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临床基因扩增检验临床基因扩增检验
质量控制质量控制
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PCR技术灵敏度高,特异性强,广泛
应用于病原体感染的早期诊断、疗效监
测、肿瘤及遗传性疾病的研究。
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由于灵敏度高和影响因素多,很容
易造成假阴性或假阳性的结果,从而限
制PCR技术在临床上的应用。
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临床基因扩增检验实验室管理暂行办法
(医卫发[2002]10号)
临床基因扩增检验实验室工作规范
(卫生部临床检验中心)
上海市临床基因扩增检验实验室工作规范
(上海市卫生局)
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实验室的规范设置实验室的规范设置
四个区域(试剂准备区、标本制备区、扩增区、
产物分析区)必须是互相独立的
各区间不能直通,应有缓冲间
应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调
设备(不能使用中央空调)
生物安全柜、冲眼器
各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯
传递窗
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临床基因扩增检验质量控制临床基因扩增检验质量控制
分析前—标本(采集、运送、验收、保存)、 仪器、试剂、耗材、人员
分析中—核酸提取、核酸扩增、产物分析、检 测的有效性判断。
分析后—报告发出、结果解释
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标本标本
标本采集时间对扩增检测结果的影响
标本的类型和采集量
采样质量的评价
采样及运输容器
标本采集中的防污染
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标本采集时间标本采集时间
临床“假阳性”问题:TB、CT、NG建议治疗
结束后2周再检测,避免因死基因存在而造成
的假阳性
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标本的接收标本的接收
标本接收建议在三个测定区之外
接收的标本应收集在原始容器中,不能接受从
其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本,
因其有较大的发生标本间污染的可能性
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标本采集量标本采集量
标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。
一般来说,如果样本的量对病原体培养够用的
话,则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增
检测。
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标本验收、拒收标本验收、拒收
血液标本:溶血、严重脂血等应拒收
泌尿生殖道分泌物:镜下观察到上皮细胞存在。
痰液:镜下观察上皮细胞很少(低于10个鳞状上
皮细胞),白细胞一般超过25个。
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标本采集中的防污染标本采集中的防污染
标本采集最好采用一次性无菌器材,采集中要
特别注意污染,防止混入操作者的头屑,表皮
细胞等。如使用玻璃器皿,必须为密闭的、必
须经高压灭菌,以使可能存在的RNAase永久性
失活。
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采样容器采样容器
采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应
对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全
血、骨髓和血浆标本,最好用EDTA抗
凝,不使用肝素,因其是 Taq酶的强抑
制剂,且在核酸提取过程中很难完全去
除。
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标本运送标本运送
实验室应根据待测靶核酸的特性,对各种
临床标本的运送条件(温度、时间)作出
相应规定。
靶核酸为DNA的标本8h,靶核酸为RNA的标
本4h内送至实验室,所有临床标本在采集
后送至实验室前,均应放2-8℃临时保存。
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标本保存标本保存 靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解,因此标本
的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要(避免反复冻融)
靶核酸为DNA的标本4℃保存1-3天,靶核酸为RNA的标本应-
20℃下保存
-20℃下保存1-2周
-70℃以下可长期保存
如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本,可于10 mmol/L
Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5~8.0)缓冲液中4 ℃下保存。
用于RNA扩增分析的样本,则应于上述 TE缓冲液中-70℃保存。
痰(液化标本)、棉拭子(离心沉淀物) -70℃以下保存
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实验室仪器设备及管理实验室仪器设备及管理
实验室仪器设备应保养良好,实验用品要
达到相应的要求。核酸扩增仪?恒温金属浴?
加样器的校准?
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扩增仪扩增仪
结构:温度控制及导热系统、光路系统、
检测系统
校准:1)光路校准(荧光检测波长530nm、
640nm、710nm)
2)温度校准(温度准确度、孔间温度
的均一性、温度升降速率)
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恒温金属浴校准恒温金属浴校准
温度准确度
孔间温度的均一性
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移液器移液器
外校
自校-参照《定量、可调移液器试行检定规程》 (JJG646-90)
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理想耗材、试剂理想耗材、试剂
耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检
试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检
采用血清盘进行质检(选择试剂品牌)
采用弱阳性进行质检(更换试剂批号)
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带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的使用及质检
首先制备一个含1~2%甘油及色素(如甲基橙)
的水溶液,如果吸头的最大体积为100μl,则
将加样器吸取体积调至110~120μl,再套上
吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好,
则有色液体不应出现在滤塞之上,否则说明滤
塞不严。
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离心管质检离心管质检
爆管试验
1)随机抽取5-10个离心管,装三分之二的蒸馏
水,1,3000 rpm离心10分钟
2)100℃ 10分钟
抑制物质检试验
采用已知浓度阳性样本进行扩增检测,如出现检
测结果与预期