上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 临床基因扩增检验临床基因扩增检验 质量控制质量控制 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory PCR技术灵敏度高，特异性强，广泛 应用于病原体感染的早期诊断、疗效监 测、肿瘤及遗传性疾病的研究。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 由于灵敏度高和影响因素多，很容 易造成假阴性或假阳性的结果，从而限 制PCR技术在临床上的应用。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 （医卫发[2002]10号） 临床基因扩增检验实验室工作规范 （卫生部临床检验中心） 上海市临床基因扩增检验实验室工作规范 （上海市卫生局） 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 实验室的规范设置实验室的规范设置 四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、 产物分析区）必须是互相独立的 各区间不能直通，应有缓冲间 应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调 设备(不能使用中央空调) 生物安全柜、冲眼器 各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯 传递窗 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 临床基因扩增检验质量控制临床基因扩增检验质量控制 分析前—标本（采集、运送、验收、保存）、 仪器、试剂、耗材、人员 分析中—核酸提取、核酸扩增、产物分析、检 测的有效性判断。 分析后—报告发出、结果解释 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本标本 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本采集时间标本采集时间 临床“假阳性”问题：TB、CT、NG建议治疗 结束后2周再检测，避免因死基因存在而造成 的假阳性 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本的接收标本的接收 标本接收建议在三个测定区之外 接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从 其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本， 因其有较大的发生标本间污染的可能性 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本采集量标本采集量 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。 一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的 话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增 检测。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本验收、拒收标本验收、拒收 血液标本：溶血、严重脂血等应拒收 泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。 痰液：镜下观察上皮细胞很少(低于10个鳞状上 皮细胞)，白细胞一般超过25个。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本采集中的防污染标本采集中的防污染 标本采集最好采用一次性无菌器材，采集中要 特别注意污染，防止混入操作者的头屑，表皮 细胞等。如使用玻璃器皿，必须为密闭的、必 须经高压灭菌，以使可能存在的RNAase永久性 失活。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 采样容器采样容器 采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应 对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全 血、骨髓和血浆标本，最好用EDTA抗 凝，不使用肝素，因其是 Taq酶的强抑 制剂，且在核酸提取过程中很难完全去 除。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本运送标本运送 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床标本的运送条件（温度、时间）作出 相应规定。 靶核酸为DNA的标本8h，靶核酸为RNA的标 本4h内送至实验室，所有临床标本在采集 后送至实验室前，均应放2－8℃临时保存。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 标本保存标本保存 靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本 的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融） 靶核酸为DNA的标本4℃保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应－ 20℃下保存 －20℃下保存1-2周 －70℃以下可长期保存 如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5～8.0)缓冲液中4 ℃下保存。 用于RNA扩增分析的样本，则应于上述 TE缓冲液中-70℃保存。 痰（液化标本）、棉拭子（离心沉淀物） -70℃以下保存 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 实验室仪器设备及管理实验室仪器设备及管理 实验室仪器设备应保养良好，实验用品要 达到相应的要求。核酸扩增仪？恒温金属浴？ 加样器的校准？ 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 扩增仪扩增仪 结构：温度控制及导热系统、光路系统、 检测系统 校准：1）光路校准（荧光检测波长530nm、 640nm、710nm） 2）温度校准（温度准确度、孔间温度 的均一性、温度升降速率） 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 恒温金属浴校准恒温金属浴校准 温度准确度 孔间温度的均一性 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 移液器移液器 外校 自校-参照《定量、可调移液器试行检定规程》 (JJG646-90) 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 理想耗材、试剂理想耗材、试剂 耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检 试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检 采用血清盘进行质检（选择试剂品牌） 采用弱阳性进行质检（更换试剂批号） 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的使用及质检 首先制备一个含1～2%甘油及色素（如甲基橙） 的水溶液，如果吸头的最大体积为100μl，则 将加样器吸取体积调至110～120μl，再套上 吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好， 则有色液体不应出现在滤塞之上，否则说明滤 塞不严。 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory 离心管质检离心管质检 爆管试验 1）随机抽取5-10个离心管，装三分之二的蒸馏 水，1，3000 rpm离心10分钟 2）100℃ 10分钟 抑制物质检试验 采用已知浓度阳性样本进行扩增检测，如出现检 测结果与预期
