Fasi cruciali

• Scelta della patologia da analizzare

• Scelta del campione da analizzare

• Scelta dell’approccio da utilizzare

• Scelta della tecnica da utilizzare• Scelta della tecnica da utilizzare

• Analisi statistica del dati

• Conferme con approcci indipendenti

Patologie da analizzare

• Patologie con base genetica dimostrata

– Analisi della ricorrenza familiare

• Patologie ad ampia diffusione nella popolazione

– Necessità di campioni numerosi – Necessità di campioni numerosi

• Patologie per le quali la conoscenza delle basi

genetiche porti un beneficio

– Comprensione delle basi biologiche

– Messa a punto di nuove strategie terapeutiche

– Prevenzione

Scelta del campione da analizzare

• Accurata valutazione clinico-strumentale

• Selezione scrupolosa dei controlli

• Sovrapponibilità dei gruppo dei pazienti e di

quello dei controlli per:quello dei controlli per:

– Sesso

– Età

– Etnia

Scelta dell’approccio da utilizzare

• Analisi di linkage

• Studi di associazione• Studi di associazione

• Approccio del gene candidato

• MUTAZIONE

< 1% popolazione

• POLIMORFISMO:

> 1% popolazione

Alterazioni sul DNA

Diversa è la loro frequenza!

Mutazioni e polimorfismi

• In regioni codificanti (esoni):

– Cambio di nucleotidi:

-silente (non cambia amminoacido)

- di senso (cambia aa)- di senso (cambia aa)

-di non senso o di stop (codone per un aa diventa

codone di stop: proteina tronca)

– Inserzioni o delezioni:

-frameshift (slittamento del codice di lettura)

Polimorfismi

• In regioni ripetute non codificanti:

– Cambio del numero di ripetizioni

Scelta dell’approccio da utilizzare

• Analisi di linkage

• Studi di associazione• Studi di associazione

• Approccio del gene candidato

Consentono di identificare geni che si presume siano coinvolti

nell'insorgenza di diverse malattie

Analisi di linkage

• Si basa sullo studio della trasmissione di marcatori di

DNA all’interno di famiglie in cui segrega una certa

malattia• Utili per localizzare loci di malattie monogeniche

Analisi di linkage

Ricordando che per la II legge di Mendel due caratteri differenti sono

ereditati in modo indipendente

l’analisi di linkage parte dal presupposto che due marcatori vicini NON

segregano in modo indipendente

Analisi della co-segregazione degli alleli di diversi marcatori

all’interno di una famiglia di individui.

Limite principale: scarso potere di risoluzione

(indicano una regione contenente potenziali geni di suscettibilità ma non

consentono di localizzare tali geni)

all’interno di una famiglia di individui.

E’ possibile in questo modo costruire gruppi di marcatori la cui

probabilità di essere associati è significativamente più elevata

della probabilità di essere indipendenti

Studi associazione “genome wide”

– Analizzano la

associazione tra

alcuni marcatori

genici e soggetti

affetti e non affetti

nella popolazione nella popolazione

indipendentemente

dalla familiarità

•Utile per lo studio di

tratti complessi

Studi associazione “genome wide”

verificano l’esistenza di una correlazione tra alleli specifici ed una

determinata malattia in una popolazione

basandosi sulla comparazione delle frequenze alleliche di varianti geniche

polimorfiche nei pazienti e nei controlli sani (popolazione di controllo)

Genotipo positivamente associato con la malattia (o predisponente):

se presente in maniera significativamente più frequente nei malati rispetto

ai controlli

Genotipo negativamente associato con la malattia (o protettivo):

se presente in maniera significativamente più frequente nei controlli

rispetto ai pazienti

Gli studi di associazione sono più sensibili degli studi di linkage ma richiedono

l’analisi di una enorme mole di tratti di DNA oppure la conoscenza a priori di

regioni geniche candidate (implicate nella patogenesi della malattia).

Approccio del gene candidato

• Si basa sullo studio in pazienti affetti e in popolazioni di controllo di geni la

cui funzione possa ipoteticamente essere correlata al carattere oggetto di

studio.

Scelta della tecnica da utilizzare

• Estrazione del DNA

• Amplificazione del DNA• Amplificazione del DNA

• Sequenziamento del DNA

Estrazione di DNA

• Varie metodiche per estrazione DNA

• Estrazione manuale: • Estrazione manuale: vari kit in commercio

(spin basket, biglie magnetiche)

• Estrattori automatici

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

• Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA

• Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo

Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici

• Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato

• Permette di separare i frammenti amplificati mediante PCRmediante PCR

Gel Documentation System

Elettroforesi su gel

Il concetto di variante genica

• La correlazione di un gene di suscettibilità con

una patologia non è legata alla presenza o

assenza di quel gene, ma alla presenza di

specifiche varianti di sequenzaspecifiche varianti di sequenza

• Per valutare la presenza di tali varianti, è

necessario procedere ad una lettura della

sequenza del gene, altrimenti detta

“sequenziamento genico”.

Sequenziamento diretto del DNA

Mutazione in eterozigosi

Mutazione in omozigosi

Analisi statistica del dati

• Poiché nella genetica del comportamento la

componente genetica è di suscettibilità e non

deterministica, ci si deve attendere che anche

un certo numero di controlli presenti le un certo numero di controlli presenti le

varianti geniche associate alla patologia

• Le analisi statistiche servono a valutare se le

differenze riscontrate tra casi e controlli siano

significative o no.

Conferme con approcci indipendenti

• Per valutare se una certa variante genica sia

effettivamente associata ad un disturbo del

comportamento, è necessario verificare se la

funzione svolta dal gene sia compatibile con funzione svolta dal gene sia compatibile con

una sua correlazione alla patologia.

Studi di espressione genica

Modelling proteico

Studi su animali knock out

o transgenici

• Permettono di verificare quale fenotipo

comportamentale si associa alla eliminazione

(KO) o all’inserimento (transgene) di uno (KO) o all’inserimento (transgene) di uno

specifico gene