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临床基因扩增检验 质量控制 - yeec. · PDF file临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 (医卫发[2002]10号) 临床基因扩增检验实验室工作规范

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  • 上上 海海 市市 临临 床床 检检 验验 中中 心心 Shanghai Centre for Clinical LaboratoryShanghai Centre for Clinical Laboratory

    临床基因扩增检验临床基因扩增检验

    质量控制质量控制

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    PCR技术灵敏度高,特异性强,广泛

    应用于病原体感染的早期诊断、疗效监

    测、肿瘤及遗传性疾病的研究。

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    由于灵敏度高和影响因素多,很容

    易造成假阴性或假阳性的结果,从而限

    制PCR技术在临床上的应用。

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    临床基因扩增检验实验室管理暂行办法

    (医卫发[2002]10号)

    临床基因扩增检验实验室工作规范

    (卫生部临床检验中心)

    上海市临床基因扩增检验实验室工作规范

    (上海市卫生局)

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    实验室的规范设置实验室的规范设置

    四个区域(试剂准备区、标本制备区、扩增区、

    产物分析区)必须是互相独立的

    各区间不能直通,应有缓冲间

    应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调

    设备(不能使用中央空调)

    生物安全柜、冲眼器

    各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯

    传递窗

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    临床基因扩增检验质量控制临床基因扩增检验质量控制

    分析前—标本(采集、运送、验收、保存)、 仪器、试剂、耗材、人员

    分析中—核酸提取、核酸扩增、产物分析、检 测的有效性判断。

    分析后—报告发出、结果解释

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    标本标本

    标本采集时间对扩增检测结果的影响

    标本的类型和采集量

    采样质量的评价

    采样及运输容器

    标本采集中的防污染

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    标本采集时间标本采集时间

    临床“假阳性”问题:TB、CT、NG建议治疗

    结束后2周再检测,避免因死基因存在而造成

    的假阳性

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    标本的接收标本的接收

    标本接收建议在三个测定区之外

    接收的标本应收集在原始容器中,不能接受从

    其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本,

    因其有较大的发生标本间污染的可能性

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    标本采集量标本采集量

    标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。

    一般来说,如果样本的量对病原体培养够用的

    话,则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增

    检测。

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    标本验收、拒收标本验收、拒收

    血液标本:溶血、严重脂血等应拒收

    泌尿生殖道分泌物:镜下观察到上皮细胞存在。

    痰液:镜下观察上皮细胞很少(低于10个鳞状上

    皮细胞),白细胞一般超过25个。

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    标本采集中的防污染标本采集中的防污染

    标本采集最好采用一次性无菌器材,采集中要

    特别注意污染,防止混入操作者的头屑,表皮

    细胞等。如使用玻璃器皿,必须为密闭的、必

    须经高压灭菌,以使可能存在的RNAase永久性

    失活。

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    采样容器采样容器

    采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应

    对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全

    血、骨髓和血浆标本,最好用EDTA抗

    凝,不使用肝素,因其是 Taq酶的强抑

    制剂,且在核酸提取过程中很难完全去

    除。

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    标本运送标本运送

    实验室应根据待测靶核酸的特性,对各种

    临床标本的运送条件(温度、时间)作出

    相应规定。

    靶核酸为DNA的标本8h,靶核酸为RNA的标

    本4h内送至实验室,所有临床标本在采集

    后送至实验室前,均应放2-8℃临时保存。

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    标本保存标本保存 靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解,因此标本

    的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要(避免反复冻融)

    靶核酸为DNA的标本4℃保存1-3天,靶核酸为RNA的标本应-

    20℃下保存

    -20℃下保存1-2周

    -70℃以下可长期保存

    如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本,可于10 mmol/L

    Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5~8.0)缓冲液中4 ℃下保存。

    用于RNA扩增分析的样本,则应于上述 TE缓冲液中-70℃保存。

    痰(液化标本)、棉拭子(离心沉淀物) -70℃以下保存

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    实验室仪器设备及管理实验室仪器设备及管理

    实验室仪器设备应保养良好,实验用品要

    达到相应的要求。核酸扩增仪?恒温金属浴?

    加样器的校准?

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    扩增仪扩增仪

    结构:温度控制及导热系统、光路系统、

    检测系统

    校准:1)光路校准(荧光检测波长530nm、

    640nm、710nm)

    2)温度校准(温度准确度、孔间温度

    的均一性、温度升降速率)

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    恒温金属浴校准恒温金属浴校准

    温度准确度

    孔间温度的均一性

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    移液器移液器

    外校

    自校-参照《定量、可调移液器试行检定规程》 (JJG646-90)

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    理想耗材、试剂理想耗材、试剂

    耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检

    试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检

    采用血清盘进行质检(选择试剂品牌)

    采用弱阳性进行质检(更换试剂批号)

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    带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的使用及质检

    首先制备一个含1~2%甘油及色素(如甲基橙)

    的水溶液,如果吸头的最大体积为100μl,则

    将加样器吸取体积调至110~120μl,再套上

    吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好,

    则有色液体不应出现在滤塞之上,否则说明滤

    塞不严。

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    离心管质检离心管质检

    爆管试验

    1)随机抽取5-10个离心管,装三分之二的蒸馏

    水,1,3000 rpm离心10分钟

    2)100℃ 10分钟

    抑制物质检试验

    采用已知浓度阳性样本进行扩增检测,如出现检

    测结果与预期