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Ereditarietà X-Linked
Madre Padre
Figlia Figlio
X X X Y
Cromosoma X Cromosoma Y
Geni sottopostiad inattivazione
Geni attivi Regionepseudo-autosomica
X InactiveSpecificTranscriptXq13
circa 80 geni- SRY- Geni della spermatogenesicirca 870 geni
Cromosoma Y
Delezioni interstiziali dell’Ynel 5-10% dei soggetti conazoospermia o grave oligospermianon ostruttiva
Delezioni del cromosoma YLe microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa
importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione
• fornisce un corretto inquadramento diagnostico • permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili• ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le
tecniche di riproduzione assistita
almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi
Casi di azoospermia o oligospermia severa :
il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y
il 5-10% è portatore di delezioni sub-microscopiche di Yq NON sono individuabili all’analisi del cariotipo (microdelezioni) ma possono essere identificate mediante STS-PCR
STS “sequence tagged sites” sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR
Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001)
Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletionsM.Simoni et al.
• elenco di STS da non utilizzare• set di STS primers consigliati:
AZFa: sY84,sY86AZFb: sY127,sY134AZFc: sY254,sY255
Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino all’estremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati all’ICSI)
Multiplex a
sY254 (c)
sY 86 (a)
sY127 (b)
Multiplex b
sY255 (c)
sY134 (b)
sY84 (a)
Frequenza delle microdelezioni Y
estema variabilità tra i vari studi (1%-55%)dipende dai criteri di selezione
pazienti azoospermici o gravemente oligospermici(<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’11%(solo le forme idiopatiche : 18%)
se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’1%
Casistica laboratorio Genetica Medica:1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c2/600 AZFa+b+c Tot. 23/600 (3.8%)
AZFaDBY - UTY
USP9Y*
Del
interstizialerara
Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS)
AZFb RBMY1A(multicopia)
Del
interstizialerara
Arresto della spermatogenesi alla pubertà prima o durante la meiosi
AZFc
DAZ(4-7 copie)
BPY2
CDY1(2 copie una nel cluster DAZ una all’estremo 3’)
Del
interstiziale ccomune Presenza di cellule
germinali in vario stadio di maturazione ma pochi spermatozoi (periodo fertile giovanile)
Del
terminale cintermedia
Del
interstiziale bccomune
Fenotipo variabile dalla SCOS alla oligospermia
Del
terminale abcrara
Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS)
Mutazioni puntiformi in USP9Y* in 2 maschi con ipospermatogenesi
Variabilità fenotipica delle delezioni
• non costante correlazione genotipo-fenotipo• in genere:
– azoospermia (84%)
– grave oligospermia (meno di 1 x106ml) (14%)
– moderata oligospermia (1-5 x106ml) (2%)
• alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili
• del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave
• del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY
• del Y molto centromeriche associate a bassa statura
Sex reversal
Inattivazione dell’X solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine
stadio di morula
casualeinnattivazione X pat. / X mat.
propagazione clonale
Zigote femminile
meno di100 cellule
Inattivazione bilanciata dell’X Cosa succede se una donna porta un gene non
funzionante sull’X
Zigotefemminile
il 50% delle cellulenon esprime quel gene
Innattivazione casuale X paterno / X materno
gene mutato
Inattivazione dell’X
• Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e femmine
• Alcuni geni sfuggono all’inattivazione
(regioni pseudo-autosomiche alle estremità del cromosoma X)
• I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per l’inattivazione
• La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione
Inattivazione sbilanciata dell’X
Perchè ?
• Un cromosoma X porta una mutazione LETALE
• C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma
• La regione che controlla l’inattivazione è alterata
• E’ avvenuto “per caso”
Inattivazione Sbilanciata dell’X:effetto della selezione
Zigotefemminile Selezione
nei tessuti in cui la funzione del gene è
indispensabile
Inattivazionecasuale
stadio embrionale
gene mutato
Malattie X-Linked recessive
Femmina Femmina Maschio Maschio SANA PORTATRICE MALATO SANO
Madre( portatrice )
Padre
X X X Y
Ereditarietà X-Linked recessiva
Ereditarietà X-Linked recessiva
Distrofia Musculare di Duchenne DMD
Giorgio Ester Enrico
Giorgio ha 3 anni
• modesto ritardo nell’iniziare a camminare
• cammina con lentezza
• ha difficoltà a stare eretto
• non corre
• all’esame obiettivo– ipertrofia dei gastrocnemi– debolezza dei muscoli prossimali
• Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui
Biopsia Muscolare
ControlloNormale
Giorgio
Colorazione Ab anti-Distrofina
ControlloNormale
Giorgio
Distrofina
proteina associata alla membrana :
- il dominio N-terminale lega l’actina
- lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica- una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio
- il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana
Gene DMD
2,4 Mb (12 cMorgan)8 promotori 79 esoni (0.6%)mRNA 14 kb trascritto in 16 ore
DM Duchenne : mancata espressione di distrofina - delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%)
- mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%)
- delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine)
DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina - delezioni “in-frame” (85%)
- di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”
Ricerca diretta delle delezioni nella DMD
- preparazione del DNA genomico- amplificazione con PCR multiplex
di 9 o più esoni- separazione dei frammenti in gel di agarosio- visualizzazione con EB e raggi UV- fotografia (o immagine digitale)
Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne
• Diagnosi confermata da biopsia muscolare
• Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati )
• Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme
Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300tasso di nuove mutazioni di 10-4 / meiosi (1/3 dei casi)
Albero famigliare allargato dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna
Enrico Ester Giorgio Rosa
GiovannaElena
La cugina Rosa vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato
• Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è =
25%
• Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?
Creatina Kinasi (CPK)
• fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato
• molto elevata nei maschi malati
• livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici
– Giovanna e Rosa hanno CPK normale
Stima “Bayesiana” del rischio
Probabilità “complessiva “ :tiene conto della
probabilita a priori di essere e di non essere portatore
( appartenendo ad dato albero famigliare )
e di altri fattori che
modificano queste due probabilità (prob. condizionali)
Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi
sani
CPK normale
Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale
GiovannaElena
Quale è la probabilitàche Zia Giovanna sia portatrice ?
Che lo sia Che non lo sia
Probabilità “ a priori ” 1 / 2 1 / 2
con CPK Normale ? 1 / 3 1
con 2 figli Maschi Sani ? 1 / 4 1
Prob. condizionale 1/2 .1/3 .1/4 = 1 / 24 1 / 2
Prob. finale 1 : 12 1 / 24
1 / 24 + 1 / 2= 1 / 13
Cugina Rosa : ha 1/2 della probabilità di Giovanna
e CPK normale
CPK normale
Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale
GiovannaElena
Il rischio a priori per Rosaè
la metà di quello di Zia Giovanna
1/13 x 1/2 = 1/26
Quale è la probabilitàche Rosa sia portatrice ?
Che lo sia Che non lo sia
Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / 26 25 / 26
con CPK Normale ? 1 / 3 1
Prob. “ a posteriori ” 1/26 .1/3 = 1 / 78 25 / 26
Prob. finale 1 : 75
1 / 78
1 / 78+25 /26= 1 / 76
Che lo sia Che non lo sia
Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / 26 25 / 26
con CPK Normale ? 1 / 3 1
Prob. “ a posteriori ” 1/26 .1/3 = 1 / 78 25 / 26
Prob. finale 1 : 75
Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto
1/ 76 x 1/4 = 1 / 304
Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione
1/304 è la probabilità che la cugina Rosapossa avere un figlio affetto
CPK normale(1/13)
Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale (1/76)
GiovannaElena
Uso del Linkage nella malattia DMD( mutazione non trovata )
Enrico Ester Giorgio Rosa
GiovannaElena
Analisi di linkage
• Linkage = concatenazione• Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo
stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi
Gene con mutazione
Allele 1 locus polimorfico A (1, 2, 3, 4)
Allele 3 locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)
Allele 2
Gene wt
Allele 1
La frequenza di ricombinazioneè una “misura della distanza”tra loci diversi :
= 0.5 (50%) loci lontani = 0 (0%) loci vicinissimi = 0.02 (2%) loci vicini
unità di misura = centiMorgancM = 1 ricombinazione/100 meiosi
Analisi di linkage
1
Mut
3
2
wt
1
2
Mut
3
1
wt
1
Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD
2,4 Mb (12 cMorgan)
Eson
e 1
Eson
e 79
Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli
Microsatellite C
Microsatellite B
Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli
G E
N E
D
MD
5’
3’
Uso del Linkage: 1 marcatore (A) 5’ UT
( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? )
Enrico Ester Giorgio Rosa
GiovannaElena
1
1
7 73
7 3
1
Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)
( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? )
Enrico Ester Giorgio Rosa
GiovannaElena
1
1
7 73
7
4
4
5 56
5
3
6
1
4
Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D)
Enrico Ester Giorgio Rosa
GiovannaElena
1
1
7 73
7
4
4
5 56
5
3
6
1
4
7
4
9
2
9
2
Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ?
1 e 2 ricombinazioni tra marcatori
mut
mut
1mut
mut
1mut
mut
1
2
Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD
2,4 Mb (12 cMorgan)
Eson
e 1
Eson
e 79
Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli
Microsatellite C
Microsatellite B
Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli
G E
N E
D
MD
5’
3’
0.124 = 0.00024 ricombinazioniin 1 su 5000 casi
Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ??
Enrico Ester Giorgio Rosa
GiovannaElena
17 73
7
45 56
5
3
6
1
4
1
4
1
4
1
4 Nuove mutazioni10-4 / meiosi(1/3 dei casi)
Analisi del rischio in famiglie X-linked
• Informazioni dall’albero famigliare
• Calcolo del rischio secondo Bayes
• Ricerca della mutazione (test diretto)
• Uso del linkage (test indiretto)
• Attenzione alle ricombinazioni !
( usare più marcatori… meglio se intragenici )
05/04/2005
Davide 16
2 2 3 1 3 1 1 1 1
Francesco
1 1 1 2 2 3 2 2 1
Martina
1 21 22 32 11 32 12 11 11 1
30
1 11 11 22 22 33 12 12 11 1
14
62
82
18
5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 15’-5N3 introne 15’-7n4 introne 25STR44 13.8 kb a valle dell’esone 44STR45 1.2 kb a valle dell’esone 45STR49 introne 49DMD1-2c introne 56DXS1214 introne 623’DYS MS esone 79
Caso negativo per delezionie duplicazioni DMD
05/04/2005
Davide 16
2 2 3 1 3 1 1 1 1
Francesco
1 1 1 2 2 3 2 2 1
Martina
1 21 22 32 11 32 12 11 11 1
30
1 11 11 22 22 33 12 12 11 1
14
62
82
18
5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 15’-5N3 introne 15’-7n4 introne 25STR44 13.8 kb a valle dell’esone 44STR45 1.2 kb a valle dell’esone 45STR49 introne 49DMD1-2c introne 56DXS1214 introne 623’DYS MS esone 79
In caso di gravidanza:- villocentesi in 11ma set- determinazione del sesso (SRY)- informativa solo la trasmissione Xp
111223221
05/04/2005
Davide 16
2 2 3 1 3 1 1 1 1
Francesco
1 1 1 2 2 3 2 2 1
Martina
1 21 22 32 11 32 12 11 11 1
30
1 11 11 22 22 33 12 12 11 1
14
62
82
18
1 1
introne 1 - 25esone 63 - 79