Enzymologie Appliquée - staff.univ-batna2.dz

Université Batna 2

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Microbiologie et de Biochimie

Master 1 Microbiologie Appliquée

Enzymologie Appliquée

(Chapitre 3)

- Origine des enzymes

-Techniques d’extraction et de purification

des enzymes

Chargé de cours : BENAMMAR Leyla

Année universitaire 2019-2020

Enzymologie Appliquée Master1 Microbiologie Appliquée Chargé de cours : BENAMMAR L. Année universitaire : 2019/2020

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1. Origines des enzymes

Les enzymes biologiquement actives peuvent être extraites de tout organisme vivant.

Un très large éventail de sources est utilisé pour la production commerciale d'enzymes. Sur la

centaine d'enzymes utilisées industriellement, plus de la moitié proviennent de champignons

et de levures et plus d'un tiers de bactéries, le reste étant réparti entre les sources animales

(8%) et végétales (4%).

Les microorganismes sont préférés aux plantes et aux animaux comme sources

d'enzymes car :

1. Ils sont généralement moins chers à produire.

2. Croissance rapide.

3. Facilement optimisable (optimisation des conditions de croissance).

4. Leur teneur en enzymes est plus prévisible et contrôlable.

5. Les tissus des végétaux et des animaux contiennent plus de matières potentiellement

nocives que les microorganismes, notamment des composés phénoliques (provenant des

plantes), des inhibiteurs d'enzymes endogènes et des protéases.

1.1. Enzymes d’origine végétale

Les enzymes d'origine végétale comprennent l'amylase, l'invertase, la papaïne, la

broméline, la ficine etc. Ces enzymes ont joué un rôle important dans la production

alimentaire, notamment dans les sirops, la boulangerie, les boissons alcoolisées, les produits

laitiers, etc. Outre l'utilisation des plantes comme usine pour la production d'enzymes, elles

peuvent également servir de matière première (activateur) pour l'amélioration de l'activité

enzymatique microbienne employée dans l'industrie alimentaire.

1.1.1. La papaïne : EC number: 3.4.22.2. Extraite d’une plante équatoriale et tropicale, le

papayer (à partir du fruit la papaye) qui sert à attendrir la viande, elle possède des propretés

anti-inflammatoires (favorise la guérison des plais et accélère la cicatrisation), utilisé en

cosmétique pour ces effets exfoliants, blanchissants, assouplissant de la peau (crème et

gommage).


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1.1.2. La bromélaine : EC number: 3.4.22.4. Extraite des tiges et racines de l’ananas. On

s'en sert comme additif alimentaire pour attendrir la viande ou comme agent de texture. Prise

sous forme de complément alimentaire, la bromélaïne faciliterait la digestion des protéines,

elle soulage les douleurs causées par l'arthrose.

1.1.3. La ficine : EC number: 3.4.22.3. Tirée des figues. Elle est utilisé dans l'industrie

alimentaire sous le code (E1101(iv)) pour l’attendrissement des viandes et la coagulation du

lait.

1.1.4. L’actinidine : EC number: 3.4.22.14 : extraite des fruits de kiwi. Une enzyme qui

améliore la digestion des protéines et aide à lutter contre les ballonnements. Elle a une

propriété de lutter contre les problèmes de mauvaise haleine, car elle capture certains

composés sulfurés qui se forment dans la bouche et dans l’intestin. Cet effet ne s’observe que

dans le cadre d’une consommation régulière.

1.2. Enzymes d’origine animale

1.2.1. La présure : est le nom donné au coagulant d'origine animale, extrait du suc gastrique

de la caillette (quatrième poche de l'estomac des jeunes ruminants, le plus souvent veaux ou

chevreaux), abattus avant sevrage. Elle est composée de deux enzymes, la chymosine et la

pepsine. C'est cette présure qui permet aux jeunes ruminants de digérer le lait. La présure est

employée pour la coagulation du lait lors de la fabrication de certains produits laitiers

(fromages…etc.).

1.2.2. La trypsine : extraite de pancréas de porc ou de bœuf.

1.2.5. La catalase : extraite du foie des bovins ou du cheval. Elle permet la dismutation du

peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée) en eau et dioxygène.

1.2.6. Les lipases : extraites du pancréas de porc des ovins ou des bovins.

1.2.6. Le lysozyme : extrait du blanc d’œuf de poule.

1.3. Enzymes d’origine microbienne

Les Micro-organismes utilisés pour la production d'enzymes comprennent environ 50

bactéries et champignons GRAS*.

*GRAS: en Anglais: Generally Recognized As Safe (ne présente aucun danger sanitaire lors

de son utilisation).


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La plus grande majorité des enzymes utilisées dans l’industrie est issue des

microorganismes : 50 % provenant des moisissures et de levures, 35 % des bactéries et 15 %

restant d’origines diverses.

Les bactéries sont principalement représentées par Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis, et diverses espèces de Streptomyces.

Les champignons sont généralement représentés par Aspergillus, Mucor, Rhizopus,

Kluyveromyces et Saccharomyces.

La bactérie Bacillus subtilis et le champignon Aspergillus oryzae sont les

microorganismes les plus employés pour la production d'enzymes par la société mondiale de

biotechnologie Novozymes. Tous deux ont une immense capacité de production d'enzymes et

sont considérés comme totalement inoffensifs pour l'homme.

Les microorganismes peuvent être cultivés en grande quantité dans une période

relativement courte selon des méthodes de fermentation établies. La production microbienne

d'enzymes est économique à grande échelle grâce aux milieux de culture peu coûteux et les

cycles de fermentation courts.

Grace à une meilleure connaissance des mécanismes de fonctionnement et de

régulation génétique de ces enzymes, leurs disponibilité n’est plus un problème. Les

développements de la biologie cellulaire, de la génétique moléculaire, du génie enzymatique

et de la protéomique durant les dernières décennies ont bouleversé la production in vitro des

enzymes. Il est devenu possible de cloner les gènes qui codent pour des enzymes particuliers

et de les exprimer dans des microorganismes hôtes qui sont mieux adaptés aux conditions

industrielles (pH variable, température élevée……etc.) à grande échelle.

La surexpression de certains gène permet d’obtenir, avec des souches de

microorganismes cultivés dans des conditions appropries, une production massive d’enzymes

de grand intérêt à la fois biotechnologique et industriel. En outre, les méthodes de génie

génétiques permettront l’introduction et l’expression dans ces microorganismes de gènes

étrangers (d’organismes supérieurs ou d’autres microorganismes).


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2. Extractions des enzymes

Quel que soit le type de cellule choisi pour produire l’enzyme d’intérêt, nous devrons

sélectionner une méthode pour briser ce dernier et en extraire le contenu. À moins que

l’enzyme ciblée ne soit une protéine sécrétée et donc disponible dans le milieu (cas des

enzymes extracellulaire*.

L’extraction désigne l’action de séparer une enzyme d’un composé dont elle fait

partie. Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de

la membrane cellulaire par des procédés mécaniques, physiques, chimiques, ou enzymatiques.

(*) Lorsque l’enzyme est extracellulaire, elle est libérée dans le milieu extérieur avec un petit nombre d’autres molécules, donc on n’aura pas besoin de passer par l’étape d’extraction. Il suffit donc de séparer le milieu des cellules pour obtenir un extrait enzymatique brut (passer directement à la purification).

2.1. Choix de techniques d’extraction

Plusieurs choix s’offrent pour l’extraction des enzymes. Ce choix ce fait en fonction

de :

- Type de cellule utilisée.

-La localisation de l’enzyme.

-Les conditions de purification de notre enzyme.

-L’équipement disponible.

2.2. Techniques d’extraction

2.2.1. Méthodes mécaniques

De nombreux procédés mécaniques permettent de lyser différents types cellulaires afin

d'obtenir des extraits appelés classiquement extraits protéines totales hydrosolubles. Selon les

types de parois cellulaires rencontrées (ou leur absence), la libération des protéines totales

hydrosolubles sera plus ou moins difficile à obtenir.

A. Homogénéisateur de type Dounce

Cet appareil en verre borosilicaté ressemble à une éprouvette aux parois épaisses dans

laquelle s’enfonce un piston serré. Le passage des cellules dans l’espace extrêmement exigu

entre le piston et la paroi interne du tube cause leur rupture pour la réduction en fines

particules, et sans création de dommages aux noyaux de cellules. Le plus souvent le Douncer

est munis de deux pistons de diamètre différent, permettant d'effectuer un broyage fin ou

ultra-fin. (Fig1).


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B. Homogénéisateur de type Potter-Elvehjem

Le Potter-Elvehjem ressemble à un Dounce sauf que son piston a souvent une tête de

téflon (Fig.2). C’est un dispositif utilisé pour perturber les tissus (animal ou végétal). Un

piston cylindrique en téflon (PTFE) sur une tige en acier inoxydable tourne dans un tube en

verre borosilicaté bien ajusté (0,1 à 0,15 mm). Une suspension de particules tissulaires est

soumise à des forces de cisaillement lorsque le piston se déplace de haut en bas et presse la

suspension à travers l'espace entre le piston en rotation et le tube.

C. Presse French

Cet appareil a été mis au point pour la première fois par Milner, Lawrence et French

en 1950 pour préparer un extrait à partir d’une Algue Chlorella. Par la suite cette presse

cellule a été utilisée pour la destruction de plusieurs types de microorganismes.

L’appareil vise lui aussi à forcer les cellules à passer dans un espace très restreint ce

qui déchire leur membrane. Il consiste en un cylindre creux en métal, cylindre dans lequel

s’enfonce un piston de métal munis de plusieurs O-rings (circle) en caoutchouc très solide. À

la base du cylindre, une petite valve est installée; celle-ci peut être obstruée par une petite

bille en téflon (Fig. 3).

La presse utilise une pompe hydraulique externe pour entraîner le piston dans le

cylindre qui contient l'échantillon liquide. L'échantillon hautement pressurisé est ensuite

pressé devant une vanne à pointeau. Lorsque l'échantillon passe à travers la valve, le fluide

subit une contrainte de cisaillement et une décompression, ce qui provoque une perturbation

cellulaire. Plus la pression est haute dans le cylindre, plus la lyse est totale (Voir les vidéos

sur mon site pour plus de détails concernant le mode de fonctionnement).

D. Bombe à disruption

Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle de grandes quantités d'azote

sont d'abord dissoutes dans le mélange de cellule sous haute pression dans le récipient sous

pression approprié. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. Puis, lorsque la

pression du gaz est soudainement relâchée; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme

des bulles en expansion qui étirent les membranes de chaque cellule jusqu'à ce qu'elles se

rompent et libèrent le contenu de la cellule ( Fig. 4). (Voir les vidéos sur mon site pour plus

de détails concernant le mode de fonctionnement)


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Figure 1. Homogénéisateur de type Dounce

Figure 2. Homogénéisateur de type Dounce


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Figure 3. Fonctionnement du Presse French

Figure 4. Bombe à disruption


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E. Sonication

Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Une tige de métal le

"sonicateur" à l’extrémité très fine est introduite dans la suspension de cellules (Fig. 5). La

sonde du sonicateur va mettre le milieu en vibration ultrasonique (fréquence de 20 ou 40 kHz)

émettant un bruit fort déplaisant (l’utilisateur doit porter obligatoirement des cache-oreilles).

Les vibrations sont des ondes de pression ultrasoniques qui causent la croissance de

bulles par un phénomène appelé "cavitation". Ces bulles sont soumises à un grand stress par

les ondes ultrasoniques et peuvent subitement grandir, se contracter ou même imploser. Une

telle implosion est accompagnée d'une très haute augmentation locale de la pression et de la

température d’où l’obligation de mettre les échantillons dans un bac de glace, en utilisant des

impulsions courtes avec des pauses pour rétablir une température plus basse (Voir les vidéos

sur mon site pour plus de détails concernant le mode de fonctionnement).

Figure 5. La bombe à disruption


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2.2.2. Méthodes physiques

A. Choc osmotique

Un choc osmotique peut suffire à briser la membrane cellulaire de cellules fragiles,

avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-

osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par

causer une rupture de la membrane plasmique.

Il est possible de lyser les membranes plasmiques sans briser les noyaux. La lyse des

noyaux, si elle arrive accidentellement, se traduira par une soudaine augmentation de la

viscosité de la solution: c'est la chromatine qui est libérée qui en la responsable. Donc

L’éclatement des organites est l’inconvénient de cette technique.

2.2.3. Méthodes chimiques

La lyse chimique est basée sur l’utilisation d’un tampon de lyse ; utilisée dans le but

de rompre les cellules. La plupart des tampons de lyse contiennent des sels (par exemple Tris-

HCl ou EDTA) pour réguler l'acidité et l’osmolarité du lysat. Parfois, des détergents (tels que

Triton X-100 ou SDS : (dodécylsulfate de sodium) sont ajoutés pour briser les structures

membranaires. Un tampon de lyse peut être utilisé sur les cellules de tissus animaux et

végétaux ou même sur les cellules microbiennes.

L'emploi de détergents convenablement dosés permet de désorganiser les édifices

membranaires en double feuillet phospholipidiques tout en préservant les conformations

protéiques natives. Un détergent souvent utilisé dans les réactions chimiques de lyse est le

TritonX-100 et le tampon SDS.

2.2.3. Méthodes enzymatiques

La lyse enzymatique permet la destruction de la paroi par des enzymes.

Le lysozyme est utilisé pour digérer le peptidoglycane des parois des bactéries. Le

peptidoglycane est directement accessible au lysozyme chez les bactéries Gram (+),

cependant c’est n’est pas le cas chez les bactéries Gram (-) du fait de la présence de la

membrane externe.

Le traitement des Gram (-) impose de perméabiliser la membrane externe au

lysozyme, ceci est généralement réalisé par l’addition d’un tampon (le Tris-EDTA) :

l'EDTA chélate (complexe) les cations magnésium qui stabilisent le double feuillet de la


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membrane externe au lipopolysaccharide. Le Tris est réputé être un agent perméabilisant

des membranes externes.

La Lyticase (une endo-β1-3 glucanase) hydrolysant les liaisons β1-3 des glucanes

appelés laminarine) des parois des levures.

La Zymolyase est un mélange de 3 enzymes (endo-β1-3 glucanases, mannanases,

protéases) sécrétées par Arthrobacter luteus et hydrolyse les composants de paroi des

levures utilisées dans le domaine industrielle.

3. Purification des enzymes

La purification est l’étape visant à enlever toutes les impuretés d’un extrait brut

contenant l’enzyme d’intérêt. La purification d’une enzyme devra mettre en œuvre plusieurs

techniques successives et/ou complémentaires. Le choix de la technique de purification se base

principalement sur les propriétés caractéristiques des enzymes :

Leur taille moléculaire ;

Leur solubilité ;

leur charge électrique ;

Leur affinité biologique pour d’autres molécules ;

Leurs différences d’adsorption caractéristiques.

3.1. Techniques de séparation basées sur les propriétés de solubilité

-Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium

3.2. Techniques de séparation basées sur la taille

-Dialyse

-Filtration sur membrane

-Filtration sur gel

3.3. Techniques de séparation basées sur la densité

-Centrifugation et Ultracentrifugation.

3.4. Techniques de séparation basées sur la différence de poids moléculaire

-Electrophorèse sur gèle de polyacrylamide (SDS-Page)


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-Chromatographie d’exclusion moléculaire sur gel.

3.5. Techniques de séparation basées sur le pHi (la charge)

-Electrophorèse simple

-Chromatographie échangeuse d’ions

3.6. Techniques de séparation basées sur l’hydrophobicité et hydrophilicité des protéines

-Chromatographie de partage

3.7. Techniques de séparation basées sur l’interaction spécifique avec d’autres biomolécules

-Chromatographie d’affinité

4. Forme et techniques de conservation des enzymes

Les enzymes sont commercialisées sous forme de concentré liquide stabilisé ou de

solide (poudre ou particules), une enzyme enrobée ou sous forme de microgranulés.

La formule de la préparation enzymatique consiste à ajouter différents composés tels

que des protéines, des sucres ou des polyols ayant pour effet de :

Stabiliser l'enzyme (minimiser la perte d’activité enzymatique durant le

transport, le stockage et l’utilisation);

Faciliter l'étape de déshydratation (production d’enzyme en poudre à partir de

la forme liquide);

Préservation contre la contamination microbienne ;

Eviter la précipitation (dans le cas d’enzyme liquide) ;

Optimisation de critères esthétiques.

Les préparations enzymatiques sous forme de poudre sont obtenues soit par

atomisation, soit par lyophilisation.

Ces opérations requièrent au préalable l'ajout à la préparation d'enzyme d'agents

protecteurs tels que l’amidon, maltodextrines, gomme arabique ou des sels lors de


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l’atomisation ou des sucres, polyéthène glycol, propylène glycol, polyols ou acides

aminés lors de la lyophilisation.

Exemple de quelques agents stabilisants pour les concentrés enzymatiques liquides :

Des polyols : glycérol, sorbitol ou mannitol.

Des disaccharides : lactose.

Des sels : NaCl, MgSO4.

L’ajout de Benzoate de sodium, Sorbate de sodium, et Ascorbate de sodium à une

concentration de 0,1-0,2% (w/v) confère un effet bactériostatique, ce qui permet une bonne

conservation de l’enzyme.

4.1. Règles de base pour la manipulation d'une enzyme

Pour une stabilité optimale, les enzymes doivent être stockées sous leur forme

commerciale d'origine (lyophilisée, suspension de sulfate d'ammonium, etc.) à la

température appropriée indiquée sur l'étiquette.

Les enzymes doivent être diluées pour être utilisées avec un tampon glacé ou de l'eau

distillée, selon le type d'enzyme (le plus souvent les enzymes commercialisés sont

concentrés et doivent subir une dilution préalable).

Les solutions enzymatiques diluées sont généralement instables. La quantité

d'enzyme requise pour l'expérience doit être diluée dans les 1 à 2 heures suivant

l'utilisation. Les enzymes ne doivent pas être diluées pour un stockage à long terme.

Les flacons contenant des enzymes lyophilisées (ainsi que des cofacteurs, tels que

NADH et NADPH) doivent atteindre la température ambiante avant d'être ouverts.

Cela permet d'éviter la condensation de l'humidité sur la poudre, qui peut entraîner

une perte d'activité ou une dégradation. Si le réactif est hygroscopique, une seule

mauvaise manipulation peut ruiner le flacon entier.

Les solutions ou suspensions d'enzymes normalement stockées à 4°C ou -20°C

doivent être conservées dans un bac de glace lorsqu'elles sont utilisées sur la paillasse

du laboratoire.


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Éviter la congélation-décongélation répétée des enzymes diluées et des lyophilisats

en solution. Conserver en petites quantités. La stabilité des enzymes individuelles

peut varier considérablement et doit souvent être déterminée empiriquement dans vos

conditions exactes.

Les enzymes doivent être manipulées avec soin pour éviter toute contamination.

Utilisez une nouvelle pipette pour chaque aliquote prélevée dans le flacon initial. Ne

remettez jamais le matériel inutilisé dans le flacon initial. Le port de gants protège à

la fois le manipulateur et l'enzyme.

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