PROJE ADI : Terapötik Gen Aktarımı için Tasarlanan Viral Olmayan Lipopleks Nanobiyoteknolojik SistemlerininTasarlanması

Proje Yöneticisin

GAZİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİBAŞVURU FORMUKONTROL LİSTESİ

(✔) 1.1. Proje Yöneticisine ilişkin bilgiler belirtildi.(✔) 1.2. Projedeki diğer elemanların bilgileri belirtildi.(✔) 1.3. Projenin Adı yazıldı.(✔) 1.4. Projenin türü belirtildi.(✔) 1.5. Projenin süresi belirtildi.( ) 1.6. Üniversite dışından destekleyen diğer kuruluşlar belirtildi (varsa).(✔) 1.7.1 Bütçe detayı yazıldı.(✔) 1.7.2 Bütçe icmali yazıldı.(✔) 1.7.3 Projeye ilişkin gerekli malzemelerin ayrıntılı gider listesi dolduruldu.( ) 2.1. Projenin amacı ve önemi belirtildi.( ) 2.2. Araç, gereç ihtiyacı ve yöntemler hakkında ayrıntılı bilgi verildi.( ) 2.3. Araştırma ekibinin daha önce yaptığı çalışmalara ilişkin belgeler eklendi.( ) 2.4. Araştırma olanakları hakkında bilgi verildi.( ) 2.5. (1) Talep edilen makine teçhizatın hangi amaçla kullanılacağı belirtildi.( ) 2.5. (2) Talep edilen makine teçhizatın kullanımına ilişkin bilgi verildi.( ) 2.5. (3) İstenilen cihazın mevcut durumuna ilişkin bilgi verildi.( ) 2.5. (4) Projenin tamamlanmasından sonra cihazın değerlendirilme şekli belirtildi.( ) 2.5. (5) Cihazın teknik özelliklerine ilişkin ayrıntılı bilgiler verildi.( ) 2.5. (6) Cihazın tahmini fiyatına ilişkin fatura eklendi.( ) 3.1. Proje ile ilgili olarak yapılan çalışmalar, araştırmanın bunlar arasındaki yeri belirtildi ve çalışmalara ilişkin

referans listesi verildi.( ) 3.2. Daha önce araştırma yapılmış ise bu çalışmalarla ilgili bilgi verildi.( ) 3.3. Çalışmaları gösteren bir uygulama plan verildi.( ) 3.4. Araştırma giderlerinin gerekçeli dökümü verildi.(✔) 3.5. Önerilen projenin Türkçe ve bir yabancı dilden ismi ve özeti verildi.(✔) 3.6. Türkçe ve ingilizce olarak proje konusu ile ilgili anahtar kelimeler verildi.(✔) 3.7. Hakem olarak yararlanılmak üzere (2 si G.Ü. haricinden ve yönergenin 3/g md.deki tanıma uyan) 3

hakem ismi, yazışma ve e-posta adresleri verildi.( ) 3.8. Deney hayvanı veya klinik çalışmalar için gerekli Etik Kurul onay belgesi sunuldu.( ) 3.9. Yüksek lisans, doktora veya uzmanlık tezi olarak onaylandığının resmi belgesi sunuldu.( ) 3.10. Araştırmacıların özgeçmiş ve konu ile ilgili başlıca yayınlarının listesi sunuldu.(✔) 3.11. Proje Yöneticisinin Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenen diğer projeleri

belirtildi.

Unvanı, Adı Soyadı: UZMAN DR. ERHAN SÜLEYMANOĞLUFakülte/Y.Okulu: Eczacılık FakültesiTarih:İmza:

1

Form-1

1. GENEL BİLGİLER

Proje Kod:

GAZİ ÜNİVERSİTESİBİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

BAŞVURU FORMU

PROJEYE İLİŞKİN İMZALARGÖREVİ UNVANI,ADI SOYADI TARİH İMZA

PROJEYÖNETİCİSİ UZMAN DR. ERHAN SÜLEYMANOĞLU

BÖLÜM / A.DBAŞKANI

DEKAN / MÜDÜR

1.1.PROJE YÖNETİCİSİUnvanı, Adı ve Soyadı : UZMAN DR. ERHAN SÜLEYMANOĞLUBölümü : Temel Eczacılık BilimleriFakülte, Enstitü veya Yüksekokulu : Eczacılık FakültesiEv Adresi: Gazi Mahallesi Polatlı Caddesi, No:115/5Ev Tel No: 211-19-47Belgegeçer No:e-posta adresi: esuleymanoglu@gazi.edu.trİş Tel No: 202-32-50

1.2 PROJEDEKİ DİĞER ELEMANLARUnvanı, Adı ve Soyadı Fakülte / Enstitü /

YüksekokuluBölüm/AD Projedeki Görevi

Prof. Dr.,Ningur Noyanalpan Eczacılık Fakültesi Temel Eczacılık Bilimleri Yapı-aktivite ilişkilerininincelenmesi

Yrd. Döç. Dr.,Kamile Öztürk Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Aksaray Üniversitesi'ndegörevli In vitro transfeksyon deneyleri

Prof. Dr., Rus BilimlerAkadem,Vasiliy Kuvichkin

Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Biyofiziksel Analizler

1.3 PROJENİN ADITerapötik Gen Aktarımı için Tasarlanan Viral Olmayan Lipopleks Nanobiyoteknolojik Sistemlerinin Tasarlanması

2

1.7 PROJE BÜTÇESİ

1.4 PROJENİN TÜRÜa) Bağımsız Proje Bilimsel Araştırma Projesi (BAP) Kapsamlı Projeb) Sanayi İşbirliği Projeleric) Lisansüstü Tez Projeleri Yüksek Lisans Doktora Tıpta Uzmanlık

X d) Çok Disiplinli Araştırma Projeleri

1.5 PROJENİN SÜRESİProjenin Teklif(Yönetici) Teklif(Uzmanlar Gr.) Kabul(Bap Komisyonu)Süresi 24

1.6 PROJEYİ ÜNİVERSİTE DIŞINDAN DESTEKLEYEN DİĞER KURULUŞLARDestek Sağlayan Kuruluşun Adı Destek Miktarı

Toplam 0

1.7.1 BÜTÇE DETAYIANALİTİK BÜTÇEKODU

I II II IV

EKONOMİKSINIFLANDIRMA

PROJE YÖNETİCİSİ1. YIL 2. YIL TOPLAM

UZMANLAR GRUBU1. YIL 2. YIL TOPLAM

BAP KOMİSYONU1. YIL 2. YIL TOPLAM

03 2 TÜKETİME YÖNELİK MAL VEMALZEME AL

28.000 28.000

1 Kırtasiye ve Büro Mal.Alımları

01 Kırtasiye Alımları

02 Büro Malzemesi Alımları

04 Diğer Yayın Alımları

05 Baskı ve Cilt Giderleri

90 Diğer Kırt. & Büro Malz.Alımları

3 Enerji Alımları

02 Akaryakıt ve Yağ Alımları

4 Yiyecek İçecek ve Yem Al.

03 Yem Alımları

6 Özel Malzeme Alımları 28.000 28.000

01 Lab. Malzemesi ile Kimyevi veTemrinlik Malzeme Alımları

28.000 28.000

03 Zirai Malzeme ve İlaç Alımları

04 Canlı Hayvan Alım, Bakım

90 Diğer Özel Malz. Alımları

9 Diğer Tüketim Mal ve MalzemesiAlımları

01 Bahçe Malz. Yap.Bak. Giderleri

3

1.7.1 BÜTÇE DETAYIANALİTİK BÜTÇEKODU

I II II IV

EKONOMİKSINIFLANDIRMA

PROJE YÖNETİCİSİ1. YIL 2. YIL TOPLAM

UZMANLAR GRUBU1. YIL 2. YIL TOPLAM

BAP KOMİSYONU1. YIL 2. YIL TOPLAM

90 Diğer Tük. Mal-Mlz Alımları

03 3 YOLLUKLAR 10.000 10.000

1 Yurtiçi Geç. Gör.Yollukları

01 Yurtiçi Geç.Gör.Yollukları

3 Yurtdışı Geç.Gör.Yollukları 10.000 10.000

01 Yurtdışı Geç.Gör.Yollukları 10.000 10.000

03 5 HİZMET ALIMLARI 114.000 114.000

1 Müşavir Firma ve Kişi Ödeme.

01 Etüt-Proje Bilirkişi Ekspertiz Gd.

05 Harita Yapım ve Alım Giderleri

90 Diğer Müşavir Firma-Kişilere Öd.

2 Haberleşme Giderleri

01 Posta ve Haberleşme Giderleri

02 Telefon Abonelik-Kullanım Ücr.

4 Tarifeye Baplı Ödemeler

01 İlan Giderleri

5 Kiralar

01 Dayanıklı Mal ve Malzeme Alım.

02 Taşıt Kiralaması Giderleri

03 İş Makinesı Kiralaması Giderleri

08 Yüzer Taşıt Kiralaması Giderleri

10 Bilgisayar ve Bilg.Sist.YazılımKiralama Giderleri

9 Diğer Hizmet Alımları 114.000 114.000

03 Kurslara Katılma Giderleri 2.000 2.000

90 Diğer Hizmet Alımları 112.000 112.000

03 7 MENKUL MAL, GAYRİMADDİHAK ALIM BAKIM VE ONARIMGİDER.

1 Menkul Mal Alım Giderleri

01 Büro,İşyeri Mal ve Malz.Alıml.

02 Büro,İşyeri Mak.ve Teçh.Alıml.

03 Avadanlık,Yedek Parça Alımları

90 Diğer Dayanıklı Mal.-Mlz.Alıml.

2 Gayri Maddi Hak Alımları

01 Bilgisayar Yazılım Alımları

02 Fikri Hak Alımları

3 Bakım ve Onarım Giderleri

02 Makine Teçhizat Bakım On.Gid.

06 1 MAMUL MAL ALIMLARI

2 Büro,İşyeri Mak-Teçh.Alımları

01 Büro Makineleri Alımları

02 Bilgisayar Alımları

03 Tıbbi Cihaz Alımları

04 Laboratuar Cihazı Alımları

90 Diğer Makine Teçhizat Alımları

4

1.7.1 BÜTÇE DETAYIANALİTİK BÜTÇEKODU

I II II IV

EKONOMİKSINIFLANDIRMA

PROJE YÖNETİCİSİ1. YIL 2. YIL TOPLAM

UZMANLAR GRUBU1. YIL 2. YIL TOPLAM

BAP KOMİSYONU1. YIL 2. YIL TOPLAM

06 3 GAYRİ MADDİ HAK ALIMLARI

4 Patent Alımları

01 Patent Alımları

1.7.2 BÜTÇE İCMALİANALİTİK

BÜTÇE KODUEKONOMİK

SINIFLANDIRMAPROJE YÖNETİCİSİ1. YIL 2. YIL TOPLAM

UZMANLAR GRUBU1. YIL 2. YIL TOPLAM

BAP KOMİSYONU1. YIL 2. YIL TOPLAM

03-2 TÜKETİME YÖNELİK MAL VEMALZEME AL

28.000 28.000

03-3 YOLLUKLAR 10.000 10.00003-5 HİZMET ALIMLARI 114.000 114.00003-7 MENKUL MAL, GAYRİMADDİ HAK

ALIM BAKIM VE ONARIM GİDER.06-1 MAMUL MAL ALIMLARI

06-3 GAYRİ MADDİ HAK ALIMLARIGENEL TOPLAM 152.000 0 152.000 0 0 0 0 0 0

1.7.3 AYRINTILI GİDER LİSTESİ

SıraNo Malzeme Adı Malzeme

MiktarıMalzeme

ÖlçüBirimi

TahminiBedeli

Birim Fiyatı Toplam FiyatıAnalitik

Bütçe Kodu

1 sarf kimyasal malzemeler 1 28.000 28.000 03.2.6.012 Seyahat 2 sefer 5.000 10.000 03.3.3.013 Kurslara katılma giderleri 1 adet 2.000 2.000 03.5.9.034 ODTÜ Merkez Laboratuvarı ve

Rusya Federasyonu hizmet alımları1 adet 112.000 112.000 03.5.9.90

1.8. PROJE YÖNETİCİSİNİN GAZİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİTARAFINDAN DESTEKLENEN DİĞER PROJELERİNO PROJE KODU PROJE İSMİ SÜRE BÜTÇESİ EK

BÜTÇEPROJE İLE İLGİLİ

YAYINLAR1 02/2005-15 Paclitaxel (TAXOLun) anti-

kanser etki mekanizmasınınmodel Langmuir Blodgettbiyomembran sistemi ilemoleküler düzeyde incelenmesi

24 35.700 17.850

5

2. PROJE HAKKINDA BİLGİLER 2.1. Projenin Amacı ve Önemi: Proje önerimiz Avrupa Birliğinin 7. Çerçeve programında (http://erc.europa.eu, http://cordis.europa.eu/fp7/ideas/home_en.html) yer alan öncelikler sıralamasına uygun olarak hazırlanmıştır. Başka bir deyişle genom bilimleri ve biyonanoteknoloji kapsamında (Bk.: cordis.europa.eu/fp7/home_en.html; http://www.innovation.public.lu/servlet/front) olup çok merkezli ortak bir çalışma olarak tasarlanmıştır. Ancak, nanobiyoteknolojik boyutu dışında, daha fundamental hücresel etki mekanizmalarının modellemesini de kapsamaktadır. Disiplinlerarası bir çalışma olarak sunulması bizce çok daha rasyonel bir yaklaşımdır. Bunun sebepleri şöyle sıralanabilir. Her nekadar ülkemizde nanoteknolojiye ve moleküler biyolojiye yapılan yatırımlar artmış olsa da, bu konudaki ülke olarak ilerlememiz sadece çok pahalı teçhizatın alınmasına değil, bu teçhizatı kullanabilecek deneyimli personelin yetiştirilmesi ve çalıştırılmasına bağlıdır. İlgili bilim dallarının kullandığı karmaşık yöntemleri uygulayabilmek için uzun vadeli proje desteğine, özellikle buradaki araştırmacı statülerin özerkliğine bağlıdır ve en önemlisi uluslararası ortakların katılımlarıyla ve katkılarıyla mümkündür. Ülkemizde her ne kadar da moleküler genetik yöntemlerinin gerçekleştirilmesi için gereken birtakım cihazlar alınmışsa da, bunların çoğu çalıştırılamamaktadır. Üniversite panel ve çalıştaylarında bu gerçekler defalarca dile getirilmiştir. Fakültemizdeki durum da pek farklı değildir. Fakültemizde maddî olanaksızlardan dolayı bu tür harcamalar yapılmamışsa da, diğer üniversitelerde bu amaçla yurt dışından çok büyük paralar ödenerek pratik seminerlerde bu yöntemleri göstermek amacıyla firma temsilcileri getirilmektedir. Bu konuda eğitilmiş ve bu konularda bağımsız olarak proje yürütebilecek akademisyenlerimizin sayısı da bir hayli azdır. Avrupa Birliği destekli FP7 çerçeveye veya TÜBİTAK proje destekleme birimlerine gönderilen moleküler genetik, moleküler klonlama veya biyonanoteknolojik konulu proje sayısına bakacak olursak bu gerçek bir kez daha ortaya çıkacaktır.

Sunduğumuz bu proje önerisinde tüm bu zorlukların daha kolayca aşılması amacıyla çok merkezli bir ortak çalışmanın önemi vurgulanmaktadır. Birçok proje başvurusunun aksine, çok pahalı cihazların alınması yerine Türkiye’de mevcut olan imkânları ve bu amaca uygun proje desteği sunan sponsorlarımız araştırılmıştır. Bu bağlamda, proje önerimizde tek cihazla yapılacak ölçümler değil, çok kapsamlı deneysel tasarımlara yer verilmiştir. Projemizin konusunu teşkil eden nükleik asit-fosfolipid etkileşmeleri konusunu çalışan birçok grupla temas sağlanmıştır. Bu konuda uzun yıllardan beri deneyimi bulunan Prof. V. Kuvichkin’in grubundan gelen ortak çalışma teklifi olumlu karşılanmıştır ve bütün ayrıntılar üzerinde uzun bilimsel tartışmalar sonucu bu proje önerimiz hazırlanmıştır. Amacımıza en uygun proje desteği programı olarak Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri biriminin çerçevesi olduğu görüşü paylaşılmış ve proje önerimiz buna uygun olarak tasarlanmıştır. Bu bağlamda, ulusal yükseköğretim stratejileri (Bk.: http://www.yok.gov.tr/duyuru/strateji_gorus.htm) ve üniversitemizin strateji plan geliştirme programı (http://www.strateji.gazi.edu.tr/) esas alınmıştır. Proje önerimizdeki bu vurgu, uluslararası proje destek programlarına katılmamız bakımından da önemlidir, çünkü Avrupa Birliği’nin gerek 6cı, gerekse 7ci çerçeve programlarında yukarıda bahsedildiği üzere öncelikli konu başlıklarına önem

6

verileceği ayrıca vurgulanmaktadır (Bk.: www.fp7.org.tr). Ancak bu proje destek programlarına Türkiye’den gönderilen proje başvurusu yeterli değildir. Buna paralel olarak, ülkemizde de ulusal nanoteknoloji stratejileri geliştirilmiştir. Bu tür nanoteknoloji çalışmaları da en ileri düzeyde şu anda Türkiye’de de yapılmaktadır. Bunun için de gereken altyapı ve AR-GE olanakları kurulmuştur. Örneğin, Orta Doğu Teknik Üniversitesinde 2006 yılından bu yana Nanoteknoloji Merkezi faaliyet göstermektedir. Ayrıca, aynı üniversite Avrupa Birliği kaynaklarından 1.5 milyon EU’luk subvansiyon sayesinde Merkez Laboratuvarını kurmuştur (Bk.: www.centrallab.metu.edu.tr). Bu Merkez Laboratuvarın Ocak-2006 tarihinde kurulmuş olup, asıl amacı üniversitelere ve sanayi kuruluşlarına bilimsel destek ve yürütülmekte olan projelerde öçlüm olanakları sağlamaktır. Avrupa Birliğinden akreditasyon alan bir kuruluş olarak O. D. T. Ü. Merkez Laboratuvarı çok önemli hizmetler vermektedir.

Bunun dışında, Bilkent Üniversitesinde Devlet Plânlama Teşkilâtından alınan 25 Milyon Dolarlık proje ile büyük bir alana yayılmış Ulusal Nanoteknoloji Merkezi (Bk.: www.nano.bilkent.edu.tr) kurulmuştur ve bu merkez de çok yakın bir tarihte faaliyete geçmiştir. Hacettepe Üniversitesi Beytepe kampüsünde de birçok nanoteknolojik projenin yürütüldüğü BİYOMEDTEK Merkezi kurulmuştur (www.biyomedtek.com). Yakın bir tarihte de, bu üniveritenin Teknopark’ı açılacaktır (www.teknopark.hacettepe.edu.tr). Buna paralel olarak, Ankara Üniversitesi birkaç yıl önce Devlet Plânlama Teşkilâtından almış olduğu 8 Milyon Dolarlık proje desteği ile Biyoteknoloji Enstitüsü kurmuştur. Daha sonra, bu enstitüye bağlı Merkez Laboratuvarı da kurulmuştur (Bk.: http://www.biotek.ankara.edu.tr/).

Görüldüğü gibi, Ankara’da bulunan diğer üniversitelerde bu tür büyük yatırımlar yapılırken üniversitemizde bu ölçekte henüz daha herhangi bir girişim olmamıştır. Ancak, son yıllarda üniversitemizde de büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Şöyle ki, Yarıiletken Araştırma Merkezine bağlı bir Nano-Club faaliyete başlamıştır. Ancak, bu birimin biyonanoteknolojiye hitap etmemektedir, daha ziyade mühendislik bilimleriyle ilgilenmektedir. Ancak, bunun dışında, yakında çok önemli olan Ulusal Nanotıp Konsorsiyumu üniversitemizde kurulmuştur ki, bu çok isabetli bir gelişmedir. Üniversitemizin Teknoparkı da tamamlandığında uluslararası düzeyde nanoteknolojik araştırmaların yapılabileceği ümit edilmektedir. Bu konu ile ilgili çok olumlu bir gelişme de önümüzdeki günlerde Nanotıp Araştırma Laboratuvarının kurulması olacaktır (Bk.: http://www.gazi.edu.tr/duyurular/nanotip%20davetiye.jpg).

Ancak, bu tür merkezleri diğer araştırma merkezlerle yarışabilir düzeyde tutabilmek için büyük ölçekli, sürekli ve uzun vadeli projeler çıkarmak gerekmektedir. Projemizi de böyle bir düşünceyle sunmaktayız. Şimdiye kadar Fakültemizde herhangi bir nanoteknoloji başlıklı proje çıkarılmadığı gibi laboratuvar donanımı da son derece yetersizdir. Bu bakımdan, bu konularla ilgili güncel ve özgün değeri olan projelerin hazırlanması önem kazanmıştır. Bu amaçla, şu anda çalışmakta olduğumuz ve gerek moleküler hücre biyolojisinde gerekse biyonanoteknolojide büyük önem arz eden nükleik asit-fosfolipid etkileşmeleri konulu bir projeyi Rus ortaklarımızdan tarafımıza iletilen ortak çalışma teklifini de değerlendirerek böyle bir çalışmayı gerçekleştirmek arzusundayız. Böyle bir ortaklığın üniveritemiz için çok önemli fırsatlar sunmaktadır. Her

7

şeyden önce, yukarıda adı geçen ölçüm merkezlerine alınan cihazları Malzeme Mühendisliği, Kimya, Fizik, veya benzer alanlardan gelen meslektaşlarımız kullanmaktadır ve çalıştırmaktadır. Bu konularda ülkemiz çok büyük bir mesafe almıştır. Ancak, biyolojik ölçümler henüz daha rutin olarak bu merkezlerimizde yapılamamktadır. Bunun en önemli sebeplerinden biri de biyolojik örneklerin sıvı olmalarından kaynaklanmaktadır. Söz konusu cihazlar ise daha çok katı örneklerle ölçüm yapmaktadır. Bu önemli engeli aşmak için, bizce çok yüksek yatırımlar ve zaman gerektiren yurtdışına eleman göndermek yerine bu şekilde ikili ve çok merkezli ortak projeler kanalıyla bu merkezlerimize yurtdışından deneyimli bilim insanlarını davet etmek çok daha isabetli olur. Bu bağlamda projemizde, çok deneyimli olan Rus ortaklarımızın proje esnasında Türkiye’ye ölçümler yapmak üzere yapacakları ziyaretlerine büyük önem verilmiştir. Örneğin, bu çerçevede söz konusu bu ziyaretlerinde tarafımıza başka ülkelerden alınması çok zor olan teknoloji transferi ve eğitim gerçekleştirilecektir. Bu ziyaretler esnasında tarafımıza yoğun olarak, şu anda yapamadığımız lipozom elektron mikroskopisi, lipozomlarla gerçekleştirilen füzyon ve salınım deneyleri, z-potansiyel ölçümleri, floresans mikroskopisi ve floresans spektroskopik ölçümler gösterilecektir. Bu sayede bu proje bitiminde bu tür araştırmaların yapılmasında ve yeni çok kapsamlı projelerin ortaya çıkarılmasında bağımsız olarak hareket etmemiz sağlanmış olacaktır. Proje önerimizin başlangıç noktasını oluşturan ön yüzey kimyasal ölçümler tarafımdan Gazi Üniveristesinde, çok önemli fizikokimyasal inceleme bölümünü teşkil eden ölçümleri de Rusya Federasyonundaki diğer ortaklarımız gerçekleştirecektir. Böylece, araştırma grubumuzu uluslararası düzeyde tanıtılması amaçlanmıştır. Bu tür çok merkezli bir çalışmada sağlanacak bir başarı, daha ilerki aşamalarda başvurmayı plânladığımız uluslararası ve Avrupa Birliği destekli çok daha kapsamlı proje destekleme programlarına dahil edilmemizi kolaylaştıracatır.

Konu ve Kapsam: Proje önerimiz şu ana kadar yeterince araştırılmamış olan hücresel nükleik asitler

ile membranlar arasında oluşan etkileşmelerinin multidisipliner bir yaklaşım çerçevesinde moleküler ve hücresel düzeyde incelenmesi üzerine odaklanmaktadır. Bu proje önerimizin bilimsel dayanağı kısaca şöyle özetlenebilir. Birçok biyomakromoleküler aktivitenin fosfolipid yüzeylerinde meydana geldiği hususu, birçok bilim insanının ilgisini çekmektedir ve bu hücresel yapıların sinyal iletim mekanizmaları ve genom organizasyonu üzerine etkileri ile ilgili yoğun araştırmalarının başlatılmasında çok önemli bir motivasyonu teşkil etmektedir. Bu bağlamda, yüksek moleküler ağırlığa sahip hücresel makromoleküler bileşiklerden 4 ayrı türü teşkil eden proteinler, nükleik asitler, polisakkaridler ve lipidler uzun yıllar boyunca araştırılmışlardır. Bunlar arasında oluşan bileşiklerden, protein-protein, lipid-protein ve nükleik asit-protein etkileşmeleri ayrıntılı olarak incelenmiştir [1-4]. Ancak, nükleik asitler ile hücresel fosfolipidler ve hücresel zarlarla etkileşmeler yeterince araştırılmamıştır. Bunun en önemli sebeplerinden biri, bu tür oluşumları mikroskopik, spektroskopik, termodinamik veya kinetik olarak incelemenin son derece zor olmasından kaynaklanmaktadır. Bu konuda özellikle moleküler hücre biyolojisinin temelini oluşturan özgün kavramlar olarak çok sayıda teoriler ortaya atılmıştır. Ancak birçokları spekülativtir ve daha ayrıntılı olarak incelenmelerine ihtiyaç vardır.

8

Nükleik asit-hücre fosfolipid etkileşmeleri ile ilgili araştırmalarının bu ilk yıllarında genel olarak birtakım hücresel olaylardaki rolleri ilgiyi çekmekteydi. Gerek prokaryotlarda, gerekse eukaryotlarda birçok biyokimyasal ve biyofiziksel teori geliştirilmiştir. Örneğin, bakteri segregasyonunda ortaya çıkan nükleoid bölünmesi, plazmid replikasyonunda, mezozomların oluşmasında, eukaryotik hücre döngüsünde ve kromozom kompaktizasyonunun hücresel kontrolünde, gen ifadesinde ve özellikle transkripsiyon, translasyon ve rekombinasyon olaylarında membranlarla bağlanma noktaları ortaya çıkarılmıştır [1-4]. Ancak, şimdiye kadar toplanan tüm bu veriler genel bir geçerliliği olan gen-membran modelini geliştirmek için yeterli değildir. Bu bağlamda projemiz, yaşayan hücrelerde böyle bir gen-hücre zarı bileşiğinin ortaya çıkarılması ve karakterizasyonu ile ilgilenmektedir. Bu fikir, bu projeyi beraberce yürüteceğimiz Rus ortaklarımızın özgün bulgularına dayandırılmıştır [4]. Projemizin diğer boyutu ise biyoteknolojiktir ve son yıllarda önem kazanan gen aktarımı ile ilgilidir. Bilindiği üzere, gen aktarım yöntemlerinden biri olan lipofeksyon lipid vezikülleri içerisinde enkapsüle edilmiş terapötik nükleik asitlere dayanmaktadır. Böylece, proje önerimizin genel konusu olan nükleik asit-fosfolipid etkileşmelerinin bu noktada da önemli olduğu açıktır. Bu her iki boyutu da incelemek üzere bu proje önerimiz çok dikkatlice hazırlanmıştır. Nükleik asit-membran etkileşmeleri konusunda uzun yıllar çalışmaları bulunan çok deneyimli Rus ortaklarımızla müşterek çalışma olarak tasarlanmıştır. Söz konusu proje önerimiz ön fizikokimyasal, yüzey kimyasal, yapı-aktivite ilişkilerini ortaya çıkaracak şekilde morfolojik ve işlevsel incelemelerden ibarettir ve 2 yıl gibi bir sürede tamamlanması öngörülmüştür. Proje önerimizde bu süreyi göz önünde bulundurarak yeni ve pahalı techizatlara ihtiyaç duyulmayacak şekilde Türkiye’de ve Rusya Federasyonu’nda bulunan cihazlarların müşterek kullanımına özen gösterilmiştir. Böylece, üniversitemizin kaynaklarından en rasyonel olarak istifade edilmesi hedeflenmiştir. Bu bağlamda proje önerimizin kapsamı Gazi Üniversitesi B. A. P. Biriminin sağladığı proje desteği hükümlerine uygun olarak hazırlanmıştır. Bu anlaşma, taraflara sağlamış olduğu imkânlarla ve fırsatlarla bir önceki bölümde yer alan esas amacımıza ulaşma konusunda yeterli olacağı kanısındayız.

Bu Bölümle İlgili Referanslar: 1. A. A. Travers, DNA-Protein Interactions, Chapman & Hall; 1st Edition, (1993) pp. 192. 2. K. Scheffzek, Protein-Protein Recognition, C. Kleanthous (Ed.). Oxford University Press, (2000) pp. 314 3. M. P. Moyer, Association of DNA and RNA with membranes, Int. Rev. Cyt. 61, (1980) 1– 25. 4. V. V. Kuvichkin, DNA–lipid interactions in vitro and in vivo, Bioelectrochemistry 58 (2002) 3– 12.

Özgün Değer: Proje önerimiz iki ayrı hipoteze dayanmaktadır. Bunlardan ilki tarafımıza ait bir

hipotez olan lipozom-Mg2+-DNA lipoplekslerin hücre içi geçiş yolları ve daha sonraki etki mekanizmaları ile ilgilidir [1,2]. Söz konusu hipotezin esaslarına burada kısaca yer verilmiştir.

9

DNA-Lipozom Nanobileşenlerinin Hedeflendirilmiş Hücre İçi Geçiş Mekanizması ile İlgili Yeni Hipotez’in Esasları

Tedavi amacıyla tasarlanan lipozomlara dayalı gen taşıyıcıların hücre içi akıbetlerinin araştırılması konusu henüz daha başlangıç aşamasındadır. Şimdiye kadar bahsedilen tüm önemli faktörler dışında, nükleik asitlerin konformasyonunun belirleyici bir rol oynadığı açıktır. DNA ile lipidler arasında oluşan yeni fazlardaki meydana gelen konformasyonel değişikliklerinin ayrıntılı mekanizmasını ortaya çıkarmak için ve bu oluşumlarının transfeksyon etkinliği üzerindeki rolü yorumlayabilmek için, projemizde DNA ile yük taşımayan fosfolipidler arasında ilk temasları oluşturan bu makromoleküller arasındaki tanınmayı incelemiş bulunmaktayız. Bu yöntemle elde ettiğimiz verileri, daha önce aynı DNA-Mg2+-fosfatidilkolin üçlü bileşiklerin oluşumunun termodinamik özelliklerini ortaya çıkardığımız çalışmalarımızdaki [1,2] verilerle birleştirerek yeni özellikler taşıyan ve daha az toksik olan bir gen aktarım tasarımını yapmamızı mümkün kılacaktır. Söz konusu verilerimize dayanarak ve literatürde DNA-lipozom bileşikleriyle ilgili yayımlanan modelleri de değerlendirerek, bu önerimizde fosfolipid-Mg2+ ikili bileşikler ile anyonik hücre membranı arasında membran geçiş kompleksinin (membrane translocation complex) oluşması ile transfeksyon arasındaki ilişkiyi ortaya koyarak, model DNA’nın bir hücre içi geçiş hipotezi teklif etmekteyiz. Bu bağlamda, projemizde yapılan ön fizikokimyasal ölçümlere dayanarak, DNA-lipozom nanooluşumlarının hücre içi akıbetleri ile ilgili şu modelimizi sunmaktayız: İlk aşama (Şekil 1) nükleik asit ile MLV veya ULV lipozomlarla (lipopleks) bileşik oluşturulmasından ve yüzeysel kuvvetlerce kontrol edilen hedef hücre yüzeyine yakınlaştırılmasından ibarettir. Lipoplekslerin hedef hücre yüzeyinde bulunan negativ yüklü fosfolipidler tarafından nötralize olduğundan ve bunlarla füzyon yaptığından, bu kompleksten DNA ayrılır. Bunun sonucunda, daha önce yaptığımız floresan mikroskopik incelememize de dayanarak [3], nükleik asit hacminin genişlemekte olduğunu söyleyebilmekteyiz. Bu olay tersinirdir ve oluşan lipid fazlarının temel fizikokimyasal özelliklerine bağımlılık göstermektedir. Böylece hidrasyon, TºC, basınç, yüzey gerilimi ve potansiyeli, v.s. ölçülebilen parametreler meydana gelen muhtemel vezikül yüzeyinin tahmini için kullanılabilmektedir. Lamelar olmayan (non-lamellar) lipid fazların oluşumu yüksek bir olasılıktır ve bunlar transfeksyon üzerinde çok etkilidir. Füzyonun hızı ve DNA’nın salınımı bu şekilde meydana gelen daha yüksek lipid yüzeyinden kontrol edilir. Ancak, bu aşamada bu olayda elektrostatiğin mi yoksa hidrofobisitenin mi daha etkili olduğu açık değildir. Modelimize göre, hücre membranının lipid içeriği, tanınma şeklinden daha önemlidir.

Bunu takiben, ikinci aşamada, lipoplekslerin hücresel alınımı akışkan hücre membranının yüzeyinde meydana gelmekte ve bunun neticesinde nükleik asitin hidrofobik nedenlerle genişlemesi söz konusudur.

Üçüncü aşama, lipid-lipid, lipid-protein ve DNA-integral membran proteinleri etkileşmelerince meydana getirilen polinükleotid zincirinin membran faza girmesinden ve

10

bu faz üzerinden geçişinden (insertion and translocation) ibarettir. Bu bağlamda, polinükleotidlerin intraselüler geçiş yolu mekanizması ile daha önce teklif edilen cell-penetrating peptides tarafından gerçekleştirilen membran por oluşumu mekanizmasından farklıdır. Bu aşamada oluşan yapının meydana gelmesindeki hangi fizikokimyasal ve koloidal kuvvetlerin etkili olduğu ve ayrıca sayıları incelenmiş değildir.

Son aşama, difüzyon aracılıyla, DNA’nın hücre içi sitozole geçişinden ibarettir. Bu aşama, hücre sitozolü nükleik asitler için çok kötü bir çözgen olduğundan gen transfeksyonun etkinliğini düşürerek büyük bir engel teşkil etmektedir.

Şekil 1. Tek katmanlı lipozom (lipopleks) içerisinde enkapsüle edilmiş DNA’nın metal iyonlarca tetiklenen hücre içi geçişinin muhtemel mekanizması. (E. Süleymanoğlu, Il

Farmaco, Aug; 60 (8) (2005) 701-710).

Şekil 1’de teklif ettiğimiz mekanizma, DNA kondanzasyonu, katlanması ve katyonlarla bileşik oluşturması, endositoz’a girmesi ve çekirdeğe taşınması gibi hücresel olaylar doğrultusundaki lipoplekslerin kabul edilen genel etki mekanizmalarını esas almaktadır.

Bu bağlamda, hipotezimize göre, polianyonik DNA, pozitiv yük taşıyan deterjanlar gibi katyonik transfeksyon ajanlarıyla veya katyonik veya zwitterionic lipozomlarla hücresel hedeflendirilmesinden önce bileşik oluşturmaktadır. Bu bileşikler

11

hücreler tarafından endositoz ile alınmaktadır. Hücre yüzeyinde bulunan negativ yüklü fosfolipidlerle tanınmanın temelini oluşturan elektrostatiğin kontrol edilmesi güçtür ve gen transfeksyon deneyleri istenilmeyen serum cevaplarıyla sonuçlanabilmektedir. Bunun dışında, bu tasarımda kullanılan metal iyonlar sıkça heterojen boyutlara sahip olan lipid-DNA parçacık dağılımına sebep olur. Çok sık meydana gelen MLV terapötik genlerin intraselüler geçiş yolu üzerinde bulunan başka bir engeldir. Bu yüzden, bilim adamları lipopleks tasarımlarında elektrostatik kontrolden ziyade elektrostatik olmayan, örneğin daha zayıf olan H-bağ oluşumu üzerinde çalışmaktadır. Lipoplekslerin hücre içi akıbetleri ile ilgili geliştirdiğimiz modelimizde tam olarak hangi mekanizmanın gerçekleşeceği, lipozomları teşkil eden fosfolipidlerin lipid türü ve içeriğine, yüklerine, boyutlarına, yüzey alanlarına, nükleik asitlerin konformasyon ve konsantrasyonlarına, kan veya serumun varlığı gibi nedenlere bağlıdır. Çok etkili olan viral hücre içi geçiş mekanizmasına benzerlilik gösterdiğinden, lipozom-hücre membranı füzyon yolu ile gerçekleştirilen gen transfeksyonu tercih edilmektedir. Bu mekanizma genelde fuzyonu tetikleyen ve meydana getiren ajanlar kullanarak gerçekleştirilir. Proje önerimizde, daha önce adı geçen fuzyon ajanlardan farklı olarak ve açıklanan sebeplerden dolayı tercih edilmesi söz konusu olan Mg2+ kullanılmıştır. Tasarımımızda, bu metal iyonların neden tercih edildiği daa önceki yayınlarımızda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Lipozom-Hücre Etkileşmeleri Lipozom içeriğinin hedef hücrelere transferi esnasında oluşan lipozom-hücre etkileşmelerinin moleküler mekanizmalarından 4 ayrı etki mekanizması detaylı olarak bilinmektedir [4]. Bunlar sırasıyla:

1. Lipozomların hücre yüzeyine adsorpsyonu ve lipozom içeriğinin ekstraselüler olarak salınımı ve bunu takip eden bu maddelerin hücreye pasiv taşınması;

2. Lipozomların hücre yüzeyine adsorpsyonu ve lipozomal katmandan plazma membranına lipofilik bileşenlerin seçici taşınımı;

3. Lipozomların endositotik internalizasyonu ve bunu takip eden endolizozomal yol üzerinden lipozomların hücre içi degradasyonu ve içeriklerinin intraselüler olarak salınımı;

4. Lipozomal membran ile plazma membran veya intraselüler olarak endozomal membranlar arasında oluşan füzyon aracılıyla lipozom içeriğinin sitoplazmaya salınımı. Bu 4 ayrı mekanizmadan herhangi birinin meydana gelip gelmeyeceği lipid türü, vezikül boyutu, yükü vs. fizikokimyasal parametreler gibi lipozomun özelliklerini belirleyen faktörlere bağlıdır. Bunu belirleyen diğer faktörler ise hedef hücrenin türü ve kan veya serumun varlığı gibi çevresel faktörlerdir. Genel olarak, enjekte edilen lipozomların kanda in vivo ortamda karaciğerin ve dalağın doku makrofajları ve ayrıca da hepatositler tarafından saldırıya uğradıkları bilinmektedir [4]. Lipozomların, bu hücrelerle reaksyona girmeleri sonucunda hücre yüzeyinde bulunan reseptörlerce meydana getirilen bu parçacıkların endositozu ve fagositozu ile sonuçlanır. Bu olay esnasında lipozomlar endositoza uğratılıp hücre membranının invaginasyonuna neden olup endozomal kompartmanlara dönüşümünü gerçekleştirmektedir. Bu endozomlar daha sonra lizozomlarla füzyon yapmakta ve bunu endozomal içeriklerinin lizozomal degrdasyonu ve lipozomal içeriklerinin hücreye salınımları takip etmektedir. Sonuç olarak, çoğu zaman bu reseptörlerce meydana

12

getirilen lipozomların hücre içi degradasyonları yüzünden bu yol üzerinden çalışan lipozomal gen nakli tasarımları son derece problematiktir. Reseptörlerce geçiş yolunu virüsler çok iyi bir şekilde gerçekleştirmektedir ve günümüzde viral gen nakli tasarımları bu reseptörlerce kontrol edilen endositoz yoluna dayanmaktadır. Söz konusu tasarımlar ancak çok ileri düzeyde laboratuvar donanımına sahip uluslararası merkezlerde gerçekleştirilmektedir ve viral taşıyıcıların kullanıldığı tasarımlara dayanmaktadır. Rekombinasyon tehlikesinin meydana gelme olasılığının çok yüksek olduğundan, yukarıda da bahsedildiği gibi bu rekombinant viral gen nakli araçları son derece tehlikelidir ve dikkatlice uygulanmaktadır. Degradasyon problemi yüzünden lipozom’a dayalı gen taşıyıcı tasarımları bu reseptörler üzerinden çalışan intraselüler geçiş yolunu bir şekilde engelleyebilen özelliklere sahip olmalı.

Proje önerimizde, bu noktada, bir alternativ intraselüler geçiş yolu olarak yukarıda bahsedilen lipozom-hücre etkileşmelerinin dördüncü mekanimasını teşkil eden lipozom katmanı ile hedef hücre arasındaki muhtemel füzyon üzerinde durulmuştur. Bunu gerçekleştirmek için çok etkili olan viral proteinlerine benzerlik gösteren çeşitli proteinlere veya peptidlere füzyonu meydana getiren ajanlar olarak ihtiyaç vardır. Ancak, bazen bu proteinlerin hacimce büyük olmaları ve bu yüzden özellikle spektroskopik incelemeleri artefaktlarla veya spesifik olmayan sinyallerle sonuçlanmaları tekrarlanabilinir protokollerin geliştirilmesini çok zor yapmıştır. Bu bakımdan, projemizde proteinler yerine hacimce çok daha küçük, ancak doğal bileşenler olan metal iyonlar (Mg2+) kullanılmıştır. Deneysel tasarımımızda kullanılan ve önceden fizikokimyasal özellikleri çok iyi bilinen poly-L-Lysine ve protamin sadece DNA kompaktizasyonu ve lipozomlarala temas ettiren kontroller olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım, daha yeni ve orijinal olup detaylı olarak henüz daha araştırılmamıştır. Yukarıda da bahsedidiği gibi viral olmayan gen taşıyıcı tasarımları olarak sentetik polimerler (polipleksler) veya lipozomlar (lipopleksler) kullanılmaktadır. Polimerler yapıları itibariyle, örneğin boyut ve elektrostatik özellikler bakımından lipozomlardan çok daha fazla sentez olanakları sunmakta. Ancak, lipozomal sistemler fosfolipid katman içerdiklerinden füzyon olaylarını membran akışkanlığını düzenleyerek gerçekleştirdiklerinden bu mekanizma çok daha biyolojik olarak değerlendirilmektedir ve polimerlerde gözüken immün reaksyonlara daha az neden olmaktadırlar. Günümüzde, reseptörlerce meydana getirilen ve lipozomların degradasyonlarıyla sonuçlanan yolu engellemek için araştırma grupları genelde katyonik lipid ve buna yardımcı olarak kullanılan (helpler lipid) yüksüz (nötr) lipidlerden oluşan bir lipozom gen taşıyıcıları üzerine yoğunlaşmışlardır. Katiyonik lipozomlarla genin intraselüler geçişi daha kolay gerçekleşmesine rağmen, bu gen taşıyıcıları seruma enjekte edildiklerinde, çok düşük etkili transfeksyon, immün cevap ve daha önemlisi sitotoksisitenin meydana geldiği klinik deneylerce tespit edilmiştir. Bu yüzden proje önerimizde genelde katiyonik lipid kısmından kaynaklanan sitotoksisiteyi engellemek amacıyla bu tür lipidleri kullanmayıp, sadece nötr lipidleri içeren bir gen taşıyıcı tasarımı üzerinde durduk.

Sunulan model genomik DNA ve plazmid DNA için geliştirilmiştir. Bu iki gen aktarım yönteminin birbirinden çok farklı amaçlarla uygulandığı ve bir birine kıyasla çok farklı intraselüler geçiş farmakokinetiğine sahip oldukları konularına daha önce değinilmiştir. Ancak bu farklılıklar sadece farmakodinamik ve farmakokinetik özellikleri

13

kapsamaktadır. Membran üzerinden hücre içi geçişleri ise aynı mekanizmaya dayanmaktadır ve bu yolu optimize etmek için aynı fizikokimyasal parametreler üzerinde çalışmayı gerektirmektedir. Sonuç olarak, bu iki şekilde de görüldüğü üzere metal iyonlarca yakın temasları sağlanarak yük taşımayan fosfolipidlerle DNA veya RNA’nın kondanze bir bileşik oluşturmalarına ve bu bileşiğin hedef hücre membranıyla füzyon yapması sonucu hücre içi sitozole geçişine dayanmaktadır.

Hücre içi geçişi başarılı bir şekilde gerçekleştirilen nükleik asitlerin endositotik engellerden ve sitoplazmik nükleaz degradasyonundan korumak araştırma gruplarının en büyük hedefidir. Genelde, yabancı terapötik DNA molekülünü çok az sayıda hücre almakta ve çekirdeğindeki ekspresyonunu gerçekleştirmektedir. Bu şekilde hücre membranı üzerinden geçişi gerçekleştirilen nükleik asit olsa bile ve sitoplazmada sözü edilen degradasyonlardan korunabilse bile, gen transkripsyonunun meydana geldiği çekirdeğe ulaşmadan çok önce daha sitozolde veya daha sonra DNA ve lipidler oluşturdukları bileşikten ayrılmaları gerekir. Bu projemizin de temelini oluşturan ve günümüzde tercih edilen lipid’e dayalı gen taşıyıcı tasarımı arzusu, hedeflendirme zorlukları, lipid-DNA yapıları ile ilgili belirsizlikler ve sıkça meydana gelen ve serum cevabına sebep olan heterojen bileşikler yüzünden gerçekleştirilememektedir. Ayrıca, sistematik olarak uygulandıklarında, nükleik asitler kandaki hidrofobik yapılarının ve parçacıklarının 90% oranında uzaklaştıran opsonizasyon sonucunda meydana gelen kan klirınsına uğramaktadır ve bu da lipid veziküllerinin kullanılmasını kısıtlamaktadır [4]. Genel olarak, yük taşımayan MLV ve ULV negativ ve pozitiv yüklü MLV’lere göre daha yavaş bir klirıns göstermektedir. ULV MLV’lerden daha yüksek bir dirence sahiptir [4]. Daha önemlisi, kendi başına izole moleküllerle yapılan deneyler sonucunda elde edilen neticeleri in vivo ortama uyarlamak son derece güçtür. In situ ortamda, hücresel olayların farklılık gösterdiğinden, lipozom-hücre etkileşmelerinin incelemek için kullanılan hücre kültürü düzeneklerinden elde edilen neticeler çok dikkatlice yorumlanmalı. Bu hücresel olaylar, araştırmada kullanılan hücre türüne, uygulanan transfeksyon protokolüne, serumun varlığına, bileşik oluşumunu kolaylaştıran maddelerin ortamda bulunmasına ve TºC gibi faktörlere bağımlılık göstermektedir. Ayrıca, lipofeksyon protokollerin başarılı olabilmesi uygulanan gen raportör sistemine de bağlıdır [4].

Polielektrolit ve fizikokimyasal olarak sistemi daha basit tutmak için, projemizde sadece genel faz değişimleri üzerinde durulmaktadır. Yukarıdaki şekilde teklif ettiğimiz mekanizmaların gerçek duruma göre basitleştirilmiş oldukları açıktır. Bu mekanizmaları kanıtlamak için çok sayıda farklı gen raportör sistemi ve canlı hücre floresans mikroskopisi uygulanmalıdır. Ancak, projemizden elde ettiğimiz verileri esas alarak ve bunları daha önce literatürde yayımlanan modelleri de değerlendirerek, yeni ve özellikleri iyileştirilmiş gen taşıyıcılarının tasarlanmasını mümkün hale getireceği ümidini taşıyoruz.

Projemizde yer alan fosfolipid-metal iyon-nükleik asit nanobileşen oluşumunda kullandığımız zwitteriyonik lipidlerin uygulanması fikri de son zamanlarda nötr veya yüksüz lipozomlarla gerçekleştirilmiş başarılı lipofeksyon çalışmalardan [4] da desteklenmiştir. Bu yüzden de bu gelişmeler daha az toksik olan bu tür lipidlere dayanan viral olmayan gen aktarım tasarımlarımızla ilgili çalışmalarımızı daha ileri düzeye taşımamız için motive edicidir.

14

Tasarımlarımızda nükleik asit ile fosfolipidler arasındaki tanınmayı sağlayan

metal katyonlarının lipofeksyon üzerine elektrostatik kontrolü mümkün yapabilmeleri bizce incelenmesi gereken bir konudur. Bu doğrultuda modelimizde kullandığımız çift değerli metal iyonları transfeksyon etkinliğini şu şekilde artırabilmektedir. Örneğin, hücre membran üzerinden hızlı geçiş yaparak, sitozolü de engel karşılamaksızın geçerek nükleusa ulaşma özellikleri sayesinde, gen aktarım aracı olarak tasarlanan ve katlanmamış (globül) DNA veya RNA’yı içeren veziküllere dayalı yeni intraselüler hedeflendirme yollarını da kapsayan tasarımların uygulanması mümkün olabilir.

Sunduğumuz lipozom-hücre etkileşmeleri modelinde de yer alan ULV’dan ortaya çıkan ve nükleik asit sarmalında polinükleotid zincirlerinin birbirinden ayrılması sonucu birkaç vezikül arasındaki füzyonlarının meydana gelmesini göstermektedir. Böylece, elde edilmesi amaçlanan daha yüksek yüzeye sahip füzojenik vezikül oluşmaktadır. Burada, Mg2+ yukarda da bahsedildiği üzere DNA polianiyonu birkaç lipozomun etki alanına getirmek için kullanılmıştır. Bu şekilde, lipozomların hücre membranını destabilize etkileri de kolaylaştırılır.

Metal iyonların DNA ve lipidlere bağlanma, hücre membranına bağlanma ve membrandan geçerek çekirdeğe ulaşabilme özellikleri dışında sarmala bağlanan moleküllerce gerçekleştirilen çekirdeğe DNA hedeflendirme kaabiliyetleri, çift değerli metal katiyonların bileşik oluşturan DNA ile membran üzerinden geçişi gerçekleştirebildikleri nükleositoplazmik taşınım modeliyle ile de bağdaşır. Ancak, metal iyonların varlığında nükleik asitlerce tetiklenen fosfolipid füzyon mekanizması bilinmemektedir. Bir olasılık, katyonik peptidlere benzer şekilde inorganik katyonların hidrasyon tabakalarının veziküller arasındaki uzaklaştırıcı kuvvetlerinin (inter-vesicle repulsive forces) elektrostatik nötralizasyonunu sayesinde olabilmesinden ibarettir. Birkaç membran katmanının birbiri ile temas bölgesine yakınlaşmaları, metal iyonların hidrofobik ve elektrostatik özellikleri sayesinde gerçekleştirilen lipozom-hücre fosfolipid bileşik oluşumunu lipidler arası (lipid mixing) karışım olayları izler.

Proje önerimizin ikinci boyutu moleküler hücre biyojisi için büyük önem taşıyan in vivo nükleik asit-fosfolipid eteileşmeleriyle ilgili olup bu konuda çok önceden Rus ortaklarımızın ortaya attığı hipotezlerine dayanmaktadır [5-11]. Bu hipotezin esasları kısaca şöyledir:

15

In vivo Hücresel Nükleik Asit-Membran Bileşiklerinin Oluşması ve Gen İfadesini

Etkilemeleri Hipotezi ile İlgili Hususlar

16

Şekil. 2. Eukaryotik hücre çekirdeğinde meydana gelen nükleik asit-çekirdek membranı arasında oluşan bileşikler ve işlevsel anlamları. (V.V. Kuvichkin hipotezi-1983, bk. [6]). Proje önerimizin bu bölümüne bu şeklin yer alması konusunda önceden Sn. Prof. V.V.

Kuvichkin’den izin alınmıştır.

Bu proje önerimizdeki müşterek olarak çalışacağımız Rus ortaklarımız, söz konusu nükleik asitlerle hücre membranları arasında oluşan bileşiklerin araştırılmasında 1980’li yıllardan beri büyük katkıları olmuştur [6-11]. Bu grubun çalışmaları özellikle yaşayan hücre düzenekleri üzerinde ölçümlere dayanmaktadır. Nükleik asitlerle biyomembranlar arasında oluşan bileşiklerin tüm hücre türlerinde görüldüğü hususu bu grup çalışanları tarafından önemle vurgulanmaktadır. Bu çalışmalarının dayanağı şu şekilde kısaca açıklanabilir.

Nükleik asitlerin membranlarla bağlanma noktalarının incelenmesi o yıllarda hızla ilerleyen biyomembranlardaki lipid-protein araştırmalarına paralel olarak 1970’li yıllarda başlatılmıştır. Bu konuda geliştirilen teorik modeller, daha önceki biyokimyasal verilere dayandırılmıştır. Örneğin, bu tür bileşiklerde sadece, tek zincirli nükleik asit topolojilere karşı duyarlılığı bulunan S1 endonükleaz aktiviteleri saptanmıştır. Söz konusu bileşikler EDTA tarafından degradasyona uğratıldığından ve EDTA ile EGTA genelde çift valanslı metal katiyonları reaksyon ortamından uzaklaştırdığından, söz konusu metal iyonların bu bileşik oluşumlarında rol oynadığı fikrinin ortaya atılmasına sebep olmuştur. Rus ortaklarımız bu modeli daha da geliştirerek çift valanslı metal iyonların (Ca2+, Mg2+ v.s.) muhtemel rolünü incelemişlerdir [6-11]. Yaptıkları çeşitli spektroskopik, mikroskopik, termodinamik ve hücresel ölçümlere dayanarak söz konusu nükleik asit-biyomembran etkileşmelerinin gen ifadesinde ve özellikle sinyal iletim mekanizmalarındaki rolleri ile ilgili 1983 yılında ilginç bir hipotez ortaya atmışlardır. Bu hipotez Şekil 2’de şematik olarak gösterilmiştir. Bu hipoteze göre, hücre çekirdek membranında ilk önce, DNA ile çekirdek membranı arasında temas sağlanmaktadır (A). Bunu takiben, eukaryotik gözenek geçici olarak oluşmaktadır (B) ve daha sonra da R-loop denilen yapı meydana gelmektedir. Son aşama olarak (C) eukaryotik çekirdek gözeneği oluşmaktadır. Söz konusu yapı membranla DNA arasında bağlanma noktalarını yüzey basınç güçlerinin etkisiyle hafifletmek suretiyle ve snRNA türlerinin oluşmasıyla gerçekleşmektedir (D). (D)’de gösterilen yapılar (C)’de meydana gelen yapıların bir kesitidir.

Yıllar sonra, Rus ortaklarımızın bu hipotezi Salzburg Üniversitesi’nde gen ifadesi olaylarını çalışan Prof. A. J. M. Matzke ve M. A. Matzke tarafından esas alınmış ve bugün geçerli olan genel bir gen ifadesi teorisi geliştirilmiştir [12]. Bu proje önerimizin ortağı da olan Prof. V. V. Kuvichkin’in 1983 yılında geliştirdiği bu hipotez doğrudan RNA öncülleriningen ifadesi esnasında kesilmesi (splicing), mRNA gelişimi, ribozomal öncüllerinin katabolizması ve çekirdek gözenekleri üzerinden gerçekleşen nükleositoplazmik taşınım olayları ile ilgilidir. Söz konusu hücre çekirdek membranında en yüksek miktarda yük taşımayan fosfatidilkolin lipidlerin bulunduğundan, daha önce bahsedilen Mg2+’un hücresel rolü doğrultusunda bunlar arasında olası bileşik oluşmasının incelenmesi ilginç olacaktır. Bu ölçümlerle ilgili Rus ortaklarımız projemizin 2ci yılında yapılması plânlanan çalışmaları Xenopus ovosit düzenekleri kullanarak gerçekletireceklerdir. Bu düzenekler ilk defa projemizde teklif edilmektedir ve literatürde şimdiye kadar benzer tasarımlarla ilgili çalışmalar yayımlanmamıştır. Bu bakımdan, bu ölçümler projemize özgün değer katacaktır.

17

Projemizin bir diğer boyutu ise biyoteknoloiktir. Örneğin, bu projemizden elde edilecek neticeleri yeni lipozom kromatografik yöntemlerin geliştirimesiyle ilgili yeni bir tasarımımıza daha burada yer vermek istiyoruz:

DNA Ayrışımı ve Analizi için İmobilize Lipozom Kromatografisinin Geliştirilmesi

Bu doğrultuda fosfolipid-nükleik asit arasındaki tanıma (phospholipid-nucleic acid recognition) ile ilgili bu projeizle elde edilen önemli fizikokimyasal parametreler çok yakın bir gelecekte çeşitli yapı ve özelliklere sahip nükleik asitlerin ayrıştırılması, saflaştırılması ve analizleri için yeni ve analitik özellikleri iyileştirilmiş kromatografik stasyoner fazların üretilmesinde ve uygulamasında kanımızca kullanılabileceklerdir. Projemizde, bu bağlamda çeşitli katyonların da varlığında nükleotid dizilişi ve nükleotid asit topolojilerine spesifik olarak ve gerektiğinde spesifik olmayan nükleik asitlerin çeşitli tepkilemelerde önem taşıyan yapı-aktivite ilişkisi araştırmalarında bu nükleik asit-fosfolipid etkileşmelerinin sıvı, çift-fazlı sistem olarak kullanılmalarını vurgulamaktayız. Kromatografik kolonun jel matrikslerine böyle kovalent olarak bağlanmış lipozomlarla çeşitli nükleik asit türleri veya plazmidler arasında bileşik oluşumunun sabitlilik, bağlanma afiniteleri ve daha sonra meydana gelen kompaktizasyonun ortaya çıkarılmasında çok daha kolay kullanılabilecekleri gibi lipozomlarla bağ yapan, reaksyona giren ve bileşkler oluşturan birçok biyolojik ve farmakolojik özellikleri olan etken makromoleküllerin de yapılarının aydınlatılması kolaylaşacaktır. Bizce, böyle tasarlanmış sistemler önemli biyospesifik tanıma olaylarında kantitativ analizleri mümkün kılacaktır ve daha sonra diğer parametreler dışında, özellikle ortam sıcaklığı, pH, pI ve tampon içeriğine bağlı olarak membrana-bağlı nükleik asitlerin nasıl değişime uğradıklarını ve bunun nasıl bir biyolojik önemi olduğunu açıklayacaktır. Bu şekilde elde edilen verilerle biyomembran üzerinden hücre sitozolüne geçiş yapan çeşitli ilâçları ve tedavi amaçlı sentezlenen nükleik asit bileşenlerinin farklı boyut ve lipid türüne sahip hücre membranlarla bileşik oluşumunun diğer önemli parametrelerini ve özellikle biyolojik neticeleri olan membran akışkanlığı ve bu bağlamda patolojik durumların ortaya çıkması ile ilgili konular aydınlatılacaktır.

Bu şekilde kolayca modifiye edilen lipozomlar, sıvı fazı olan ve stasyoner fazı teşkil eden biyomakromoleküllerin spesifik olarak ayrıştırılması için bir model oluşturan lipozomun iç hacmini içeren kısım ile bir çeşit sıvı çift fazlı sistem olarak algılanmaktadır. Böylece, imobilize lipozom kromatografisi sıvı-sıvı partition kromatografisinin (liquid-liquid partition chromatography) bir çeşidi olarak görülmektedir. Bu tasarımımızda, lipozomun sıvı iç hacmi ile dış sıvı fazı arasında çeşitli moleküler ağırlığa sahip maddelere karşı yüksek geçiş özelliklerine sahip olan vezikül katmanı sayesinde bir faz farklılığı oluşmaktadır. Bu sistem, elektrostatik ve hidrofobik bağ kuvvetlerini kullanarak konformasyonel değişiminin de meydana geldiği veya tercihe göre getirilmediği durumlarda nükleik asitlerin imobilizasyonunda kullanılabilmektedir. Projemizde, bu bağlamda, bu çift fazlı sistem nükleotid dizilişi ve topolojiye spesifik

18

olarak veya tercihe göre olmayarak fosfolipidlerle nükleik asitler arasında kompleks oluşumunun araştırılması konusu, Mg2+ veya diğer çift değerli katiyonların da varlığında ele alınmaktadır. Lipidlerin faz değişimi ve faz geçiş sıcaklığının üzerinde ve altındaki ısı değelerinde çalışarak, bu sistemin termostatik kontrolü de mümkündür. Ayrıca, lipozom ve nükleik asitlerin yüzeyleri ve topolojileri bu yaklaşım sayesinde değişime uğratılarak lipid membranlarının hidrofobik ve elektrostatik baş gruplarını (head groups) yerel erişimi yükseltilir.

Lipid vezikülleri ile DNA veya RNA arasında oluşan bileşiklerde, bu gibi konformasyon değişikliği parametreleri ayrıntılı olarak henüz daha araştırılmamıştır ve gen taşıyıcıların yapı aydınlatılmasında kullanılmaları kanımızca çok ilginç olmalıdır. Bu bağlamda, söz konusu poli(ribo)nükleotidler yük taşımayan fosfolipidlerin çeşitli katiyonların varlığında membran füzyonu meydana getirip getirmedikleri araştırılabilir. Böylece, bu şekilde kovalent olarak kromatografik kolonun jel matriksine bağlanan lipozomların kendi akışkanlıklarını ve yüzey tanıma özelliklierini de kontrol ettikleri fikri substrat olarak ele alınan farklı boyut ve konformasyona sahip nükleik asitler için de bu soyut varsayımlar ve somut parametreler incelenebilecektir. Buradaki amaç, bu şekilde sterik olarak stabilize edilen veziküllerin elektrostatik etkileşme kaabiliyetlerini kullanarak lipozom yüzeyinde nükleik asitlerin kompaktizasyonunu gerçekleştirmektir.

Söz konusu lipid fazın içeriğini doğal hücre membranlarda bulunan bileşiklere benzerlik gösterecek şekilde seçerek ve tampon içeriğini, pH, pI ve T°C gibi fizikokimyasal parametreleri de bu doğal hücre ortamında ölçülen değerlerde tutarak, çeşitli lipid’e-bağlı nükleik asitlerin konformasyonları araştırılabilir. Bu şekilde kovalent olarak imobilize edilmiş lipozomların stabiliteleri, çeşitli ilâç ve terapötik nükleik asitlerin membranlara bağlanma afiniteleri ve fosfolipidlere bağlı nükleik asitlerin kompaktizasyon özellikleri incelenmektedir. Bu tasarımımız, çok katmanlı (multilamellar vesicles, MLV) veya tek katmanlı (unilamellar vesicles, ULV) lipozomların veya veziküllerin kromatografik kolon jel matriksine (chromatographic gel beads) kovalent bağlama süretiyle enjektör, pompa ve UV-detektör ile donatılmış yüksek performanslı sıvı kromatografisi (high perfomance liquid chromatography, HPLC) ile söz konusu fizikokimyasal parametrelerinin incelenmesine dayanmaktadır. Bu şekilde kovalent olarak stabilize edilmiş fosfolipid vezikülleri çok daha akışkandır ve doğal hücre membranlarına çok daha iyi bir yaklaşım ve modeli teşkil edip, nükleik asitlerin membran akışkanlığı üzerindeki etkilerini incelemek için çok daha uygun bir sistemdir. Bu tasarımımıza göre, fosfolipidler, jel’e fosfatlarıyla fosfodiester bağ ve aktiv grubun karbonat kısmıyla nükleofilik fosfat katalizi ile bağlanmaktadır. Biyomembran ortamına yaklaştığı için imobilize edilmiş veziküllerde heterojen lipid katmanın elde edilmesi tercih sebebidir. Bu tasarımda, tek lipid veya birkaç lipid karışımının kullanıldığında genelde elektrostatik ve hidrofobik etkileşmeler meydana gelmektedir. Böylece, bu tasarım sayesinde membran-poli(ribo)nükleotidler arasında oluşan bileşiğin oluşma kinetiğini de incelemek mümkündür. Ayrıca, bu tasarım, serbest iyonların ve membrana bağlı olarak işlev yapan çeşitli yüklü deterjanların nükleik asit kondanzasyonu ve kompaktizasyonu gerçekleştiren ajanlar olarak lipid’e bağlı gen taşıyıcı tasarımlarda da, fizikokimyasal özellikleri iyileştirilmiş moleküller olarak diziliş ve konformasyon’a bağlı nükleik asitlerin saflaştırmasındaki yeri de incelenebilmektedir.

19

Farmasötik formülasyonlarda kullanımları için büyük ölçüde, miktarda ve saflıkta

plazmid DNA’nın üretilmesi insan gen tedavisi gibi birçok biyoteknolojik uygulamalar için esastır. Özellikle plazmid DNA saflığı söz konusu olunca, plazmidleri daha yüksek bir dinamik bağlama kapasitesine sahip ve iyileştirilmiş ve optimize edilmiş kromatografik kolon matrikslerinin tasarımı çok büyük bir önem kazanır. Şu ana kadar saflştırma amacıyla uygulanmakta olan poröz matrikslere bir alternativ olarak tasarımımızda geleneksel malzemelere kıyasla iyileştirilmiş hidrodinamik özelliklere sahip membran özellikli matrikslerin uygulamaya yönelik hususlar vurgulamaktadır. Bu bağlamda, çeşitli nükleik asit konformasyonları fizikokimyasal ve stereokimyasal olarak ayrıştırabilen kontrollü DNA presipitasyonlarını gerçekleştirerek tasarımımızda tek ve çift zincirli DNA’ların saflaştırmasına da yer verilmiştir. Böylece DNA işlevsel yüzeyin yaratılmasında ve daha sonra bu lipozomal yüzeyinde nükleik asit imobilizasyonu için kullanılabilir. Genomik ve plazmid DNA veya RNA arasındaki ayrışım kullanılan katiyona bağlı olarak farklı kompaktizasyon globülü meydana geleceğinden mümkün olmaktadır. Bu tasarım, yine negativ yüklü DNA ile yük taşımayan veya pozitiv yüklü lipidleri çift valanslı katyonlar (Mg2+, Ca2+, vs.) aracılıyla bir araya getiren elektrostatik etkileşmelerinin uygulanmasına dayanmaktadır. Diğer yandan, elektrostatik kuvvetler dışında DNA-lipid oluşumu bazlarla matriksteki ligand-taşıyan gruplar arasında hidrofobik etkileşmeler sayesinde de meydana gelidiğinden söz konusu konformasyonlar arası ayrışım ters-fazlı sıvı kromatografisi (Reverse Phase Liquid Chromatography, RPLC) ile de inclenebilinmektedir. Bu durumda, bağlı olan polinükleotidler hidrofobik bir özellik olan yükselen hidrofobisiteye göre elüye olmaktadırlar. Böylece, daha yüksek moleküler ağırlığa sahip nükleik asitler RPLC kolonunda daha uzun bir süre kalacaklardır. Sonuç olarak, bu tasarım sayesinde tek sarmallı DNA’yı plazmid DNA’dan ve çift sarmallı DNA’dan saflaştırmak mümkün olur. Süpersarmallı plazmid DNAlar genelde gen aktarımı için en uygun malzeme olduklarından kromatografik yaklaşımların en önemli amacı bu konformasyonu diğer plazmid konformasyonlardan ayrıştırmak ve saflaştırmaktır.

Nükleotid bazlar kromatografik kolon bağlayıcıya (colon linker) şeker, baz veya fosfat kısmındaki çeşitli pozisyonlarda bağlanmaktadır. Gen transkripsiyonu, ve translasyonu, virüs-hücre etkileşmeleri, nükleositoplazmik taşınım ve hücre bölünmesi gibi çok önemli hücresel olaylarda rol oynayan proteinlerin büyük bir bölümü öncelikli olarak tek zincirli veya çift zincirli nükleik asit dizilişlerine bağlanmayı tercih ederler. Bu olaylarda önemli rol oynayan makromoleküller membrana-bağlı olarak işlev yapmaktadır. Böylece, bu olayların moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak, bu kilit moleküllerin saflaştırmasına bağlıdır. Bu da yeni nükleotid dizilişi ve konformasyona spesifiklik gösteren kromatografik nükleik asit saflaştırma tasarımlarını zorunlu kılar. İmobilize afinite lipozom-DNA kromatografisi konusunda çalışmalarımız yoğun olarak devam etmektedir ve yeni bir araştırma projesi olarak sunulacaktır.

20

PROJE ÖNERİMİZİN DEVAMI OLARAK YAPILMASI ÖNGÖRÜLEN ORTAK ÇALIŞMALAR

Bu proje önerimiz, insan gen tedavisinde kullanılan, viral olmayan ve lipozomlara dayalı gen taşıyıcılardan sitotoksik etki gösteren katyonik lipidlere bir alternativ olarak görülen yük taşımayan lipidlerden oluşan ve metal iyonlarla (Mg2+) bir polianiyon olan DNA ile üçlü bileşikler oluşturan yeni bir terapötik nükleik asit formülasyonunun yüzey kimyasal, koloidal, fizikokimyasal, biyofiziksel, mikroskopik ve işlevsel ölçümleri ile incelenmesiyle ilgilidir. Burada metal iyon, DNA kompaktizasyonu için şimdiye kadar kullanılan füzojenik proteinlere yine bir alternativ olarak önerilmektedir. Projenin öncellikli amacı, nükleik asit-Mg2+-fosfolipid üçlü bileşikler oluşumunu ve burada yer alan makromoleküllerin birbirini tanınmasını önce yüzey kimyasal yaklaşımlarla tespit edilip, daha sonra proje önerimizde yer alan diğer ölçümlerle teyit edilmesidir. Söz konusu moleküller arası tanınma olayı kullanılan protokole ve cihazlara bağlı olarak tespit edilmesi zor olan bir reaksyondur. Amacımız, bu şekilde karakterize edilen DNA-lipid bileşenlerinin fizikokimyasal parametrelerine dayanarak bu gen aktarım tasarımını lipidler aracılıyla gerçekleştirilen in vitro transfeksyon (lipofeksyon) ve nihayet in vivo deneylerde denemek suretiyle iyi ve güvenilir bir model terapötik nükleik asit formülasyonu elde etmek. Bunun için uluslararası düzeyde ortak çalışmalara girmeyi ümit etmekteyiz. Ancak, in vitro transfeksyon ve in vivo ortamda söz konusu formülasyon çalışmalara girmenin koşulu ilk önce bu formülasyonların fizikokimyasal karakterizasyonudur ve bunu da projemizde çeşitli biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak gerçekleştirmeyi hedeflemekteyiz. Bu ön verilere dayanarak bu konuyu çok daha iddialı boyutlara taşımayı arzuluyoruz. İleriye yönelik yurt dışı ortaklarımızla yapmayı planladığımız deneyler kısaca şunlardır: • Öncelikle, Fakültemizde şu ana kadar atık sorunu tehlikesi yüzünden radyoaktiv bileşenlerle çalışmaların mümkün olmadığından, sözü edilen lipozom-hücre etkileşmelerinin radyoaktiv lipid markerleri kullanarak incelemeyi planlamaktayız. Örneğin, lipozomları radyoaktiv 3Hkolesteril eter ve kolesteril 14C-oleat işaretleriyle çifte işaretleyerek lipozomların intraselüler degradasyonu hakkında çok önmeli bilgiler elde edilebilir. Radyoaktiv işaretleme yöntemine bir alternativ olarak piyasada uzun yıllardan beri bulunan lipidlere spesifik floresan işaretler kullanılabilinir. Ayrıca, lipozomların iç hacminde enkapsüle edilmiş şekilde bulunan DNA’nın kompaktizasyonu konvansyonel floresans mikroskopisi ile veya konfokal lazer taramalı mikroskopisi (confocal laser scanning microscopy) ile incelemek çok önemli bilgiler vermektedir. Örneğin, DNA’ya spesifik DAPI ile lipidlere spesifik FM 4-64 ile aynı anda nükleik asit ve lipidler ayrı renklerle boyanır ve aynı anda her iki biyomolekül dinamiği hakkında bilgiler edinilir [3].

• Projemizin bir sonraki aşaması hücre kültürlerinin kullanılması ile ilgilidir. Ancak, bu konu ile ilgili gerçekleştilecek olan in vitro transfeksyon hücre türüne göre spesifiklik gösterdiğinden, in situ olarak elde edilecek olan neticeleri çok dikkatlice değerlendirilmeli, çünkü her hücre türü kendine özgü DNA internalizasyon kinetiği göstermektedir. Diğer yandan, hücre kültürlerinin kullanılmasının büyük avantajı bu hücre kültürlerini piyasadan edinebilme kolaylığı ve yapılmakta olan deneylerin kontrol

21

edilebilme fırsatıdır. Örneğin, hücre kültürü düzeneğini kullanarak kan ve kan bileşenlerinin (serum, plazma ve çeşitli proteinler) veya farklı reseptörlerin lipozom-hücre etkileşmelerine etkilerini ortaya çıkarmayı planlamaktayız.

• Bu projemizde, sadece yük taşımayan fosfatidilkolin gibi lipidlerin DNA’ya bağlanma özellikleri spektroskopik olarak incelenmiştir. Oysa, yük taşımayan fosfolipidlerle negativ yüklü fosfatidilserin-veya fosfatidilgliserol içeren lipozomların çeşitli hücre kültürleri ve türleri ile yapılan araştırmalarca farklı hücre-lipozom etkileşmelerinin ve özellikle bağlanma afinitelerin söz konusu olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu yüzden bu projede yapılan tüm ön fizikokimyasal ölçümlerini farklı yük taşıyan lipidleri kullanarak lipozom bileşenlerinin bağlanma afiniteleri, intraselüler salınımları ve hücre içi akıbetlerini incelemeyi hedeflemekteyiz.

• In vitro tranfeksyon protokolleri ortam sıcaklığına göre son derece duyarlıdır ve etkili transfeksyon için ortam sıcaklığının optimize edilmesi gerekmektedir. Örneğin, bazı hücre kültürleri 4ºC en etkili transfekyon oranı gösterirken diğer hücre türleri 37ºC’de en yüksek transfeksyon veya lipofeksyon gösterirler. Bu bakımdan, in vitro transfeksyon deneylerini farklı ortam sıcaklığında gerçekleştirerek termodinamik olarak en etkili transfeksyon ortamını tespit etmeyi düşünmekteyiz.

• Ortaklarımızla müşterek olarak yapmayı planladığımız projemizin ileriye dönük boyutlardan biri de elde edilen in vitro verilerini in vivo ortamda denemektir ve böylece in vitro – in vivo ilişkilerini incelemektir. Bunun için sıçan ve rat modellerini kullanarak in vivo ortamda lipozomların klirıns hızı ile ilgili farmakokinetik veriler elde edilebilinir.

• Bir sonraki aşama olarak, projenin gidişatına göre lipozomların kinetiğini ve doku dağılımlarını ve intra-organ dağılımlarını radyoaktiv ve/veya floresan işaretleri kullanarak araştırmayı hedefliyoruz. Bu konu ile ilgili şu an çok güncel olan Molecular Imaging-KODAK In Vivo Imaging cihazının Fakültemize kazandırılması ile ilgili proje hazırlıklarımız devam etmektedir. Bu uzun vadeli çalışmalara dahil edilebilmemiz için bir önkoşul olan söz konusu bileşiklerinin fizikokimyasal karakterizasyonu doğrultusunda elde edeceğimiz başarılara dayanarak daha uzun vadeli ve uluslararası boyutu olan projelere katılmayı ümit ediyoruz. Bu konuda daha önce çalıştığım çok iyi laboratuvar donanımlı araştırma grupları ile temas edilmiş ve çok olumlu yanıtlar alınmıştır. Böylece, yukarıda da bahsedildiği gibi çalışmalarımızın nanoteknolojik boyutuna ulaşılmış olunacak ki, bu Avrupa Birliğinin 7ci Çerçeve Programında proje öncelik sıralamasında ilk yerlerde bulunan bir konu olarak bize uluslararası projelere de katılmamızı sağlayacaktır.

Sonuç olarak, proje önerimizin ilk hedefi yukarıda bahsedildiği üzere Mg2+ varlığında yük taşımayan fosfolipidlerle DNA arasında bileşik oluşturmak suretiyle yeni ve özellikleri iyileştirilmiş farmasötik nanoformülasyon geliştirmektir. Bu tür formülasyon ile ilgili tasarımlar şu ana kadar literatürde yayımlanmamıştır. Projemizin ikinci hedefi ise yaşayan hücre düzeneklerinde söz konusu nükleik asit-membran bileşiklerinin oluştuğunu göstermektir. Bunun için Rus ortaklarımızın tecrübe ve katkıları çok etkili olacaktır. Bu her iki hedefe ulaşmak için daha önce uyguladığımız ve vakıf olduğumuz, ancak şu ana kadar literatürde bu yöntemlere yer verilmeyen düzenekler

22

üzerine Rus ortaklarımızla mutabık kalınmıştır. Örneğin, AFM, konfokal floresans mikroskopisi ile hem DNA hem fosfolipidlerin ayrı ayrı görüntülenmesi, daha sonra faz değişimlerinin Raman spektroskopisi ile ortaya çıkarılması ilk defa yapılacaktır. Tüm diğer ölçümler bunları teyit edici niteliği taşımaktadır. Bu bakımdan, bu tür bir yaklaşım bizce özgün olacağından, literatürde de yerini alacaktır. Buna dayanarak yeni projeler hazırlanacaktır ve patent çalışmaları başlatılacaktır.

Bu Bölümle İlgili Referanslar: 1. Süleymanoğlu E. Preparation and phase behaviour of surface-active pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential adiabatic scanning microcalorimetric study. Il Farmaco, Aug; 60 (8) (2005) 701-710. 2. Süleymanoğlu E. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Energetics of DNA-Mg2+-Phosphatidylcholine Ternary Complex Formation and its Further Compaction as a Gene Delivery Formulation, PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4) (2006) 218-231. 3. Süleymanoğlu, E. Fluorescence microscopy of condensed DNA conformations of bacterial cells. J. Microbiol. 40 (2002) (4): 319-326. 4. N.S. Templeton, Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategies. 2nd Ed., Marcel Dekker, (2003). 5. L.I. Shabarchina, B.I. Sukhorukov, V.V. Kuvichkin VV., Structure and function of DNA--membrane contact in cells, Biofizika Mar-Apr; 25 (2) (1980) 270-5 (In Russian). 6. B.I. Sukhorukov, V.V. Kuvichkin, L.I. Shabarchina, Theoretical model of DNA-membrane contacts, Biofizika Sep-Oct; 28(5) (1983) 771-5. 7. V.V. Novikov, V.V. Kuvichkin VV ve E.E. Fesenko, Role of DNA-membrane interactions in prokaryote-to-eukaryote transition: an hypothesis, Cytobios, 96 (383) (1998) 151-6. 8. V.V.Kuvichkin, V.V. Novikov VV, F.K. Aliushev, S.M. Eremin, I.A. Markov ve Iu.A. Ten, DNA-membrane complexes, mitochondria and aging, Bioelectrochemistry, May 15; 56 (1-2) (2002) 189-93. 9. VV. Kuvichkin, Role of lipid membrane-nucleic acid interactions, DNA-membrane contacts and metal (II) cations in origination of initial cells and in evolution of prokaryotes to eukaryotes, Bioelectrochemistry, Nov; 58 (1) (2002) 41-6. 10. V.V. Kuvichkin, DNA-lipid interactions in vitro and in vivo, Bioelectrochemistry, Nov; 58(1) (2002) 3-12. 11. R.I. Zhdanov, V.V. Kuvichkin, A.S. Shmyrina, A.R. Jdanov ve V.A. Tverdislov, The role of lipid-nucleic acid interactions in the reconstruction in vitro of the nuclear shell with pores, Biofizika, Mar-Apr; 48 (2) (2003) 236-9. (In Russian). 12. A.J.M. Matzke ve M.A. Matzke, The electrical properties of the nuclear envelope and their possile role in the regulation of eukaryotic gene expression, Bioelecrtochem. Bioenerg., 25, (1991) 357-370.

Yaygın Etki/Katma Değer: Projemizin gerçekleştirilmesi sonucunda ülkemizde moleküler tıp ve gen tedavisi

konulu güncel ve özgün araştırmalarının hız kazanacağı ümidini taşıyoruz. Örneğin

23

EMBL ve EMBO gibi uluslararası bilim ve proje geliştirme teşkilatlarına da dahil edilmemiz doğrudan ülkemizden çıkacak olan patent ve buluş sayısına bağlı olduğundan, bu tür multidisipliner yaklaşımlar ve uluslararası işbirliği sayesinde patent çalışmaları da artacağı açıktır. Söz konusu projemizin başarılı bir şekilde tamamlanması durumunda, projenin devamı olarak “Lipozom-Mg2+-DNA Üçlü Bileşenlerinin in vitro Transfeksyon Etkinliklerinin İncelenmesi” ve “Kardiyovasküler Patolojilerde Hücresel Tedaviler ve Gen Aktarım Çalışmaları” adlı projeleri hazırlamak arzusundayız. Bu projeler kapsamında bu bileşiklerin in vitro transfeksyon etkinliklerini ortaya çıkarıp, daha sonra in vivo ortamda yaşayan deneysel hayvanlar düzeneklerinde patolojik olguların görüntülemesini sağlayan ve lipozomların in vivo akıbetini görüntüleyen KODAK in vivo Imaging sistemin Fakültemize getirilmesi amaçlanmaktadır. Her iki proje ile ilgili Avrupa’daki eski proje ortaklarımla temas halindeyim. Bu her iki konuda da Gazi Üniveitesi-B. A. P. birimi yetkililerine ayrıca bilgi verilecektir.

Bu proje esnasında elde edilen verilere dayanarak geliştirilecek olan modelleri projeye danışman olarak iştirak eden Prof. Dr. Ningur Noyanalpan tarfından derslere yansıtılacaktır. Ayrıca, projenin bir bölümünü kapsayan ve Fakültemizde hazır bulunan Silicon Graphics Workstation ile Rus ortaklarımızla müşterek olarak yapılacak moleküler dinamik hesaplamalar doğrudan yüksek lisans ve doktora öğrencilerimize aktarılacaktır. Söz konusu sistem ülkemizde ilk defa uygulanacağından, üniversite öğrenimine sağlayacağı katkılar büyük olacaktır

AB Çerçeve Programlarına katılmamızla ilgili çalışmalarım 2004 yılından itibaren devam etmektedir. Gereken tüm temaslar kurulmuş olup Avrupa’daki ortaklarımızdan cevap beklenilmektedir. Şu ana kadar sebep bildirilmeksizin Fakültemiz Yönetimi tarafından bu tekliflerime olumlu veya olumsuz herhangi bir cevap verilmemiştir. Bu proje önerimizin kabul edilmesi takdirde ve projemizi başarıyla tamamlayabildiğimiz takdirde bu durumun değişeceğini ümit ediyoruz. 2.2. Yöntem: Bu araştırmanın amacı gen taşıyıcıları olarak sıkça kullanılan DNA ve nötr fosfolipidlerin tek başına ve aralarında oluştırdukları bileşenlerde ilk tanınma olaylarından yola çıkarak bu moleküllerde meydana gelen yapısal değişiklikleri ortaya çıkarmak ve biyofarmasötik tasarım açısından yorumlamak. Bu verilerin daha önce bilimsel literatürde bildirilmiş nükleik asit ve fosfolipidlerin hidrasyonu ile ilgili elde edilen verilerle kıyaslamak önemlidir. Örneğin, bu neticeler daha sonra lipid’e dayalı gen taşıyıcı tasarımlarının biyofarmasötik gerekçelere dayanarak fizikokimyasal profillerini çıkarmak ve nükleotid dizilişine duyarlı olan veya olmayan tek ve çift zincirli nükleik asit kromatografisinde kullanılabilir. Esas Langmuir-Blodgett tek katmanla gerçekleştirilen yüzey basınç ölçümlerine geçilmeden önce ön incelemeler yapılacaktır. Bunun için uluslararası standartlara uyulacaktır. Bu yaklaşımlar uyarınca ilk önce bir formülasyonunun ön fizikokimyasal özellikleri iyi bir şekilde incelenmesi gerekmektedir. Bu doğrultuda, ilk önce DNA-fosfolipid bileşik oluşumunun ön yüzey kimyasal, kolloidal, fizikokimyasal ve biyofiziksel incelenmesi yapılıp tek katman ölçümlerine geçilecektir. Bu proje önerimizin deneysel tasarımı daha iyi anlaşılabilmes amacıyla, projemizin amaç ve kapsamına uygun olarak kullanılacak olan yöntemlerle ilgili kısa bilgiler aşağıda verilmiştir. Daha sonra projenin temelini teşkil eden lipozom ölçümleriyle ilgili ayrıntılı deneysel protokollere yer verilmiştir. İlk bölümde sadece

24

projemizde takip edilecek yaklaşımlarla ilgili yöntemlere yer verilmiştir. Bunun dışında diğer biyomembran yöntemleriyle ilgili ayrıntılı bilgi için ilgili moleküler hücre biyolojisi laboratuvar el kitaplarına başvurulmalıdır.

Biyomembran ve Yapay Membran Araştırmalarında Kullanılan Başlıca Yöntemler

Günümüzde, biyomembran ve yapay membran modellerin araştırmalarında birçok fizikokimyasal, moleküler biyolojik ve biyokimyasal yaklaşımlar uygulanmaktadır. Bunlardan fizikokimyasal yöntemler çeşitli spektroskopik, termodinamik, yüzey kimyasal ve kolloid kimyasal incelemelere dayanır ve bu ölçümlerden elde edilen verilerin matematiksel ifadesinden ibarettir. Bunlar hem biyomembran, hem model membranlarla gerçekleştirilmektedir. Moleküler biyolojik yöntemler genelde biyomembranların ve membran kanal proteinlerinin cDNA dizilişini ortaya çıkararak voltage-gated iyon kanal ölçümleri veya tek kanal üzerinden geçişi takip eden patch-clamp tekniği gibi yöntemlerin de yardımıyla membran gözeneklerinden gerçekleşen çeşitli iyon geçişlerini hücre kültürleri üzerinde göstererek ortaya koyan yaklaşımlara dayanır. Biyokimyasal yaklaşımlar da buna benzer şekilde membran yapısında yer alan ve araştırılması istenilen makromoleküllerin saflaştırılıp tekrar yapay membran modeline rekonstitüe edilmesine dayanır. Böyle bir in vitro rekonstitüsyon yöntemi biyolojik sistemin in vitro ortamlarda da çalıştırıldığı takdirde incelenen biyosistemin gerçek etki mekanizmasını ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birçok reseptör-ligand bağlanma kinetiğinin ortaya çıkarılması, söz konusu reseptörlerin biyolojik hücreden saflaştırılıp yapay membranlara rekonstitüe edilip ligand bağlanma afinitelerini takibine dayanır. Yapay membran sistemleri genelde üç gruba ayrılır. Bunlardan biyomembranlara ilk yaklaşım olarak lipid tek katman (Langmuir-Blodgett film) düzeneği geliştirilmiştir. Bu iki boyutlu model membran yaklaşımı birçok biyolojik ve farmakolojik etkisi olan moleküllerin model hücre üzerinden intraselüler penetrasyon mekanizmalarının incelenmesinde uygulanmaktadır. Diğer bir iki boyutlu model sistemi ise Black Lipid Membrane (BLM) sistemidir. Bu düzenekte dikey Pt veya teflon plâkaları arasında bulunan boşlukta çift katman oluşturulmaktadır. Bu yöntem tarihsel olarak büyük önem taşımıştır. Örneğin, ilk membran elektrofizyolojik olayları bu yaklaşımla ortaya çıkarılmıştır. Ancak, bu yöntem çok karmaşık mikroskopik incelemelerini de gerektirdiğinden, son derece deneyimli personelin çalışmasına bağlıdır. Üçüncü yaklaşım ise lipid veziküllerin (lipozomların) kullanımına dayanır. Bu veziküller bir üç boyut kazandırdığından, yine üç boyutlu olan doğal hücreye diğer iki model membran sisteminden çok daha iyi bir yaklaşım teşkil etmektedir. Biyomembran incelemelerine geçmeden önce, araştırılmakta olan makromoleküllerin ilk önce saflaştırılmış şekillerinin fizikokimyasal özelliklerinin takip edilmesi gerekmektedir. Bu da çeşitli fizikokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlarının önemini vurgulamaktadır. Bunlara önerilen projemizin amacına uygun olarak kısaca değinilmiştir.

BİYOFİZİKSEL YÖNTEMLER -Spektroskopik Yöntemler

Aşağıda adı geçen spektroskopik yöntemler biyomembran araştırmalarda membran bileşenlerinin yapı ve aktiviteleri ile ilgili bilgilerin elde edilmesinde çok önemli rol oynamıştır. Bu yöntemler hızlı ve invaziv veya destrüktiv değildir. Bu

25

bakımdan bunların tümü fizyolojik ortamlara yaklaşan ve bu sistemleri simüle eden koşullarda uygulanabilmektedir. Ayrıca, bunlarla membranlarda meydana gelen çok hızlı tepkimelerin ve konformasyon değişikliklerinin kinetiğini de incelemek mümkündür.

-Difference Spectroscopy Bazı durumlarda belli bir membran kromoforun ve çevresindeki moleküllerin

absorbsyon spektrumunda meydana gelen spektral değişikliklerinin söz konusu olduğunda kromoforun tek başına gösterdiği konformasyon değişikliğinden ziyade, tüm toplam spektrumdaki değişikliklerin ölçülmesi daha uygundur. Bu işlem çift-ışınlı spektrofotometre ile yapılmaktadır. Bu yöntemle meydana gelen tepkimelerin kinetiğinin ölçülmesi elektron taşıyıcılarının indirgenme-oksitlenme olaylarına bağlı olduğu gibi, NMR, ESR ve termodinamik yöntemlerinden farklı olarak moleküllerin konformasyonu hakkında çok kısıtlı bilgiler vermektedir. Ancak, bu yöntemi kullanarak makromolekül-ligand bağlanma afinitesi ve kinetiği hakkında çok önemli bilgiler edinebilinir.

-Fourier Transform Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi Bir titreşim spektroskopisi olan FTIR spektrometresi kompleks oluşumu

esnasında tepkimeye giren biyomakromoleküllerin sekonder yapıları hakkında çok önemli bilgiler vermektedir. Tepkimeye giren fonksiyonel gruplar hakkında çok önemli bilgiler de vermektedir. Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Electron Spin Resonance (ESR) veya Floresans Spektroskopisi vb. gibi yöntemlerin aksine çok fazla örneğe gereksinim duyulmadığı bu ölçüm yöntemi ayrıca da çok hacimli etiket moleküllerinin de katılmasını gerektirmemektedir ve saçılmadan (“scattering”)’ten kaynaklanan artefaktlar da burada engellenmektedir. Ayrıca, FTIR spektrometresi katı ve sıvı fazda bulunan örneklerle çalışma fırsatı da sunmaktadır.

-Raman Spektroskopisi Bir titreşim spektroskopik yaklaşımı olarak bu spektroskopik yöntem

moleküllerin iradyasyonunu takiben gözlenen moleküler titreşimlerin ölçülmesine dayanmaktadır. Bu yöntem, örneğin kolesterolün fosfolipid jel-sıvı kristal faz geçişi üzerindeki etkisinin araştırılmalarında uygulanmaktadır. Raman spektroskopisi ayrıca Fe-S taşıyan proteinlerde (örneğin transferinde) Fe-S karşılıklı etkileşmeleri veya hem proteinlerdeki porfirin-protein etkileşmeleri, veya çeşitli organik moleküllerinde (örneğin, karotenoidler, vitaminler, antibiyotikler, steroidler ve polisakkaridler) C-C titreşimleri ile ilgili çok önemli bilgiler vermiştir. Son yıllarda Raman spektroskopisi membranların yüzeysel özelliklerinin araştırmalarında da yoğun olarak kullanılmaktadır.

Yüzey Kimya Yöntemleri:

-Langmuir-Blodgett Monolayer Yöntemi

Monomoleküler katmanların (tek katmanların veya monolayer’ların) incelenmesi, membranda yer alan bileşenlerin hakkında çok önemli yapı-aktivite bilgilerini verdiği gibi, monolayer yüzeysel basıncı, incelenmekte olan molekülün lipid tek katmanda işgal ettiği moleküler alanı, bu moleküler alanın yüzeysel basınç üzerindeki etkisi hakkında da bilgiler vermektedir. Bu düzenek böylece molekülün biyomembran yüzeyinde ve hacminde nasıl paketlendiği konusunda da bilgiler vermektedir. Bu yaklaşım böylece,

26

yeni farmakolojik ajan-biyomembran etkileşmelerinin yeni modellerinin de geliştirilmesinde katkıda bulunmaktadır. Membran ortamında başka maddelerle karışım içinde bulunan bileşiklerin karışımdaki tek tek özelliklerini, stereokimyasını ve etkileşme enerjilerini, suda çözünen bileşiklerin lipidlere karşı gösterdikleri afinitelerini de ortaya çıkarmak mümkündür. Monolayer yöntemi çok katmanlı oriente edilmiş (oriented multilayers) sistemlerinin ve içeriği ve topolojisi önceden belirlenen membran sistemlerinin oluşumunun temelini oluşturmaktadır. Monolayer yöntemini ayrıca daha pratik amaçlarla, örneğin ortam saflılığının tayininde ve kontrolünde, ekolojik uygulamalarda ve son yıllarda kemosensör ve biyosensör teknolojisinde mikroçiplerin orientasyonu ve toplaşımı için mikroelektronik sanayide de kullanılmaktadır.

PROJEDE UYGULANACAK LİPOZOM HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ (Ayrıntılı Protokol)

Lipozomlar veya lipid veziküller üç boyutlu olmaları itibariyle doğal hücrelere benzeyen fosfolipidler gibi amfifilik moleküllerin kendi kendine oluşturdukları (self-assembling) yapılara sahip yuvarlak agregatlardır. Bu bakımdan doğal hücrelere iyi bir yaklaşımı teşkil ederler. Yüksek biyoyararlılıkları ve çeşitli molekül ve maddelerin vezikül hacmi içinde yüksek miktarda enkapsüle edilebilmeleri bakımından, lipid vezikülleri ayrıca mükemmel bir ilâç taşıma aracı olarak değerlendirilmişlerdir. Lipozomların çeşitli türleri (MLV, SUV, LUV, FRV) uygulanmakta olan birçok yöntemi kullanarak hazırlamak mümkündür. Projemizde çok popüler bir yöntem olan “hand-shaken vesicles preparation” yöntemi uygulanacaktır. Lipozomların herhangi bir formülasyonunu hazırlamak için lipid moleküllerini önce sıvı ortamına aktarmak gerekmektedir. Orijinal prosedüre uygun olarak, ince tabaka lipid filmi yuvarlak balon jojeye konulmak suretiyle bunların daha sonra sıvı ortamında çalkalanması ve çözülmesi sağlanmaktadır. 1. Vezikül Oluşturulması.

Lipozomlar (lipid vezikülleri) ince tabaka lipid filmlerinin veya diğer lipid yüzeylerinin hidrasyonu ile oluşturulacaktır. Bu yapılarda sıvı kristal şeklinde bulunan lipid katmanları akışkan hale getirilecektir. Hidrasyonu meydana gelmiş lipid katmanların agitasyon ve çalkalama esnasında bulundukları balon jojenin veya kabbın iç yüzeyinden ayrılırlar ve daha büyük yuvarlak çok katmanlı veziküller (Large Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur. Kenarlarda katmanın hidrokarbon kısmının su ile etkileşmeleri engellendiğinden, bu yapı termodinamik açıdan da bakılacak olursa çok sağlam ve sabittir. Parçacıkların oluşumundan sonra boyutlarının düşürülmesi sonik enerjinin (sonikasyon) veya mekanik enerjinin (ekstrüzyon) harcanmasını gerektirmektedir. Genel olarak, uygulamayı amaçladığımız prosedür hidrasyon için lipidin hazırlanması, eşzamanlı gerçekleştirilen hidrasyon, agitasyon ve çalkalama ve veziküllerin homojen dağlımının sağlanması için yapılan boyutlandırma aşamalarından ibaret olacaktır.

27

Lipidler ilk önce kloroformda çözülüp homojen lipid karışımının elde edilmesi için iyice karıştırılacaktır. Literatürde de yer aldığı üzere, lipid çözeltileri 10-20 mg lipid/ml kloroform konsantrasyonunda hazırlanır. Bu lipid miktarları da proje önerimizin bütçe gerekçeleri bölümüne yansıtılmıştır. Ancak, lipid çözünürlülüğü veya lipidlerin tam olarak karışımın elde edilmesi hedeflendiği takdirde, daha yüksek konsantrasyonlarla çalışmak avantajlı olacaktır. Bu şekilde çözülen fosfolipid süspansyonu azot gazı ile uzaklaştırarak ince lipid filmi elde edilecektir. Bu şekilde hazırlanan çok katmanlı lpozomları daha sonra birçok deneyde kullanıldığından, söz konusu işlem rotary evaporator ile gerçekleştirilecektir. Böylece balon jojenin dibinde ince lipid filmi veya tabakası oluşturulacaktır. Muhtemelen bu ortamda kalan organik çözgeni tamamen uzaklaştırmak amacıyla, bu film daha sonra bir gece boyunca vaküm pompa ile kurutulacaktır. Bu işlemden sonra lipid uygun tamponlarla hidrate edilip kaplara aktarılacaktır ve sıvı azot tankına konularak dondurulacaktır. Bu işlem birkaç defa tekrarlanarak lipozom-DNA karışımının “freze-thawing” işlemi uygulanacaktır. Bu işlem elde edilmesi istenilen lipid hacmine göre değişir. Bunun ardından, kurutulmuş lipid filmi bulunduran balon joje vaküm pompadan çıkarılır ve tekrar bir sonraki hidrasyon için dondurulmuş vaziyette muhafaza edilir. Kuru lipid filminin hidrasyonu basitçe sıvı ortamın veya tampon çözeltisinin lipidin bulunduğu balon jojeye katarak ve çalkalayarak gerçekleştirilecektir. Hidrasyon ortamı kullanılan lipidin genel jel-sıvı kristal faz geçiş ısısından (Tc veya Tm) daha yüksek ısı ortamlarında gerçekleştirilecektir. Bu işlemden sonra lipid süspansiyonu, bulunduğu kendi ortam ısısının söz konusu Tm ‘in üzerinde olacak şekilde muhafaza edilecektir. Yüksek faz geçişine sahip lipidler için bu işlemi balon joje içinde bulunan lipidleri rotary evaporator sistemine bağlayarak vaküm kullanılmaksızın gerçekleştirmek mümkündür. Daha sonra, bu balon jojeyi yine önceden lipid süspansyon ısısısnın üzerinde bulunan bir ısı ortamında ısıtılmış su banyosuna aktarılarak ve çalkalayarak lipidin hidrasyonunu gerçekleştirerek lipidlerin akışkan fazı elde edilecektir. Lipid türüne bağlı olarak hidrasyon için gereken zaman değişmekte, ancak bu işlemin çalkalama ve vorteksleme zamanları ile birlikte, genelde bir saati aşmamasına özen gösterilecektir. Bazı durumlarda, veziküllerin boyut dağılımı ve homojeniteleri iyileştirildiğinden, bundan sonraki aşama olan vezikül boyutlandırma işlemine geçmeden önce, lipid süspansyonu bu şekilde bir gece bekletilecektir. Hidrasyon ortamını genelde lipid veziküllerin uygulama amacı tayin eder. Uygun hidrasyon ortamı, distile su, tampon çözeltileri, tuzları, ve şeker çözeltileri gibi elektrolit olmayan bileşenleri içerir. Hidrasyon esnasında, bazı lipidler yapılarına özgü kompleksler oluştururlar. Hidrasyonun sonucunda, büyük çok katmanlı veziküller (Large Multilamellar Vesicles, LMV) oluşturulacaktır. Katmanlar arasında bulunan lipid yüzeyleri su katmanı ile çevrilidir. Sabit, hidrasyonu gerçekleştirilmiş çok katmanlı veziküllerin elde edilmesinden sonra, bu parçacıkların boyutları ekstrüzyön yöntemi kullanılarak düşürülecektir. Bu yöntemde lipid süspansyonu önceden bilinen ve tercih edilen gözenek büyüklüğüne sahip 2 polikarbonat filtre üzerinden 10 defa geçirilerek bu çapa yakın boyuttaki tek katmanlı veziküller elde edilecektir. Farklı gözenek boyutlara sahip polikarbonat filtreler mevcuttur. Böylece elde edilecek olan tek katmanlı veziküllerin (large unilamellar vesicles (LUV)) boyutlarını önceden kontrol etmek mümkündür. Bu yöntem sayesinde ortalama olarak söz konusu tek katmanlı veziküllerin boyut dağlımı son derece homojendir. Şimdiye kadar bahsedilen tüm diğer lipozom boyutunun düşürülmesinde kullanılan yöntemlerde olduğu gibi burada da bu işlem lipidin

28

faz geçiş ısı derecesinin üzerinde bir değerde çalışılması gerekmektedir. Bu işlem sonucunda, elde edilen lipozomların boyutu boyut analizi cihazıyla (particle sizer) teyit edilecektir. Bu şekilde her zaman deney öncesi taze olarak hazırlanan farklı boyuta sahip tek katmanlı veziküller daha sonraki fizikokimyasal incelemelerde kullanılacaktır.

Lipozom-DNA bileşiklerinin oluşturulması Bunun için her deneyden önce farklı oranlarda lipozom-Mg2+-DNA kompleksleri

oluşturulacaktır. Bu işlem güncel literatürde (Bk. örneğin:Birchall, J. C., Kellaway, I. W. Ve Mills, S. N., Physico-chemical characterization and transfection efficiency of lipid-based gene delivery complexes. Int. J. Pharmaceut., 183 (1999), 195-207) de açıklandığı üzere DNA çözeltisine (1 mg DNA/ml distile su) amaçlanan miktarlarda çeşitli sıvı lipozom süspansyonu aktarılacaktır. Bu şekilde elektrostatik güçlerce oluşturulan lipid-DNA kompleksleri pipetleme işlemi ile iyice karıştırılacaktır ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bırakılacaktır. Hemen bundan sonra bu kompleksler aşağıda adı geçen yöntemlerle incelenecektir. (Bu bölümün hazırlanmasında: Wang, G., Liposomes as Drug Delivery Vehicles, In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 411-434; Kobayashi, N., Nishikawa, M., and Takakura, Y., Gene Therapy and Gene Delivery, In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 305-318; Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), Drug Delivery: Principles and Applications, John Wiley & Sons, Inc., (2005)’dan yararlanılmıştır).

Projemizdeki Deneysel Tasarım İlk önce MLV ve ULV lipozom-DNA karışımları hazırlanacaktır [7]. Daha

sonraki deneylerde bol miktarda kullanılacağından bu çözeltiler yukarıda bahsedildiği üzere rotary evaporator ile hazıranıp diğer biyofiziksel ölçümlere geçilecektir. Söz konusu bileşik oluşumlarında yer alan fosfolipid, metal katiyon ve DNA, ayrı ayrı ve bileşik halindeki yapıları incelenecektir. Daha sonra, metal katiyonun rolünü incelemek üzere, reaksiyon ortamından metalleri uzaklaştıran EDTA ile bileşikler muamele edilip Mg2+ rolu ortaya çıkarılacaktır. Üçlü bileşiklerde nükleik asitin sekonder yapısı akkında şu ana kadar çok az bilgi bulunmaktadır. Bu bağlamda, bu bileşiklerde DNA tek veya çift sarmal şeklinde olup olmadığı, tek zincirli nükleik asitlere karşı aktiv olan S1 endonükleaz enzim aktiviteleri denenecektir. Böylece üçlü sistemde meydana gelen sekonder yapılsal değişiklikleri konusunda çok önemli bilgiler elde edilecektir. Sırasıyla yüzey kimyasal analiz (Langmuir-Blodgett tek katman, FTIR ve Raman spektrometrik ölçümler) ve UV/VIS spektroskopik ölçümler uygulanacaktır. Daha sonra, üçlü lipozom-Mg2+-DNA bileşiklerin termodinamik incelenmesi (DSC ve ITC) yapılacaktır. Rus ortaklarımızın Ankara’ya yapacaakları ziyaretleri esnasında müşterek olarak bu parçacıkların z-potansiyel ve boyut analizlerini [3-6] takiben, floresans mikroskopik ölçümlere geçilecektir. Lipidlerle tanınmalarından kaynaklanan DNA topolojisinde meydana gelen sekonder değişiklikler plazmid DNA kullanarak agaroz jel elktroforez incelemelerine geçilecektir. Tüm bu analizler tarafımdan Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesinde ve Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında gerçekleştirilecektir. Bu incelemelrin ayrıntılı protokolleri aşağıdadır. Söz konusu protokoller ilk defa lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerin incelenmesinde uyulanacaktır.

29

-Langmuir-Blodgett Tek Katmanın Oluşturulması. Langmuir-Blodgett cihazı NIMA Technology Ltd (The Science Park, Coventry CV4 7EZ, İngiltere; Model 112D) ürünüdür ve Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Daire Başkanlığınca desteklenen bir önceki projem çerçevesinde Fakültemize getirilmiştir. Bu cihazı üreten diğer firmalara nazaran NIMA Technology Ltd.’in piyasaya sürdüğü son derece popüler ve çok amaçlı modeller ve özellikle de bu firma temsilcilerinin tarafımıza yapmış olduğu çok düşük fiyat teklifleri bu firma ürününün alınmasında rol oynamıştır. Söz konusu cihazın teknik özellikleri. Bu cihaza diferansiyel taramalı mikrokalorimetre (DSC), Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektpmetresi ve Floresans Mikroskopi sistemlerinin de uygulanıyor olabilmesi son derece önemlidir ve çok yönlü ölçümlerin yapılmasını mümkün kılmaktadır. Söz konusu cihaz 40 cm2 esas alanı, 2 elektromekanik olarak hareket ettirilen bariyer, yüzey basınç sensörü, inverted mikroskopisi için sapphire pencere sistemi, dipper mekanizması ve bilgisayara bağlı software versyon 5.16 içermektedir.

Tek katmanların yüzeysel temizliliği kriteri olarak bariyer testi uygulayarak 3 ayrı tekrardan elde edilen izotermler arasındaki farkın ±0.1 mN/m’den daha fazla olmamasına dayanmaktadır.

-Yüzey basınç-alan (π-A) izotermleri. Tek katmanlar air-water (hava-su ara sınır) ara yüzeye kloroformu çözücü olarak

kullanarak uygulanacaktır. Fosfolipidler ve DNA stock çözeltileri ilk önce ekvimolar (1:1) 0.2 mM’ lık konsantrasyonlarda hazırlanmıştır. Daha sonra, bunlardan istenilen oranlarda karışımlar hazırlanmıştır. Her uygulamadan önce Hamilton şırıngası 3 kez kloroform ile temizlenecektir. Bunu takiben ara yüzeye birkaç damla DNA örneği uygulanacaktır. 10 dakika çözücü evaporasyonu için beklendikten sonra, yüzey basınç-alan (π-A) izotermleri elde edilecektir ve kaydedilecektir. Neticelerin tekrarlanabilirliği bakımından güvenilir olup olmadıkları en az 3 tekrar yaparak değerlendirilecektir.

-Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (Differential Scanning Calorimetry) ve İzotermal Titrasyon Kalorimetrik Ölçümleri.

Lipid vezikülleri ilk önce geleneksel ince tabaka film (thin-film) yöntemine göre hazırlanacaktır. Bunun için, lipid ve DNA stock çözeltileri kloroform ile hazırlanıp, bunlardan istenilen miktarlar balon jojelere aktarılacaktır. İyi bir karışım elde etmek için bunlar vortekslenip, gaz N2 ile evaporasyonları gerçekleştirilecektir. Böylece balon jojenin iç cam yüzeyine ince tabaka lipid film oluşturulacaktır. Bu film gece boyunca vakum desikatör ile muamele edilecektir ve böylece son kloroform kalıntı miktarları da uzaklaştırılmış olacaktır. 1ml saf su veya ilgili tampon (SSC, TRIS veya HEPES) ile balon jojeye aktarılıp 1 dakika boyunca vortekslenecektir. Balon joje daha sonra söz

30

konusu lipidin faz değişim ısı noktasından daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanan sonikatörde tutulup, 5-10 dakikalık bir süreyle sonikasyon uygulanacaktır. Daha sonra bu balon joje çalkalanan su banyosuna 37°C’de 1 saat boyunca bırakılacaktır ve böylece iyi bir DNA-lipid karışımı hazırlanmış olacaktır. DSC ölçümleri Perkin-Elmer Pyris Marka DSC cihazı ile Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında yapılacaktır. Referans olarak hermetik kapanabilinen boş alüminyum kaplar kullanılacaktır Lipid konsantrasyonu olarak 20 mg/ml kullanılacaktır ve bundan 10 µl lipozom süspansyonu hermetik alüminyum kaplara konulup ve kaplar böylece kapatılacaktır. Termogramlar gösterilen sıcaklık aralığında (20-100°C) elde edilecektir ve faz diagramları çizilecektir. Bu termal analizden sonra DNA-lpiozom bileşiklerinin oluşum kinetiği izotermal titrasyon kalorimetrik ölçümlerle incelenecektir.

Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektrometresi. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında yapılacaktır.

Bu ölçümlerde tüm spektrum çekimleri ve direkt ölçüm yöntemi uygulayarak gerçekleştirilecektir.

Tüm diğer ölçümler için yeni protokoller geliştirilecektir. Bu bakımdan projemizin özgün değeri artırılacaktır.

Yüzey kimyasal analizin bir diğer yaklaşımları olan AFM [2] ve Raman Saçılımı Yeditepe Üniversitesindeki diğer ortağımız Doç. Dr. Mustafa Çulha tarafından gerçekleştirilecektir. Aynı grup tarafından söz konusu bileşikler SEM ve Konfokal Floresans mikroskopileriyle incelenecektir [1]. Floresans mikroskopik yöntemler birkaç floresan boya kullanarak hem lipidleri hem DNA’yı görüntüleyerek farklı protokoller uygulanacaktır. Rus ortaklarımız da kendi protokollerini takip edecektir. Rus tarafı ayrıca Privalov tipi adiabatik DSC ce CD ölçümlerini gerçekleştirip üçlü bileşenlerin sekonder yapısal değişikliklerini ortaya çıkaracaktır. Bu sayede bunların yapılarıyla ilgili çok önemli bilgiler elde edilecektir. Proje önerimizin kabul edilmesi takdirde ayrılan bütçeden bir öğrenciye burs tahsis edilecektir. Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında veya Bilkent Üniversitesi Ulusal Nanoteknoloji Merkezinde (UNAM) yürütülecek olan ölçümlerle ilgili servis ödeneği ve hizmet alım bedellerine bütçe gerekçelerimizde yer verilmiştir. Projemizin bu ilk yılında yapılacak olan bu ön yüzey kimyasal, koloidal, fizikokimyasal ve biyofiziksel ölçümlerden sonra, çok daha ilginç olan işlevsel analizlere geçilecektir. Rus ortaklarımızın Ankara’ya yapacakları ziyaretlerinde floresans spektrometrik, lipozom füzyon takibe ve lipozom salınım deneyleri yapılacaktır. Böylece elde edilen üçlü bileşiklerin ortaya çıkarılacak olan yapılarından yola çıkarak etkili gen aktarım tasarımları ile ilgili çalışmalar başlatılabilecektir [8-10]. Projemizin ikinci yılında çok ilginç olan nükleik asit-fosfolipid bileşiklerin yaşayan hücre ve Xenopus ovosit ekstrat düzeneklerinde gerçekleştirilecek olan in vivo ortamdaki araştırmalarla devam edilecektir. Söz konusu yaklaşımda Rus ortaklarımızın deneyimleri bulunmaktadır. Böylece projemizin esas amacına ulaşılmış olunacaktır.

31

Bu Bölümle İlgili Referanslar: 1. A.J. Metso, H. Zhao, I. Tuunainen, P. K. J. Kinnunen, Observation of the main phase transition of dinervonoylphosphocholine giant liposomes by fluorescence microscopy, Biochim. Biophys. Acta 1713 (2005) 83-91. 2. B. Ruozi, G. Tosi, E. Leo, M. A. Vandelli, Application of atomic force microscopy to characterize liposomes as drug and gene carriers, Talanta 73 (2007) 12-22. 3. D.G. Fatouros ve S.G. Antimisiaris, Effect of amphiphilic drugs on the stability and z-potential of their liposome formulations: a study with prednisolone, diazepam, and griseofulvin, J. Colloid Interf. Scince 251 (2002) 271-277. 4. L. Ciani, S. Ristori, A. Salvati, L. Calamai, G. Martini, DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery: zeta potential measurements and electron spin resonance spectra, Biochim. Biophys. Acta 1664 (2004) 70-79. 5. K. K. Son, D. Tkach, D. H. Patel, Zeta potential of transfection complexes formed in serum-free medium can predict in vitro gene transfer efficiency of transfection reagent, Biochim. Biophys. Acta 1468 (2000) 11-14. 6. K. Takeuchi, M. Ishihara, C. Kawaura, M. Noji, T. Furuno, M. Nakanishi, Effect of zeta potential of cationic liposomes containing cationic cholesterol derivatives on gene transfection, FEBS Letters 397 (1996) 207-209. 7. M. Keller, Lipidic carriers of RNA/DNA oligonucleotides and polynucleotides: What a difference a formulation makes! J. Contr. Release 103 (2005) 537-540. 8. Y. Liu, H. Miyoshi ve M. Nakamura, Nanomedicines for gene delivery and imaging: a promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer 120 (2007) 2527-2537. 9. T. Imura, H. Yanagishita, T. Ikegami, H. Negishi, D. Kitamoto, Drastic improvements in trapping efficiency and dispersibility for phosphatidylcholine liposomes in the presence of divalent metal ions, J. Oleo Sci., 52, 12, (2003) 673-679. 10. A. Samad, Y. Sultana ve M. Aqil, Liposomal drug delivery systems: an updated review, Curr. Drug Deliv., 4 (2007). 2.3. Araştırıcıların Deneyimi:

FAKÜLTEMİZİ TEMSİL EDEN ARAŞTIRMACILARIN DENEYİMLERİ: PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN DİĞER PROJELERİ: Proje Yürütücüsünün TÜBİTAK Destekli Projeleri

Proje No Projedeki

Görevi Proje Adı

Başlama/Bitiş Tarihi

Destek Miktarı (YTL)

Proje No: 105S151 (SBAG-HD-42)

Proje Yürütücüsü

Gen Taşıyıcıları Olarak Tasarlanan Nükleik Asit-Fosfolipid Bileşenlerinin Fizikokimyasal Özelliklerinin FTIR Spektroskopisi ile Moleküler Düzeyde İncelenmesi

2005/2006 12 000 YTL

32

Proje Yürütücüsünün Diğer Projeleri (DPT, BAP, vb.)

Proje No Projedeki

Görevi Proje Adı

Başlama/Bitiş Tarihi

Destek Miktarı (YTL)

Proje No: 02/2005-15

Proje Yürütücüsü

Paclitaxel (TAXOL®’un) anti-kanser etki mekanizmasının model Langmuir –Blodgett biyomembran sistemi ile moleküler düzeyde incelenmesi

2005/2007 53.550 YTL

Proje Yürütücüsünün Son 5 Yılda Yapmış Olduğu Yayınlar

Yazar(lar) Makale Başlığı Dergi Cilt/Sayı/Say

fa Tarih

E. Süleymanoğlu

Circular dichroism and fluorescence spectroscopic study of RNA-protein folding patterns in human hnRNP A3 and their implications in human autoimmune diseases

Prog. Biochem. Biophys.

31 (3): 219-224

2004

E. Süleymanoğlu

Preparation and phase behaviour of surface-active pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential adiabatic scanning microcalorimetric study

Il Farmaco Aug; 60 (8): 701-710

2005

E. Süleymanoğlu

Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Energetics of DNA-Mg2+-Phosphatidylcholine Ternary Complex Formation and its Further Compaction as a Gene Delivery Formulation

PDA J. Pharmaceut. Sci.

Technol.

60 (4): 218-231

2006

E. Süleymanoğlu Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Developing an Immobilized Liposome Chromatography for DNA Separation and Analysis

PDA J. Pharmaceut. Sci.

Technol.

60 (4): 232-239

2006

33

Y. Manavbaşı ve E. Süleymanoğlu

Nucleic acid-phospholipid recognition: Fourier transform infrared spectrometric characterization of ternary phospholipid-inorganic cation-DNA complex and its relevance to chemicopharmaceutical design of nanometric liposome based gene delivery formulations

Arch Pharm Res. Aug; 30 (8): 1027-40

2007

Karl Skriner, Wolfgang Hueber, Erhan Süleymanoglu, Elisabeth Höfler, Veit Kren, Josef Smolen ve Günter Steiner

The Regulator of TNFα mRNA Decay AU-rich Element Binding Factor 1 is Targeted by Autoantibodies of Patients with Systemic Rheumatic Diseases

Arthritis Rheum. Feb; 58 (2): 511-520

2008

ÖZGEÇMİŞ

1. GENEL

DÜZENLEME TARİHİ : 18.04.2008

T.C. KİMLİK NO : 14785030626

ÜNVANI ADI SOYADI : Dr. Erhan Süleymanoğlu

YAZIŞMA ADRESİ : Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, Hipodrom, 06330-Ankara

DOĞUM TARİHİ ve YERİ : 22.03.1967, Sofya

TEL : 0-(312)-202-32-50 GSM: 05423527265

E-POSTA : esuleymanoglu@gazi.edu.tr FAKS : 0-(312)-223-50-18 2. EĞİTİM (Son aldığınız dereceden / diplomadan başlayarak yazınız)

ÖĞRENİM DÖNEMİ DERECE (*) ÜNİVERSİTE ÖĞRENİM ALANI

1996-1999 Ph. D. (Doktora)

Viyana Üniversitesi İmmünokimya ve Moleküler Genetik

1993-1995 M. Sc. (Yüksek Lisans)

Orta Doğu Teknik Üniversitesi

Biyokimya

1990-1992

B. Sc. (Lisans)

Orta Doğu Teknik Üniversitesi

Biyolojik Bilimler

34

1984-1989 B. Sc. (Lisans) Sofya Üniversitesi-Biyoteknoloji Enstitüsü

Biyoteknoloji (Moleküler Klonlama)

(*) Diploma Türü (Lisans, Y.Lisans, vb.) 3. AKADEMİK ve MESLEKİ DENEYİM

GÖREV DÖNEMİ ÜNVAN ÜNİVERSİTE BÖLÜM

1999-2000 Post-doc Amsterdam Üniversitesi Hücre Moleküler Biyolojisi

2000-2001 Konuk araştırmacı

Amsterdam Hür Üniversitesi

Moleküler Hücre Fizyolojisi ve Matematiksel Biyokimya

1992-1994 Ar. Gör. Gazi Üniversitesi-Tıp Fakültesi

Biyofizik Anabilim Dalı

4. YAYIN BİLGİLERİ ISI indexine kayıtlı dergilerde yayınlanan 16

Diğer indexlere kayıtlı / Hakemli dergilerde yayınlanan

2

Indexlere kayıtlı / Hakemli konferans kitaplarında yayınlanan

48

Diğer yayınlar 1 kitap

TOPLAM 67

5. YAYINLARINIZA ALDIĞINIZ TOPLAM ATIF SAYISI (Web of Science‘a göre) : 21 6. PROJE DENEYİMİ

YER ALDIĞINIZ PROJE SAYISI

Proje yürütücüsü olarak Araştırmacı olarak

Kurumsal (BAP vb.) 1 -

Ulusal 1 (TÜBİTAK) -

Uluslararası - 3

7. DİĞER AKADEMİK FAALİYETLER ( Hakemlik/Danışmanlık/Editörlük Deneyimi) Son bir yılda uluslararası indekslere kayıtlı makale/ derleme için yaptığınız danışmanlık sayısı

6

Son bir yılda projeler için yaptığınız danışmanlık sayısı

-

Danışmanlığını yaptığınız öğrenci sayısı Tamamlanan Devam Eden

35

Y.Lisans

Doktora

Uzmanlık

Editör/Yardımcı Editör olduğunuz dergiler

1- Electronic Journal of Biomedicine (http://biomed.uninet.edu)-Editorial Board 2- International Journal of Biomedical Sciences (www.ijbs.org)-Editorial Board. 3-

8. SEÇİLMİŞ YAYINLAR (Proje konusuyla ilgili en önemli 5 yayınınız)

YAZAR(LAR) MAKALE/BİLDİRİ BAŞLIĞI

DERGİ/TOPLANTI ADI

CİLT/SAYI/SAYFA

TARİH

Erhan Süleymanoğlu

Preparation and phase behaviour of surface-active pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential adiabatic scanning microcalorimetric study

Il Farmaco Aug; 60 (8): 701-710.

2005

Erhan Süleymanoğlu

Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Energetics of DNA-Mg2+-Phosphatidylcholine Ternary Complex Formation and its Further Compaction as a Gene Delivery Formulation

PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol.

60 (4): 218-231. 2006

Erhan Süleymanoğlu

Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Developing an Immobilized Liposome Chromatography for DNA Separation and Analysis

PDA J. Pharmaceut.

Sci. Technol.

60 (4): 232-239. 2006

Yasemin Manavbaşı ve Erhan Süleymanoğlu

Nucleic acid-phospholipid recognition: Fourier transform infrared spectrometric characterization of ternary phospholipid-inorganic cation-DNA

Arch Pharm Res., Aug; 30 (8): 1027-40.

2007

36

complex and its relevance to chemicopharmaceutical design of nanometric liposome based gene delivery formulations

Erhan Süleymanoğlu

Adiabatic Differential Scanning Calorimetric Study of Divalent Cation Induced DNA - DPPC Liposome Formulation Compacted for Gene Delivery

Braz. Arch. Biol. Technol.

47 (6): 881-885. 2004

YAYINLAR DIŞINDA PROJE KONUSU İLE İLGİLİ EN ÖNEMLİ 5 FAALİYET

(Eser/görev/faaliyet/sorumluluk/olay/üyelik vb.)

1. 1998 yılında Bratislava Üniversitesinde (Slovakya) DNA-lipozom kompleks oluşumu ile ilgili Differential Scanning Calorimetry ölçümleri öğrenilmiştir.

2. 1998 yılında konuk araştırmacı olarak bulunduğum Bergen Üniversitesinde (Norveç) Langmuir-Blodgett yöntemi öğrenilmiştir

3.1998 yılında konuk araştırmacı olarak bulunduğum Paris Üniversitesi-Curie Enstitüsünde Circular Dichroism ve Floresans Spektroskopisi yöntemleri öğrenilmiştir.

4.1999-2000 yılları arasında post-doc olarak çalıştığım Amsterdam Üniversitesinde (Hollanda) floresans mikroskopisi öğrenilmiştir

5.2000-2001 yılları arasında konuk araştırmacı olarak bulunduğum Amsterdam Hür Üniversitesinde (Hollanda) chloroquine jel elektroforez yöntemi öğrenilmiştir

PROJE KONUSUNDA YETKİNLİĞİMİZİ VURGULAMAK İÇİN GEREKLİ GÖRÜLEN DİĞER BİLGİLER

1. Önerilen proje konusu ile ilgili çalışmalarım 1993 yılında başlamıştır ve Orta Doğu Teknik

Üniversitesinde yapmış olduğum “Effect of Metal Ions on Interaction Between Nucleic Acid, Protein (Melittin) and Drug (Tamoxifen) with Model Membranes” adlı yüksek lisans tezimin büyük bir bölümünü kapsamaktadır. Söz konusu dönemde, bu konuda Türkiye’de yapılan ilk çalışmaydı. O yıllarda henüz daha lipofeksiyon konusu daha yeni önem kazanmaya başlamıştı ve nükleik asitler ile biyomembranlar arasında oluşan yapılar daha çok hücre biyolojisi ve moleküler evrim olayları için önem taşıyan bir konu olarak algılanmaktaydı. Daha sonraki yıllarda moleküler hücre mühendisliğinin yeni bir yaklaşımı olarak yabancı genlerin hedef hücrelere nakli konusu yoğun olarak ilgi çekmiştir ve hem β-galaktozidaz veya Green Fluorescence Protein (GFP) gibi gen ekspresyonunu gösteren çeşitli raportör sistemler hem de birçok yeni plazmid türleri tasarlanmıştır. Viyana Üniversitesinde doktora çalışmalarımda ilk önce söz konusu vektör tasarımını, in vitro transfeksyonu ve bunun incelenmesinde kullanılan floresans mikroskopisini uyguladım,

37

daha sonra da post-doc olarak çalıştığım Amsterdam Üniversitesinde yine floresans mikroskopisini kullanarak çeşitli canlı hücreler üzerinde farklı nükleik asit-hücre membran oluşumları (life cell microscopy) üzerine çalışmalar yaptım. Nükleik asit-fosfolipid oluşumlarını incelemek üzere Bratislava Üniversitesinde çeşitli termodinamik ölçümler uyguladım, daha sonra da Bergen Üniversitesinde bu tür oluşumları Langmuir-Blodgett tek katman sistemi ile inceledim. Türkiye’ye kesin dönüş yaptığım 2004 yılından itibaren bu konudaki çalışmalarım yoğun olarak devam etmektedir. 2006 yılında TÜBİTAK desteği ile (Proje No: 105S151 (SBAG-HD-42)) “Gen Taşıyıcıları Olarak Tasarlanan Nükleik Asit-Fosfolipid Bileşenlerinin Fizikokimyasal Özelliklerinin FTIR Spektroskopisi ile Moleküler Düzeyde İncelenmesi” adlı bir ön araştırma projesini tamamladım. Bu projede elde edilen neticelere dayanarak çok daha kapsamlı ve özgün yaklaşımları içeren yeni bir proje sunmaktayız. Bu projede uluslararası işbirliğin önemi özellikle vurgulanmıştır ve bu konuda çok başarılı çalışmaları olan bir Rus araştırma grubu ile müşterek olarak hazırlanmıştır. Bu konuyu ülkemizde popülarize etmek ve özellikle hızla gelişen nanobiyoteknolojideki yeni uygulama alanlarına girebilmek ve böylece Fakültemizde de iddialı uluslararası projeleri gerçekleştirebilmek arzusundayım. Çok prestijli Rus Bilimler Akademisinden bir grubun tarafıma böyle bir ortak çalışma teklifi sunmuş olması da bizim için büyük bir onur kaynağı olduğu gibi bu alanda araştırma grubu olarak gelişmemiz için de büyük bir fırsattır.

ÖZGEÇMİŞ

5. GENEL

DÜZENLEME TARİHİ :28.04.2008

T.C. KİMLİK NO : 14458042840

ÜNVANI ADI SOYADI : Prof. Dr. Ningur Noyanalpan YAZIŞMA ADRESİ : Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Eczacılık Meslek Bilimleri, Hipodrom, 06330-Ankara

DOĞUM TARİHİ ve YERİ : 11.02.1944, İstanbul

38

TEL : 2154467 GSM: 05323647358

E-POSTA : ningur@gazi.edu.tr FAKS :2235018 6. EĞİTİM (Son aldığınız dereceden / diplomadan başlayarak yazınız)

ÖĞRENİM DÖNEMİ DERECE (*) ÜNİVERSİTE ÖĞRENİM ALANI

1966-1969 Doktora Ankara Üniversitesi Farmasötik Kimya

1961-1966 Lisans Ankara Üniversitesi Farmasötik Kimya (*) Diploma Türü (Lisans, Y.Lisans, vb.) 7. AKADEMİK ve MESLEKİ DENEYİM

GÖREV DÖNEMİ ÜNVAN ÜNİVERSİTE BÖLÜM

1982-1994 Dekan Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

Farmasötik Kimya

1973 Doç. Ankara Üniversitesi Farmasötik Kimya

1979 Prof. Ankara Üniversitesi Farmasötik Kimya 8. YAYIN BİLGİLERİ ISI indexine kayıtlı dergilerde yayınlanan 5

Diğer indexlere kayıtlı / Hakemli dergilerde yayınlanan

-

Indexlere kayıtlı / Hakemli konferans kitaplarında yayınlanan

-

Diğer yayınlar -

TOPLAM 5

5. YAYINLARINIZA ALDIĞINIZ TOPLAM ATIF SAYISI (Web of Science‘a göre) : - 6. PROJE DENEYİMİ

YER ALDIĞINIZ PROJE SAYISI

Proje yürütücüsü olarak Araştırmacı olarak

Kurumsal (BAP vb.) - -

Ulusal 2 2

Uluslararası - -

39

7. DİĞER AKADEMİK FAALİYETLER ( Hakemlik/Danışmanlık/Editörlük Deneyimi) Son bir yılda uluslararası indekslere kayıtlı makale/ derleme için yaptığınız danışmanlık sayısı

-

Son bir yılda projeler için yaptığınız danışmanlık sayısı

4

Tamamlanan Devam Eden

Y.Lisans 8 2

Doktora 1

Danışmanlığını yaptığınız öğrenci sayısı

Uzmanlık - -

Editör/Yardımcı Editör olduğunuz dergiler

1- 2- 3-

8. SEÇİLMİŞ YAYINLAR (Proje konusuyla ilgili en önemli 5 yayınınız)

YAZAR(LAR) MAKALE/BİLDİRİ BAŞLIĞI

DERGİ/TOPLANTI ADI

CİLT/SAYI/SAYFA

TARİH

Gökçe M, Ozçelik B, Bakir G, Karaoğlu T, Bergçin E, Noyanalpan N.

Antiviral and antimicrobial activities of new nitrobutane derivatives.

Arzneimittelforschung.

54(12):891-7 2004

Unlü S, Onkol T, Dündar Y, Okçelik B, Küpeli E, Yeşilada E, Noyanalpan N, Sahin MF.

Synthesis and analgesic and anti-inflammatory activity of some new (6-acyl-2-benzoxazolinone and 6-acyl-2-benzothiazolinone derivatives with acetic acid and propanoic acid residues.

Arch Pharm (Weinheim)

Aug;336(8):353-61.

2003

Ersan S, Nacak S, Noyanalpan N, Yeşilada E.

Studies on analgesic and anti-inflammatory activities of 1-dialkylaminomethyl-2-(p-substituted phenyl)-5-substituted benzimidazole derivatives.

Arzneimittelforschung

Jul;47(7):834-6. 1997

40

Kupchan SM, Britton RW, Chiang CK, Noyanalpan N, Ziegler MF.

Tumor inhibitors. 88. The antileukemia principles of Colchicum speciosum

Lloydia Sep;36(3):338-40 1973

9. YAYINLAR DIŞINDA PROJE KONUSU İLE İLGİLİ EN ÖNEMLİ 5 FAALİYET (Eser/görev/faaliyet/sorumluluk/olay/üyelik vb.)

1. Silicon Graphics Workstation ile çalışan Amber programının getirilmesi

2.

3.

4.

5.

10. PROJE KONUSUNDA YETKİNLİĞİNİZİ VURGULAMAK İÇİN GEREKLİ GÖRDÜĞÜNÜZ DİĞER BİLGİLER

Silicon Graphics Workstation konusunda deneyim ve tecrübeye sahiptir.

2.4. Araştırma Olanakları:

Önerdiğimiz projede, Türkiye’de ve Rusya Federasyonu’nda mevcut olan laboratuvar ve araştırma olanaklarının azami derecede kullanılmasına özen gösterilmiştir ve bu hususları göz önünde bulundurarak proje bütçesi son derece dikkatlice hazırlanmıştır. Bu konu ile ilgili projeye katılacak olan tüm arkadaşlarımızla mutabakat

41

sağlanmıştır. Projemiz sırasıyla ön fizikokimyasal, yüzey ve kolloid kimyasal, yapı-aktivite ve işlevsel ölçümleri ve incelemeleri kapsamaktadır. Söz konusu fizikokimyasal ölçümler, Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) hazır ve çalışır vaziyette bulunan z-potansiyel, sıcaklık kontrol sistemi ile donatılmış UV/VIS spektrofotometrik ve türbidimetrik, Fourier Transform Infrared Spektroskopik (FTIR), termodinamik (Diferansiyel Taramalı Kalorimterik (DSC) ve Izotermal Titrasyon Kalorimetrik (ITC)) cihazları ile gerçekleştirilecektir. Bu ölçümlerin kusursuz bir şekilde yerine getirilmesinde tüm sorumluluk tarafıma aittir. Yüzey kimyasal ve kolloid kimyasal incelemeler (yüzey potansiyel ve yüzey gerilim ölçümleri), 2005 yılında Gazi Üniveritesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri (BAP) Daire Başkanlığınca desteklenen (No: 02/2005-15) “Paclitaxel (TAXOL’un) anti-kanser etki mekanizmasının model Langmuir –Blodgett biyomembran sistemi ile moleküler düzeyde incelenmesi” adlı projem ile Fakültemize kazandırmış olduğum Langmuir-Blodgett cihazıyla yapılacaktır. İncelemeyi hedeflediğimiz fosfolipid-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerin yüzey kimyasal karakterizasyonlarının bir başka yaklaşımı olan Atomik Kuvvet Mikroskopisik (Atomic Force Microscopy (AFM)) ölçümler Dr. Yurii Nechipurenkonun laboratuarında yapılacatır. Hazırlanacak olan çok katmanlı ve tek katmanlı lipozomların boyut analizi öncellikle z-potansiyel ölçümlerle yapılması öngörülmüştür. Bu ölçümleri daha sonra elektron mikroskopisi ile (Scanning electron microscopy (SEM) ve transmission elektron microscopy (TEM)) ile teyit edilecektir. SEM ölçümleri Dr. V. Kuvichkin’in grubu gerçekleştirecektir. TEM incelemelerini de bu Rus araştırma grubu yapacaktır. Söz konusu üçlü bileşiklerin yapı-aktivite ilişkisini Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi laboratuarında benim bizzat katılacağım çalışmalarla ortaya çıkarılacaktır. Bu bağlamda, çift sarmallı plazmidlerin fosfolipidlerce meydana getirilen topolojik değişiklikleri yine tarafımdan agaroz jel elektroforez ile incelenecektir. Bu ölçümlere destek olarak konfokal mikroskopik analiz Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi laboratuarında yapılacaktır. Mg2+ varlığında nükleik asitlerce meydana getirilen muhtemel fosfolipid vezikül füzyon olaylarını floresans spektroskopisi ile bu konuda çok büyük tecrübesi olan Rus araştırma grubu tarafından incelenecektir. Söz konusu ölçümler, Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi laboratuarında da Rus ortaklarımızın Ankara’ya ziyaretleri sırasında da yapılacaktır ve böylece şu anda kullanamadığımız bu yöntem Türkiye’de uygulamaya konulacaktır. Rus araştırma grubunun X-Ray kristalografisi ile elde edeceği atomik koordinatlarla Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Kimya Anabilim Dalında bulunan Silicon Graphics Workstation ile Amber programında moleküler dinamik hesaplamalar yapılacaktır ve bulara dayanarak henüz daha yayımlanmamış fosfolipid-metal katiyon-DNA üçlü bileşiklerle ilgili yeni ve özgün modeller geliştirilecektir. Fakültemizde yapılacak olan projemizin bu kısmını bu sistemi getirmiş olan Prof. Dr. Ningur Noyanalpan ve bu konuda Wisconsin Üniversitesinde büyük deneyim kazanmış olan Dr. adayı Cenk Andan tarafından yapılacaktır. Türkiye’de bulunmayan techizata dayalı ölçümler Rus araştırma grubu kendi enstitülerinde gerçekleştirecektir. Bu bağlamda, sirküler dikroism (CD), bazı özel ve tecrübe gerektiren konfokal floresans mikroskopik görüntülerinin elde edilmesi ve Privalov tipi adiabatik diferansiyel taramalı kalorimetrik (DSC) ölçümler Rusya Federasyonda yapılacaktır. Projenin ikinci yılında, fosfolipid-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerin işlevsel analizleri yapılacaktır. Bununla ilgili olarak Türk grubu biyoteknolojik boyutunu daha ayrıntılı

42

incelemek amacıyla in vitro transfeksiyon etkinlikleri ile ilgili yeni bir protokol Aksaray Üniversitesinde çalışan Yrd. Doç. Dr. Kamile Öztürk tarafından hazırlanacaktır ve uygulanacaktır. Lipidlerle ilk tanınma olaylarından sonra DNA’da meydana gelen konformasyonel değişikliklerle ilgili ölçümler Kazan Devlet Üniversitesinde Prof. Dr. G. Evtugyn tarafından, bunlarla ilgili teorik modeller ise Dr. Al. Krylov tarafından yapılacaktır ve geliştirilecektir. Dr. Y. Nechipurenko ayrıca elde edilen neticelere dayanarak kendi ihtisas alanı olan nanobiyosensör tasarımlarını başlatacaktır. Rus ortaklarımız ise çok daha karmaşık olan ve bu konuda bizim tecrübemiz bulunmayan bu bileşiklerin hücresel biyolojik boyutlarıyla ilgili olarak söz konusu nükleik asit-fosfolipid etkileşmelerinin meydana gelip gelmediğini Xenopus ovosit ekstratları ile yapılacak olan deneylerle ortaya çıkaracaklardır. Böylece, bu projemizle metal katiyonlarca meydana getirilen nükleik asit-fosfolipid bileşikleri hem biyofiziksel, hem biyo- ve nanoteknolojik olarak, hem de işlevsel anlamı büyük olan hücresel biyolojik bakımından incelenmiş olacaktır.

Projede Kullanılacak Mevcut Makine – Teçhizat Listesi (*)

Adı/Modeli Projede Kullanım Amacı

Langmuir-Blodgett tek katman cihazı, NIMA Technology Ltd. marka, 112 D model (Teknik

özellikler için bk.: http://www.nima.co.uk).

Fakültemize bir önceki Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Daire Başkanlığınca desteklenen projem çerçevesinde edindiğimiz bu cihaz, lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin yüzey kimyasal analizlerinde ve özellikle fosfolipid yüzeyine DNA’nın adsorbsyonu ile ilgili araştırılmalarımızda kullanılacaktır. Bu ölçümler Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesinde gerçekleştirilecektir.

UV/VIS Spektrofotometre Cary 100 marka (Teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/bio/trk/anasayfa/cihazlar/c_07.php)

Tek katmanlı ve çok katmanlı lipozomlarca oluşturulan lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin yüksek moleküler ağırlıklı bileşik hale gelmeleri ve oluşum kinetiklerinin incelenmesinde kullanılacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır. Söz konusu ölçümler, daha önceki türbidimetrik ölçüm yaklaşımımızın devamı niteliğindedir (Bk.: Severcan, F., Süleymanoğlu, E., Boyar, H. Turbidity studies of the effect of divalent cations on Tamoxifen - model membrane interactions. Biochem. Soc. Trans., 25 (3): 493S, (1997)).

Termogravimetrik Analiz ve FTIR Spektrometre Sistemi (TGA+FTIR) Perkin Elmer Pyris 1 TGA & Spectrum 1 FT-IR Spectrometer (http://www.centrallab.metu.edu.tr/rd/trk/anasayfa/cihazlar/ta/taft.php)

Bruker IFS 66/S (Teknik özellikler için bk.:

Mg2+ varlığında çeşitli lipid türleri ile DNA arasında oluşan bileşiklerde ilk tanınma olaylarını ve bu oluşumda rol oynayan fonksiyonel gruplarının ortaya çıkarılması. Bu ölçümler, daha önceki yaklaşımımızın devamı niteliğindedir (Bk.: Manavbaşı Y. and Süleymanoğlu E., Nucleic acid-phospholipid recognition: Fourier transform infrared spectrometric characterization of ternary phospholipid-inorganic cation-DNA complex and its relevance to chemicopharmaceutical design of nanometric liposome based gene delivery formulations. Arch Pharm Res., Aug; 30 (8): 1027-40, (2007)). Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi

43

http://www.centrallab.metu.edu.tr/rd/trk/anasayfa/cihazlar/s/ftir.php)

Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır.

Dinamik Işık Saçılım Spektrometresi (DLS) Cihaz: Malvern CGS-3

(Teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/rd/trk/anasayfa/cihazlar/pik/dis.php)

Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin boyut analizinde kullanılacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır.

Zeta Potansiyel ve Mobilite Ölçüm Cihazı MALVERN Nano ZS90 (Teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/rd/trk/anasayfa/cihazlar/pik/zpm.php)

Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin elektrostatik davranışları ve boyut analizinde kullanılacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır. Bu ölçümler ortaklarımızla müşterek olarak yapılacaktır ve Rus ortağımızın tecrübelerinden faydalanacaktır.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Perkin Elmer Diamond DSC (Teknik özellikleri için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/rd/trk/anasayfa/cihazlar/ta/dtk.php)

Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin bileşik hale gelmelerinin termodinamik ölçümlerinde. Söz konusu ölçümler, daha önceki biyofiziksel yaklaşımımızın devamı niteliğindedir (Bk.: Süleymanoğlu E. Preparation and phase behaviour of surface-active pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential adiabatic scanning microcalorimetric study. Il Farmaco, Aug; 60 (8): 701-710, (2005)).

Mikroizotermal Titrasyon Kalorimetre, VP-ITC MicroCal (Teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/bio/trk/anasayfa/cihazlar/c_12.php)

Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin bileşik hale gelmelerinin kinetik ölçümlerinde kullanılacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır.

Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop Zeiss LSM 510 (Teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/bio/trk/anasayfa/cihazlar/c_04.php)

Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin yapısında yer alan lipidlere, çift zincirli ve tek zincirli DNA’ya özgü floresans boyalar kullanarak, bu makromoleküllerinin ve özellikle DNA kompaktizasyon dinamiğinin ölçülmesinde kullanılacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır. Söz konusu ölçümler daha önce Amsterdam Üniversitesinde postdoc yıllarımda nükleik asit-biyomembran etkileşmeleriyle ilgili yaşayan hücre düzeneklerinde geliştirdiğimiz floresans mikroskopik yaklaşımımızın devamı niteliğindedir (Bk.: Cunha, S., Odijk, T., Süleymanoğlu, E., Woldringh, C.L. Isolation of Escherichia coli nucleoid. Biochimie, Feb., 83 (2): 149-154, (2001). Bk. ayrıca: Süleymanoğlu, E. Electrorelease of Escherichia coli nucleoids. Folia Microbiol. 47 (4): 365-370, (2002) ve Süleymanoğlu, E. Fluorescence

44

microscopy of condensed DNA conformations of bacterial cells. J. Microbiol. 40 (4): 319-326, (2002)).

Zaman Tanımlı Floresans Spektrometre, Photon Technology International Model C-71 (Yeni isim: Model TM-2/2005 Lifetime Spektroflorometre); (teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/bio/trk/anasayfa/cihazlar/c_13.php)

Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerinin oluşumunda ortaya çıkan lipid fuzyonlarının incelenmesinde kullanılacaktır. Bu ölçümler ortaklarımızla müşterek olarak yapılacaktır ve Rus ortağımızın tecrübelerinden faydalanacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır.

Yatay Elektroforezler, Amersham Biosciences; (Teknik özellikler için bk.: http://www.centrallab.metu.edu.tr/bio/trk/anasayfa/cihazlar/c_17.php)

Plazmid DNA’nın lipozomlarca indüklenen çeşitli topolojilerinin incelenmesinde kullanılacaktır. Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvarında (www.centrallab.metu.edu.tr) yapılacaktır ve proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır.

(*)Bu bölümde sadece, öneren kuruluşta var olup projede kullanılacak olan makine-teçhizat belirtilmeli, proje bütçesinden talep edilenler yazılmamalıdır. 2.5. Satın Alınması Talep Edilen Makine ve Teçhizatın: Talep ilmemiştir 3. Diğer Bilgiler 3.1.

Nükleik asit-fosfolipid etkileşmeleri ile ilgili bilimsel çalışmalar öncellikli olarak moleküler hücre biyolojisinde önem taşıyan bazı olayları açıklamak amacıyla başlatılmıştır [1-5]. Bu konudaki ilgi söz konusu hücresel olaylarda nükleik asitlerin membranlara bağlandıklarına dair deneysel gözlemlere dayanmaktadır. Örneğin, virüs-hücre etkileşmelerinde ortaya çıkan viral nükleik asitlerle hücre membran arasında oluşan çeşitli agregatlar ve viral membranla hücre membranı arasında füzyon olaylarında; bakteri segregasyonunda meydana gelen nükleoid bölünmesi; plazmid replikasyonunda; eukaryotik hücre döngüsünün çeşitli evrelerinde kromatid kondanzasyonunda; gen ifadesinde ve genom organizasyonunda, eukaryotik transkripsyon-translasyon-translokasyon ve rekombinasyon olaylarında bu tür yüksek moleküler ağırlıklı nükleik asit-membran bileşiklerinin oluştuğu ortaya çıkarılmıştır [1-5].

Son 20 yıl bu konu ile ilgili araştırmalar hızla devam etmektedir. Günümüzde de gelişen moleküler tekniklerden de faydalanarak nükleik asit-fosfolipid etkileşmeleri ile ilgili çalışmalar yoğun olarak devam etmektedir. Bu konuya proje önerimizde de konunun önemini vurgulamak amacıyla ayrı bir yer verilmiştir. Projemizin 2ci yılının büyük bir bölümü Rus ortaklarımızın yapacağı çalışmalar tamamen yaşayan hücre ve Xenopus ovosit düzeneklerinde özellikle nükleik asit-hücre çekirdeği membranı arasında oluşan bu tür bileşiklerin araştırılmasına ayrılmıştır.

Nükleik asit-hücre zarı etkileşmelerinin çok fazla ilgi çektiği bu tür moleküler biyolojik yaklaşımlar dışında, bu konuya ilgi söz konusu etkileşmelerin lipidlerle

45

gerçekleştirilen in vitro transfeksyon (lipofeksyon) ve yeni geliştirilen gen aktarımı yöntemlerinde önem kazanmasından sonra özellikle artmıştır [6]. Birçok araştırma merkezi bu tür etkileşmelerinin temelini oluşturan nükleik asit-fosfolipid bileşiklerdeki yapısal değişikliklerin daha sonra gen aktarımı esnasında transfeksyon etkinliğini nasıl etkilediği konusunun araştırılmalarına yönelmişlerir [7]. Bu araştırmalara büyük kaynaklar tahsis edilmektedir [8-12]. Bu konu ile ilgili yapılan araştırmalarda multidisipliner bir yaklaşımın takip edildiği güncel bir literatür taraması ile gösterilebilmektedir [8-20].

İnsan gen tedavisi çeşitli kalıtsal, bağışıklık, otoimmün ve kanser tedavilerinde şimdiye kadar yoğun olarak kullanılan geleneksel yöntemlere ve immünomodülasyon içeren yaklaşımlara bir alternativ olarak geliştirilmiştir [7,13]. Özellikle kanser tedavilerinde kullanılan ancak çok sayıda istenmeyen yan etkiye sahip olan çeşitli kemoterapilere bir alternativ olarak gelecek vaadeden bir yaklaşım olarak dikkati çekmektedir. Bu bağlamda, terapötik gen dizilişlerini degrade etmeden serum ortamında sabit tutan ve hedef hücreye kadar götüren yeni gen taşıyıcı formülasyonlarının geliştirilmesi gerekmektedir. Şimdiye kadar bu doğrultuda, öncellikle viral gen aktarım sistemleri geliştirilmiştir ve uygulanmıştır [14]. Bu gen aktarım tasarımları çok etkili olmuştur, ancak bu tür tasarımlarda her zaman istenmeyen viral rekombinasyon tehlikeleri mevcuttur. Bu bakımda, bilim insanarı virüslerin hücre içi geçiş ve hücre genomuna entegre olma mekanizmalarını taklit edebilecek yeni ve viral olmayan yaklaşımların geliştirilmesine yönelmişlerdir. Bu tür tasarımlar genelde negativ yüklü olan DNA’yı pozitiv yüklü moleküllerle daha kompakt hale getiren çeşitli polimerler (polipleksler) veya lipid vezikülleri (lipopleksler)’in kullanımına dayanmaktadır [15,16]. Günümüzde her iki yaklaşım da yoğun olarak kullanılmaktadır. Poliplekslerin geliştirilmesinde organik sentez laboratuarlarında çok sayıda çeşitli moleküler ağırlığa ve yüzeysel elektrostatik özelliklerine sahip çok sayıda pozitiv yük taşıyan polimer sentezlenmektedir. Bu alanda araştırmacılar bir hayli serbesttir, çünkü bu tür sentezler çok sayıda yeni polimerin ortaya çıkarılmasında laboratuvar araştırmacılarını pek zorlamamaktadır [15,16]. İkinci yaklaşım ise pozitiv yüklü lipid vezikülleri (lipozomları)’ının kullanımına dayanmaktadır [12,17-20]. Her iki yaklaşımda da amaç yeni viral olmayan taşıyıcı sistemi geliştirmek ve bunun aracılıyla aktiv halde bir terapötik nükleik asiti hedef hücreye kadar ulaştırmak [21]. Şimdiye kadar literatürde çok sayıda polipleks ve lipopleks tasarımı ile ilgili yeni fikirler yayımlanmıştır. Ancak söz konusu tasarımlar yeni gen aktarım taşıyıcı sistemlerinin ön formülasyon aşamasını kapsamaktadır. Bir sonraki hedef ise çoğu zaman aşılması çok zor olan intraselüler engellerin aşılması aşamasıdır, çünkü gerek hücre dışı ortam gerekse intraselüler ortam olarak sitoplazma son derece vizkoz olduğundan DNA için son derece olumsuz bir çözünürlülük problemini yaratmaktadır [22-24]. Bu aşamaya gelinmeden önce de zaten daha serum ortamında degradasyon sorunları muazzamdır, çünkü pozitiv yüklü serum proteinleri ile yine pozitiv yük taşıyan polipleksler veya lipopleksler arasında elektrostatik olarak bağ oluşmamaktadır ve bunlar birbirini uzaklaştırmaktadır. Ayrıca da, gerek poliplekslerin gerekse lipoplekslerin sitotoksisiteye yol açtıkları bilinmektedir [22-24]. Bu sitotoksisiteyi düşürmek en büyük hedeflerden biridir. Sitotksisiteyi düşürmek amacıyla daha hafif pozitiv yüklü polimerler, lipozomlar veya her ikisini de içeren polilipopleksler tasarlanmaktadır. Bu bağlamda, yüzeysel yük ve elektrostatiğin kontrolü büyük önem kazanmıştır. Bunun yanı sıra, daha sonraki aşamalarda transfeksyon

46

etkinliğini doğrudan etkilediklerinden taşıyıcı veziküllerin boyutu da son derece önemlidir. Bundan dolayı da söz konusu veziküllerin boyut analizleri çok önemsenmektedir. Genelde, araştırmacılar arasında 100 nm boyutunda olan lipozomlar transfeksyon etkinliğini artırdığı görüşü hakim olduğunda gen aktarımı tasarımları genelde nano-boyutlarla ilgilidir [27].

Dünyanın önde gelen araştırma merkezlerinde yürütülen bu tür araştırmalar son yıllarda ülkemizde de popülarite kazanmış ve aynı doğrultuda ilerlemektedir. Ülkemizde lipozomlarla ilgili öncü çalışmalar kontrollü salınım sistemleri veya model membran çalışmalarıyla başlatılmıştır. Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Biyomalzeme Araştırma Grubu, Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği ve Biyomühendislik Bölümü, ve Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi bu çalışmalarda öncülük etmiştir. Adı geçen son iki merkezde bu konu ile ilgili çalışmalar yoğun olarak devam etmektedir. Bu sayede Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği ve Biyomühendislik Bölümünde yüksek seviyede nanopartiküller [28], polietilenimine dayalı ve diğer polipleks ve gen aktarım tasarımları [29-31] ile ilgili özgün çalışmalar yapılmıştır. Aynı merkezde devam eden çalışmalar çerçevesinde ve Hacettepe Üniversitesi Kimya Bölümünce in vitro tranasfeksyon tasarımları da başarıyla gerçekleştirilmiş olması son derece önemli bir gelişmedir [32]. Buna benzer çalışmalar Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesince de yürütülmektedir. Son yıllarda burada yürütülen çalışmalarda özellikle mukozal immünite konusundaki araştırmalar hız kazanmıştır ve büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. 2007 yılında bu bölümün öğretim üyelerinin düzenleme kurulunda yapmış oldukları büyük katkılarıyla Uluslararası Kitin Derneğinin yıllık toplantısı ülkemizde yapılmıştır. Son yıllarda Marmara Üniversitesinde de bu konularla ilgili araştırmalar başlatılmıştır [33]. Akdeniz Üniversitesinde İnsan Gen Tedavi Merkezi kurulmuştur ve burada da özgün çalışmalar yapılmaktadır [34].

Türkiye’ye kesin dönüş yaptığım 2004 yılından itibaren söz konusu nükleik asit-fosfolipid etkileşmeleri konulu projeler gerçekşetirmeye ve bu konuyu ülkemizde popülarize etmeye özen gösterdim. Buradaki esas amacım daha önce doktora sonrası (postdoc) yıllarımda ve konuk araştırmacı olarak bulunduğum enstitülerde bu konu ile ilgili yaptığım çalışmaları Türkiye’de devam ettirmektir [35-37]. Bu amaçla Türkiye’deki ilk projem olan “Gen Taşıyıcıları Olarak Tasarlanan Nükleik Asit-Fosfolipid Bileşenlerinin Fizikokimyasal Özelliklerinin FTIR Spektroskopisi ile Moleküler Düzeyde İncelenmesi”; TÜBİTAK Proje No: 105S151 (SBAG-HD-42) başarıyla tamamladıktan sonra [38,39], söz konusu DNA-lipid etkileşmelerinin yüzey kimyasal analizi için Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Daire Başkanlığınca desteklenen “Paclitaxel (TAXOL®’un) anti-kanser etki mekanizmasının model Langmuir–Blodgett biyomembran sistemi ile moleküler düzeyde incelenmesi” adlı başka bir projem sayesinde Fakültemize Langmuir-Blodgett cihazı kazandırılmıştır. Bu sayede Fakültemizde fosfolipid tek katman düzeneği kurulmuştur ve başarıyla uygulanmıştır [40]. Bu proje önerimizde de söz konusu lipid-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerin oluşmalarının ön fizikokimyasal incelemeleri esnasında yüzey kimyasal ve kolloid ölçümlerine büyük bir yer ayrılmıştır.

Şimdiye kadar nükleik asit-fosfolipid etkileşmeleriyle ilgili yapılan literatür değerlendirmesinden de görüleceği üzere, moleküler hücre biyolojik boyutları dışında genelde gen aktarımlarda ele alınmaktadır. Bu şekilde geliştirilen farmasötik formülasyonlar genelde katiyonik polimerlere ve katiyonik lipozomlara dayalı tasarımlar kullanmaktadır. Ancak, özellikle katiyonik lipozomların son derece sitotoksik olmaları

47

kullanım boyutlarını çok kısıtlamaktadır [7,9,13,22,25]. Proje önerimizde ise katiyonik lipozomların yerine yük taşımayan zwitteriyonik lipozomların Mg2+ aracılıyla DNA’ya bağlanıp bileşik oluşturmaları ele alınmaktadır. Projemizde katiyonik poliplekslerin yerine lipozomlara yer verilmesi daha önce literatürde yayımlanan bilimsel gerekçelere dayandırılmıştır [8,9,10,12,17-20,25]. Önerilen üçlü bileşik sistemi ile ilgili gen akatarım çalışmaları literatürde henüz daha yayımlanmamıştır. Bu konu ile ilgili kendi çalışmalarımız dışında son derece az sayıda rapor bulunmaktadır. Ancak çalışmalarımızda bile sadece birtakım biyofiziksel ölçümlerden yola çıkarak spekülativ modeller kurulmuştur [35-39]. Bu durum büyük ölçüde laboratuvar donanımdaki eksikliklerimiz ve proje eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Bu konunun aydınlatılması için daha fazla araştırmaya ve daha uzun vadeli proje desteğine ihtiyaç vardır. Rus ortaklarımızla müşterek olarak hazırladığımız bu proje sayesinde söz konusu sistem ile ilgili çok önemli bilgilerin elde edileceği ümidini taşıyoruz. Bu proje ile elde edilecek daha somut veriler sayesinde daha sonraki projelerimizde zwitteriyonik lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileşiklerin in vitro transfeksyon etkinliklerinin de araştırılıp konunun bu boyutu da aydınlatılacağı görüşündeyiz. Söz konusu üçlü bileşik oluşumunda yük taşımayan lipid vezikül ile negativ yük taşıyan DNA’yı bir araya getirilmesinde ve bileşik oluşturulmasında özellikle Mg2+ rolü vurgulanmıştır. Bu tasarımımız da bu metal iyonun fosfat grup transferlerinde, membran kanal geçişlerinde ve membran yapısında, polinükleotid aktivitelerde ve gen ifadesindeki biyolojik rolü üzerine kurulmuştur [41]. Proje önerimizin bir diğer boyutu da moleküler biyolojiktir. Bu boyut, Rus ortalarımızın önceden geliştirdiği modellere ve hipotezlerine dayanmaktadır [42-48]. Ancak, söz konusu hipotezlerin geçerliliğini daha ayrıntılı araştırmak amacıyla daha fazla ölçümlerin yapılmasına ihtiyaç vardır. Dolayısıyla, bu projemizi başarıyla tamaladığımız takdirde, gerek biyonanoteknolojik gerekse moleküler biyolojik boyutlar hakkında çok önemli bilgiler elde edilecektir. Bu nitelikte bir çalışma ülkemizde şu ana kadar yapılamadığından, bu proje önerimizin özgün olduğuna ve ülkemizde de bu tür araştırmaların başlatılması için iyi bir motivasyon olacağına inanıyoruz.

Referanslar: 1. M.P. Moyer, Association of DNA and RNA with membranes, Int. Rev. Cyt. 61 (1980) 1– 25. 2. V.A. Struchkov, N.B. Strazhevskaya, DNA-bound lipids: composition and possible functions, Biochemistry (Moscow) 58 (1993). 3. P. Hobart, R. Duncan, A.A. Infante, Association of DNA synthesis with the nuclear membrane in sea urchin embryos, Nature 267 (1977) 542– 544. 4. V.V. Kuvichkin, DNA–lipid interactions in vitro and in vivo, Bioelectrochemistry 58 (2002) 3– 12. 5. A. Akhtar ve S.M. Gasser, The nuclear envelope and transcriptional control, Nat Rev Genet. 8(7) (2007) 507-17 6. P.L. Felgner, T.R. Gadek, M. Holm, R. Roman, H.W. Chan, M. Wenz, ve ark., Lipofection: A Highly Efficient, Lipid Mediated DNA-Transfection Procedure, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, (1987), 7413-7417. 7. D.D. Lasic and D. Papaadjopoulos (Eds.), Medical Applications of Liposomes, Elsevier, Amsterdam, (1998).

48

8. D.B. Fenske, A. Chonn ve P.R. Cullis PR. Liposomal nanomedicines: an emerging field, Toxicol Pathol. 36(1) (2008) 21-9. 9. D.B. Fenske ve P.R. Cullis, Liposomal nanomedicines, Expert Opin Drug Deliv. Jan; 5 (1) (2008) 25-44. 10. D.B. Fenske ve P.R. Cullis, Entrapment of small molecules and nucleic acid-based drugs in liposomes, Methods Enzymol. 391 (2005) 7-40. 11. Y. Liu, H. Miyoshi, M. Nakamura, Nanomedicine for drug delivery and imaging: a promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int J Cancer Jun 15; 120 (12) (2007) 2527-37. 12. A. Chonn ve P.R. Cullis, Recent advances in liposomal drug-delivery systems, Curr Opin Biotechnol. Dec;6 (6) (1995) 698-708. 13. N.S. Templeton, Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategies. 2nd Ed., Marcel Dekker, (2003). 14. N.A. Kootstra ve I.M. Verma, Gene therapy with viral vectors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 43 (2003) 413-39. 15. A.V. Kabanov ve V.A. Kabanov, DNA complexes with polycations for the delivery of genetic material into cells. Bioconjug Chem. Jan-Feb; 6 (1) (1995) 7-20. 16. K.B. Anwer, G. Rhee ve S.K. Mendiratta, Recent Progress in Polymeric Gene Delivery Systems. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier. Syst. 20 (4) (2003) 249-293. 17. N.S. Templeton, Developments in Liposomal Gene Delivery Systems. Expert Opin. Biol. Ther. 1 (2001) 1-4. 18. N.S.Templeton, Liposomal Delivery of Nucleic Acids In Vivo. DNA Cell Biol. 12 (2002) 857-867. 19. A.D. Miller, Nonviral liposomes. Methods Mol. Med. 90 (2004) 107-38. 20. A.S. Ulrich, Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles. Bioscience Rep. 2002; 22, 2: 129-149. 21. F. Liu ve L. Huang. Development of Non-Viral Vectors for Systemic Gene Delivery. J. Contr. Release 78 (2002) 259-266. 22. A.D. Miller, The Problem with Cationic Liposome/Micelle-Based Non-Viral Vector Systems for Gene Therapy. Curr. Med. Chem. 10 (2003) 1195-1211. 23. de Gennes P-G. Problems of DNA entry into a cell. Physica A, 274 (1999) 1-7. 24. V.V.Vlassov, L.A. Balakireva ve L.A. Yakubov, Transport of oligonucleotides across natural and model membranes, Biochim Biophys Acta, 1197 (1994) 95-108. 25. C.L. Gebhart ve A.V. Kabanov, Evaluation of Polyplexes as Gene Transfer Agents. J. Contr. Release, 73 (2001) 401-416. 26. R. Dass, Cytotoxicity Issues Pertinent to Lipoplex-Mediated Gene Therapy In-Vivo. J. Pharm. Pharmacol. 54 (2002) 593-601. 27. G. Lambert, R. Fattal, ve P. Couvreur, Nanoparticulate systems for the delivery of antisence oligonucleotides. Adv. Drug Del. Rev. 47 (2001) 99-112. 28. G.U. Güven, N.T. Laçin ve E. Pişkin, Monosize polycationic nanoparticles as non-viral vectors for gene transfer to HeLa cells. J. Tissue Eng Regen Med. (2008) Apr 8. 29. M. Türk, S. Dinçer, E. Pişkin, Smart and cationic poly(NIPA)/PEI block copolymers as non-viral vectors: in vitro and in vivo transfection studies. J Tissue Eng Regen Med. Sep-Oct; 1(5) (2007) 377-88. 30. E. Pişkin, Stimuli-responsive polymers in gene delivery. Expert Rev Med Devices. Jul; 2(4) (2005) 501-9.

49

31. E. Pişkin, S. Dinçer, M. Türk, Gene delivery: intelligent but just at the beginning. J Biomater Sci Polym Ed. 15(9) (2004) 1181-202. 32. M. Türk, S. Dinçer, I.G. Yuluğ, E. Pişkin, In vitro transfection of HeLa cells with temperature sensitive polycationic copolymers. J Control Release. Apr 28; 96 (2) (2004) 325-40. 33. G. Ozgel ve J. Akbuğa, In vitro characterization and transfection of IL-2 gene complexes, Int J Pharm. Jun 6 315(1-2) (2006) 44-51. 34. C. Aydin, A.D. Sanlioglu, B. Karacay, G. Ozbilim, L. Dertsiz, O. Ozbudak, C.A. Akdis, S. Sanlioglu, Decoy receptor-2 small interfering RNA (siRNA) strategy employing three different siRNA constructs in combination defeats adenovirus-transferred tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand resistance in lung cancer cells, Hum Gene Ther. Jan; 18 (1) (2007) 39-50. 35. Süleymanoğlu, E. Fluorescence microscopy of condensed DNA conformations of bacterial cells. J. Microbiol. 40 (2002) (4): 319-326. 36. Süleymanoğlu E. Preparation and phase behaviour of surface-active pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential adiabatic scanning microcalorimetric study. Il Farmaco, Aug; 60 (8) (2005) 701-710. 37. Süleymanoğlu E. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Energetics of DNA-Mg2+-Phosphatidylcholine Ternary Complex Formation and its Further Compaction as a Gene Delivery Formulation, PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4) (2006) 218-231. 38. Süleymanoğlu E. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Developing an Immobilized Liposome Chromatography for DNA Separation and Analysis, PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4) (2006) 232-239. 39. Y. Manavbaşı ve E. Süleymanoğlu, Nucleic acid-phospholipid recognition: Fourier transform infrared spectrometric characterization of ternary phospholipid-inorganic cation-DNA complex and its relevance to chemicopharmaceutical design of nanometric liposome based gene delivery formulations. Arch Pharm Res., Aug; 30 (8) (2007) 1027-40. 40. Y. Manavbasi ve E. Süleymanoğlu, Probing Taxol™ (Paclitaxel)-cell membrane interactions with Langmuir-Blodgett monolayer, Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry, FEBS JOURNAL 273: 354-354 Suppl. 1, JUN (2006). 41. Fraústo da Silva JJR and Williams RJP. The Biological Chemistry of the Elements. The Inorganic Chemistry of Life, Chapter 9: The Biological Chemistry of Magnesium:Phosphate Metabolism, 2nd. ed., Oxford University Press, Oxford, New York, 2001, pp. 251-276. 42. L.I. Shabarchina, B.I. Sukhorukov, V.V. Kuvichkin VV., Structure and function of DNA--membrane contact in cells, Biofizika Mar-Apr; 25 (2) (1980) 270-5 (In Russian). 43. B.I. Sukhorukov, V.V. Kuvichkin, L.I. Shabarchina, Theoretical model of DNA-membrane contacts, Biofizika Sep-Oct; 28(5) (1983) 771-5. 44. V.V. Novikov, V.V. Kuvichkin VV ve E.E. Fesenko, Role of DNA-membrane interactions in prokaryote-to-eukaryote transition: an hypothesis, Cytobios, 96 (383) (1998) 151-6.

50

45. V.V.Kuvichkin, V.V. Novikov VV, F.K. Aliushev, S.M. Eremin, I.A. Markov ve Iu.A. Ten, DNA-membrane complexes, mitochondria and aging, Bioelectrochemistry, May 15; 56 (1-2) (2002) 189-93. 46. VV. Kuvichkin, Role of lipid membrane-nucleic acid interactions, DNA-membrane contacts and metal (II) cations in origination of initial cells and in evolution of prokaryotes to eukaryotes, Bioelectrochemistry, Nov; 58 (1) (2002) 41-6. 47. V.V. Kuvichkin, DNA-lipid interactions in vitro and in vivo, Bioelectrochemistry, Nov; 58(1) (2002) 3-12. 48. R.I. Zhdanov, V.V. Kuvichkin, A.S. Shmyrina, A.R. Jdanov ve AR, V.A. Tverdislov, The role of lipid-nucleic acid interactions in the reconstruction in vitro of the nuclear shell with pores, Biofizika, Mar-Apr; 48 (2) (2003) 236-9. (In Russian). 3.2. Yapılmamıştır 3.3. Rapor dönemleri itibari ile yapılacak çalışmaları gösteren bir uygulama planı verilir. Proje kabul edildiği takdirde 30 Haziran ve 31 Aralık tarihlerine kadar proje çalışmalarının gidişi ve proje harcama durumlarıyla ilgili altı aylık dönemlerde birer gelişme raporunu ve ayrıca istenildiğinde projeye ilişkin ayrıntılı bilgileri Fakültemizin Uzmanlar Grubuna verilecektir. 3.4.

Bu ortak proje önerimiz Gazi Üniversitesi B. A. P. Biriminin yönetmeliğinde yer alan hükümlere uygun olarak hazırlanmıştır. Söz konusu anlaşma hükümleri uyarınca proje önerimiz 2 yıl süre içerisinde yapılması mümkün olan ölçümleri kapsamaktadır. Proje bütçesi de bu hususlar ve bu süre göz önünde bulundurarak Rus ortaklarımızla birlikte ve büyük titizlikle hazırlanmıştır. Rus ortaklarımızla varılan ortak görüş doğrultusunda, sadece özgün fikirler benimsenmiş ve sadece bunlarla ilgili ölçümler öngörülmüştür. Böylece, büyük ayrıntılara gidilmeyerek üniversitemizin kaynaklarından en iyi şekilde istifade edilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, projemizde çok pahalı yeni teçhizatın alınması yerine, Orta Doğu Teknik Üniversitesinde ve Rusya Federasyonunda mevcut olan ölçüm merkezlerinden istifade edilmek hedeflenmiştir ve söz konusu ölçümlerin önemli bir bölümü proje bütçesine hizmet alımı olarak yansıtılmıştır. Her iki merkezde yapılacak olan ölçümlere ilişkin hizmet alım bedellerini gösteren resmî fiyat göstergeleri ayrıca ekte sunulmuştur. Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileliklerin moleküler düzeyde araştırmasıyla ilgili olan projemizin ön yüzey kimyasal ölçümler, daha önce Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Daire Başkanlığınca desteklenen projemle oluştırduğum altyapıdan ve bu çerçevede Fakültemize kazandırdığım Langmuir-Blodgett tek katman cihazından istifade edilmek suretiyle gerçekleştirilecektir. Proje önerimizin bu ilk aşamasını teşkil eden söz konusu bu ölçümleri gerçekleştirmek amacıyla, lipozom hazırlama aşamasında yoğun olarak kullanılan ve bundan sonraki Orta Doğu Teknik Üniversitesi ve Rusya Federasyonunda ölçüm mekezlerinde yapılacak olan tüm diğer incelemelerde kullanılacak lipozom çözeltilerin hızlı bir şekilde istenilen miktarlarda elde edilmesi için sarf kimyasal malzemeler (Uygulanacak olan deneysel protokoller için Bk. Bölüm-9. Yöntem) talep edilmiştir. Bunun dışında, proje bütçesine sadece ölçümlerde kullanılacak laboratuvar cam malzemesi ve sarf kimyasal malzeme

51

alımlarına yer verilmiştir. Bunlarla ilgili tüm kimyasal miktarları Rus ortaklarımızla yaptığımız ortak değerlendirme ve deneysel tasarımlarımızın gereksinimlerini göz önünde bulundurarak talep edilmiştir. Söz konusu bu miktar talepleri bizce çok geçerli bilimsel gerekçelere dayandırılmıştır. Örneğin, proje önerimizin özgün değerini önemli ölçüde artıran fosfolipid veziküllerin akışkanlık özelliklerini floresans mikroskopisi ile takip edilmesi, A. J. Metso ve ark. [1] tarafından geliştirilen protokolde yer alan 0.7 mM lipid konsantrasyonuna ulaşılacak şekilde ve buna uygun olarak bu ölçümlerimiz için bu lipid miktarları talep edilmiştir. Mg2+ varlığında fosfolipidlerle nükleik asitler arasında oluşan bileşiklerin meydana gelmesini atomik kuvvet mikroskopisi AFM) ile incelemelerimizde, B. Ruozi ve ark. [2] yayımladığı güncel derlemede yer alan lipid ve DNA konsantrasyonları esas alınmıştır. Henüz daha ülkemizde rutin olarak yapılamayan lipozomların boyut analizi ve elektrokimyasl incelemelerinde kullanılan z-potansiyel ve floresans spektrometrik ölçümlerini Rus ortaklarımızın Türkiye’ye ziyaretleri esnasında tarafımızla ortaklaşa yapılacaktır. Lipozom-Mg2+-DNA üçlü bileliklerin meydana gelmesindeki elektrostatik olaylarını incelemek üzere, negativ kontroller olarak, zwitteriyonik lipidlerin yanı sıra pozitiv yük ve negativ yük taşıyan 2 farklı lipid türü de talep edilmiştir. Tüm spektroskopik, termodinamik ve mikroskopik ölçümlerde dana timüs DNA kullanılacaktır. Sadece agaroz jel elektroforez incelemelerinde kullanılmak üzere çok daha uygun olduğundan plazmid DNA talep edilmiştir. Bu projemizin tüm diğer ölçümlerinde kullanılacak olan lipid ve DNA miktarları D. G. Fatouras ve S. G. Antimisiaris [3], L. Ciani ve ark. [4], K. K. Son ve ark. [5], K. Takeuchi ve ark. [6], M. Keller [7], Y. Liu ve ark. [8], T. Imura ve ark. [9], ve A. Samad ve ark. [10] (Bk. Bölümün sonundaki referans listesi) çalışmalarında yer alan protokoller uyarınca talep edilmiştir. Tüm bu sarf kimyasal malzemelerin miktarları, ölçümlerimizin tekrarlanabilirliğini kanıtlamak amacıyla en az 3 deney tekrarı olarak hesaplanmıştır. Tüm bunlar Orta Doğu Teknik Üniversitesinde ve Rusya Federasyonunda yapılacak olan önemli ölçümlerle ilgili hizmet alımları bütçe beyanatımızda ve ekte yer almaktadır. Proje çalışmamızın çok önemli başka bir boyutu da Rus ortaklarımızla gerçekleştireceğimiz karşılıklı ziyaretlerdir. Söz konusu ziyaretlerle ilgili bedel taleplerimiz Rus ortağımızın tarafımıza bildirdiği miktarlara dayanmaktadır. Rus ortaklarımızın çok daha deneyimli olduğundan, Türkiye’ye yapacakları ziyaretlerin ve tarafımıza aktaracakları teknoloji transferinin önemi defalarca vurgulanmıştır. Ortaklarımızın yapacakları ziyaretlerden ve edineceğimiz yeni tecrübelerin önemini vurgulamak amacıyla bunların bedelleri proje bütçemize dikkatlice yansıtılmıştır. Çok daha deneyimli olan ortaklarımızın ziyaretleri çok daha faydalı olacağından ve bu ziyaretlerden grubumuz büyük ölçüde istifade edeceğinden, Türk tarafın temsilcisi olarak Pushchino’da bulunan Rus Bilimler Akademisi Hücre Biyofiziği Enstitüsüne yapacağım ziyaretler askari düzeyde tutulmuştur. Ancak belirtilen süre içerisinde örneğin Xenopus ekstratlarla yapılan hücresel biyolojik deneyler gibi, Türkiye’de şu anda uygulayamadığımız yeni deneysel deneyimler kazanılacaktır.

Bu Bölümle İlgili Referanslar:

52

1. A. J. Metso, H. Zhao, I. Tuunainen, P. K. J. Kinnunen, Observation of the main phase transition of dinervonoylphosphocholine giant liposomes by fluorescence microscopy. Biochim. Biophys. Acta 1713 (205) 83-91. 2. B. Ruozi, G. Tosi, E. Leo, M. A. Vandelli, Application of atomic force microscopy to characterize liposomes as drug and gene carriers, Talanta 73 (2007) 12-22. 3. D. G. Fatouros ve S. G. Antimisiaris, Effect of amphiphilic drugs on the stability and z-potential of their liposome formulations: a study with prednisolone, diazepam, and griseofulvin, J. Colloid Interf. Scince 251 (2002) 271-277. 4. L. Ciani, S. Ristori, A. Salvati, L. Calamai, G. Martini, DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery: zeta potential measurements and electron spin resonance spectra, Biochim. Biophys. Acta 1664 (2004) 70-79. 5. K. K. Son, D. Tkach, D. H. Patel, Zeta potential of transfection complexes formed in serum-free medium can predict in vitro gene transfer efficiency of transfection reagent, Biochim. Biophys. Acta 1468 (2000) 11-14. 6. K. Takeuchi, M. Ishihara, C. Kawaura, M. Noji, T. Furuno, M. Nakanishi, Effect of zeta potential of cationic liposomes containing cationic cholesterol derivatives on gene transfection, FEBS Letters 397 (1996) 207-209. 7. M. Keller, Lipidic carriers of RNA/DNA oligonucleotides and polynucleotides: What a difference a formulation makes! J. Contr. Release 103 (2005) 537-540. 8. Y. Liu, H. Miyoshi ve M. Nakamura, Nanomedicines for gene delivery and imaging : a promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer 120 (2007) 2527-2537. 9. T. Imura, H. Yanagishita, T. Ikegami, H. Negishi, D. Kitamoto, Drastic improvements in trapping efficiency and dispersibility for phosphatidylcholine liposomes in the presence of divalent metal ions, J. Oleo Sci., 52, 12, (2003) 673-679. 10. A. Samad, Y. Sultana ve M. Aqil, Liposomal drug delivery systems: an updated review, Curr. Drug Deliv., 4 (2007). 3.5.

Özet

Nükleik asitler ile hücre zarları arasında oluşan etkileşmeler gen regülasyonu, hücre döngüsü ve bölünmesi gibi olaylarda, biyomühendislikte biyosensörler olarak ve moleküler evrimdeki rolleri bakımından ilgi çekmektedirler. Daha yakın zamanda, bu bileşikler gen tedavilerinde terapötik gen taşıyıcıları olarak önem kazanmıştır. Günümüzde insan gen tedavisi ile ilgili araştırmalar etkilenen hücre türlerine özgü uygun nükleik asit aktarım araçları yokluğundan dolayı tatmin edici değildir. Uygulama noktasından gen ifadesine kadar giden yolda terapötik polinükleotid sarmalı degradasyondan koruyacak optimize edilmiş gen taşıma sistemlerine ihtiyaç vardır. Çeşitli lipidlerle nükleik asitler arasında oluşan toplaşımlar günümüzde güvenilir viral olmayan gen aktarım vektörleri olarak denenmektedir. Yoğun olarak kullanılan katiyonik lipidlerle yapılan lipofeksyon deneyleri sıkça istenmeyen sitotoksisiteye, kontrolü zor olan makromoleküler özelliklere, düşük transfeksyon oranlarına ve diğer tatmin edici olmayan neticelerle sonuçlanmaktadır. Daha etkili hücre transfeksyon protokollerin geliştirilmesinin ön koşulu olan lipid-poli(ribo)nükleotid bileşiklerin fizikokimyasal

53

özellikleri hakkında bilgiler yeterli değildir. Günümüzdekullanılan katiyonik lipidlerin hazırlanmasındaki ortaya çıkan zorluklar dışında, sitotoksisiteleri şimdiye kadar ortadan kaldırılamayan bir engel olmuştur. Lipid-nükleik asit etkileşmeleriyle ilgili sıkça yayımlanan raporların olmasına rağmen, bunları bileşik hale getiren elektrokimyasal, koloidal ve intermoleküler güçler bilinmemektedir. Bunların karakterizasyonunda şimdiye kadar uygulanan floresans ölçümler, X-Ray saçılım, çeşitli elektron mikroskopik, termodinamik ve spektroskopik tekniklerin transfeksyonun hücresel mekanizmalarına ilişkin bağlantı kurulamayacak şekilde, soyut ve sıkça birbirine çelişkili olan neticelerle sonuçlanmaktadır. Bu bakımdan, iyileştirilmiş özelliklere sahip yeni gen aktarım sistemlerinin tasarlanması önemlidir.

Sunuğumuz proje önerimizde sitotoksik katiyonik lipozomlar yerine, çift valanslı katiyonlarca (Mg2+) zwitteriyonik fosfolipidlerle DNA’yı bileşik haline getiren ve nükleik asit taşıyıcı veziküller olarak kullanımı ele alınmaktadır. Fizikokimyasal parametrelerinin iyi bilinmesi dışında, biyolojik olarak aktiv Mg2+ bu proje önerimizde sıvı ortamda ortaya çıkan kendi kendine toplaşımlarla ilgili günümüzde geçerli olan polielektrolit teorilere bir yaklaşım olarak incelenmesi teklif edilmektedir. Karşı yüklere sahip amfifillerle metal iyonların bağlanması konusu iyi bir şekilde araştırılmıştır. Diğer yandan, zwitteriyonik lipidlerle katiyonların bağlanması konusu yeterince bilinmemektedir. Günümüzde, katiyon-fosfoliid etkileşmeleriyle ilgili hesaplanan stokiometrilerin yorumlanmasında ve bağlanma enerjileriyle bağlanma sabitlerinin tayininde zorluklar bulunmaktadır. Bu bakımdan, deneysel tasarımımız, metal iyonlarca meydana getirilen supramoleküler kendi kendine toplaşımların oluşum mekanizmaları hakkında daha fazla bilgiler verecektir.

Yük taşımayan lipidlerle çeştli konformasyonlara ve boyutlara sahip polinükleotidler arasında oluşan kendi kendine toplaşımların (self-assemblies) hazırlanması ve kullanımları ile ilgili temel biyofiziksel parametreler incelenecektir. Daha spesifik olarak, çift valanslı metal katiyonlarca tetiklenen tek- ve çift sarmallı polinükleotidlerin çok katmanlı (MLV) ve tek katmanlı (ULV) fosfatidilkolin vezikülleri üzerine adsorpsyonu, agregasyonu ve adhezyonu UV/VIS Spektroskopisi ve Türbidimetri ile araştırılacaktır. Zwitteriyonik lipozomların termotropik faz değişimleri Mg2+ varlığında polinükleotidlerle ve dana timüs DNAsı ile bileşikler oluşturmaları termodinamik ölçümler ve floresans mikroskopisi ile incelenecektir ve çeşitli elekstrostatik lipid-nükleik asit bileşiklerin oluşumları ile ilgili daha önce yayımlanan verilerle kıyasalanacaktır. Bu şekilde oluşan üçlü bileşiklerin yüzey tanınma ve sınırlararası özellikleri Langmuir-Blodgett tek katman, titreşim (FTIR ve Raman) spektroskopisi ve Atomik Kuvvet Mikroskopisi (AFM) araştırılacaktır. Bu genozomların boyut ve morfoloji analizleri elektron mikroskopisi (TEM ve SEM), z-potansiyel, Dinamik Işın Saçılımı (DLS) veya Foton Korelasyon Spektroskopisi ile gerçekleştirilecektir. İnorganik katiyonların varlığında sentetik fosfatidilkolin vezikülleri ile polinükleotidler arasında oluşan üçlü bileşikler Diferansiyel Taramalı Mikrokalorimetrik (DSC) ve İzotermal Titrasyon Kalorimetrik (ITC) ölçümlerden elde edilecek olan veriler söz konusu bileşiklerin yapısal değişikleriyle ilgili termodinamik ve kinetik modellerin ortaya çıkarılmasında kullanılacaktır. Mg2+ varlığında DNA tarafından meydana getirilen lipozomlar arasında füzyon olayları floresans mikroskopisi ve salınım deneyleriyle incelenecektir. Üçlü bileşik oluşumunun elektrostatiği Silicon Graphics Workstation ortamında AMBER® programı ile modellenecektir. Transfeksiyon için etkili dairesel ve

54

süpersarmallı plazmidlerin oluşumu agaroz jel elktroforez ile ortaya çıkarılacaktır. Bu proje önerimiz Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Kurumu Gazi Üniversitesi BAP hükümlerine ve kapsamına uygun olarak 2 yıl süreli bir çalışma olarak tasarlanmıştır. Bu proje önerimiz ön fizikokimyasal ve hücresel biyolojik aşamalarını kapsamaktadır ve Gazi Üniversitesi ve Rus Bilimler Akademisi arasında bir ortak çalışma olarak öngörülmüştür. Bu çalışmamız daha sonraki uzun vadeli ve çok geniş kapsamlı projelerimizin temelini oluşturacaktır. Örneğin, bu projemizin devamı olarak, zwitteriyonik lipid-metal iyon-DNA nanokondenzatların intraselüler akıbetleri yeni projelerimizin transfeksiyon deneylerinde gelecek vadeden metal iyonlara dayalı nükleik asit farmasötikler olarak denenecektir. Yük taşımayan fosfolipidler ile açıklanan modeller daha sonra katiyonik polimerler kullanılarak söz konusu poliplekslerin bileşik oluşturma ve DNA kompaktizasyon kabiliyetleri ile karşılaştırılacaktır. Böyle bir motivasyona dayanarak, söz konusu kendi kendine toplanan üçlü bileşiğin gen tedavilerinde potansiyeli olan, özellikleri iyileştirilmiş formülasyon olarak önerilebilecektir. Bu şekilde açıklanan nükleik asit-fosfolipid bileşiklerin oluşum olasılıkları daha ayrıntılı deneylerde çekirdekçik gözenekleri üzerinde DNA ve RNA-polimerazların gen ifadelerinde ve işlevlerindeki rolleri de vurgulanarak araştırılacaktır. Bu tür zarlara bağlanma bölgeleri, bakteri segregasyonunda önem taşıyan prokaryotik nükleoidlerde, eukaryotlarda ise transkripsyon-translasyon-translokasyon olaylarında önemli noktalar olarak ele alınacaktır. Ayrıca, radyasyonun, mutajenezin, karsinojenezin, pestisid etki mekanizmalarının ve ağır metallerin hücresel etkileri de yaklaşılacaktır. Designing Non-Viral Nanobiotechnological Lipoplex Systems for Therapeutic Gene Delivery

Abstract Interactions between nucleic acids and cell membranes has attracted research

interest in terms of their role in gene regulation, cell cycle and division, as biosensors in bioengineering, as well as in molecular evolution. More recently, these complexes have gained significance as carriers of therapeutic genes in gene therapy. Human gene therapy research is currently discouraging due to the lack of suitable delivery vehicles for nucleic acid transfer to affected cell types. There is an urgent need for optimized gene delivery tools capable of protecting the therapeutic polynucleotide helix from degradation through its route from site of administration to gene expression. Self-assemblies of various lipids with nucleic acids are currently being tested in search for a realiable nonviral gene delivery vectors. Lipofection assays performed with commonly employed cationic lipids often lead to undesirable cytotoxicity, difficult to control macromolecular properties, and low transfection rates, as well as other discouraging results. Information concerning physicochemical characteristics of lipid-poly(ribo)nucleotide complexes, which is a prerequisite for designing more efficient cell transfection protocols is insufficient. Besides difficulties arising during the preparation of the currently employed cationic lipids, their cytotoxicity has been an unavoidable hurdle. Despite frequent reports on lipid-nucleic acid interactions, the electrochemical, colloidal and intermolecular forces responsible for their complex formation are not well understood. Fluorescent assays, X-Ray scattering, various electron microscopic, thermodynamic and spectroscopic

55

techniques employed until now in their characterization studies have resulted in abstract and frequently contradictory data, which is difficult to relate to cellular mechanisms of transfection. Therefore, designing novel gene delivery systems with improved properties is essential.

The current research proposal is devoted to studying the use of zwitterionic phospholipids, complexed with DNA by divalent metal cations (Mg2+) as nucleic acid carrying vehicles instead of the cytotoxic cationic liposomes. Besides their well-documented physicochemical parameters, biologically active Mg2+ were suggested in the present project proposal for approaching the currently available polyelectrolyte theories for self-assemblies in aqueous media. Metal ion binding to oppositely charged amphiphiles is well-documented. On the other hand, cation binding to zwitterionic lipids is less known. Currently, difficulties exist in interpretations of the estimated stoichiometry of cation-phospholipid interactions, as well as issues concerning the determinations of their binding constants and binding energies. Therefore, our experimental design could give further evidence for the mechanism of metal ion-mediated supramolecular self-assembly formations. Basic biophysical issues related to preparation and use of self-assemblies formed between neutral lipid and polynucleotides with various conformation and size are to be followed. More specifically, the divalent metal cation-governed adsorption, aggregation and adhesion between single- and double-stranded polynucleotides with multilamellar (MLV) and unilamellar (ULV) phosphatidylcholine vesicles is to be studied by UV/VIS Spectroscopy and turbidimetry. Thermotropic phase transitions of zwitterionic liposomes and their complexes with polynucleotides and calf thymus DNA with Mg2+ will be investigated by thermodynamic measurements and fluorescence microscopy and compared to the previous data for various electrostatic lipid - nucleic acid interactions. The surface recognition and interfacial behaviour of such ternary complexes will be studied by Langmuir-Blodgett monolayers, by vibrational (FTIR and Raman) spectroscopy, as well as by Atomic Force Micrsocopy (AFM). Size analysis and morphology of these genosomes will be determined by electron microscopy (TEM and SEM), z-potential measurements and by Dynamic Light Scattering (DLS) or by Photon Correlation Spectroscopy. Differential Scanning Microcalorimetric (DSC) and Isothermal Titration Calorimetric (ITC) measurements of synthetic phosphatidylcholine vesicles and polynucleotides and their ternary complexes with inorganic cations will be used to build the thermodynamic and kinetic models of their structural transitions, respectively. The DNA driven liposome fusions in the presence of Mg2+ will be followed by fluorescent spectroscopy and leakage assays. The electrostatics of ternary complex formation will be modelled by relevant AMBER® programme in Silicon Graphics Workstation. The formation of transfection competent covalently closed circular or superhelical plasmids will be examined by agarose gel electrophoresis. This project proposal was prepared according to the regulations and scopes, as mentioned in the regulations of Gazi University Research Projects Foundation and was designed as a 2 years duration research work. Our project proposal comprises initial physicochemical and cell biological studies phases and is planned to be realized as a collaboration between Gazi University and The Russian academic and research counterparts. This work will form the base for our more

56

prolonged future projects with enlarged scope. For instance, as a continuation of this project, intracellular features of the zwitterionic lipid-metal ion-DNA nanocondensates will be tested in further projects’ transfection experiments as a promising metal-based nucleic acid pharmaceuticals. The described models built with neutral phospholipids will be further compared with the complexing and DNA compacting capabilities of polyplexes employing cationic polymers. Based on such a reasoning, it would be thus possible to suggest this self-assembly as an improved formulation with further potential in gene therapy trials. The described nucleic acid-phospholipid complex formations will be studied in more detailed experiments on nuclear pore complexes and their further implications in gene expression and functions of DNA and RNA-polymerases. Such membrane contacts will be considered also in prokaryotic nucleoids important in bacterial segregation, whereas in eukaryotes these complexes will be regarded as focal points for transcription-translation-translocation processes. In addition, their role in cellular effects of radiation, mutagenesis, carcinogenesis, mode of action of pesticides and heavy metals will be also approached. 3.6. Nükleik asit-hücre zarı etkileşmeleri; gen tedavisi; viral olmayan gen aktarımı; zwitteriyonik lipid-polinükleotid toplaşımları; Mg2+; fizikokimyasal karakterizasyon; in vitro transfeksyon Nucleic acid-cell membrane interactions; gene therapy; non-viral gene delivery; zwitterionic lipid - polynucleotide self - assemblies; Mg2+; physicochemical characterization; in vitro transfection. 3.7.

Adı Soyadı ve Ünvanı Çalıştığı Kurum/Kuruluş

Prof. Dr. Sevda Şenel Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı, 06100 Sıhhiye, Ankara, Tel.: 3051241-3101524, Faks: 3114777, E-posta: ssenel@hacettepe.edu.tr

Prof. Dr. Murat Şumnu Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji, Anabilim Dalı, 06100 Sıhhiye, Ankara, Tel.: 3051241-3052168, Faks.: 3114777, E-posta: msumnu@hacettepe.edu.tr

Doç. Dr. Necati Özkan Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Merkezi Laboratuvar, AR-Ge Eğitim ve Ölçme Merkezi, 06531 Ankara, Tel.: 2106421 veya 2106431, Faks: 210 6425, E-posta: nozkan@metu.edu.tr

Prof. Dr. Meral Yücel Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, İnönü Bülvarı, 06531 Ankara, Tel.: 210 51 59, Faks: 210 12 89, E-posta: meraly@metu.edu.tr

3.8. _ 3.9. _ 3.10.

57

ÖZGEÇMİŞ VE ESERLER LİSTESİ

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: ERHAN SÜLEYMANOĞLU

Doğum Tarihi: 22 Mart 1967

Öğrenim Durumu:

Derece Bölüm/Program Üniversite Yıl Lisans Biyoteknoloji Sofya Üniversitesi 1993 Y. Lisans Biyokimya Orta Doğu Teknik Universitesi 1995 Doktora Biyokimya Viyana Üniversitesi 2001

Yüksek Lisans Tez Başlığı (özeti ekte) ve Tez Danışman(lar)ı: Effect of Metal Ions on Interaction Between Nucleic Acid, Protein (Melittin) and Drug (Tamoxifen) with Model Membranes.

Doktora Tezi/S.Yeterlik Çalışması/Tıpta Uzmanlık Tezi Başlığı (özeti ekte) ve Danışman(lar)ı : Klonierung und Charakterisierung des menschlichen heterogenen nukleaeren Ribonukleoproteins (hnRNP)A3 - ein neues hnRNP A/B Protein: Tez Danışmanı: Prof. Dr. Günter Steiner. Özet için bkz.: www.arcs.ac.at/dissdb/rn036425.

Görevler:

Görev Unvanı

Görev Yeri Yıl

Ar.Gör. Dr.Ar.Gör. Yar.Doç.

Yönetilen Yüksek Lisans Tezleri :

Yönetilen Doktora Tezleri/Sanatta Yeterlik Çalışmaları :

Projelerde Yaptığı Görevler :

2. Proje Yöneticisi: “Gen Taşıyıcıları Olarak Tasarlanan Nükleik Asit-Fosfolipid Bileşenlerinin Fizikokimyasal Özelliklerinin FTIR Spektroskopisi ile Moleküler Düzeyde İncelenmesi”; 2005-2006 TÜBİTAK Proje No: 105S151 (SBAG-HD-42).

58

3. Proje Yöneticisi: “Paclitaxel (TAXOL’un) anti-kanser etki mekanizmasının model Langmuir –Blodgett biyomembran sistemi ile moleküler düzeyde incelenmesi”; 2005-2007 Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri-No: 02/2005-15.

İdari Görevler :

Bilimsel Kuruluşlara Üyelikler: The New York Academy of Sciences, The Biophysical Society, The British Biophysical Society, The Society for Mathematical Biology, The European Society of Neurochemistry, The Austrian Society of Clinical Chemistry, The International Society for the Study of the Origin of Life, Metbio™.

Ödüller :

Son iki yılda verdiği lisans ve lisansüstü düzeydeki dersler (Açılmışsa, yaz döneminde verilen dersler de tabloya ilave edilecektir):

Haftalık Saati Akademik Yıl

Dönem Dersin Adı Teorik Uygulama

Öğrenci Sayısı

19xx-xxxx

İlkbahar

Güz

20xx-xxxx

İlkbahar

ESERLER

A. Uluslararası hakemli dergilerde yayımlanan makaleler :

A1. Severcan, F., Süleymanoğlu, E., ve H. Boyar, “Turbidity Studies of the Effect of

Divalent Cations on Tamoxifen - Model Membrane Interactions,” Biochem. Soc. Trans.,

25 (3): 493S, (1997).

A2. Cunha, S., Odijk, T., Süleymanoğlu, E. ve C.L. Woldringh, “Isolation of Escherichia

coli Nucleoid.” Biochimie, Feb., 83 (2): 149-154, (2001).

59

A3. Süleymanoğlu, E., “Electrorelease of Escherichia coli Nucleoids.” Folia Microbiol.,

47 (4): 365-370, (2002).

A4. Süleymanoğlu, E., “Fluorescence Microscopy of Condensed DNA Conformations of

Bacterial Cells.” J. Microbiol., 40 (4): 319-326, (2002).

A5. Steiner, G., Cervenak, Z., Skriner, K. ve E. Süleymanoğlu, “Molecular Cloning,

Expression and Immunochemical Properties of New Human hnRNP A/B Type

Autoantigen,” Biomedica, 19: 8-17, (2003).

A6. Süleymanoğlu, E., “Molecular Phylogenetics and Functional Evolution of Major

RNA Recognition Domains of Recently Cloned and Characterized Autoimmune RNA-

Binding Particle,” Geno., Prot. & Bioinfo. 1 (4): 310-320, (2003).

A7. Süleymanoğlu, E., “Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopic Study of

RNA-Protein Folding Patterns in Human hnRNP A3 and Their Implications in Human

Autoimmune Diseases,” Prog. Biochem. Biophys., 31 (3): 219-224, (2004).

A8. Süleymanoğlu, E. “Adiabatic Differential Scanning Calorimetric Study of Divalent

Cation Induced DNA - DPPC Liposome Formulation Compacted for Gene Delivery,”

Braz. Arch. Biol. Technol., 47 (6): 881-885, (2004).

A9. Süleymanoğlu, E. “Preparation and Phase Behaviour of Surface Active

Pharmaceuticals: Self-Assembly of DNA and Surfactants with Membranes. Differential

Adiabatic Scanning Microcalorimetric Study”,Il Farmaco,60 (8):701-710, (2005).

A10. Süleymanoğlu E. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Developing an

Immobilized Liposome Chromatography for DNA Separation and Analysis, PDA J.

Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4): 232-239, (2006).

A11. Manavbaşı Y. ve Süleymanoğlu E. Nucleic Acid-Phospholipid Recognition: Fourier

Transform Infrared Spectrometric Characterization of Ternary PhospholipidInorganic

Cation-DNA Complex and its Relevance to Chemicopharmaceutical Design of

Nanometric Liposome Based Gene Delivery Formulations, Arch. Pharm. Res. 30 (8):

1027-1040 (2007).

60

A12. Skriner, K., Hueber, W., Süleymanoğlu, E., Höfler, E., Krenn, V., Smolen, J. Ve

Steiner, G. AUF1, the Regulator of Tumor Necrosis Factor α Messenger RNA Decay, is

Targeted by Autoatibodies of Patients with Sstemic Rheumatic Diseases, Arthriris &

Rheumatism, 58 (2): 511-520 (2008).

B. Uluslararası bilimsel toplantılarda sunulan ve bildiri kitabında (Proceedings) basılan bildiriler :

B1. Turbidimetric Study of Interaction Between Polyribonucleotides,

Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, NATO Advanced Study Institute:

Trafficking of Intracellular Membranes: From Molecular Sorting to Membrane Fusion,

Espinho, Portugal, June 19-30, 1994.

B2. Calcium/Magnesium Specificity in Modulation of Phospholipid Phase Transition

Induced by Tamoxifen, NATO Advanced Study Institute: Molecular Dynamics of

Biomembranes, June 19 - July 1, 1995, Cargese, Corsica, France.

B3. Süleymanoğlu, E., “Self-Assembly of Lipid Vesicles and Polyribonucleotides - An

Inorganic Perspectives for the Origin of Life,” Proc. NATO Advanced Study Institute:

Solvents and Self-Organization of Polymers, Belek, Antalya, Turkey, July 23, 1995.

B4. Süleymanoğlu, E., “Self-Assembly of Lipid Droplets and Polyribonucleotides or

Primordial Soup Revisited,” ISSOL'96: International Conference on The Origin of Life,

Orleans, France, July 7 - 12, 1996.

B5. Süleymanoğlu, E., “Self-Association of Melittin with Model Membranes,” Winter

School of Biophysics: Biophysical Aspects of Protein Folding; Organized by Stockholm

Graduate School in Biophysics, as a joint programme between The Karolinska Institute,

The Royal Institute of Technology and Stockholm University, April 1 - 4, 1997.

61

B6. The hnRNP-D/AUF Proteins - A Novel Group of Autoantigens in Rheumatology,

National Scientific Meeting, Arthritis and Rheumatism - Abstract Supplement, Vol. 41,

No: 9, Sept. S349, November 8-12, 1998, San Diego, California, U.S.A.

B7. The hnRNP-D/AUF Proteins - a Novel Group of Autoantigens in SLE, MCTD and

RA, XVIII European Workshop for Rheumatology Research, March 12 - 15, 1998,

Athens, Greece.

B8. The hnRNP A/B type proteins - major molecular targets in rheumatic autoimmune

disease, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27 June, 1999,

University of Edinburgh, Scotland.

B9. Cloning of a novel hnRNP A/B type protein highly homologous to hnRNP-A3 from X.

laevis, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27 June, 1999,

University of Edinburgh, Scotland.

B10. Identification of a novel autoantigen highly related to hnRNP-A2/RA33, The 19th

European Workshop for Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway.

B11. Epitope Mapping of hnRNP-D/AUF-1 proteins, The 19th European Workshop for

Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway.

B12. The hnRNP-D/AUF-1 Proteins - Novel Autoantigens in Rheumatology, 4th

European Conference on Systemic Lupus Erythematosus; Organized by Vienna Academy

of Postgraduate Medical Education and Research, January 23 - 26, 1999, Vienna, Austria.

B13. Süleymanoğlu, E., “Thermodynamics of nucleic acid-membrane-self-assembly as a

precellular precursors and the emerging role of Ca2+ and Mg2+ as condensing agents,”

Proc. 12th International Conference on the Origin of Life and 9th ISSOL Meeting, San

Diego, California, U.S.A., 11-16, 1999.

B14. Are mRNA stability complexes target structures in systemic autoimmunity?, 14th

European Immunology Meeting, EFIS, Sept. 23-27, 2000, Poznań, Poland.

62

B15. Skriner, K., Huber, W., Süleymanoğlu, E., Smolen, J., Steiner, G. Are mRNA decay

complexes target structures in systemic autoimmune diseases? Arthritis and Rheumatism,

43 (9), Suppl. S, Sept. (2000).

B16. Analysis of Compaction Forces and Supercoil Content of Isolated E. coli nucleoids,

International Summer School on DNA and Chromosomes: Physical and Biological

Approaches, July 31 - August 12, 2000, Cargese, Corsica, France.

B17. Analysis of DNA Compaction within the Bacterial Cell, EMBO Workshop: The Cell

Cycle and Nucleoid Organization in Bacteria; Netherlands Institute for Sea Research

(NIOZ), September 2-6, 2000, Island of Texel, The Netherlands.

B18. Autoantibodies to the mRNA destabilizing protein hnRNP-D/AUF1 in patients with systemic autoimmune diseases, 21st European Workshop for Rheumatology Research, Parkhotel Schönbrunn, Vienna, Austria. 1-4 March 2001, published in Arthritis Res. 2001, 3 (Suppl A): P012.

B19. Süleymanoğlu, E., “Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy of RNA -

Protein Folding Patterns and Their Role in Autoimmune Diseases,” Proc. of The

Inaugural Austral - Asian Biospectroscopy Conference: Organized by Monash University

- Australia and hold at the Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima

(Korat) - Thailand, February 3-7, 2003.

B20. Süleymanoğlu, E., “Fluorescence Microscopy of Polymer - Induced Phase

Separation and Divalent Cation - Dependent Compaction and Structural Integrity of

Bacterial Chromosome,” Proc. of the Bionanotechnology - EuroConference on

Biomolecular Devices - Granada, Spain, 9-14 July, 2003.

B21. Süleymanoğlu, E., “Macromolecular Crowding and Bacterial DNA

Cytoarchitecture” - Conference for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on

Moleculur Biology and Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30

anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of

Sciences of Ukraine, Kiev-Ukraine, 25 - 27 September 2003.

B22. Süleymanoğlu, E., “Adiabatic Differential Scanning Microcalorimetric Study of

Divalent Cation - Induced Neutral Lipid - DNA Nanocondensate Formation Assambled

63

for Gene Delivery” - Conference for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on

Moleculur Biology and Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30

anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of

Sciences of Ukraine, Kiev-Ukraine, 25 - 27 September 2003.

B23. Süleymanoğlu, E., “Light Microscopy of Polyethylene Glycol-Induced Phase

Separation and Divalent Cation-Dependent Compaction of Prokaryotic Nucleoids” -

ELSO-2003: European Life Scientist Organization-Dresden, Germany, 20-24 September,

2003.

B24. Süleymanoğlu, E., Biophysical Aspects of RNA-protein Folding Features in A/B

Type hnRNP Proteins and Their Implications in Human Systemic Autoimmune

Pathology, 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference - The Protein World, 2 - 7

July, 2005, Budapest, Hungary.

B25. Süleymanoğlu, E., Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with

Langmuir-Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and

Differential Scanning Calorimetry, 1st Multidisciplinary Cancer Research Symposium,

Uludağ-Bursa, Turkey, 2006.

B26. Süleymanoğlu, E., Preparation and Physicochemical Characterization of

Biomolecular DNA-Zwitterionic Phospholipid Self-Assemblies and Their Implications in

Chemicopharmaceutical Design of Liposome Based Gene Delivery Nanoformulation,

NanoTR-II: NanoScience and NanoTechnology 2006, 3-5 May 2006, Middle East

Technical University, Ankara, Turkey.

B27. Manavbaşı, Y. and Süleymanoğlu, E., Assessment of Structures of

Poly(ribo)nucleotide-Phospholipid Self-Assemblies and Their Implıcations in Gene

Transfection and DNA Chromatography, 8th International Symposium on

Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8), 13-16 June, 2006, Ankara, Turkey.

B28. Manavbaşı, Y. and Süleymanoğlu, E., Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane

Interations with Langmuir-Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared

Spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry, FEBS-2006, Istanbul, Turkey.

64

B29. Manavbaşı, Y. and Süleymanoğlu, E., Fluorescence Microscopy and Interfacial

Characterization of DNA Condensation, Compaction and Release from Stable Virus-

Resembling Phospholipid-Nucleic Acid Self-Assemblies and Their Implications as Non-

Viral Gene Delivery Nanopharmaceuticals, Bilkent University, NANO-TRIII, Ankara

2007.

B30. Manavbaşı, Y. and Süleymanoğlu, E., An FTIR Spectrometric Study of the

Physicochemical Characteristics of Nucleic Acid-Phospholipid Nanoformulations

Designed for Gene Delivery at the Molecular Level, X. National Congress of

Spectroscopy, 04-07 July 2007, Izmir Institute of Technology, Urla, Izmir.

B31. Manavbaşı, Y. and Süleymanoğlu, E., Applying multilayer films and planar lipid

bilayers (BLMs) for designing nucleic acid nanobiosensors: some examples of

bioengineering at the molecular level, NANOMAT 2007, International Workshop on

nanobiotechnology & Genome Technologies, October 31-November 03, 2007, Antalya,

Turkey.

C. Yazılan uluslararası kitaplar veya kitaplarda bölümler :

C1. Huber, W., Süleymanoğlu, E., ve G. Steiner, “The hnRNP-D/AUF proteins - a novel group of autoantigens in rheumatology”, Pathogenesis and Diagnostic Relevance of Autoantibodies, ed. K. Conrad, R-L. Humbel, M. Muerer, ve Y. Shoenfeld, E.M.T., PABST Publishers, Dresden, 1998.

D. Ulusal hakemli dergilerde yayımlanan makaleler :

E. Ulusal bilimsel toplantılarda sunulan ve bildiri kitaplarında basılan bildiriler:

E1. Spectrophotometric Study of the Interaction Between Polyribonucleotides,

Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, VIth National Biophysical Congress,

September 28-30, 1994, Silivri - Istanbul, Turkey.

65

CURRICULUM VITAE Name : Ningur Family name : Noyanalpan Title : Prof. Dr. Affiliation : Gazi University, Faculty of Pharmacy Official address : Faculty of Pharmacy Gazi University Etiler 06330 Ankara TURKEY Date place of birth : March 10, 1944 İstanbul - TURKEY Nationality : Turkish Education : (from – to in degree received) 1962 - 1966 Ankara Pharmacist 1966 – 1969 Ankara Dr.Sc.Pharm.Med.Chem Post doc. 1970 – 1972 Charlottesville, VA. USA Assoc.prof. 1973 Ankara Turkey Doz.Dr. Full prof. February 1979 Ankara Turkey Prof.Dr.

Career/Employment

position: from - to employer

Assistant 1966 – 1969 Ankara University As.Med.Chem. Postdoc fellow 1970 - 1972 Charlottesville VA. USA. Dozent Dr. 1973 – 1979 Ank. Un. Head Dept. Med. Chem. Full professor 1979 – 1982 Ank. Un. Head Dept. Med. Chem. Dean 1982 - 1994 Gazi Un. Dean Faculty of Pharm. Professor 1994- Gazi Un. Head Dept. Med. Chem. Specialization: Main field: Medicinal Chemistry Other fields: Molecular Pharmacology,

Analytical Chemistry, Physical chemistry

Current res. interests: Computer aided design of the bioactive molecules particularly antihelmintic, anti HPNS activity compounds. Computation of rotational barriers for the most allowed configurations.

Fellowships, memberships: Turkish Pharmacists' Association, Chamber of Pharmacists of Ankara some other nonprofessional Societies

Grants received :British Council grants,

66

NATO grant UNICEF fellowship

Family status : Married relation education profession

Wife Faculty of Pharmacy Pharmacist

Son BS Bus. Adm. Un. Graduate Daughter State Conservatory Grad. Mezzo soprano Foreign languages : speaking writing understanding

English Fluent very good very good

French Fluent very good very good German Very good good good Russian very poor poor poor some others as hobby Hobbies : Language, reading, mechanical repairs

Sports branches

Interested : Basketball, skiing Practiced : skeet shooting (not hunting), fishing

Health conditions :Very good

Major operations :Appendectomy, pituitary adenomectomy (full prognosis) Impairement : None Major diseases : (hepatitis. tbc., etc.) None Publications list : Attached PUBLICATIONS of Prof.Dr. NINGUR NOYANALPAN 1- Text of Pharmaceutical Chemistry (Lecture Notes), 1969 Ankara Written by: Prof.Dr. Michel Bertucat (French) Translated by: Dr. Ningur Noyanalpan (Turkish) 2- Noyanalpan, N.: Studies on the alkaloids of Aconitum Cochleare Worosh Ankara 1971 (Ph.D. Thesis) 3- Noyanalpan, N. Evaluation of Some Plants Indeginous to Anatolia for the Purpose of Semi-synthesis of Steroidal Drugs. Ankara 1973 (Associate professorship Thesis) 4- Noyanalpan, N. Long Chan Hydrocarbons from Petroleum Ether Fraction of Cestrum fasciculatum (Endl.) Miers and Eriogonum tomestosum Michx.: Spectral Identification of n-Hentriacontane and n-Dotriacontane

Ecz.Fac.Mec. 4,40 (1974) 5-Kupchan,S.M.,Britton,R.M., Chiang,C.K., Noyanalpan, N., and Ziegler,M.F.: Tumor Inhibitors. 88. The Antileucemic Principles of Colchicum speciosum

Lloydia, 36 (3) 338 (1973)

67

6- Noyanalpan, N., Demir,H.: Studies on the Synthesis of new derivatives through structure modificatons of antitumor effective sugars (in turkish)

Ankara Ecz.Fak.Mec 7, 77 (1977) 7- Noyanalpan, N., Özden,T.: A New Quantitative Determination Method for Aspirin, Phenacetin, Caffein and Their Mixtures Using NMR Spectrometer.

Ankara Ecz.Fak.Mec. 7, 96(1977) 8- Noyanalpan, N.: Structure Activity Relationships in Medicinal Chemistry (in Turkish)

Pharmacia, 2,8 (1977) 9- Noyanalpan, N., Özden,T., Özden,S.; Triazene Derivatives l. Sulfaguanidine as a carrier for Substituted Triazeno Group.

Ankara Ecz.Fak.Mec. 7,104 (1977) 10- Noyanalpan, N., Özden,T.: Quantitative Determination of Meprobamate by NMR in Commercial Preparations Marketed in Turkey.

Ankara Ezc.Fac.Mec. 7, 189 (1977) 11- Noyanalpan, N., İren,B.: Studies on the synthesis and structure eluciadation of D-Homosteroids (in Turkish) (Ph.D. thesis of B. İren)

Ankara Ezc.Fac.Mec. 7, 197 (1977) 12- Noyanalpan, N.: Structure Activity Relationships in Medicinal Chemistry Part-II (in Turkish)

Pharmacia, 16 (1977) 13- Noyanalpan, N., Demir,H.: Studies on the Synthesis and Structure Elucidation of the derivatives of Mono and Dibromo Derivatives of Glucosamine

Ankara Ecz.Fak.Mec 7, 226 (1977) 14- Noyanalpan, N.: Textbook of Pharmaceutical and Medicinal Chemistry

A.Ü. Basımevi Ankara 1976 A.Ü. Eczacılık Fakültesi Yayınları No: 49 (in Turkish)

15- Noyanalpan, N., Nebioğlu,D.: Studies on the Photolytic Synthesis and Structure Elucidation of the Pregnane Derived D-Nor Steroids

Ankara Ecz.Fak.Mec. 8, 32 (1978) 16- Noyanalpan, N., Nebioğlu,D.: The Photolysis of Pregn-5-en-3beta-ol-20-diazo acetate.

Ankara Ecz.Fak.Mec. 8,47 (1978) 17- Noyanalpan, N., Atay,O., Özden,S.: Studies on the Antirheumatic Compunds Deriving from Anthranilic Acid and Substituted ArylAcetic Acid Marketed in Turkey

Ankara Ecz.Fak.Mec. 6, 80 (1978) 18- Noyanalpan, N.: Structure Activity Relationship (SAR) Studies on the Tricyclic Antidepresant Compounds Marketed in Turkey. I I

Ankara Ecz.Fak.Mec. 8, 134 (1978) 19- Tanker, N. , Şener, B. , Noyanalpan, N. , Lewis,J.R.: The Evaluation of Volatile Oils of Turkish Ruta Species in Terms of Methyl-n-nonylketone

Ankara Ecz.Fak.Mec. 10, 61 (198C)) 20- Özden,T. , Noyanalpan, N. , Özden.S.: Structure Activity Relationships in Pharmaceutical Chemistry-III De Novo Analysis Model

Fabad Farm.Bil.Der. 6, 94 (1981)

68

21- Özden,T. , Noyanalpan, N. , Özden.S.: Structure Activity Relationships in Pharmaceutical Chemistry-IV The Applications of De Novo Analysis Model

Fabad Farm.Bil.Der. 7, 17 (1982) 22- Noyanalpan, N.: Studies on the Sapogenols of Some Plants Indeginous to Anatolia or Cultivated for the Purpose of Using as Starting Material for the Synthesis of Steroidal Medicinals. The Symposium of Plant Origined Medicinal Raw material held in Eskişehir 27-29 May 1982 23- Noyanalpan, N., Işıkdağ,İ.: Synthesis of Some 2-Heterocyclic-substituted ) Berizimidazole Derivatives.

Chimica Acta Turcica 11 (3) 357-361 (1983) 24- Noyanalpan, N., Ayalp,A.: Studies on the Photolytic Products of Steroid Molecules Esterified with p-Benzoilbenzoic Acid

Ankara Ecz.Fak.Mec. 13(1-2), 12 (1984) 25- Noyanalpan,N. and Işıkdağ,İ.: Studies on the Synthesis, Structure Elucidation and Structure Activity Relationship of 2-substituted Benzimidazol Derivatives

Doğa Bilim Dergisi Seri C, 9(2), 183 (1985) 26- Noyanalpan,N., Şener,B. Türköz,S., Toker,G., Sarışeker,N.: Studies on the Sapogenols of Some Plants Indeginous to Anatolia or Cultivated for the Purpose of Using as Starting Material for the Synthesis of Steroidal Medicinals.

Hacettepe Ün. Ezc. Fak.Der. 5,(1) 17-21 (1985) 27- Noyanalpan,N., Şener,B., Toker,G., Tosun,F., Türköz,S., Sarışeker,N.: Studies on the Sapogenols of Some Plants Indeginous to Anatolia or Cultivated for the Purpose of Using as Starting Material for the Synthesis of Steroidal Medicinals. III The Sapogenols of Digitalis cariensis Boiss.

Hacettepe Ün. Ezc. Fak.Der. 5,(1) 23-26 (1985) 28- Noyanalpan,N., Tosun,A.: Studies on the Synthesis, Structure Elucidation of alfa-Metilen Benzo(d) gama-Butirolactone

Gazi Ecz.Fak.Der. l(l) 1, (1984) 29- Noyanalpan,N., Ayalp,A., Tosun,A., Özden,T.: The Synthesis, Structure Elucidation of 2-Piperidinoethyl Esters of para-Substituted Benzoic Acids

Gazi Ecz.Fak.Der. l(l) 41 (1984) 30- Noyanalpan,N. and Işıkdağ,İ.: The Studies of Different Reagents on the Synthesis of 2-Substituted Benzimidazol Derivatives and Their Comparison

Gazi Ecz.Fak.Der. 1(2) 61 (1984) 31- Noyanalpan,N., Tosun,A.: Microbiological Studies on 3-Methylene-2,3-dihydrobenzofuran-2-one II

Gazi Ecz.Fak.Der. 2(l) 9 (1965) 32- Tosun,A., Özden,T., Noyanalpan,: 2-Piperidinoethyl Esters of para Substituted Benzoic Acids. Synthesis and Structure Elucidation-II

Gazi Ecz.Fak.Der. 2 (2), 59 (1985) 33- Evren.N., Şener,B., Noyanalpan,N.: Application of HPLC to the Analysis of

Opium Alkaloids and Derivatives.

Gazi Ecz.Fak.Der. 2(2), 67 (1985)

69

34- Büyükbingöl,E., Noyanalpan,N.: Synthesis, Spectral, Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) and Spasmolytic Activity Studies of 2-Benzylbenzimidazol Derivatives.

Gazi Ecz.Fak.Der. 2(2) 81 (1985) 35- Noyanalpan,N., Şener,E.: The Quantitative Structure-Activity Relationships of Antihistaminic Active 5-Substituted-2-(p-Substituted-Benzyl)Benzoxazole Derivatives

Gazi Ecz.Fak.Der. 3(l) 1 (1986) 36- Noyanalpan,N., Uçucu,Ü., Studies On The Synthesis of Methyl-2-Benzimidazolyl Carbamate Derivatives.

Gazi Ecz.Fac.Der. 3 (1) 29 (1996) 37- Öztürk,Y., Büyükbingöl,E., Noyanalpan,N.: On The Relaxant Activity of Some Benzimidazole Derivatives on the Rat Duedonum. Approaches to the Mechanism

Gazi Ecz.Fak.Der. 3(2) 153 (1986) 38- Şener,E., Yalçın,İ., Akın,A., Noyanalpan, N.: Antifungal Activity of 2-Benzylbenzoxazole Derivatives and QSARs by Free-Wilson Analysis

Gazi Ecz.Fak.Der. 4(l) 1 (1987) 39- Noyanalpan,N., Berçin,E., Çakır,B., Abbasoğlu,U.: Benzimidazole Derivatives: (2-Benzylidene hydrazino)-Benzimidazoles, Synthesis and Anltifungal Activities.

Gazi Ecz.Fak.Der. 4 (1) 33 (1987) 40- Noyanalpan,N., Berçin,E. , Çakır,B. Abbasoğlu,U.: Benzimidazole Derivatives: (2--Benzylidene Hydrazino)-Benzimidazoles, Synthesis and Antifungal Activities.

Gazi Ecz.Fak.der. 4 (1) 47 (1987) 41- Çakır,B., Uçucu,Ü., Büyükbingöl,E., Abbasoğlu,U., Noyanalpan,N.; bis-Benzothiazole Derivatives and Their Antifungal Activities.

Gazi Ecz.Fac.Der. 4(2) 143 (1987) 42- Çakır,B., Şahin,M.F., Noyanalpan,N.: Studies on Some 1,5-Benzodiazepine Derivatives.

Gazi Ezc.Fak.Der. 5(l) 25 (1988) 43- Büyükbingöl,E., Uçucu,Ü., Abbasoğlu,U., Noyanalpan,N.: Benzimidazole Derivatives: bis Benzimidazoles and Their Antifungal Activities.

Gazi Ecz.Fac.Der. 5(l) 71 (1989) 44- Noyanalpan,N., Şener,B., Tosun,F., Türköz,S., Toker,G.: I. The Sapogenols of Yucca aloifolia L.

V. Meeting of Medical Raw Materials of Plant Origin Handbook (Ed. Sezik,E., Yeşilada,E.) 39-42 Sanem Matbaacilik Ankara (1987) 45- Büyükbingöl,E., Jabbar,A., Lewis,J.R., Noyanalpan,N., Şener, B.: Phytochemistry of Turkish Ruta Species, Ruta montana and Ruta chalepensis

IV. Meeting of Medical Raw Materials of Plant Origin Handbook (Ed. Şener,B) Gazi Üniv. Publications, Publication number: 113 Ankara 46- Evren,N., Şener,B., Noyanalpan,N.: Studies on the Alkaloids of the nonchiseled Puppy Heads Growing in Turkey.

Farmacia JTPA, 28:61 (2) 45 (1988) 47- Noyanalpan,N., Büyükbingöl,E., Yurtsever,E., Bercin,E., Şahin.F.: Structure Activity Relationship Studies on Benzimidazole Derivatives.

50th International Congress of F.I.P. Istanbul Turkey 3-7 September- 1990

70

48- Noyanalpan.N.: Pharmaceutical Chemistry Teaching in Turkey 50th International Congress of F.I.P. Istanbul Turkey 3-7 September 1990

49- Tosun,A., Özden,T, Noyanalpan,N.: 2-piperidinoethyl Ester-s of Para Substitted Benzoic Acids, Synthesis and Structure Elucidation-III

Gazi Ecz. Fak. Der. 6(2) 129 (1989) 50- Şener,B., Mutlugil,A., Noyanalpan,N., Lewis,J.R.; Alkaloid from Haplophyllum myrtifolium Bois.

Gazi Ecz. Fak. Der. 7(l), 17 (1990) 51- Yıldır,İ., Uzbay,T., Noyanalpan,N.: Synthesis of 2-(substitutedphenyl) Benzimidazole Derivatives and Their- Structure Activity Relationships

Gazi Ecz. Fak. Der. 7(2), III (1990) 52- Perçiner,H., Abbasoğlu,U., Noyanalpan,N.: A Study on Antiviral 2-(alpha-hydroxy benzyl) Benzimidazole Derivatives

Gazi Ecz. Fak. Der. 7 (2), 125 (1990) 53- Noyanalpan,N.: Curriculum Studies for The Faculty of Pharmacy.

TEB Haberler (48), 4 (1990) 54- Noyanalpan,N.: Curriculum Studies for The Faculty of Pharmacy.

TEB Haberler (49), 5 (1991) 55- Noyanalpan,N., Atay,O.: Spectrophotometric Quantitative Determination of Trimethoprim and Sulfamethoxazole in the Tablets Using Absorbance Ratio Method.

FABAD Far.Bil.Der. 15(l), 19 (1990) 56- Noyanalpan,N., Berçin,E.,.Çakır,B., Abbasoğlu,U.: 2-(Benzylidene-hydrazino) benzimidazoles, Synthesis and And Antifungal Activities

J.Fac.Pharm. Gazi 4(l),33-35 (1987). 57- Noyanalpan,N., Berçin,E.,.Çakır,B., Abbasoğlu,U.: 2-(Benzylidene-hydrazino) benzothiazoles, Synthesis and And Antifungal Activities

J.Fac.Pharm. Gazi 4(l), 47-56 (1987). 58- Berçin,E., Eroğlu,Y., Noyanalpan,N.: Synthesis and Structure Elucidation of some new Acetophenone- and Thiazolo(3,2-a)benzimidazole Derivatives I

J. Fac.Pharm Gazi 10(2),93-104 (1993). 59- Berçin,E., Uysal,M., Noyanalpan.N.: Synthesis of some new 2-(substituted bezylidene)-6(or 7)-substituted-Thiazolo[3,2-a)benzimidazol-3(2H)-ones VI",

J.Fac.Pharm. Gazi 10(2),143-151 (1993). 60- Berçin,E., Uysal-Gökçe,M., Abbasoğlu,U., Noyanalpan,N.; Nitroethane Derivatives as New Addition products of β-Nitrostyrenes and Their Antimicrobial Activities I

J. Fac.Pharm. Gazi 12(2),117-128 (1995). 61- Berçin,E, Uysal-Gökçe,M., Özçelik,B., Yurtsever,M., Noyanalpan,N.: Nitropropane Derivatives as New Addition products of β-Nitrostyrenes and Their Antimicrobial Activities II

J. Fac.Pharm. Gazi 12(2),173-187 (1995). 62- Berçin,E, Uysal-Gökçe,M., Noyanalpan,N.: Reactions of New Nitroethane Derivatives; Formation of New Benzothiazepines and Benzothiazoles III.

J. Fac.Pharm. Gazi 13(l),85-96 (1996).

71

63- Ersan,S., Nacak,S., Nilgün,A., and Noyanalpan,N.: Synthesis and Antimicrobial Activity of 1-Dialkylaminomethyl2-(p-substituted Phenyl)-5-substituted Benzimidazole Derivatives Arzneim.-Forsch./Drug Res. 47 (1), 4, 410-412 (1997) 64- Ersan,S., Nacak,S., Noyanalpan,N., and Yeşilada.E.:Studies on Analgesic and Anti-inflammatory Activities of 1-Dialkylaminomethyl-2- (p-substituted Phenyl)-5-substituted Benzimidazole Derivatives 65- Yasemin Dündar, Serdar Ünlü, Erden Banoğlu and Ningur Noyanalpan “Synthesis Of Some New 4,5-Diphenyl-2-Oxo-3H-1,3-Oxazole Derivatives As Inhibitors Of Cyclooxygenase (Cox) Enzymes” XIXth International Symposium on Medicinal Chemistry ISMC 2006, İstanbul, 29 Ağustos-2 Eylül, 2006. 66- Yasemin Dündar, Mehtap Gökçe, Esra Küpeli, Mustafa Fethi Şahin, Ningur Noyanalpan. “Synthesis And Analgesic And Anti-Inflammatory Activity Of Ethyl (6-Substituted-3(2H)-Pyridazinone-2-yl)Acetate Derivatives” 8th International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8), Ankara, Haziran 13-16, 2006. 67- Yasemin Dündar, Bilge Çakır, Ningur Noyanalpan, “Synthesis Of Some New 1-Acylthiosemicarbazides And 1,2,4-Triazole-5-Thiones.” 2nd International Meeting on Medicinal and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-2, Antalya, Ekim 10-14, 2004. 68- Serdar Ünlü, Tijen Önkol, Yasemin Dündar, Berna Ökçelik, Esra Küpeli, Erdem Yesilada, Ningur Noyanalpan, M. Fethi Sahin, “Synthesis And Analgesic And Anti-İnflammatory Activity Of Some New (6-Acyl-2-Benzoxazolinone And 6-Acyl-2-Benzothiazolinone Derivatives With Acetic Acid And Propanoic Acid Residues” Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 2003, 336, 353–361. 69- Ersanli CC, Dündar Y, Sari U, Noyanalpan N, Odabasoğlu M, Erdönmez A “Methyl 3-(2-Oxobenzothiazolin-3-yl)-Propanoate” Acta Crystallographıca Section E-Structure Reports Onlıne 59: O1604-O1606 Part 11, NOV 2003. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 47 (11), 7, 834-836 (1997) 70- DÜNDAR, Yasemin; ÇAKIR, Bilge; KÜPELİ, Esra; ŞAHİN, M. Fethi; NOYANALPAN, Ningur: “Synthesis of Some New 1-Acylthiosemicarbazides and 1,2,4-Triazol-5-Thiones, and Their Analgesic and Anti-Inflammatory Activities” Turk J. Chem., 31 (2007) , 301– 313. 71- Gokce, Mehtap; Utku, Semra; Bercin, Erdogan; Oezcelik, Berrin; Karaoglu, Taner; Noyanalpan, Ningur. Synthesis and in vitro antimicrobial and cytotoxicity activities of 2-[(2-nitro-1-phenylalkyl)thio]benzoic acid derivatives. Turkish Journal of Chemistry (2005), 29(2), 207-217. CODEN: TJCHE3 ISSN:1300-0527. CAN 144:108057 AN 2005:458986 CAPLUS 72- Gokce, Mehtap; Oezcelik, Berrin; Bakir, Goekcen; Karaoglu, Taner; Bercin, Erdogan; Noyanalpan, Ningur. Antiviral and antimicrobial activities of new

72

nitrobutane derivatives. Arzneimittel Forschung (2004), 54(12), 891-897. CODEN: ARZNAD ISSN:0004-4172. CAN 142:348103 AN 2005:52823 CAPLUS 73- Ersanli, Cem Cuneyt; Dundar, Yasemin; Sari, Ugur; Noyanalpan, Ningur; Odabasoglu, Mustafa; Erdoenmez, Ahmet. Methyl 3-(2-oxobenzothiazolin-3-yl)propanoate. Acta Crystallographica, Section E: Structure Reports Online (2003), E59(11), o1604-o1606. CODEN: ACSEBH ISSN:1600-5368. CAN 140:120114 AN 2003:852139 CAPLUS 74- Unlu, Serdar; Onkol, Tijen; Dundar, Yasemin; Oekcelik, Berna; Kuepeli, Esra; Yesilada, Erdem; Noyanalpan, Ningur; Sahin, M. Fethi. Synthesis and analgesic and anti-inflammatory activity of some new (6-acyl-2-benzoxazolinone and 6-acyl-2-benzothiazolinone derivatives with acetic acid and propanoic acid residues. Archiv der Pharmazie (Weinheim, Germany) (2003), 336(8), 353-360. CODEN: ARPMAS ISSN:0365-6233. CAN 140:111310 AN 2003:749520 CAPLUS 75- Ersan Seyhan; Nacak Sultan; Noyanalpan Ningur; Yesilada Erdem: Studies on analgesic and anti-inflammatory activities of 1-dialkylaminomethyl-2-(p-substituted phenyl)-5-substituted benzimidazole derivatives. Arzneimittel-Forschung (1997), 47(7), 834-6. Journal code: 0372660. ISSN:0004-4172. PubMed ID 9272240 AN 97418234 MEDLINE PS. Prof.Dr. Ningur Noyanalpan is the founder of Journal of Faculty of Pharmacy Gazi University that started at 1984. ÖZGEÇMİŞ

9. GENEL

DÜZENLEME TARİHİ : 20 Nisan 2008

T.C. KİMLİK NO : 19114019488

ÜNVANI ADI SOYADI : Yrd. Doç. Dr. Kamile ÖZTÜRK

YAZIŞMA ADRESİ : Aksaray Ünv. Fen-Edb Fak. Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı

DOĞUM TARİHİ ve YERİ : 01.01.1971

TEL : 0382 215 1554 GSM: 0532 516 0479

E-POSTA : kamileztrk@yahoo.com.tr FAKS : 10. EĞİTİM (Son aldığınız dereceden / diplomadan başlayarak yazınız)

73

ÖĞRENİM DÖNEMİ DERECE (*) ÜNİVERSİTE ÖĞRENİM ALANI

1997-2005 Doktora Hacettepe Üniversitesi Moleküler Biyoloji

1993-1997 Yüksek Lisans Hacettepe Üniversitesi Moleküler Biyoloji

1987-1993 Lisans Hacettepe Üniversitesi Fen Fak. Biyoloji Bölümü

(*) Diploma Türü (Lisans, Y.Lisans, vb.) 11. AKADEMİK ve MESLEKİ DENEYİM

GÖREV DÖNEMİ ÜNVAN ÜNİVERSİTE BÖLÜM

2007- Yrd. Doç. Dr Aksaray Üniversitesi Biyoloji Bölümü

2006- 2007 Dr. Biyolog GATA Ar-Ge Merkezi

2004- 2006 Dr. Biyolog GATA Mikrobiyoloji Bilim Dalı

1996- 2004 Araş. Gör. Hacettepe Üniversitesi Biyoloji Bölümü

12. YAYIN BİLGİLERİ ISI indexine kayıtlı dergilerde yayınlanan 6

Diğer indexlere kayıtlı / Hakemli dergilerde yayınlanan

2

Indexlere kayıtlı / Hakemli konferans kitaplarında yayınlanan

3

Diğer yayınlar (Tebliğ ve poserler) 6

TOPLAM 17

5. YAYINLARINIZA ALDIĞINIZ TOPLAM ATIF SAYISI (Web of Science‘a göre) : 2 6. PROJE DENEYİMİ

YER ALDIĞINIZ PROJE SAYISI

Proje yürütücüsü olarak Araştırmacı olarak

Kurumsal (BAP vb.) 4

Ulusal 2

Uluslararası -

7. DİĞER AKADEMİK FAALİYETLER ( Hakemlik/Danışmanlık/Editörlük Deneyimi)

74

Son bir yılda uluslararası indekslere kayıtlı makale/ derleme için yaptığınız danışmanlık sayısı

Son bir yılda projeler için yaptığınız danışmanlık sayısı

Tamamlanan Devam Eden

Y.Lisans

Doktora

Danışmanlığını yaptığınız öğrenci sayısı

Uzmanlık

Editör/Yardımcı Editör olduğunuz dergiler

1- 2- 3-

8. SEÇİLMİŞ YAYINLAR (Proje konusuyla ilgili en önemli 5 yayınınız)

YAZAR(LAR) MAKALE/BİLDİRİ BAŞLIĞI

DERGİ/TOPLANTI ADI

CİLT/SAYI/SAYFA

TARİH

K. Öztürk, A. Olgun, E. Saruhan, A. Ergen, Ş. Akman, M. K. Erbil

Mitochondrial DNA Alterations in Aging

Ann NY Acad. Sci 1100/246-249 2007

E. Saruhan, A. Olgun, K. Öztürk, Ş. Akman, M.K. Erbil

Age Related Paraoxonase Activity Changes in Turkish Populations

Ann NY Acad. Sci 1100/ 218-222 2007

A.Olgun, K. Öztürk, S. Bayır, Ş. Akman, M. K. Erbil

Deuteronation and Aging

Ann NY Acad. Sci 1100/ 400-403 2007

M. Durusoy, E. Karagöz, K. Öztürk

Assessment of the Relationship Between the Antimutagenic Action of Riboflavin and Glutathione and the Levels of Antioxidant Enzymes

The Journal of Nutritional Biochemistry

13/ 598-602. 2002

K. Öztürk, M. Durusoy The detection and comparison of the genotoxic effects of some nitro aromatic compounds by the umu and SOS chromotest systems

Toxicology Letters

108/ 63-68 1999

CURRICULUM VITAE

75

Yurii D. Nechipurenko, Ph.D.

The DNA-Protein Recognition Laboratories EIMB (Engelhardt Institute of Molecular Biology), Vavilov str., 32 Moscow, 119991 Russia

MSU (Moscow State University) PERSONAL

CONTACT NUMBERS: E-mail: yurii.nechiporenko@gmail.com, nech99@mail.ru

Tel: +7 (499) - 135 1092 (work), (495)-694-01 62 (home)

+7 (926) - 218 34 16 (mobile) Fax: + 7(499)-135 14 05 Home address: Sadovaya-Samotechnaya 7 - 14 Moscow 127473, Russia http://www.hrono.ru/avtory/publ.html

MARITAL STATUS: Married, one children

EDUCATION

2005 Dr. Sci. Moscow State University, Thesis Title: Statistical Thermodynamics of binding of Ligands on DNA and RNA

1983 Ph.D., Moscow State University,

Postgraduate Student of EIMB, Russian Academy of Sciences, Moscow Thesis Title: Cooperative Effects Upon Binding of Ligands on DNA

1979 M.Sc., Faculty of Physics,

Moscow State University Thesis Title: Cooperative Binding of Long Ligands on Nucleic Acids

PROFESSIONAL EXPERIENCE

2002-present Senior Scientist Institute of Molecular Biology,

Russian Academy of Sciences, Moscow 119991, Russia

76

1983-2001 Research Associate Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow 119991,

Russia

1982-1983 Junior Research Associate Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow 119991,

Russia

SCIENTIFIC INTERESTS - Binding of proteins, dyes and oligonucleotides to DNA and RNA - Nanostructures, molecular constructions - Mathematical modelling in biophysical chemistry. PUBLICATIONS

1. Yury Nechipurenko, Sergey Grokhovsky, Georgy Gursky, Dmitry Nechipurenko and Robert Polozov DNA-Based Nanostructures: Changes of Mechanical Properties of DNA upon Ligand Binding. In collection: NATO Science for Peace and Security Series B: Physics and Biophysics, Nanomaterials for Application in Medicine and Biology, Springer, 2008, p. 59-67.

2. Grokhovsky S.L., Il’icheva I.A., Nechipurenko D.Yu., Panchenko L.A., Polozov R.V., Nechipurenko Yu.D. Heterogeneity of DNA local structure and dynamics: ultrasound studies. Biofizika 2008, V.53, N3, P.417-425.

3 Lando D., Nechipurenko Yu. Distribution of unselectively bound ligands along DNA. J/ of Biomolecular structure and dynamics, 2008, V. 26, P. 187 – 196 4. Nechipurenko Yu.D, Statistical thermodynamics of DNA-ligand binding. Russ. Chem. Journal, 2007, V.51, P.23-30. 5. Vorob'ev E.A., Nechipurenko Yu.D., Salianov V.I., Evdokimov Yu.M. Description of the binding of chitosan to DNA at different ionic strengths in terms of the theories of ion condensation and adsorption Biofizika. 2007 Jul-Aug;52(4):636-42. 6. Matveeva O, Nechipurenko Y, Rossi L, Moore B, Saetrom P, Ogurtsov AY, Atkins JF, Shabalina SA. Comparison of approaches for rational siRNA design leading to a new efficient and transparent method. Nucleic Acids Res. 2007;35(8):e63. Epub 2007 Apr 10.

77

7. Zakharov M.A., Nechipurenko Yu.D., Lortkipanidze G.B., Evdokimov Yu.M. The thermodynamic stability of nanoconstructions based on the double-stranded DNA molecules Biofizika. 2005 Nov-Dec;50(6):1036-41. 8. Zakharov M.A., Sokolovskaia L.G., Nechipurenko Yu.D., Lortkipanidze G.B., Evdokimov Yu.M. The formation of nanoconstructions based on double-stranded DNA molecules. Biofizika. 2005 Sep-Oct;50(5):824-32.

9. Zakharov M.A., Yevdokimov Yu.M., Skuridin S.G. and Nechipurenko Yu.D. Nanotechnology Based on Spatially Fixed ds DNA (RNA) Molecules. Nanotech 2005 Vol. 1. P. 288 – 291.

10. Nechipurenko YD, Jovanovic B, Riabokon VF, Gursky GV. Quantitative methods of analysis of footprinting diagrams for the complexes formed by a ligand with a DNA fragment of known sequence. Ann N Y Acad Sci. 2005 V.1048 P. 206-214.

11. Yevdokimov YM, Skuridin SG, Nechipurenko YD, Zakharov MA, Salyanov VI, Kurnosov AA, Kuznetsov VD, Nikiforov VN. Nanoconstructions based on double-stranded nucleic acids. Int J Biol Macromol. 2005 V.36 P.103-15.

12. Nikiforov V. N., Kuznetsov V. D., Nechipurenko Yu. D., Salyanov V. I., Yevdokimov Yu.M. Magnetic Properties of Copper as a Constituent of Nanobridges Formed between Spatially Fixed Deoxyribonucleic Acid Molecules. JETP Lett. 2005 V.81, P. 264-265.

13. Ryabokon VF, Nechipurenko YD, Gurskii GV. Quantitative methods of analysis of footprinting diagrams for the complexes formed by a ligand and a DNA fragment of known sequence. Dokl Biochem Biophys. 2004 V. 398 P. 329-33

14. Nechipurenko Yu. D., Wolf A.M., Salyanov V.I., Yevdokimov Yu.M. Equilibrium Adsorption of ligands on DNA (for Chitosan). Journal of Experimental and Theoretical Physics. 2004, V.98, P. 93-101.

15. Nechipurenko Yu. D., Wolf A.M., Gursky G.V. Statistical fluctuations in processes of gene expression regulation: consideration of the problem from point of view of statistical mechanics. Biofizika. 2003 V. 48. P. 986-997. 16. Nechipurenko Yu. D., Wolf A.M., Yevdokimov Yu.M.Distribution functions, describing the binding of extended ligands with DNA molecules. Possible use for cases of DNA condensation. Biofizika. 2003.V. 48, P. 802-811. 17. Nechipurenko Yu. D., Gursky G.V. Thermodynamic models of binding ligands to nucleic acids. Biofizika. 2003. V. 48. P. 773-796. 18. Nechipurenko Yu. D., Riabokon V.F., Semenov S.V., Yevdokimov Yu.M.Thermodynamic models, describing formation of "bridges" between nucleic acid molecules and liquid crystals. Biofizika. 2003. V. 48. P. 635-643. Russian. 19. Yevdokimov Yu.M., Salyanov V.I., Nechipurenko Yu. D., Skuridin S.G., Zaharov M.A., Spener F., Palumbo M., Molecular constructions on the basis of nucleic acids, fixed in structure of liquid crystal. Mol Biol (Mosk) 2003, V.37, 340-355.

78

20. Nechipurenko Yu. D., Salyanov V.I., Zaharov M.A., Yevdokimov Yu.M. "Bridge" structures between nucleic acid molecules fixed in the structure of a liquid crystal. Biofizika, 2002, V.47, P.600-606. 21. Nechipurenko Yu. D., Streltsov S.A., Yevdokimov Yu.M. Thermodynamic model of the formation of bridges between nucleic acid molecules in a liquid crystal. Biofizika, 2001, V.46, P.428-435. 22. Nechipurenko Yu.D., Mikheikin A.L., Streltsov S.A., Zasedatelev A. S., and I.R. Nabiev I.R. Mixed mode of ligand-DNA binding results in S-shaped binding curves. Journal of Biomol. Structure & Dynamics, 2001, V.18, P. 703-708. 23. Mikheikin A.L., Nechipurenko Yu.D., Zasedatelev A.S., Streltsov S.A. Competition Between Different Ligand-DNA Complexes Produced S-shaped Binding Curves. J. Biomol. Struct. Dynam. 2001, V. 18, P. 913. 24. Streltsov S.A., Mikheikin A.L., Nechipurenko Yu. D. Interaction of DNA Molecules in the Presence of DNA Topoisomerase I Inhibitor Topotecan. J. Biomol. Struct. Dynam., 2001, V. 18, P. 914-915. 25. Streltsov SA, Mikheikin AL, Nechipurenko Yu.D. Interaction of topotecan--a DNA topoisomerase I inhibitor--with dual-stranded polydeoxyribonucleotides. II. Formation of a complex containing several DNA molecules in the presence of topotecan. Mol Biol (Mosk). 2001, V.35, P.442-450. 26. Nechipurenko Yu.D., Mikheikin A.L., Streltsov S.A. New physical interpretation of S-shaped curves for DNA-ligand binding: competition between different ligand complexes. Biofizika, 2000 V.45, P. 1011-1015. 27. Streltsov S.A., Borodina M.V., Nechipurenko Yu.N., Semenov T.E. Trivaline initiates formation of homo- and heteroquadruplex DNA structures. Biofizika. 1997. V.42. P.378-388. 28. Nechipurenko Yu.D., Popov N.V., Shabalina S.A., Isaev M.A., Matveeva O.V. A model of multiple contacts, describing the interaction of rRNA sites with mRNA. Biofizika. 1995, V.40, P.1208-1213. 29. Churikov N.A., Nechipurenko Yu.D. Parallel complementary sequences in natural DNA: the parallel biosynthesis hypothesis. Dokl. Akad. Nauk SSSR. 1991, V. 318, P.1233-1238. 30. Chzhu Ts.D., Li M.G., Siui L.D., Chzhu Ts.Ts., Khu Ts.Iu., Siui Ia.L., Chzhan L.P., Khan' I.Ts., Chernov B.K., Nechipurenko Yu.D., et al. Basic characteristics of a parallel dual DNA helix by scanning tunnel microscopy data. Dokl. Akad. Nauk SSSR. 1991, V.317, P.1250-1253.

79

31. Akhrem A.A., Lando D.Yu., Shpakovskii A.G., Nechipurenko Yu.D., Arutiunian S.G. The effect of long-range interactions between adsorbed ligands on the DNA helix-coil transition. Mol Biol (Mosk). 1990, V.24. P.649-656. 32. Iovanovich B., Nechipurenko Yu.D. Analysis of distribution of ligands adsorbed on DNA fragments. Mol Biol (Mosk). 1990, V.24. P.478-86. 33. Tchurikov N.A., Chernov B.K., Golova Y.B., Nechipurenko Yu.D. Parallel DNA: generation of a duplex between two Drosophila sequences in vitro. FEBS Lett. 1989, V. 257, P.415-418. 34. Sprizhitsky Yu.A., Nechipurenko Yu.D., Alexandrov A.A., Volkenstein M.V. Statistical analysis of nucleotide runs in coding and noncoding DNA sequences. J Biomol Struct Dyn. 1988, V.6, P.345-358. 35. Nechipurenko Yu.D. Anticooperative interactions between the nearest neighbor chromatosomes. Biofizika. 1988, V.33, P.580-583. 36. Sprizhitskii Yu.A., Nechipurenko Yu.D, Aleksandrov AA, Vol'kenshtein MV. Characteristics of nucleotide blocks in coding and non-coding DNA sequences from different organisms. Mol Biol (Mosk). 1988, V.22, P.338-56. 37. Nechipurenko Yu.D., Gursky G.V. Cooperative effects on binding of proteins to DNA. Biophys. Chem. 1986, V.24, P.195-209. 38. Nechipurenko Yu.D., Vol'kenshtein M.V. Analysis of the nucleosome arrangement on satellite DNA. Dokl. Akad. Nauk SSSR. 1986, V.286, P. 216-220. 39. Nechipurenko Yu.D., Gurskii G.V. Analysis of the binding of proteins and antibiotics with DNA fragments. Dokl Akad Nauk SSSR. 1985, V. 281, P.213-216. 40. Nechipurenko Yu.D. Binding of small molecules with nucleic acids possessing tertiary structure. Biofizika. 1985, V. 30, P.231-232. 41. Nechipurenko Yu.D., Vol'kenshtein M.V. Synonymous codon usage at the ends of double-stranded regions in the secondary structure of mRNA. Dokl Akad Nauk SSSR. 1985. V.282, P.721-724. 42. Skamrov A.V., Ribalkin I.N., Beabealashvili R.Sh., Gottikh B.P., Grokhovsky S.L., Nechipurenko Yu.D., Zasedatelev A.S., Gursky G.V., Zhuze A.L., Khorlin A.A. Specific coverage of DNA by distamycin A, netropin and bis-netropsin molecules from the DNAse I. Mol Biol (Mosk). 1985, V. 17, P. 177-195.

80

43. Nechipurenko Yu.D. Cooperation effects in binding of large ligands to DNA. II. Contact interactions between adsorbed ligands. Mol Biol (Mosk). 1984, V. 18, P.1066-1080. 44. Nechipurenko Yu.D. Zasedatelev A.S., Gurskii G.V. Cooperative effects during the binding of large ligands with DNA. Non-contact interaction between adsorbed ligands. Mol Biol (Mosk). 1984, V. 18, P. 798-812. 45. Kukhanova M.K., Burd S.B., Viktorova L.S., Nechipurenko Yu.D., Gottikh B.P. Interaction of substrates and substrate-like inhibitors with the peptidyltransferase center from Escherichia coli ribosomes. Mol Biol (Mosk). 1984,V.18, P.691-703. 46. Nechipurenko Yu.D., Krylov A.S., Zasedatelev A.S., Gurskii G.V. Interactions between distamycin A analogs bound to DNA Mol Biol (Mosk). 1984, V.18, P.332-342. 47. Nechipurenko Yu.D., Bourd S.B. Theoretical model for binding of ligands to ribosome. Europ. Journal of Biochemistry, 1983, 135, 469-470. 48. Nechipurenko Yu.D. Determination from binding isotherms of thermodynamic parameters characterizing interactions between ligand molecules bound DNA. Studia Biphys. 1982, 87, 217-218. 49. Streltsov S.A., Khorlin A.A., Surovaya A.N., Gursky G.V., Zasedatelev A.S., Nechipurenko Yu.D., Zhuze A.L., Gottikh B.P. Oligo-L-valin binds preferentially to GC-regions on DNA. Studia Biophysica, 1982, 87, 189-190. 50. Surovaya A.N., Streltsov S.A., Khorlin A.A., Gursky G.V., Nechipurenko Yu.D., Zasedatelev A.S., Zhuze A.L., Gottikh B.P. Specific binding interactions between DNA and oligopeptides which model the recognition sites of regulatory proteins. Studia Biophysica, 1982, 87, 191-192. 51. Nechipurenko Yu.D. Thermodynamic parameters characterizing interaction between ligand molecules adsorbed on a polymer. Biofizika. 1982 V. 27. P.391-398. 52. Nechipurenko Yu.D. Determination from binding isotherms of thermodynamic parameters characterizing interactions between ligand molecules bound on DNA. Studia Biophysica. 1982. V. 87. P. 217-218. 53. Nechipurenko Yu.D, Zasedatelev A.S, Gurskii G.V. Theory of one-dimensional adsorption on homopolymer. Different orientation of bound ligand molecules. Biofizika. 1979, V. 24, P.351-361. AWARDS

Stipend by the George Soros foundation, 1993

81

PROFESSIONAL SKILLS BIOHYSICAL CHEMISTRY: Mathematical modeling of nucleic acids - ligand

binding PROGRAMING: Fortran, Mathcad EXPERIMENTAL: Phys-Chem Experiments in Solution (CD, UV, Fluorescence,

Melting curve) MEMBERSHIP: Member of editorial board of Bioinformation.net CURRICULUM VITAE ALEXANDER S. KRYLOV PERSONAL DATA Address Work: Institute of General Pathology and Pathophysiology Russian Academy of Medical Sciences, street Batliyskaya 8, 121315, Moscow, Russia. Tel: +7-(495)-601-2155, Fax: (7-095) 151-17-56 E-mail: akrylo2@mail.ru Home: Polykarpova 8, flat 87, Moscow, 125284, Russia Tel: +7-(495)-945-1932 Mobile: +7-(917)-518-59-15 EDUCATION: 1977-1980 Post-graduate course in the Engelhardt Institute of Molecular Biology , Moscow, Russia. Ph.D in Molecular Biophysics, June 1981 Ph.D. thesis:” The mechanism of DNA AT pairs recognition by antibiotic distamycin A” 1969 – 1975. Department of Molecular Biophysics, Physico-Chemical Faculty, Moscow Institute of Physics and Technology (MIPT) 1975. Diploma M.S. in Physical Chemistry. PROFESSIONAL EXPERIENCE 2004 – now. Institute of General Pathology and Pathophysiology Russian Academy of medical Sciences, street Batliyskaya 8, Leading Researcher and Consultant in Stemedica Ltd, USA. Biochemistry of Lipids and Lipid – DNA Interaction. Biochemistry and biochemical aspects of cell biology. 1999-2004. BioChip Center in Engelhardt Institute of Molecular Biology, Moscow, Russia, Research Associate and consultant in US company ALGODIGN, LLC Nucleic Acids-Protein and NA – Lipid interactions Application, developing of microchip techniques, PCR on microchips, binding of proteins to microchip, DNA hybridization on microchip.

82

1993-1999. Institute of Experimental Cardiology, Cardiology Research Center of Russia, Moscow, Russia. Research Associate. Research in the field of biochemistry of atherosclerosis and role of Oxysterol Binding Protein. In collaboration with professor E.B.Thompson, UTMB, Galveston, Texas, USA. 1990-1999. The D.I. Ivanovsky Institute of Virology Russian Academy Medical Sciences, Moscow, Russia. Senior Research Scientist Research in the field of applied biochemistry purificacion of recombinant hepatitis B surface antigen. In collaboration with Cadila Laboratories Ltd. Ahmedabad, India. 1986-1990. Institute of Biotechnology, Ministry of Medical Industry, Moscow, Russia. Senior Research Scientist. Research in field of enzymes of carbohydrate exchange and investigation of mechanism of enzyme catalysis. 1975-1986. Engelhardt Institute of Molecular Biology, Moscow, Russia. Probationer, Post graduate, Junior Research Scientist. Research in the field of Nucleic Acids - Protein Recognition, Antibiotics binding to specific DNA sequences RESEARCH EXPERIENCE Nucleic Acids – Protein (and Lipid) Interaction on the Microchip. Antibiotics and Drugs – Nucleic Acids Interaction on the Microchip. Nucleic Acids – Protein and Ligand Interaction measured by optical methods:(UV-Vis spectra, fluorescence, CD spectra). Enzymatic reactions (PCR) on the Microchip. Proteins (enzymes and vaccines) purification, electrophoretic analysis and modification. Enzymatic catalysis: enzymes of carbohydrate exchange. Antibiotics investigation. Nucleic Acids isolation and analysis: cloning, PCR, MAJOR RESEARCH INTERESTS 1. Nucleic Acids – Protein Interactions . and Lipids – DNA Interactions. 2. Investigation of biochemical reactions by means of biochips (DNA Microarrays) 3. Drugs and dyes binding to DNA measured by microchip and optical methods. 4. General Biochemistry: Enzyme catalysis and protein purification and investigation. Antibiotics and their mechanism of action. TEACHING ACTIVITIES Moscow Institute of Physics and Technology (MIPT),Department of Molecular Biophysics. Lecturer of the course “Methods of Applied Biochemistry”. PATENTS United States Patent Application, N 20030073091 Filed: December 27, 2001, Published: April 17, 2003 Krylov, Alexander S., Mirzabekov, Andrei, Prokopenko, Dmitry V., Zasedateleva Olga A., Use of generic oligonucleotide microchips to detect protein-nucleic acid interaction. Russian Patent RU 2182708 from 20.05.2002.

83

Application N 2000109793 from 17.04.2000 Mirzabekov A.D., Zasedatelev A.S., Krylov A.S., Zasedateleva O.A., Prokopenko D.V. Massive parallel screening of the binding specificity of biologically active compounds to single- and double-stranded DNA with nucleotide microchips PUBLICATIONS (Selected) 1. Zhdanov RI, Krylov AS, Zarubina TV, Zhdanov AR, Amici A, Venanzi F. Effect of phospholipid membranes on the specific and nonspecific transcription systems in vitro. Dokl Biochem Biophys. 2005 May-Jun;402:193-6 2. Zhdanov RI, Shmyrina AS, Zhdanov AR, Krylov AS, Bruni P. Triple complexes of metal (II) cations with nucleic acids and phospholipid vesicles: the role of physiological cations (II). Dokl Biochem Biophys. 2005 Nov-Dec;405:373-7. 3. Evdokimov IuM, Salianov VI, Krylov AS, Hechipurenko IuD, Volf AM, The formation of liquid-crystalline dispersions of DNA-chitosan complexes under the conditions of molecular crowding, Biofizika. 2004 Sep-Oct;49(5):789-99. Russian. 4. Mikheikin AL, Chudinov AV, Iaroshchuk AI, Rubina AIu, Pan'kov SV, Krylov AS, Zasedatelev AS, Mirzabekov AD Dye with low specificity to nucleotide sequences of DNA: use for assessing the quantity of oligonucleotides, immobilized in cells of biological microchips, Mol Biol (Mosk). 2003 Nov-Dec;37(6):1061-70. Russian 5. V.R.Chechetkin, D.V.Prokopenko, O.A.Zasedateleva, G.I.Gitelson, E.S.Lomakin, M.A.Livshits, 1L.Malinina, A.Y.Turygin, A.S.Krylov, A.D.Mirzabekov. Analysis of Binding Specificity of Disulfide Bonded Dimeric -Cro V55C Protein with Generic Hexamer Oligonucleotide Microchip. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2003, Volume 21,Issue Number 3, ©Adenine Press (2003 6. Zasedateleva O.A., Krylov A.S. , Prokopenko D. V,. . Skabkin M. A,. Ovchinnikov L. P,. Kolchinsky A., Mirzabekov A. D., Specificity of Mammalian Y-box Binding Protein p50 in Interaction with ss and ds DNA Analyzed with Generic Oligonucleotide Microchip, Journal of Molecular Biology, Vol. 324, No. 1, November 15, 2002, pp. 73-87 7. Krylov A.S, Zasedateleva O.A, Prokopenko D.V, Rouviere-Yaniv J, Mirzavekov A.D. Massive parallel analysis of the binding specificity of histone-like protein HU to single- and double-stranded DNA with generic oligodeoxyribo- nucleotide microchips. Nucleic Acids Res., 2001, Vol. 29(12), pp.2654-2660.

84

8. Johnson B.H, Russell M.J, Krylov A.S, et al. Structure-apoptotic potency evaluations of novel sterols using human leukemic cells. Lipids (United States), Mar 2000, 35(3) p305-315 9. Krylov A.S, Shevelev A.Ia, Kosenkov E.I, et al. Change in cholesterol metabolism in HepG2 cells caused by antisense RNA to the oxysterol-binding protein gene. Dokl Akad Nauk (Russia), Oct 1999, 368(6) p830-2 10. Misharin A.Iu, Krylov A.S, Alquier C, et al. Affinity of 3-beta-(2-hydroxyethoxy)-5-alpha-cholest-8(14)-ene-15-one to oxysterol binding protein and its metabolism in HepG2 hepatoma cells Bioorg Khim (Russia), Apr 1997, 23(4) p297-303 11. Neustroev K.N, Krylov A.S, Firsov L.M, et al. Isolation and properties of beta-mannosidase from Aspergillus awamori. Biokhimiia (USSR), Aug 1991, 56(8) p1406-1412 12. Neustroev K.N, Krylov A.S, Abroskina O.N, et al. Isolation and properties of alpha-galactosidase from Aspergillus awamori. Biokhimiia (USSR), Mar 1991, 56(3) p447-457 13. Khorlin A.Ia, Krylov A.S, Abroskina O.N, et al. Alpha-mannosidase isolated from in vitro growing Panax Ginseng C.A.Mayer cells. Biokhimiia (USSR), Feb 1991, 56(2) p314-319 14. Iagudin V.Ia, Krylov A.S Antigenic structure of endotoxins from Bacillus thuringiensis. Prikl Biokhim Mikrobiol (USSR), Jan-Feb 1990, 26(1) p85-92 15. Sazykin A.Iu, Krylov A.S, Navashin S.M Isolation and properties of beta-lactamase of the cephalosporinase type from cells of Enterobacter aerogenes 6803. Antibiotiki (USSR), Nov 1984, 29(11) p810-4 16. Sazykin A.Iu, Krylov A.S, Vakulenko S.B, et al. Determination of beta-lactamase types of clinical strains of bacteria using a modified microiodometric method. Antibiotiki (USSR), Jun 1984, 29(6) p413-7 17. Nechipurenko Iu. D, Krylov A.S, Zasedatelev A.S, et al. Interactions between distamycin A analogs bound to DNA. Mol Biol (Mosk) (USSR), Mar-Apr 1984, 18(2) p332-42 18. Gursky G.V, Zasedatelev A.S, Krylov A.S, et al Synthetic sequence-specific ligands. Cold Spring Harb Symp Quant Biol (United States), 1983, 47 Pt 1 p367-78 19. Krylov A.S Molecular models of DNA binding with antineoplastic antibiotics specific for certain DNA bases Antibiotiki (USSR), Mar 1982, 27(3) p221-34

85

20. Mikhailov M.V, Zasedatelev A.S, Krylov A.S, et al. Mechanism of AT base pairs recognition by molecules of dye "Hoechst 33258" Mol Biol (Mosk) (USSR), May-Jun 1981, 15(3) p690-705 21. Khorlin A.A, Krylov A.S, Grokhovsky S.L, et al. A new type of AT-specific ligand constructed of two netropsin-like molecules. FEBS Lett (Netherlands), Sep 8 1980, 118(2) p311- 22. Krylov A.S, Khorlin A.A, Grokhovskii S.L, et al. Synthetic ligands capable of "recognizing" DNA AT-sequences possessing a 2nd-order axis of symmetry Dokl Akad Nauk SSSR (USSR), Sep-Oct 1980, 254(1) p234 23. Zasedatelev A.S, Mikhailov M.V, Krylov A.S, et al. Mechanism of recognition of AT-pairs in DNA by molecules of the dye Hoechst 33258 Dokl Akad Nauk SSSR (USSR), 1980, 255(3) p756-60 24. Krylov A.S, Grokhovskii S.L, Zasedatelev A.S, et al. Reaction of fluorescent labeled analogs of the antibiotic distamycin A with synthetic polydeoxyribonucleotides Biofizika (USSR), Jan-Feb 1979, 24(1) p181-8 25. Krylov A.S, Grokhovsky S.L, Zasedatelev .AS, et al. Quantitative estimation of the contribution of pyrrolcarboxamide groups of the antibiotic distamycin A into specificity of its binding to DNA AT pairs. Nucleic Acids Res (England), Jan 1979, 6(1) p289-304 26. Krylov A.S, Grokhovskii S.L, Zasedatelev A.S, et al Quantitative assessment of the contribution of the pyrrolcarboxamide groups in distamycin A antibiotic in achieving its binding specificity with DNA AT-pairs Dokl Akad Nauk SSSR (USSR), 1978, 239(3) p732-5 27. Krylov A.S, Gurskii G.V, Kondrat'eva N.O, et al. Structure of DNA complexes with regular polypeptides Mol Biol (Mosk) (USSR), Mar-Apr 1978, 12(2) p297-307.

Vasily V. Kuvichkin Ph.D-CV Vasily V. Kuvichkin Ph.D., Senior Staff Scientist , Laboratory of Mechanisms of Reception, Institute of Cell Biophysics of the Russian Academy of Sciences, , Pushchino, 3, Institutskaya, 142290 Moscow region, Russia Phone: +7(4967735243), Fax:(4967) 33-05-09 E-mail:vkuvich@email.com

(i) Professional Preparation Rostov on the Don State University Physics, B.S., 1976 Moscow State University Molecular Biology M.S., 1980 Institute of Biophysics of RAS Biophysics PhD. 1990 (ii) Appointments

86

Senior Staff Scientist , Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences Senior Staff Scientist, Institute of Theoretical and Experimental Biophysics , Russian Academy of Sciences, Researcher, Institute of Applied Microbiology, Ministry of Microbiology of USSR, (iii) Publications

Most closely related to the proposed project

Kuvichkin V. V. et all 2007 Two paper in publication. Kuvichhkin V.V. 2002, Lipid-nucleic acids interactions in vitro and in vivo,

Bioelectrochemistry 58, pp. 3– 12 Kuvichkin V.V. DNA-membrane complexes, mitochondria and aging 2002

Bioelectrochemistry, v 56(2),pp.189-193. Kuvichkin V.V., Uteshev V.K., 2003 The role of lipid-nucleic acids interactions in

nuclear envelope and pore complex assembly Biophysics, v.48 (2) , pp. Sukhorukov BI, Petrov AI, Kazarian RL, Kuvichkin VV. Formation of complexes

between DNA and cationic amphiphile molecules by the fluorescent probe method, Biofizika, 2000 ;45(2):245-53.

Novikov VV, Kuvichkin VV, Novikova NI, Fesenko EE. Effect of weak magnetic fields on the capacity of various proteins and polyamino acids to form complexes with DNA. Biofizika. 2000 ;45(2):240-4.

Fesenko EE, Novikov VV, Kuvichkin VV, Iablokova EV. Effect of treated with weak magnetic field aqueous salt solutions on the intrinsic fluorescence of bovine serum albumin. Isolation from solutions and partial characterization of the biologically active fluorescing fraction.Biofizika. 2000 ;45(2):232-9.

Other significant publications Zhdanov RI, Kuvichkin VV. Role of DNA-membrane interactions in prokaryote-to-

eukaryote transition: an hypothesis. Cytobios. 1998;96(383):151-156. Novikov VV, Kuvichkin VV, Fesenko EE. Effect of weak combined low frequency

constant and alternative magnetic fields on intrinsic fluorescence of proteins in aqueous solutions.Biofizika. 1999 Mar-Apr;44(2):224-30.

KuvichkinV.V., Emeljanenko V.I, Kuznetsova S.M., ZhdanovR.I., Petrov A.I., Calorimetric study of the complexes: polyA*polyU -phosphatidylcholine liposomes-Mg++., Biophysics, 1999 v.44,N3,pp.386-394.

Zhdanov R.I., Kuvichkin V.V., 1993," Membrane phospholipids act as DNA/RNA receptors during formation of specific DNA-nuclear membrane contacts and gene expression",in:NEW DEVELOPMENT IN LIPID-PROTEIN INTERACTIONS AND RECEPTOR FUNCTION (Gustafson J.A.and Wirtz k.W.A., eds.), Plenum, New York,pp.249-262

(iv) Synergistic Activitie invited speaker at the International Biophysics Congress, August 27th-Sept1th 2005,Montpellier, France. Invited Speaker at the European Biophysics Congress, 2003, Alicante, Spain. Invited Speaker at the 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, 2006, Kyoto, Japan.

87

CV-Prof. Gennady A. Evtugyn

Gennady A. Evtugyn Department of Analytical Chemistry of A.M.Butlerov Chemistry Institute of Kazan State University 18, Kremlevskaya Street, 420008 Kazan Russian Federation e-mail: Gennady.Evtugyn@ksu.ru Phone: +7-843-2315491 Fax: +7-843-2315416 Gennady Evtugyn, born 29 July 1962, Russian. 1987: Chemist-researcher, senior researcher at Kazan State University 1995: Associated Professor of Applied Ecology Department of Kazan State University 2000: Full Professor of Applied Ecology Department 2004: Full Professor of Analytical Chemistry Department 2007: Head of Analytical Chemistry Department Degrees: Candidate of Chemical Science (Ph.D.) at Kazan State University; 1987, Physical Chemistry (organic electrosynthesis) Senior Doctor of Sciences at Saratov State University; 1999, cholinesterase based biosensors Member of Commission for Electrochemical Methods of Analysis and of Biochemical and Biological Methods of Analysis, Russian Academy of Sciences. Adviser for 7 candidate dissertations. More than 100 publications, among them 32 articles in international journals. Scientific Interests: electroanalytical chemistry, analysis of bioactive compounds, electrochemical biosensors and DNA sensors, electropolymerization. Experience of International Cooperation: 2000 - Research team leader of INTAS Project 00-273 2002 - Research team leader of NATO Linkage grant 2002 - at present - member of KSU research team of BRHE project program (Research-educational center "Materials and Technologies of 21 century" REC-007) Selected List of Publications: 1. G.A.Evtugyn, A.Porfireva, T.Hianik, M.S. Cheburova, H.C. Budnikov Potentiometric DNA sensor based on electropolymerized phenothiazines for

88

protein detection, Electroanalysis 20 (2008) 1300-1308. 2. G.Evtugyn, M.Ryabova, T.Hianik, A. Porfireva, Aptasensor for thrombin based on carbon nanotubes-methylene blue composites, Electroanalysis 20 (2008) 2310-2316. 3. T. Hianik, I.Grman, A.Profireva, G.EvtugynAptabodies - new type of artificial receptors for detection proteins, Protein Pept. Lett. 15 (2008) 799-805. 4. A.Ivanov, G. Evtugyn, ; H. Budnikov, S. Girotti, S.Ghini, E.Ferri, A.Montoya, J.V.Mercader, Amperometric immunoassay of azinphos-methyl in water and honeybees based on indirect competitive ELISA, Anal.Letters 41, 3 (2008) 392-405. 5. A.Porfirieva, G.Evtugyn, T.Hianik, Polyphenothiazine modified electrochemical aptasensor for detection of human <alfa>thrombin, Electroanalysis 19 (2007) 1915-1920. 6. G.A. Evtugyn, S.A. Eremin, R.P. Shaljamova, A.R. Ismagilova, H.C. Budnikov, Amperometric immunosensor for nonylphenol determination based on peroxidase indicating reaction, Biosens. Bioelectron. 22 (2006) 56-62. 7. G.A.Evtugyn, O.E.Goldfarb, H.C.Budnikov, A.N.Ivanov, V.G.Vinter, Amperometric DNA-peroxidase sensor for the detection of pharmaceutical preparations, Sensors 5 (2005) 364-376. 8. E.Suprun, G.Evtugyn, H.Budnikov, F.Ricci, D. Moscone, G.Palleschi, Acetylcholinesterase sensor based on screen-printed carbon electrode modified with Prussian Blue, Anal. Bioanal. Chem. 2005. V.383. P.597-604. 9. T.Hianik, V.Ostatna?, Z.Zajacova?, E.Stoikova, G.Evtugyn, Detection of aptamer--protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 291-295. 10. G.Evtugyn, A.Mingaleva, H.Budnikov, E.Stoikova, V.Vinter, S.Eremin, Affinity biosensors based on disposable screen-printed electrodes modified with DNA, Anal. Chim. Acta 479 (2003) 125-134.

89

Not : “Proje Başvuru Formu” nda (Form-1) yer alması gereken bilgiler ile bu forma eklenmesi gereken diğer bilgi ve belgelerin eksiksiz olması amacıyla, aşağıda bulunan “Kontrol Listesi” ni mutlaka işaretleyiniz ve “Kontrol Listesi” ni birinci sayfa olarak iliştiriniz.

90

91