Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Microbiologie et de Biochimie
Master 1 Microbiologie Appliquée
des enzymes
Année universitaire 2019-2020
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Les enzymes biologiquement actives peuvent être extraites de tout organisme vivant.
Un très large éventail de sources est utilisé pour la production commerciale d'enzymes. Sur la
centaine d'enzymes utilisées industriellement, plus de la moitié proviennent de champignons
et de levures et plus d'un tiers de bactéries, le reste étant réparti entre les sources animales
(8%) et végétales (4%).
Les microorganismes sont préférés aux plantes et aux animaux comme sources
d'enzymes car :
2. Croissance rapide.
4. Leur teneur en enzymes est plus prévisible et contrôlable.
5. Les tissus des végétaux et des animaux contiennent plus de matières potentiellement
nocives que les microorganismes, notamment des composés phénoliques (provenant des
plantes), des inhibiteurs d'enzymes endogènes et des protéases.
1.1. Enzymes d’origine végétale
Les enzymes d'origine végétale comprennent l'amylase, l'invertase, la papaïne, la
broméline, la ficine etc. Ces enzymes ont joué un rôle important dans la production
alimentaire, notamment dans les sirops, la boulangerie, les boissons alcoolisées, les produits
laitiers, etc. Outre l'utilisation des plantes comme usine pour la production d'enzymes, elles
peuvent également servir de matière première (activateur) pour l'amélioration de l'activité
enzymatique microbienne employée dans l'industrie alimentaire.
1.1.1. La papaïne : EC number: 3.4.22.2. Extraite d’une plante équatoriale et tropicale, le
papayer (à partir du fruit la papaye) qui sert à attendrir la viande, elle possède des propretés
anti-inflammatoires (favorise la guérison des plais et accélère la cicatrisation), utilisé en
cosmétique pour ces effets exfoliants, blanchissants, assouplissant de la peau (crème et
gommage).
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1.1.2. La bromélaine : EC number: 3.4.22.4. Extraite des tiges et racines de l’ananas. On
s'en sert comme additif alimentaire pour attendrir la viande ou comme agent de texture. Prise
sous forme de complément alimentaire, la bromélaïne faciliterait la digestion des protéines,
elle soulage les douleurs causées par l'arthrose.
1.1.3. La ficine : EC number: 3.4.22.3. Tirée des figues. Elle est utilisé dans l'industrie
alimentaire sous le code (E1101(iv)) pour l’attendrissement des viandes et la coagulation du
lait.
1.1.4. L’actinidine : EC number: 3.4.22.14 : extraite des fruits de kiwi. Une enzyme qui
améliore la digestion des protéines et aide à lutter contre les ballonnements. Elle a une
propriété de lutter contre les problèmes de mauvaise haleine, car elle capture certains
composés sulfurés qui se forment dans la bouche et dans l’intestin. Cet effet ne s’observe que
dans le cadre d’une consommation régulière.
1.2. Enzymes d’origine animale
1.2.1. La présure : est le nom donné au coagulant d'origine animale, extrait du suc gastrique
de la caillette (quatrième poche de l'estomac des jeunes ruminants, le plus souvent veaux ou
chevreaux), abattus avant sevrage. Elle est composée de deux enzymes, la chymosine et la
pepsine. C'est cette présure qui permet aux jeunes ruminants de digérer le lait. La présure est
employée pour la coagulation du lait lors de la fabrication de certains produits laitiers
(fromages…etc.).
1.2.2. La trypsine : extraite de pancréas de porc ou de bœuf.
1.2.5. La catalase : extraite du foie des bovins ou du cheval. Elle permet la dismutation du
peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée) en eau et dioxygène.
1.2.6. Les lipases : extraites du pancréas de porc des ovins ou des bovins.
1.2.6. Le lysozyme : extrait du blanc d’œuf de poule.
1.3. Enzymes d’origine microbienne
Les Micro-organismes utilisés pour la production d'enzymes comprennent environ 50
bactéries et champignons GRAS *.
* GRAS: en Anglais: Generally Recognized As Safe (ne présente aucun danger sanitaire lors
de son utilisation).
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La plus grande majorité des enzymes utilisées dans l’industrie est issue des
microorganismes : 50 % provenant des moisissures et de levures, 35 % des bactéries et 15 %
restant d’origines diverses.
licheniformis, et diverses espèces de Streptomyces.
Les champignons sont généralement représentés par Aspergillus, Mucor, Rhizopus,
Kluyveromyces et Saccharomyces.
La bactérie Bacillus subtilis et le champignon Aspergillus oryzae sont les
microorganismes les plus employés pour la production d'enzymes par la société mondiale de
biotechnologie Novozymes. Tous deux ont une immense capacité de production d'enzymes et
sont considérés comme totalement inoffensifs pour l'homme.
Les microorganismes peuvent être cultivés en grande quantité dans une période
relativement courte selon des méthodes de fermentation établies. La production microbienne
d'enzymes est économique à grande échelle grâce aux milieux de culture peu coûteux et les
cycles de fermentation courts.
Grace à une meilleure connaissance des mécanismes de fonctionnement et de
régulation génétique de ces enzymes, leurs disponibilité n’est plus un problème. Les
développements de la biologie cellulaire, de la génétique moléculaire, du génie enzymatique
et de la protéomique durant les dernières décennies ont bouleversé la production in vitro des
enzymes. Il est devenu possible de cloner les gènes qui codent pour des enzymes particuliers
et de les exprimer dans des microorganismes hôtes qui sont mieux adaptés aux conditions
industrielles (pH variable, température élevée……etc.) à grande échelle.
La surexpression de certains gène permet d’obtenir, avec des souches de
microorganismes cultivés dans des conditions appropries, une production massive d’enzymes
de grand intérêt à la fois biotechnologique et industriel. En outre, les méthodes de génie
génétiques permettront l’introduction et l’expression dans ces microorganismes de gènes
étrangers (d’organismes supérieurs ou d’autres microorganismes).
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2. Extractions des enzymes
Quel que soit le type de cellule choisi pour produire l’enzyme d’intérêt, nous devrons
sélectionner une méthode pour briser ce dernier et en extraire le contenu. À moins que
l’enzyme ciblée ne soit une protéine sécrétée et donc disponible dans le milieu (cas des
enzymes extracellulaire*.
L’extraction désigne l’action de séparer une enzyme d’un composé dont elle fait
partie. Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de
la membrane cellulaire par des procédés mécaniques, physiques, chimiques, ou enzymatiques.
(*) Lorsque l’enzyme est extracellulaire, elle est libérée dans le milieu extérieur avec un petit nombre d’autres molécules, donc on n’aura pas besoin de passer par l’étape d’extraction. Il suffit donc de séparer le milieu des cellules pour obtenir un extrait enzymatique brut (passer directement à la purification).
2.1. Choix de techniques d’extraction
Plusieurs choix s’offrent pour l’extraction des enzymes. Ce choix ce fait en fonction
de :
-Les conditions de purification de notre enzyme.
-L’équipement disponible.
De nombreux procédés mécaniques permettent de lyser différents types cellulaires afin
d'obtenir des extraits appelés classiquement extraits protéines totales hydrosolubles. Selon les
types de parois cellulaires rencontrées (ou leur absence), la libération des protéines totales
hydrosolubles sera plus ou moins difficile à obtenir.
A. Homogénéisateur de type Dounce
Cet appareil en verre borosilicaté ressemble à une éprouvette aux parois épaisses dans
laquelle s’enfonce un piston serré. Le passage des cellules dans l’espace extrêmement exigu
entre le piston et la paroi interne du tube cause leur rupture pour la réduction en fines
particules, et sans création de dommages aux noyaux de cellules. Le plus souvent le Douncer
est munis de deux pistons de diamètre différent, permettant d'effectuer un broyage fin ou
ultra-fin. (Fig1).
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B. Homogénéisateur de type Potter-Elvehjem
Le Potter-Elvehjem ressemble à un Dounce sauf que son piston a souvent une tête de
téflon (Fig.2). C’est un dispositif utilisé pour perturber les tissus (animal ou végétal). Un
piston cylindrique en téflon (PTFE) sur une tige en acier inoxydable tourne dans un tube en
verre borosilicaté bien ajusté (0,1 à 0,15 mm). Une suspension de particules tissulaires est
soumise à des forces de cisaillement lorsque le piston se déplace de haut en bas et presse la
suspension à travers l'espace entre le piston en rotation et le tube.
C. Presse French
Cet appareil a été mis au point pour la première fois par Milner, Lawrence et French
en 1950 pour préparer un extrait à partir d’une Algue Chlorella. Par la suite cette presse
cellule a été utilisée pour la destruction de plusieurs types de microorganismes.
L’appareil vise lui aussi à forcer les cellules à passer dans un espace très restreint ce
qui déchire leur membrane. Il consiste en un cylindre creux en métal, cylindre dans lequel
s’enfonce un piston de métal munis de plusieurs O-rings (circle) en caoutchouc très solide. À
la base du cylindre, une petite valve est installée; celle-ci peut être obstruée par une petite
bille en téflon (Fig. 3).
La presse utilise une pompe hydraulique externe pour entraîner le piston dans le
cylindre qui contient l'échantillon liquide. L'échantillon hautement pressurisé est ensuite
pressé devant une vanne à pointeau. Lorsque l'échantillon passe à travers la valve, le fluide
subit une contrainte de cisaillement et une décompression, ce qui provoque une perturbation
cellulaire. Plus la pression est haute dans le cylindre, plus la lyse est totale (Voir les vidéos
sur mon site pour plus de détails concernant le mode de fonctionnement).
D. Bombe à disruption
Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle de grandes quantités d'azote
sont d'abord dissoutes dans le mélange de cellule sous haute pression dans le récipient sous
pression approprié. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. Puis, lorsque la
pression du gaz est soudainement relâchée; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme
des bulles en expansion qui étirent les membranes de chaque cellule jusqu'à ce qu'elles se
rompent et libèrent le contenu de la cellule ( Fig. 4). (Voir les vidéos sur mon site pour plus
de détails concernant le mode de fonctionnement)
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Figure 4. Bombe à disruption
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E. Sonication
Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Une tige de métal le
"sonicateur" à l’extrémité très fine est introduite dans la suspension de cellules (Fig. 5). La
sonde du sonicateur va mettre le milieu en vibration ultrasonique (fréquence de 20 ou 40 kHz)
émettant un bruit fort déplaisant (l’utilisateur doit porter obligatoirement des cache-oreilles).
Les vibrations sont des ondes de pression ultrasoniques qui causent la croissance de
bulles par un phénomène appelé "cavitation". Ces bulles sont soumises à un grand stress par
les ondes ultrasoniques et peuvent subitement grandir, se contracter ou même imploser. Une
telle implosion est accompagnée d'une très haute augmentation locale de la pression et de la
température d’où l’obligation de mettre les échantillons dans un bac de glace, en utilisant des
impulsions courtes avec des pauses pour rétablir une température plus basse (Voir les vidéos
sur mon site pour plus de détails concernant le mode de fonctionnement).
Figure 5. La bombe à disruption
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2.2.2. Méthodes physiques
A. Choc osmotique
Un choc osmotique peut suffire à briser la membrane cellulaire de cellules fragiles,
avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-
osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par
causer une rupture de la membrane plasmique.
Il est possible de lyser les membranes plasmiques sans briser les noyaux. La lyse des
noyaux, si elle arrive accidentellement, se traduira par une soudaine augmentation de la
viscosité de la solution: c'est la chromatine qui est libérée qui en la responsable. Donc
L’éclatement des organites est l’inconvénient de cette technique.
2.2.3. Méthodes chimiques
La lyse chimique est basée sur l’utilisation d’un tampon de lyse ; utilisée dans le but
de rompre les cellules. La plupart des tampons de lyse contiennent des sels (par exemple Tris-
HCl ou EDTA) pour réguler l'acidité et l’osmolarité du lysat. Parfois, des détergents (tels que
Triton X-100 ou SDS : (dodécylsulfate de sodium) sont ajoutés pour briser les structures
membranaires. Un tampon de lyse peut être utilisé sur les cellules de tissus animaux et
végétaux ou même sur les cellules microbiennes.
L'emploi de détergents convenablement dosés permet de désorganiser les édifices
membranaires en double feuillet phospholipidiques tout en préservant les conformations
protéiques natives. Un détergent souvent utilisé dans les réactions chimiques de lyse est le
TritonX-100 et le tampon SDS.
2.2.3. Méthodes enzymatiques
La lyse enzymatique permet la destruction de la paroi par des enzymes.
Le lysozyme est utilisé pour digérer le peptidoglycane des parois des bactéries. Le
peptidoglycane est directement accessible au lysozyme chez les bactéries Gram (+),
cependant c’est n’est pas le cas chez les bactéries Gram (-) du fait de la présence de la
membrane externe.
Le traitement des Gram (-) impose de perméabiliser la membrane externe au
lysozyme, ceci est généralement réalisé par l’addition d’un tampon (le Tris-EDTA) :
l'EDTA chélate (complexe) les cations magnésium qui stabilisent le double feuillet de la
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membrane externe au lipopolysaccharide. Le Tris est réputé être un agent perméabilisant
des membranes externes.
La Lyticase (une endo-β1-3 glucanase) hydrolysant les liaisons β1-3 des glucanes
appelés laminarine) des parois des levures.
La Zymolyase est un mélange de 3 enzymes (endo-β1-3 glucanases, mannanases,
protéases) sécrétées par Arthrobacter luteus et hydrolyse les composants de paroi des
levures utilisées dans le domaine industrielle.
3. Purification des enzymes
La purification est l’étape visant à enlever toutes les impuretés d’un extrait brut
contenant l’enzyme d’intérêt. La purification d’une enzyme devra mettre en œuvre plusieurs
techniques successives et/ou complémentaires. Le choix de la technique de purification se base
principalement sur les propriétés caractéristiques des enzymes :
Leur taille moléculaire ;
Leurs différences d’adsorption caractéristiques.
3.1. Techniques de séparation basées sur les propriétés de solubilité
-Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium
3.2. Techniques de séparation basées sur la taille
-Dialyse
-Centrifugation et Ultracentrifugation.
3.4. Techniques de séparation basées sur la différence de poids moléculaire
-Electrophorèse sur gèle de polyacrylamide (SDS-Page)
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3.5. Techniques de séparation basées sur le pHi (la charge)
-Electrophorèse simple
-Chromatographie échangeuse d’ions
3.6. Techniques de séparation basées sur l’hydrophobicité et hydrophilicité des protéines
-Chromatographie de partage
3.7. Techniques de séparation basées sur l’interaction spécifique avec d’autres biomolécules
-Chromatographie d’affinité
4. Forme et techniques de conservation des enzymes
Les enzymes sont commercialisées sous forme de concentré liquide stabilisé ou de
solide (poudre ou particules), une enzyme enrobée ou sous forme de microgranulés.
La formule de la préparation enzymatique consiste à ajouter différents composés tels
que des protéines, des sucres ou des polyols ayant pour effet de :
Stabiliser l'enzyme (minimiser la perte d’activité enzymatique durant le
transport, le stockage et l’utilisation);
Faciliter l'étape de déshydratation (production d’enzyme en poudre à partir de
la forme liquide);
Eviter la précipitation (dans le cas d’enzyme liquide) ;
Optimisation de critères esthétiques.
Les préparations enzymatiques sous forme de poudre sont obtenues soit par
atomisation, soit par lyophilisation.
Ces opérations requièrent au préalable l'ajout à la préparation d'enzyme d'agents
protecteurs tels que l’amidon, maltodextrines, gomme arabique ou des sels lors de
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l’atomisation ou des sucres, polyéthène glycol, propylène glycol, polyols ou acides
aminés lors de la lyophilisation.
Exemple de quelques agents stabilisants pour les concentrés enzymatiques liquides :
Des polyols : glycérol, sorbitol ou mannitol.
Des disaccharides : lactose.
Des sels : NaCl, MgSO4.
L’ajout de Benzoate de sodium, Sorbate de sodium, et Ascorbate de sodium à une
concentration de 0,1-0,2% (w/v) confère un effet bactériostatique, ce qui permet une bonne
conservation de l’enzyme.
4.1. Règles de base pour la manipulation d'une enzyme
Pour une stabilité optimale, les enzymes doivent être stockées sous leur forme
commerciale d'origine (lyophilisée, suspension de sulfate d'ammonium, etc.) à la
température appropriée indiquée sur l'étiquette.
Les enzymes doivent être diluées pour être utilisées avec un tampon glacé ou de l'eau
distillée, selon le type d'enzyme (le plus souvent les enzymes commercialisés sont
concentrés et doivent subir une dilution préalable).
Les solutions enzymatiques diluées sont généralement instables. La quantité
d'enzyme requise pour l'expérience doit être diluée dans les 1 à 2 heures suivant
l'utilisation. Les enzymes ne doivent pas être diluées pour un stockage à long terme.
Les flacons contenant des enzymes lyophilisées (ainsi que des cofacteurs, tels que
NADH et NADPH) doivent atteindre la température ambiante avant d'être ouverts.
Cela permet d'éviter la condensation de l'humidité sur la poudre, qui peut entraîner
une perte d'activité ou une dégradation. Si le réactif est hygroscopique, une seule
mauvaise manipulation peut ruiner le flacon entier.
Les solutions ou suspensions d'enzymes normalement stockées à 4°C ou -20°C
doivent être conservées dans un bac de glace lorsqu'elles sont utilisées sur la paillasse
du laboratoire.
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en solution. Conserver en petites quantités. La stabilité des enzymes individuelles
peut varier considérablement et doit souvent être déterminée empiriquement dans vos
conditions exactes.
Les enzymes doivent être manipulées avec soin pour éviter toute contamination.
Utilisez une nouvelle pipette pour chaque aliquote prélevée dans le flacon initial. Ne
remettez jamais le matériel inutilisé dans le flacon initial. Le port de gants protège à
la fois le manipulateur et l'enzyme.