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Epidemiologia e diagnosidell’influenza aviare in Italia

Ana Moreno Martin

Influenza aviare (H5N1) e influenza H1N1Come protteggere me stesso, la mia famiglia e la collettività

Azienda Ospedaliera L. Sacco – Milano5 Ottobre 2009

Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna - Italy

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Influenza aviare: una “nuova”emergenza?

NON è una malattia nuovaSegnalata da un veterinario Perroncito, nel 1878 !!!Identificazione dell’agente causale come un microrganismo filtrabile (1902 Centanni e Savonuzzi) A/Chicken/Brescia/1902 H7N7 Conosciuta ad inizio secolo scorso come peste lombarda (Hutyra & Marek)

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Eziologia

Orthomyxoviridae

Influenzavirus tipo A

Sottotipi

Haemagglutinin (16)

Neuraminidase (9)

Multiple combinazioniHA-NA

AIV

NA HA

4

Specie ospiti dei virus influenzaliSensibilità ad H e N

H7

H15H16

5

Virus influenzali

Affinità tra proteina H e sito recettoriale2 tipi di recettori:

SAα2,3Gal – Virus aviari, equiniSAα2,6Gal – Virus umani, suini

Specificità recettori - mutazioni aa nella HA L226, S228 SAα2,6Gal Q226, G228 SAα2,3Gal (Vilnes et al, J Virol, 1998)

V135S, A138S >affinità SAα2,6Gal (Das et al, J Comput

Chem, 2009)

6

Distribuzione dei recettori nei tessuti ospiti

Uomo

Recettori SAα2,6Gal - faringe, trachea, bronchi

Recettori SAα2,3Gal – bronchioli, alveoli

Nature(2006), 440:435-436

Prove Istochimica (lectine):Sambucus nigra - SA α2,6 Gal (verde)Maackia amurensis- SA α2,3 Gal (rosso)

7

Distribuzione dei recettori neitessuti ospiti

J Mol Genet Med(2009) 3:143-151

AnatraRecettori SAα2,3Gal – trachea, intestino, reneRecettori SAα2,6Gal - rene

PolloRecettori SAα2,6Gal – trachea, rene Recettori SAα2,3Gal – intestino

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RESERVOIRS

DEAD-END hosts

SPILLOVER

GENE POOL??

Contesto Ecologicointerconnessione tra ospiti serbatioi, spillover, aberranti

9

Anseriformi: anatre, oche, cigniCaradriiformi: gabbiani, rondini marine, trampolieri

Mantiene l’infezione Non contrae la malattia o solo in forma lieve Animali giovaniCiclo oro-fecale

Ospite reservoir

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Flussi migratori

Aree di riproduzione

Aree specie presentitutto l’anno

Aree di ivernazzione

Flussi migratori diA.platyrhincos, A. querquedulain Eurasia ed Africa ed A. discors in America

Science 312, 384 (2006)

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Pollame domestico Suscettibile all’infezione se espostoTrasmette l’infezione ad altri ospiti Non mantiene la disseminazione virale per lungo tempo Una malattia più grave dei reservoirCiclo respiratorio

Ospite spillover

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S’infetta raramente di solito contrae una malattia graveininfluenti nella epidemiologia della malattia, ma possono esserne gravemente colpiti

Ospite aberrante

Infezione H5N1:

uomo, cane, gatto, tigre, leopardo

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Distinte per:- Sintomatologia clinica indotta nei volatili - Caratteristiche degli stipiti virali:

Influenza aviaria a bassa patogenicità

(LPAI)

Influenza aviaria ad alta patogenicità

(HPAI)

H5, H7

Influenza aviare:due malattie

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Basi molecolari della patogenicità

Virus a bassa patogenicità

Possiedono un solo aminoacido basico nel sito di “cleavage”

Es. sequenze aminoacidiche H7:

-PEIPKGR*GLF-,

-PENPKGR*GLF-

Virus ad alta patogenicità

Possiedono più aminoacidi basici nel sito di “cleavage”

Es. sequenze aminoacidiche H7:

-PEIPKKKKR*GLF-, -PETPKRKRKR*GLF-,

-PEIPKKREKR*GLF-, -PETPKRRRR*GLF-

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Fusione envelope con membrana cellula ospite

Peptide di fusione dell’emoagglutinina

BASSA

liberato da enzimi presenti solo in tessuti respiratori ed enterici

Patogenesi e patogenicità

ALTA

liberato da enzimi presenti in tutti i

tessuti

Entrata virione nella cellula

Replicazione

Fuoriuscita del virione

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Virus influenzali H5, H7

Uccelli acquatici selvatici: virus a bassa patogenicità

Pollame domestico: adattamento dei virus influenzali

HA addizione siti di glicosilazione

NA delezione aminoacidi

Virus H5 e H7: variazione della patogenicità

(drift antigenico)

Influenza aviaria a bassa virulenza (H5 e H7) LPAI

Influenza aviaria ad alta virulenza (HPAI)

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Disposizioni legislative

DIR 2005/94/CEEInfluenza aviaria - infezione del pollame o altri volatili causata da virus influenzale A:

sottotipi H5, H7IVPI > 1,2 nei pulcini di 6 sett

Manuale OIE maggio 2005Notifiable Avian Influenza Virus (NAI)HPAIV, tutti AIV H5 e H7LPAIV – tutti i virus non NAI

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H7N1 LPAI – 1999 (tacchini)

19

H7N1 HPAI -1999-2000 (tacchini)

20

H7N1 HPAI- 1999-2000 (anatre)

21

Influenza aviareItalia

1998 H5N2 (HPAI) Veneto H5N9 (LPAI) Emilia Romagna

1999-2001 H7N1 ca. 500 milioni €Marzo - Dicembre 1999

199 LPAI focolai

Dicembre 1999 – Aprile 2000

413 HPAI focolai

Agosto- Marzo 2001

73 LPAI focolai

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Influenza aviare - Italia

2002-2004 H7N3 (LPAI) ca.45 milioni €Ottobre 2002 – Settembre 2003: 388 focolai

15 settembre 2004 – 06 novembre 2004: 28 focolai

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2005 H5N2 (LPAI) ca.1,8 milioni €12 aprile-10 maggio: 15 focolai Lombardia

Influenza aviare - Italia

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Influenza aviare - Italia

2007 H7N3 (LPAI)Mag-Ott: 17 focolai

H5N2 (LPAI): 1 focolaio Emilia Romagna

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Influenza aviare - Italia

2009 H5N7 (LPAI)Apr- Mag: 4 focolai Veneto, Lombardia

H7N3 (LPAI)Apr- 1 Sett: 4 focolai

22 H7

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AIV in uccelli acquatici

LPAI (H4N6)MALLARDBRESCIA PROVINCE07/11/2005

LPAI (H5N1)MALLARDMODENA PROVINCE2005

LPAI (H10N7)MALLARDCREMONAPROVINCE10/04/2006

LPAI (H11N9)MALLARDPAVIA PROVINCE2005

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Diagnosi

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Ricerca antigene o genoma virale

Immunofluorescenza: sensibilitàbassa, specificità buona per influenza tipo AELISA sandwich (per nucleoproteina tipo A)Kit immunoenzimaticiRt-PCR: real time

tradizionale

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5F10 Np-AELISA

Sensibilitàequivalente deitre test

AnigenAIV AgAnimalGenetics Inc

DirectigenFlu A BD

C+ C-

TQ -1 -2 -3 -4 -5

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Ricerca genoma viralePCR Tradizionalegene M- Fouchier et al, J Clin Microbiol, 2000 - Sapckman et al, J Clin Microbiol, 2002H5, H7 - Diagnostic manual of avian influenza 2005/94/ECH9- Slomka et al, Av Dis, 2007

Real time Diagnostic manual of avian influenza 2005/94/ECgene M, H5, H7- Sapckman et al, J Clin Microbiol, 2002H9- Monne et al, J Clin Microbiol, 2008

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Diagnosi virologica

ISOLAMENTO VIRALEUova embrionate di pollo 9-11 gg via i.a.Colture cellulari (MDCK)Identificazione

Tipo A Mab based sandwich ELISA (NPA)

Sottotipo tipizzazione antigenicaEmoagglutinina: HI Neuraminidasi: NI

Mab based sandwich ELISAs H5, H7, N1-N9

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Tipizzazione HemagglutininaN

EGH

1N1

H4N

6H

3N2

H1N

2H

2N2

H7N

7H

7N3

H7N

1H

5N3

H5N

1H

5N2

NEG

PMV2

PMV3

PMV4

H6N

2H

9N2

H9N

8H

10N

4N

DV

H5N

2C

+C

-

NEG

H1N

1H

4N6

H3N

2H

1N2

H2N

2H

7N7

H7N

3H

7N1

H5N

3H

5N1

H5N

2

NEG

PMV2

PMV3

PMV4

H6N

2H

9N2

H9N

8H

10N

4N

DV

H5N

2C

+C

-

Elisa virologica sandwich H5 Mab 5D8

Elisa virologica sandwich H7 Mab 7A4

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Tipizzazione Neuraminidasi

N1 N2 N3 N4 N5 NpA(Ctrl+)

H8N4H8N4H1N1H1N1H5N2H5N2H6N2H6N2H6N5H6N5H7N3H7N3H9N3H9N3H5N1H5N1

N6 N7 N8 N9 NpA(Ctrl+)

H4N6H9N8H10N7H11N9H3N8H13N6NDVH7N7

Mab platform sandwich ELISA

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Diagnosi sierologica

Ab verso Ag di gruppo (Tipo A):

AGID ELISA ( indiretta o competitiva)

Ab sottotipo specifici Anti-HA (16 H ≠):HI ELISA (H5 o H7)Anti-NA(9 N ≠):IFELISA HeinenHeinen VetVet Science Tomorrow, Science Tomorrow,

20022002

Proteine HA e NAAntigeni superficiali sottotipo-specifici

Proteine M1 e NPAntigeni profondi

tipo-specifici

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Elisa sierologica H5, H7

H7 C+NEG

H5N2 sieri positivi di campo

H7N3 sieri positivi di campo

H5 C+

H6/9 POS

NEG

H5N2 sieri positivi di campo

H7N3 sieri positivi di campo

H5 C+

H6/9 POS

NEG

H7 C+

H6/9 POS NEG

H6/9 POS

700 sieri pollo, tacchino : 200 –, 331 + H7, 113 + H5, 36 + H7/H 5

Elisa competitiva H7Mab 7A4/7A4HrpSe= 99.7%(IC95%) Sp= 100% (IC95%)

Elisa competitiva H5MAb 5D8/5D8HrpSe= 100% (IC95%) Sp= 98.5%(IC95%)

36

H7

N3

H7

N3

H9

N2

H5

N2

H1

N1

H7

N1

H7

N3

H7

N3

H9

N2

H5

N2

H1

N1

H7

N1

H7

N3

H7

N3

H9

N2

H5

N2

H1

N1

H7

N1

100% NEGATIVI100% NEGATIVI

100% NEGATIVI

H7N1 H5N2 H7N3 100%

H7N1 H5N2 H7N3 100%

H7N1 H5N2 H7N3 100%

ELISA PER AC ANTI-N2ELISA PER AC ANTI-N3

ELISA PER AC ANTI-N1

ELISA % INIBIZI

ONE

SN SP

N1 75 1 0,994

N2 75 0,976 0,995

N3 75 0,990 0,990

1404 sieri: 595 pollo, 717 tacchino, 75 anatra, 14 quaglia, 10 struzzi

Moreno et al, Vaccine, 2009

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Grazie per l’attenzione

Non fai ridereproprio per niente