A] + [B] ist für ein einzelnes Molekül
zwar von der Konzentration von AB unabhängig, aber da in einer Molekülpopulation
Hin- und Rückreaktion im Gleichgewicht stehen, gehen die Konzentrationen doch
wieder ein. Für die Analyse von Einzelmolekülen gelten andere Formeln.
Die Geschwindigkeit v einer Reaktion hängt ab von der Konzentration der Moleküle
(oder des Moleküls) und einer Proportionalitätskonstanten k, die von den
Eigenschaften der spezifischen Reaktion bestimmt wird.
Für die Hinreaktion gilt also v+1 = k+1 ∙ [A] ∙ [B]
Und für die Rückreaktion v-1 = k-1 ∙ [AB]
Stehen beide Reaktionen im Gleichgewicht, ist v der Hinreaktion (v+1) genau so gross
wie v der Rückreaktion (v-1). Die beiden Konstanten (k+1, k-1) ändern sich dabei nicht.
Es ist dann k+1 ∙ [A] ∙ [B] = k-1 ∙ [AB]
Oder anders ausgedrückt K = k+1 ∕ k-1 = [AB] ∕ [A] ∙ [B]
K bezeichnet man als Gleichgewichtskonstante der Reaktion.
Enzymkatalysierte Reaktionen
Denken wir an eine enzymkatalysierte Reaktion, dann muß im einfachsten Fall
zunächst das Substrat S an das Enzym E binden. Im so gebildeten Enzym-Substrat-
Komplex laufen dann die Umformungen ab, aus denen am Ende das Produkt P und
das (unveränderte!) Enzym E hervorgehen. Die Rückreaktion von E + P zurück in
den Komplex ist so unwahrscheinlich, daß wir sie vernachlässigen können.
In einer solchen Reaktion gilt die Michaelis-Menten-Gleichung. Sie beschreibt die
Beziehung zwischen der Geschwindigkeit einer Reaktion und der Substratkonzentration.
Michaelis-Menten-Gleichung
Leonor Michaelis und Maud Menten postulierten diese
berühmte Gleichung 1913.
V ist die Reaktionsgeschwindigkeit.
Vmax ist die Maximalgeschwindigkeit. Sie wird dann
erreicht, wenn alle vorhandenen Enzymmoleküle in
einem Enzym-Substrat-Komplex vorliegen.
Km ist die Michaelis-Konstante, ein Maß für die
Bindungsstärke (oder Affinität) zwischen Enzym und
Substrat. Km ist abhängig on Ionenstärke, pH-Wert,
Temperatur und anderen Umweltbedingungen.
[S] ist die Substratkonzentration.
Bei graphischer Auftragung von V gegen [S] ergibt sich
eine Hyperbel, deren Anfangssteigung Vo ist (die
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion). Die
Michaeliskonstate Km ist die Substratkonzentration bei
der halben Maximalgeschwindigkeit, ½ Vmax.
© Nelson/Cox: Lehninger Principles of Biochemistry
Lineweaver-Burk-Diagramm
Man möchte zur Charakterisierung eines
Enzyms gern Vmax und Km kennen. Bei der
Hyperbel aus dem Michaelis-Menten-
Diagramm lässt sich jedoch Vmax kaum
exakt ablesen; dadurch ist dann auch Km
nicht genau zu bestimmen.
Wenn man die selben Daten nach
Lineweaver und Burk aufträgt, erhält man
eine Gerade
Der X-Achsenabschnitt ist in dieser
Auftragung -1/Km,
der Y-Achsenabschnitt ist 1/Vmax
und die Steigung ist Km/Vmax.
© Nelson/Cox: Lehninger Principles of Biochemistry
Reaktionsablauf
Während einer Reaktion ändern sich die
Konzentrationen von Substrat, Produkt, freiem
Enzym und Enzym-Substrat-Komplex. Die
Abbildung rechts stellt eine in vitro Reaktion dar
in der ein Substrat komplett umgesetzt wird.
In vivo werden die Verhältnisse anders sein, z.B.
kann Substrat nachgeliefert und Produkt
verbraucht oder in ein anderes Kompartiment
verschoben werden (Fließgleichgewicht!). Es
können Inhibitoren oder Aktivatoren auftauchen,
Parameter mit Einfluss auf Proteineigenschaften
können sich ändern, ein Substrat kann
gleichzeitig in mehrere unterschiedliche
Reaktionen eintreten so dass verschiedene
Enzyme kompetieren, und durch Enzymsynthese
und -abbau kann sich sogar [E] ändern.
© Wikipedia
Enzymhemmung
Enyzme können durch kompetitive Inhibitoren gehemmt werden. Diese binden
ebenso wie das Substrat an das aktive Zentrum des Enzyms und haben eine
ähnliche Struktur wie das echte Substrat. Malonat ist zum Beispiel ein kompetitiver
Inhibitor der Succinatdehydrogenase. Kompetitive Hemmung lässt sich duch Zugabe
von mehr Substrat aufheben.
Nicht-kompetitive Hemmstoffe binden an anderen Stellen des Enzyms und ändern
dadurch dessen Struktur und damit auch die Funktion. Zugabe von mehr Substrat
hilft in diesem Fall nichts. Allosterische Enzyme, die bei Bindung von Hemmstoffen
oder Substraten ihre Strukutur ändern, unterliegen nicht der Michaelis-Menten-
Kinetik, sondern anderen, komplizierteren Beziehungen.
© both figures
Stryer: Biochemistry
Beispiel: Chymotrypsin
Chymotrypsin ist eine Protease.
Proteasen spalten Peptidbindungen.
Chymotrypsin ist ein
Verdauungsenzym das im Pankreas
produziert wird.
Es besteht im aktiven Zustand aus
zwei Ketten (Quartärstruktur!).
Es gehört zur grossen Gruppe der
Serinproteasen.
Die Serinproteasen tragen diesen
Namen, weil für ihren
Reaktionsmechanismus ein Serinrest
der Protease eine entscheidende Rolle
spielt. © Anthony J. Frisby, Thomas Jefferson University
Aktivierung von Chymotrypsin
Chymotrypsin entsteht durch
enzymatische Spaltung von
Chymotrypsinogen, einem Proenzym
(Zymogen). Die Synthese eines
inaktiven Vorläufermoleküls schützt
den Pankreas vor Selbstverdauung.
Chymotrypsinogen wird von Trypsin
gespalten, einer weiteren
Serinprotease.
Trypsin selber entsteht durch Spaltung
des Proenzyms Trypsinogen.
Trypsinogen wird durch
Enteropeptidase gespalten, einer
dritten Serinprotease, die so
sequenzspezifisch spaltet, daß
Trypsinogen praktisch ihr einziges
Substrat ist.
© Physiologische Chemie, Universität Würzburg
Substratspezifität
Proteasen spalten nicht beliebige Peptidbindungen. Bei Serinproteasen richtet sich die
Spezifität nach der Aminosäure des Substrats, die N-terminal von der Spaltstelle liegt.
Chymotrypsin: Aromatische oder grosse unpolare Seitenkette.
Trypsin: Lysin oder Arginin.
Elastase: Kleine, ungeladene Seitenkette.
Diese Selektivität wird durch eine Tasche in der Proteasestruktur festgelegt, in der die
Seitenkette der N-terminalen Aminosäure während der Spaltung fixiert wird. Die
Struktur des aktiven Zentrums bestimmt damit, welche Substrate verwendet werden.
© Stryer: Biochemistry
Mechanismus der Serinproteasen
Durch die Wasserstoffbrückenkette die
von Asp 102 über His 57 nach Ser 195
verläuft, wird das Proton der OH-
Gruppe von Ser 195 zum His 57
verschoben. Die resultierende -CH2O-
Gruppe kann die Carbonylgruppe einer
Peptidkette nukleophil angreifen. Es
entsteht ein H2N-Produkt und ein Acyl-
Enzym-Intermediat. Danach wird die
Carboxylgruppe auf Wasser als
Akzeptor übertragen.
Dieser Reaktionsmechanismus findet
sich in ähnlicher Form z.B. bei der
nicht verwandten bakteriellen Protease
Subtilisin, manchen Esterasen (etwa
Acetylcholin-Esterase) und manchen
Lipasen.
© Stryer: Biochemistry
Katalytische Triade
Die drei Aminosäuren der katalytischen
Triade liegen in der Struktur von
Chymotrypsin sehr eng beisammen, obwohl
sie in der Sequenz weit voneinander entfernt
sind.
Es gibt nur vier bekannte Mechanismen für
Proteasen:
Serinproteasen (Trypsin, Chymotrypsin,
Elastase, Thrombin)
Saure Proteasen (Pepsin,
HIV-1 Protease)
Zinkproteasen (Carboxypeptidase A und B)
(Achtung: Zinkproteasen sind nicht das
gleiche wie Zinkfingerproteine)
Thiol-Proteasen (Papain, Cathepsin B)
© both pictures Anthony J. Frisby,
Thomas Jefferson University
Enzyme ...
Enzyme sind eine Grundlage des Lebens, weil
ohne Enzyme biologische Reaktionen wegen
der fehlenden hohen Aktivierungsenergie nicht
ablaufen könnten
und Energiezufuhr durch Erhitzen komplexe
Strukturen zerstört, da die Wärmebewegung
(Brown'sche Molekularbewegung) zu gross
wird.
Enzyme waren daher von Anfang an Teil des
Lebens.
Enzyme sind nützlich beim Kochen.
© Waverley Root: Food. An authoritative and visual
history and dictionary of the foods of the world
