PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS – PUC GOIÁSDEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOSDisciplina: MICROBIOLOGIA APLICADA

Profa: Ana Maria da Silva Curado Lins, MSc.

Microbiologia

2010

Introdução à MicrobiologiaIntrodução

Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= ciência)A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da ciência que

dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de organismos unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser encontrados como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou massas), sendo que as células, mesmo estando associadas, exibiriam um caráter fisiológico independente.

Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de organismos procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas, protozoários, fungos) e também os vírus.

Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as primeiras observações de bactérias e outros microrganismos, além de diversos espécimes biológicos. Embora Van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenhafornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência.

Recentemente foi publicado um artigo discutindo a importância de Robert Hooke para o desenvolvimento da Microbiologia.

Classificação dos seres vivos

De acordo com a definição tradicional da microbiologia, esta é uma ciência que até recentemente, era responsável pelo estudo de organismos classificados em três reinos distintos: Monera, Protista e Fungi. No entanto, a partir dos estudos de Carl Woese, a microbiologia passou a estar relacionada a três domínios de seres vivos.Sistemas de classificação dos seres vivos:Linnaeus (séc. XVIII): reinos Animal e VegetalHaeckel (1866): introdução do reino ProtistaWhittaker (1969): 5 reinos, dividos principalmente pelas características morfólogicas e fisiológicas:Monera: ProcariotosProtista: Eucariotos unicelulares - Protozoários (sem parede celular) eAlgas (com parede celular)Fungi: Eucariotos aclorofilados

Plantae: VegetaisAnimalia: Animais

No entanto, a partir dos estudos de C. Woese (1977), passamos a dispor de um sistema de classificação baseado principalmente em aspectos evolutivos (filogenética), a partir da comparação das sequências de rRNA de diferentes organismos. Com esta nova proposta de classificação, os organismos são agora subdividos em 3 domínios (contendo os 5 reinos), empregando-se dados associados ao caráter evolutivo.Archaea: ProcariotosBacteria: ProcariotosEukarya: Eucariotos

A princípio, acredita-se que estes 3 domínios divergiram a partir de um ancestral comum. Provavelmente os microrganismos eucarióticos atuaram como ancestrais dos organismos multicelulares, enquanto as bactérias e archaeas correspondem a ramos que não evoluíram além do estágio microbiano.Archaea: são organismos procariotos que, freqüentemente são encontrados em ambientes cujas condições são bastante extremas (semelhantes às condições ambientais primordiais na Terra), sendo por isso, muitas vezes considerados como sendo “ancestrais” das bactérias. No entanto, hoje em dia considera-se as archaeas como um grupo “intermediário” entre procariotos e eucariotos. Muitos destes organismos são anaeróbios, vivendo em locais "inabitáveis" para os padrões humanos - fontes termais (com temperaturas acima de 100°C), águas com elevadíssimos teores de sal (até 5M de NaCl - limite de dissolução do NaCl), em solos e águas extremamente ácidos ou alcalinos (espécies que vivem em pH 0, outras em pH 10) e muitas são metanogênicas.

Genericamente, podemos dizer que as Archaeas definem os limites da tolerância biológica às condições ambientais.

Bacteria: Corresponde a um enorme grupo de procariotos, anteriormente classificados como eubactérias, representadas pelos organismos patogênicos ao homem, e bactérias encontradas nas águas, solos, ambientes em geral.Dentre estas, temos as bactérias fotossintetizantes (cianobactérias) e outras quimiossintetizantes (E. coli), enquanto outras utilizam apenas substratos inorgânicos para seu desenvolvimento.

Eukarya: No âmbito microbiológico, compreende as algas, protozoários e fungos (além das plantas e animais). As algas caracterizam-se por apresentarem clorofila (além de outros pigmentos), sendo encontradas basicamente nos solos e águas.Os protozoários correspondem a células eucarióticas, apigmentados, geralmente móveis e sem parede celular, nutrindo-se por ingestão e podendo ser saprófitas ou parasitas.

Os fungos são também células sem clorofila, apresentando parede celular, realizando metabolismo heterotrófico, nutrindo-se por absorção.

Como mencionado anteriormente, os vírus são também assunto abordado em microbiologia, embora, formalmente, não exibam as características celulares, no sentido de não apresentarem metabolismo próprio, de conterem apenas um tipo de ácido nucleico, etc.

A Microbiologia na atualidade

A definição clássica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e até mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta última década. Como exemplo pode-se citar duas premissas que já não podem mais ser consideradas como verdade absoluta na conceituação desta área de conhecimento: as dimensões dos microrganismos e a natureza independente destes seres.Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium fischelsoni que, a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto já descrito, exibindo cerca de 500 Pm de comprimento. Esta bactéria foi isolada do intestino de um peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgião), encontrado nas águas da Austrália e do Mar Vermelho. Além de apresentar dimensões nunca vistas, tal bactéria mostra-se totalmente diferente das demais quanto ao processo de divisão celular, que ao invés de ser por fissão binária, envolve um provável tipo de reprodução vivíparo, levando à formação de pequenos “glóbulos”, que correspondem às células filhas.

Mais recentemente, em 1999, outro relato descreve o isolamento de uma bactéria ainda maior, isolada na costa da Namíbia. Esta, denominada Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho nú, atingindo até cerca de 0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura.

Como analisar a questão do tamanho dosmicrorganismos?

Durante muito tempo se acreditava que o tamanho das bactérias era imposto pelo seu próprio metabolismo, ou seja, se a bactéria aumentasse muito em tamanho, ela seria incapaz de se manter viável e morreria. Tal fato decorre da seguinte dedução: A área superficial da membrana citoplasmática seria o fator limitante para a eficiência das trocas com o meio externo.

Sabendo-se que a área de uma esfera é calculada pela fórmula e que o volume de uma esfera é obtido pela fórmula , a medida que a área aumenta, seu volume aumenta muito mais rapidamente. Assim, se uma bactéria começasse a crescer, aumentando sua área, a proporção área/volume diminuiria. Isto faria com que a célula passasse a apresentar um volume muito grande, sendo que sua área

superficial seria insuficiente, em termos de trocas através da membrana, para manter sua viabilidade.

A partir dos isolados de bactérias “gigantes”, o conceito da limitação de tamanho bacteriano vem sendo abandonado, pois não há mais como questionar a existência e viabilidade destas bactérias e, possivelmente, novos relatos serão incorporados, deixando de ser meras curiosidades.

Uma das explicações mais prováveis para tal fato reside na existência de grandes mesossomos nestes tipos bacterianos, refutando assim a hipótese de que tais estruturas seriam meros artefatos de microscopia.

Novos estudos vêm sendo realizados, os quais estão trazendo informações sobre outras estratégias desenvolvidas pelos microrganismos para que sobrevivam, quando apresentam dimensões extremamente maiores que os microrganismos "convencionais".

Microrganismos atuando como seres multicelularesOutro aspecto que vem sendo demonstrado refere-se ao caráter

“multicelular” das bactérias. Embora estas exibam a capacidade de sobreviver como uma célula única, realizando os processos metabólicos necessários à sua perpetuação, quando as bactérias encontram-se associadas, formando colônias, ou biofilmes (estruturas rígidas, adesivas, de natureza geralmente polissacarídica, que encontram-se fortemente ancoradas às superfícies, criando um ambiente protegido que possibilita o crescimento microbiano), estas passam a se comportar de forma social, exibindo divisão de tarefas e alterando seu perfil fisiológico de forma a apresentar uma cooperação que reflete-se em diferentes níveis metabólicos.

Sabe-se que muitos genes de virulência são expressos somente quando a densidade populacional atinge um determinado ponto. Da mesma forma, a capacidade de captar DNA do meio externo, a bioluminescência, etc, envolvem a percepção da densidade populacional por parte das bactérias.

Este tipo de mecanismo de comunicação é denominado “sensor de quorum” (quorum sensing) e vem sendo amplamente estudado nas mais diferentes áreas da Microbiologia, uma vez que foi descrito tanto para bactérias como para fungos.

Estudos com bactérias primitivas

Ainda em relação às novas pesquisas desenvolvidas na área de Microbiologia, temos o cultivo de bactérias pré-históricas, visando a busca de compostos com atividade antimicrobiana ou de interesse comercial. Neste sentido, empresas foram criadas (“Ambergene”), especializadas na reativação de formas bacterianas latentes, isoladas de insetos preservados em âmbar. Os resultados obtidos revelam a reativação de mais de 1200 espécies bacterianas, apresentando de 2 a até 135 milhões de anos. Em 2000, foi publicado um relato descrevendo o isolamento e cultivo de uma espécie bacteriana a partir do líquido contido em um cristal de sal de 250 milhões de anos. Os estudos de sequenciamento do DNA que codifica o RNA ribossomal 16S indicam que o organismo pertence ao gênero Bacillus, uma bactéria em forma de bastonete, Gram positiva, com a capacidade de formar endósporos. Até o momento, esta corresponde à espécie bacteriana mais antiga.

A questão da vida em marte

Em 1997, foram publicados relatos de expedições da NASA a Marte, sugerindo a presença de possíveis microrganismos (“nanobactérias”) em espécimes minerais, sendo que achados semelhantes foram também detectados em partículas de meteoritos de Marte, que atingiram a Terra. A favor desta hipótese há o achado de microrganismos que decompõem minerais, frequentemente isolados das profundezas marinhas (A cerca de 1,5 km abaixo do solo).

Os meteoritos apresentam carbono, fósforo, nitrogênio, além da presença de água. Já em relação às condições ambientais de Marte (muito frio), temos como contra-argumento o isolamento de Archaea a partir de ambientes absolutamente inóspitos, inicialmente comsiderados como inadequados à vida.

De acordo com alguns pesquisadores, não é absurdo considerar que a vida surgiu em Marte, pois estudos com o meteorito Nakhla, que caiu em 1911 no Egito, com aparentemente de 1,3 bilhões de anos, revelam a presença de elementos cocóides, potenciais fósseis bacterianos, variando de 0,25 a 2,0 Pm de tamanho, o que seria correspondente ao tamanho médio atual das bactérias.

Curiosamente, estas formas ovais apresentam um teor maior de carbono no seu interior que nas áreas ao seu redor. Além disso, exibem também um elevado teor de óxido de ferro, um composto comum em células fossilizadas.

Recentemente, a NASA enviou outra sonda para Marte e os dados recebidos reforçam cada vez mais a idéia da existência anterior de vida em Marte, devido aos achados da possível ocorrência de água naquele planeta.

Assim, com base nestes novos achados e principalmente com estudos envolvendo as Archaea, a microbiologia vem levantando uma série de questões quanto à fisiologia e o metabolismo celular, além de questionar permanentemente os limites das condições de vida.

Ubiqüidade dos microrganismos

Os microrganismos são os menores seres vivos existentes, encontrando-se em uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes papéis na natureza. Este grupo caracteriza-se por ser completamente heterogêneo, tendo com única característica comum o pequeno tamanho dos organismos.

Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituída pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribuídos entre plantas (35%) e animais (15%).

Em termos de habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos os ambientes, tanto na superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C ; de regiões polares, com temperaturas inferiores a -10°C; de ambientes extremamente ácidos (pH=1) ou básicos (pH=13). Alguns sobrevivem em ambientes extremamente pobres em nutrientes, assemelhando-se à água destilada. Há ainda aqueles encontrados no interior de rochas na Antártida.

Em termos metabólicos, temos também os mais variados tipos, desde aqueles com vias metabólicas semelhantes a de eucariotos superiores, até outros que são capazes de produzir ácido sulfúrico, ou aqueles capazes de degradar compostos pouco usuais como cânfora, herbicidas, petróleo, etc.

Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhões de anos, pode-se dizer que nós evoluímos em seu mundo e eles em nosso.

Desta forma, não é de se estranhar que a associação homem-microrganismo mostra-se com grande complexidade, com os microrganismos habitando nosso organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral,nariz, ouvidos e trato genitourinário. Embora a grande maioria destes microrganismos não causem qualquer dano, compondo a denominada “microbiota normal”, algumas vezes estes podem originar uma série de doenças, com maior

ou menor gravidade. Nesta classe de organismos estão aqueles denominados patogênicos e potencialmente patogênicos.

Sabe-se que em cerca de 1013 células de um ser humano podem ser encontradas, em média, cerca de 1014 células bacterianas. No homem, estas se encontram em várias superfícies, especialmente na cavidade oral e trato intestinal.

Principais funções dos microrganismos na natureza

Além de seu importante papel como componentes da microbiota residente de animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos produtos microbiológicos “naturais” tais como: vinho, cerveja, queijo, picles, vinagre, antibióticos, pães, etc. Paralelamente, não pode ser deixada de lado a importância dos processos biotecnológicos, envolvendo engenharia genética, que permitem a “criação” de novos microrganismos, com as mais diversas capacidades metabólicas.

Os microrganismos desempenham também um importante papel nos processos geoquímicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrogênio, sendo genericamente importantes nos processos de decomposição de substratos e sua reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns de grande importância atualmente: DDT, outros pesticidas, cânfora, etc.

O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo utilizado pelos organismos fotossintetizantes, para sua nutrição.Virtualmente, a energia para o desenvolvimento da vida na Terra é derivada, em última análise, a partir da luz solar. Esta é captada pelas plantas e microrganismos fotossintetizantes (algas e bactérias), que convertem o CO2 em compostos orgânicos, através da reação:CO2 + H2O => (CH2O)n + O2

Os herbívoros alimentam-se de plantas e os carnívoros alimentam-se dos herbívoros.

O CO2 atmosférico torna-se disponível para a utilização na fotossíntese origina-se de duas fontes biológicas principais: 1) 5 a 10% a partir de processos de respiração e 2) 90 a 95% oriundos da degradação (decomposição ou mineralização) microbiana de compostos orgânicos.

Em termos de ciclo global, há um balanço entre o consumo de CO2 na fotossíntese e sua produção através da mineralização e respiração. Este balanço, no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, tais como a queima de combustíveis fósseis, promovendo um aumento da qualntidade de CO2

atmosférico, resultando no conhecido “efeito estufa”.A celulose existente nas plantas, embora seja um substrato extremamente

abundante na Terra, não é utilizável pela vasta maioria dos animais. Por outro lado, vários microrganismos, incluindo fungos, bactérias e protozoários a utilizam, como fonte de carbono e energia. Destes microrganismos, muitos encontram-se no trato intestinal de vários herbívoros e nos cupins.

Muitos compostos tóxicos podem ser degradados por microrganismos, dentre eles, policlorados, DDT, pesticidas.

Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem refere-se à introdução de genes bacterianos em outros organismos (ditos transgênicos), tais como plantas. Assim, está em franco desenvolvimento a obtenção de plantas transgênicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de insetos.

Microrganismos como agentes de doenças

Os microrganismos, eventualmente provocam doenças no homem, outros animais e plantas. Apesar dos enormes avanços em relação ao tratamento de doenças infecciosas, estas vêm se tornando novamente um tema preocupante, em virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais resistentes às drogas. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde vem demonstrando crescente interesse nas doenças emergentes e reemergentes, de origem infecciosa.

Abaixo apresentamos um quadro cronológico que deixa clara tais preocupações, em relação ao número de mortes provocadas por doenças infecciosas.

Importância da Microbiologia

É uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência básica ou aplicada.

Básica: estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (modelo comparativopara seres superiores). => Microbiologia Molecular Aplicada: processos industriais, controle de doenças, de pragas, produção de alimentos, etc.Áreas de estudo:Odontologia: Estudo de microrganismos associados à placa dental, cárie dental e doenças periodontais. Estudos com abordagem preventiva.Medicina e Enfermagem: - Doenças infecciosas e infecções hospitalares.Nutrição: - Doenças transmitidas por alimentos, Controle de qualidade de alimentos, Produção de alimentos (queijos, bebidas).Biologia: - Aspectos básicos e biotecnológicos. Produção deantibióticos, hormônios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos (ácidos, álcool), Despoluição (Herbicidas - Pseudomonas, Petróleo), Bio-filme (Acinetobacter), etc.BIOTECNOLOGIA - Uso de microrganismos com finalidades industriais, como agentes de biodegradação, de limpeza ambiental, etc.

Um breve histórico da importância da microbiologiaEfeitos das doenças nas civilizaçõesTalvez um dos aspectos mais negligenciados quando se estuda a microbiologia refere-se às profundas mudanças que ocorreram no curso das civilizações, decorrentes das doenças infecciosas.De forma geral, as doenças provocavam um abatimento físico e moral da população e das tropas, muitas vezes influenciando no desenrolar e no resultado de um conflito.

A própria mobilização de tropas, resultando em uma aglomeração, muitas vezes longa, de soldados, em ambientes onde as condições de higiene e de alimentação eram geralmente inadequadas, também colaborava na disseminação de doenças infecciosas, para as quais não existiam recursos terapêuticos.

Paralelamente, em áreas urbanas em franca expansão, os problemas mencionados acima eram também de grande importância, pois rapidamente as cidades cresciam, sendo que as instalações sanitárias geralmente eram completamente precárias.

Com a prática do comércio entre as diferentes nações emergentes, passou a haver a disseminação dos organismos para outras populações, muitas vezes susceptíveis a aqueles agentes infecciosos.Abaixo listaremos, brevemente, um pequeno histórico com alguns exemplos dos efeitos das doenças microbianas no desenvolvimento de diferentes civilizações.

O declínio do Império Romano, com Justiniano (565 AC), foi acelerado por epidemias de peste bubônica e varíola. Muitos habitantes de Roma foram mortos, deixando a cidade com menos poder para suportar os ataques dos bárbaros, que terminaram por destruir o Império.

Durante a Idade Média varias novas epidemias se sucederam, sendo algumas amplamente disseminadas pelos diferentes continentes e outras mais localizadas. Dentre as principais moléstias pode-se citar: Tifo, varíola, sífilis, cólera e peste.

Em 1346, a população da Europa, Norte da África e Oriente Médio era de cerca de 100 milhões de habitantes. Nesta época houve uma grande epidemia da peste, que disseminou-se através da “rota da seda” (a principal rota mercante para a China), provocando um grande número de mortes na Ásia e posteriormente espalhando-se pela Europa, onde resultou em um total de cerca de 25 milhões de pessoas, em poucos anos.

Novas epidemias da peste ocorreram nos séculos XVI e XVII, sendo que no século XVIII (entre 1720 e 1722), uma última grande epidemia ocorreu na França, matando cerca de 60% da população de Marselha, de Toulon,. 44% em Arles, 30% em Aix e Avignon.

A epidemia mais recente de peste originou-se na China, em 1892, disseminando-se pela Índia, atingindo Bombaim em 1896, sendo responsável pela morte de cerca de 6 milhões de indivíduos, somente na Índia.

Antes da II Guerra Mundial, o resultado das guerras era definido pelas armas, estratégias e “pestilência”, sendo esta última decisiva. Em 1566, Maximiliano II da Alemanha reuniu um exército de 80.000 homens para enfrentar o Sultão Soliman da Hungria. Devido a uma epidemia de tifo, o exército alemão foi profundamente dizimado, sendo necessária a dispersão dos sobrevivente, impedindo assim a expulsão das hordes de tribos orientais da Europa nesta época.

Na guerra dos 30 anos (1618-1648), onde protestantes se revoltaram contra a opressão dos católicos, além do desgaste decorrente da longa duração do confronto, as doenças foram determinantes no resultado final. Na época de Napoleão, em 1812, seu exército foi quase que completamente dizimado por tifo, disenteria e pneumonia, durante campanha de retirada de Moscou. No ano seguinte, Napolãeo havia recrutado um exército de 500.000 jovens soldados, que foram reduzidos a 170.000, sendo cerca de 105.000 mortes decorrentes das batalhas e 220.000 decorrentes de doenças infecciosas.

Em 1892, outra epidemia de peste bubônica, na China e Índia, foi responsável pela morte de 6 milhões de pessoas.

Até a década de 30, este era quadro, quando Alexander Fleming, incidentalmente, descobriu um composto produzido por um fungo do gênero

Penicillium, que eliminava bactérias do gênero Staphylococcus, um organismo que pode produzir uma vasta gama de doenças no homem. Este composto - denominado penicilina - teve um papel fundamental na desfecho da II Guerra Mundial, uma vez que passou a ser administrado às tropas aliadas, enquanto o exército alemão continuava a sofrer pesadas baixas no campo de batalha.

Além destas epidemias, vale ressaltar a importância das diferentes epidemias de gripe que assolaram o mundo e que continuam a manifestar-se de forma bastante intensa até hoje. Temos ainda o problema mundial envolvendo a AIDS, o retorno da tuberculose (17 milhões de casos no Brasil) e do aumento progressivo dos níveis de resistência aos agentes antimicrobianos que vários grupos de bactérias vêm apresentando atualmente.

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 1)Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos

As bactérias são extremamente variáveis quanto ao tamanho e formas que apresentam. Até recentemente acreditava-se que as menores bactérias apresentavam cerca de 0,3 Pm (ex: Mycoplasma), entretanto, já existem relatos de células menores, denominadas nanobactérias ou ultramicrobactérias, com tamanhos variando de 0,2 a 0,05 Pm de diâmetro, sendo algumas inclusive já cultivadas em laboratório. Há ainda controvérsias quanto a este grupo, pois vários autores acreditam ser meros artefatos.Muitas bactérias medem de 2 a 6 Pm de comprimento, por 1 a 2 Pm de largura, mas certamente estes valores não podem ser definidos como absolutos, pois eventualmente encontramos bactérias de até 500 ou 800 Pm, como no caso de Epulopiscium ou Thiomargarita. Em relação às formas, a maioria das bactérias estudadas seguem um padrão menos variável, embora existam vários tipos morfológicos distintos. De maneira geral, as bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais: cocos, bacilos e espiralados.Os cocos correspondem a células arredondadas, podem se dividir sem um plano de orientação definido, o que leva a um grande número de arranjos diferentes. Assim temos os cocos isolados, diplococos (Neisseria, pneumococos), tetracocos, sarcinas (cubos contendo 8 células), estreptococos (cocos em cadeia) e estafilococos (cocos formando massas irregulares).

Os bacilos têm forma de bastonetes, podendo apresentar extremidades retas (Bacillus anthracis), arredondadas (Salmonella, E. Coli), ou ainda afiladas (Fusobacterium). Como seu plano de divisão é fixo, ocorrendo sempre no menor eixo, os bacilos exibem uma menor variedade de arranjos, sendo via de regra encontrados isolados, como diplobacilos ou ainda como estreptobacilos. Há ainda um arranjo, denominado “em paliçada”, também denominado letras chinesas, que é típico do gênero Corynebacterium. Tal tipo de arranjo ocorre porque a parede celular desses organismos é dupla e no momento da divisão celular ocorre a ruptura de apenas uma das camadas, deixando as células unidas pela camada de parede que não se rompeu. Os bacilos podem ainda apresentar-se como pequenas vírgulas (Vibrio cholerae) ou em forma de meia lua (Selenomonas).

Espiralados: Sua nomenclatura é bastante controvertida ainda. Um tipo de classificação divide os espiralados em dois grupos, osespiroquetas, que apresentam uma forma de espiral flexível, possuindo flagelos periplasmáticos. O

outro grupo são os espirilos, que exibem geralmente morfologia de espiral incompleta e rígidos. Geralmente os espiralados são microrganismos bastante afilados, de difícil observação por microscopia de campo claro, sendo muitas vezes analisados por meio da microscopia de campo escuro, ou de técnicas de coloraçãoempregando a impregnação por sais de prata.

Há ainda formas intermediárias como os cocobacilos; formas pleomórficas (quando o microrganismo não tem uma morfologia padrão), tal como Mycoplasma; ou ainda formas de involução, originadas quando o meio encontra-se desfavorável ao desenvolvimento. Nesses casos, como o organismo deixa de

realizar os processos metabólicos (nutrição e divisão celular) adequadamente, este sofre alterações morfológicas.

Há também bactérias apresentando apêndices, tais como extensões celulares na forma de longos tubos ou hastes (prostecas) (Rhodomicrobium vannielii). Além destas bactérias, estudos vêm revelando a ocorrência de bactérias com formas bastante peculiares, tais como células estreladas ou retangulares.

Ultraestrutra Bacteriana

A ultraestrutura bacteriana começou a ser estudada em maiores detalhes nas décadas de 50 e 60, a partir do melhoramento das técnicas de microscopia eletrônica. Os procedimentos adotados incluíam a lise celular, seguida de centrifugação para promover a separação dos vários componentes subcelulares, que podiam agora ser purificados e analisados bioquimicamente.Parede Celular - Estrutura presente na maioria das bactérias conhecidas, exceto em micoplasmas e algumas Archaea, que não a possuem.Corresponde a uma das estruturas mais importantes nas células bacterianas, estando localizada na porção mais externa, acima da membrana citoplasmática. Devido à sua grande rigidez, a parede celular é responsável pela manutenção da

forma do microrganismo. Como o ambiente intracelular é bastante concentrado em relação ao meio externo, (variando de 2 a até 10 atm), a parede atua como uma barreira física rígida, que mantém a forma celular, impedindo que a célula estoure em decorrência do grande turgor.

Além disso, a parede celular atua como uma barreira de proteção contra determinados agentes físicos e químicos externos, tais como o choque osmótico. A parede pode ainda desempenhar importante papel em microrganismos patogênicos, em decorrência de presença de componentes que favorecem sua patogenicidade, tais como antígenos ou moléculas envolvidas no reconhecimento celular.

Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho). A partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento das técnicas de análise bioquímica dos diferentes componentes celulares, foi verificado que esta diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida às diferenças de composição e estrutura das paredes celulares.

Assim, quando observadas sob microscopia eletrônica de transmissão, as bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80 nm), de aspecto homogêneo, enquanto as células Gram negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo, aparentemente apresentando mais de uma camada. A microscopia eletrônica de varredura revelou outras diferenças entre estes dois grupos de organismos. As Gram positivas exibiam a superfície mais lisa e homogênea, enquanto as Gram negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial.

Composição da parede celular

Peptideoglicano (mureína ou mucopeptídeo): Compostoexclusivamente encontrado no domínio Bacteria, sendo o responsável pela rigidez da parede celular. O peptideoglicano corresponde a um enorme polímero complexo que, em bactérias Gram positivas pode formar até 20 camadas, enquanto em células Gram negativas está presente, formando apenas uma ou duas camadas.

O peptideoglicano corresponde a um esqueleto, formado por dois derivados de açúcares, a N-acetilglicosamina (NAG) e o ácido Nacetilmurâmico (NAM), unidos alternadamente, através de ligações do tipo ß-1,4. O grupo carboxil de cada molécula de NAM liga-se a um tetrapeptídeo, composto por aminoácidos que alternam-se nas configurações L e D. Destes aminoácidos, o D-glutamato, D-alanina e o ácido mesodiaminopimélico não são encontrados em qualquer outra proteína conhecida.

Acredita-se que sua presença confira maior resistência da parede contra a maioria das peptidases.

Assim, em cada resíduo de NAM há um tetrapeptídeo associado. A enorme rigidez da da parede celular é resultante das ligações entre os tetrapeptídeos de cadeias adjacentes. Neste aspecto, há uma grande diferença entre as bactérias Gram positivas e negativas. Nas bactérias Gram negativas (Ala-Glu-DAP-Ala), a ligação entre os tetrapepídeos é direta, ocorrendo entre o grupamento amino do DAP subterminal (posição 3) e o grupamento carboxi da D-Ala terminal (posição 4). Já nas Gram positivas (Ala-Glu-Lys-Ala), a ligação é indireta, sendo mediada por uma ponte interpeptídica de natureza variável (cinco glicinas em S. aureus). A análise das figuras abaixo deixa clara a grande estruturação do peptídeoglicano, em virtude das inúmeras ligações cruzadas existentes ao longo da molécula. Assim, devido a esta complexa estruturação física, o peptideoglicano confere rigidez à parede, embora exiba certo grau de elasticidade e também porosidade.

Nas bactérias Gram positivas, cerca de 90% da parede celular é composta pelo peptídeoglicano, que geralmente forma cerca de 20 camadas.

O restante da parede é composto essencialmente por ácido teicóico. Nas bactérias Gram negativas, apenas cerca de 10% da parede corresponde ao peptideoglicano, existindo geralmente como uma camada única ou dupla. Os demais componentes da parede celular de bactérias Gram negativas serão analisados posteriormente.Esquema ilustrando o espesso peptideoglicano de bactérias Gram positivas(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Ácidos Teicóicos: Juntamente com peptideoglicano, os ácidos teicóicos compõem a parede celular das bactérias Gram positivas. Estes compostos, presentes em grandes quantidades, correspondem a polímeros de glicerol ou ribitol ligados a açúcares ou aminoácidos e conectados entre si por meio de grupamentos fosfato.

Os ácidos teicóicos associam-se ao peptideoglicano pela ligação do grupamento 6 hidroxil do ácido N-acetilmurâmico, podendo alternativamente associar-se aos lipídeos da membrana citoplasmática, quando passam a ser denominados de ácidos lipoteicóicos. Devido à sua carga negativa, os ácidos teicóicos contribuem com o caráter negativo da superfície celular de Gram positivas. Seu papel fisiológico é ainda desconhecido, mas especula-se que estes possam participar nos processos de passagem de íons pela parede, ou ligar-se a prótons, mantendo um pH celular relativamente baixo.

Em casos de escassez de fosfato, os ácidos teicóicos podem ser substituídos por ácidos teicurônicos, deixando assim os fosfatos livres para comporem ATP ou DNA, por exemplo.

Fórmula de um ácido teicóico, contendo ribitol(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

O componente adicional da Parede Celular de Gram negativos

Membrana Externa: Esta, embora denominada "membrana"externa é um componente da parede celular, presente apenas nas bactérias Gram negativas. A membrana externa corresponde a uma segunda bicamada lipídica (semelhante à membrana plasmática), localizada acima do peptideoglicano, contendo fosfolipídeos, lipoproteínas, proteínas e também lipopolissacarídeos. Quando comparada à membrana citoplasmática, a membrana externa exibe maior permeabilidade a pequenas moléculas, tais como glicose ou outros monossacarídeos.

Sua face interna geralmente é rica em pequenas lipoproteínas (7,2 kDa), denominadas lipoproteínas de Braun, que ligam-se covalentemente ao peptideoglicano, ancorando firmemente a membrana externa à camada de peptideoglicano.

Estudos indicam que a membrana externa e a membrana citoplasmática mantém contato em algumas discretas regiões celulares, denominadas sítios de adesão. Acredita-se que estas regiões de junção podem conferir maior rigidez à parede celular das bactéria Gram negativas, além de fixar melhor a membrana externa, não deixando-a frouxa, associada somente ao peptideoglicano. Os sítio de adesão foram também denominados junções de Bayer e acredita-se que possam ser importantes locais de passagem de compostos citoplasmáticos, seja componentes envolvidos na síntese da membrana externa ou diferentes nutrientes.Esquema da parede celular de organismos Gram negativos(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

A face externa da membrana externa é rica em lipopolissacarídeos (LPS), inexistentes na membrana citoplasmática. Estes componentes são também denominados de endotoxina, uma vez que provocam febre, choque e eventualmente morte, quando injetados em animais. O LPS é uma molécula complexa, composta por 3 regiões distintas: lipídeo A, polissacarídeo central e cadeia polissacarídica lateral O, ou Antígeno O.

Esquema do lipopolissacarídeo, encontrado na face externa da membrana externa(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

O lipídeo A corresponde à porção mais interna da molécula, ancorando o LPS à porção hidrofóbica da membrana externa. Este componente corresponde à porção tóxica do LPS e geralmente é composto por ácido esteárico, palmítico, mirístico, láurico ou capróico. Estes ácidos graxos estão ligados a um dissacarídeo

de NAcGlicosamina-P. A porção polissacarídica localiza-se acima do lipídeo A, em direção ao exterior, sendo composta por duas regiões, o polissacarídeo central e polissacarídeo O, que é mais externo, de natureza repetitiva. Em Salmonella, o cerne é composto por 10 açúcares pouco usuais. Conectado ao cerne, há o Ag O, que geralmente é composto por 3 a 5 açúcares bastante peculiares e variáveis. A natureza destes açúcares pode ser modificada pelos microrganismos, resultando em um mecanismo de evasão do sistema imune. O LPS também confere carga nagativa à superfície celular.

O LPS se associa a proteínas, formando a face externa da unidade de membrana.

A membrana externa apresenta um grupo especializado de proteínas, denominadas genericamente de porinas, que atuam como canais para a passagem de pequenas moléculas hidrofílicas, participando assim do processo de nutrição. As porinas podem ser específicas, contendo sítios de ligação para 1 ou mais substratos, ou inespecíficas, compondo canais aquosos.

A maioria das porinas correspondem a proteínas transmembrânicas, com 3 subunidades idênticas, que formam orifícios de cerca de 1 nm, sendo que, aparentemente, possuem mecanismos para a abertura e fechamento. Para algumas substâncias, a membrana externa é mais restritiva.

Compostos que afetam a Integridade da Parede Celular

Ação da Lisozima na PC: Esta enzima, sintetizada por alguns organismos e por glândulas endócrinas do homem, age clivando as ligações do tipo β-1,4, presentes no peptideoglicano. Nas células Gram positivas, o tratamento com lisozima origina protoplastos (células sem parede celular), enquanto nas Gram negativas, a lisozima origina esferoplastos (células com resquícios de parede celular).

Ação da penicilina na PC: Este antibiótico impede a ligação dos tetrapeptídeos. A droga se liga irreversivelmente às PBPs, que são proteínas envolvidas no processo de biossíntese do peptideoglicano. Paralelamente, as autolisinas, que atuam em conjunto com a maquinaria de biossíntese, passam a degradar porções do peptideoglicano. Como a síntese está bloqueada, o resultado líquido é a formação de uma parede defeituosa.

A Camada SAlgumas bactérias e várias Archaea apresentam uma camada de natureza

protéica ou glicoprotéica estruturada (como um piso de tacos), denominada camada S. Esta camada, as bactérias, encontra-se acima da parede celular e até o momento, suas funções não se encontram totalmente esclarecidas.

Acredita-se que esta camada proteja a célula contra flutuações osmóticas, de pH e íons, além de auxiliar na manutenção da rigidez da parede. Alguns autores especulam que a camada S pode mediar a ligação dos organismos a superfícies.Microscopia eletrônica de uma célula contendo a camada S.(Adaptado de Prescott et al., 2002)

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 2)

Cápsula, Glicocálix e camada limosa - A cápsula pode ser definida como uma camada externa à parede celular, geralmente apresentando-se como um material viscoso, fortemente associado à superfície celular, geralmente de

natureza polissacarídica e raramente protéica. Por outro lado, o termo camada limosa é algumas vezes definido como uma uma zona difusa, contendo material pouco organizado, sendo facilmente removida.

A presença da cápsula normalmente confere vantagens às bactérias, pois suas principais funções incluem: ligação às células do hospedeiro, fator de virulência por dificultar a fagocitose e também a proteção, seja aumentando a resistência ao dessecamento, uma vez que armazena grandes quantidades de água, fonte de nutrientes e proteção contra a infecção por bacteriófagos, ou interação com anticorpos.

Em odontologia, a presença da cápsula pode ser considerada como um importante fator de virulência para o principal agente cariogênico - S.mutans, que sintetiza um cápsula composta por um homopolissacarídeo denominado glucano (produto da degradação da sacarose em glicose e frutose). Tal polímero adere-se firmemente à parede celular do microrganismo e permite sua aderência ao esmalte, favorecendo sua colonização.

Outros microrganismos apresentam cápsula de natureza heteropolimérica - S. pneumoniae. Eventualmente, a cápsula pode ser de natureza polipeptídica, como em B. anthracis (ácido glutâmico, na forma D).

Micrografia óptica, empregando atácnica de coloração negativa,revelando células capsuladas.(Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998)Micrografia eletrônica detransmissão, revelando a delgadacápsula circudando a célula(Adaptado de "An eletctronic companion to microbiology")

Fímbrias e Pili - Muitas bactérias Gram negativas apresentam apêndices finos (3 a 10 nm), retos e curtos, denominados fímbrias. Geralmente estas são bastante numerosas, podendo atingir números de 1000 ou mais por célula. Como são muito pequenas e delgadas, somente podem ser visualizadas pela microscopia eletrônica. As fímbrias são de natureza protéica, compostas por subunidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de pilina. As fímbrias possuem, geralmente em sua extremidade, e algumas vezes ao longo da estrutura, proteínas distintas, denominadas adesinas, as quais mediam a adesão específica da célula bacteriana a diferentes substratos.Micrografia eletrônica devarredura de bacilos apresentandofímbriasEsquema ilustrando a organizaçãoestrutural de uma fímbria, assinalando apresença de moléculas do tipo adesina,situadas na extremidade da estrutura(Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology)

Muitas bactérias podem ainda apresentar outro tipo de apêndice, denominado pilus F ou fímbria sexual, o qual exibe semlhanças estruturais com as fímbrias. No entanto, este tipo de fímbra é normalmente encontrado em um menor número nas células, variando de 1 a 10. O pilus F corresponde a uma estrutura bastante longa e menos rígida que as fímbrias convencionais, estando envolvido no reconhecimento de outras bactérias, em um processo de transferência de genes denominado conjugação.Micrografia eletrônica colorizada, revelando a longa fímbria sexual (pilus F).Observar também a presença de fímbrias.

Atualmente, diferentes tipos diferentes de fímbrias vêm sendo descritos, sendo vários destes associados à adesão, ou à virulência.

Bactérias Gram positivas podem, muitas vezes, apresentar estruturas fibrilares (diferentes de fímbrias) em sua superfície, provavelmente também envolvidas nos processos de adesão a substratos.

Flagelos - Estruturas longas, delgadas e relativamente rígidas, apresentando cerca de 20 nm de espessura e 15 a 20 Pm de comprimento, responsáveis pela locomoção das bactérias. Devido à sua pequena espessura, os flagelos somente podem ser visualizados por meio de colorações específicas, microscopia de campo escuro, ou por microscopia eletrônica.

De acordo com o número e distribuição dos flagelos, as bactérias podem serclassificadas como: atríquias (sem flagelos), monotríquias (um único flagelo), anfitríquias (um flagelo em cada extremidade) , lofotríquias (um tufo de flagelos em uma, ou ambas as extremidades) e peritríquias (apresentando flagelos ao longo de todo o corpo bacteriano).Bactéria monotríquia(Adaptado de Atlas, 1997 - Principles ofMicrobiology)Bactéria anfitríquia(Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)Bactéria lofotríquia(Adaptado de Tortora et al., 1998 -Microbiology)Bactéria lofotríquia(Adaptado de Atlas, 1997 - Principles ofMicrobiology)Bactéria peritríquia(Adaptado de Tortora et al., 1998 -Microbiology)Bactéria peritríquia(Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Estrutura - Estruturalmente, o flagelo pode ser subdivido em 3 regiões: filamento, corpo basal e gancho, sendo estas duas últimas importantes para a inserção e movimentão do filamento. O filamento dos flagelos apresenta estrutura helicoidal, com comprimento de onda constante para cada espécie.

Este corresponde a um cilindro longo e oco, composto por unidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de flagelina, que pode variar de 30 a 60 kDa, dependendo do microrganismo. Sua extremidade distal é revestida por uma proteína seladora. Algumas bactérias apresentam bainhas de diferentes naturezas revestindo o filamento, tal como em Vibrio cholerae, ou Bdellovibrio. O gancho apresenta maior espessura que o filamento, sendo composto por diferentes subunidades protéicas. O corpo basal corresponde à porção mais complexa do flagelo, apresentando 4 anéis ligados a um bastão central em bactérias Gram negativas, enquanto em Gram positivas são observados apenas 2 anéis. Os anéis externos L e P associam-se ao LPS e peptidioglicano, respectivamente, enquanto os anéis S e M estão associados à membrana citoplasmática.Esquema da estrutura dos flagelos bacterianos, em célulasGram negativas (à esquerda) e Gram positivas (à direita)(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)Detalhe ampliado da estrutura de um flagelo de células Gram negativas(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Síntese flagelar - Muitos genes estão envolvidos na síntese do flagelo e namobilidade celular. Em E. coli e Salmonella foram identificados mais de 40 genes (fla), que codificam proteínas estruturais, de exportação de componentes para o exterior e de regulação de muitos eventos bioquímicos envolvidos na síntese de novos flagelos. A síntese de flagelos é fortemente regulada, tanto por fatores metabólicos como por sinais emitidos durante a divisão celular. Acredita-se que as subunidades de flagelina sejam transportadas ao longo do filamento e se autoarranjam espontaneamente, quando atingem a ponta.

Movimentação - A movimentação dos flagelos ocorre através de um mecanismo de rotação do filamento, em velocidades que podem atingir até 270 ou 1100 rps, o que permite uma locomoção de até 100 Pm/segundo, correspondendo a 100 vezes o seu comprimento/minuto. Os flagelos atuariam de maneira análoga a propulsores de um barco, sendo o sentido da rotação importante para o tipo de movimentação resultante. Em muitas células monotríquias, a rotação no sentido anti-horário promove a movimentação para frente, enquanto a rotação no sentido horário faz com que a célula se locomova no sentido oposto.

Em outras monotríquias, quando o flagelo gira no sentido horário promove alocomoção.Tipos de movimentação de células monotríquias(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

No caso de bactérias peritríquias, quando os flagelos giram no sentido antihorário as células se movem para frente. Estes dobram seus ganchos e seus filamentos se agrupam, formando um feixe, que gira e propele a célula.Quando a rotação ocorre no sentido horário, os flagelos se separam e a bactéria passa a vibrar somente, até que os flagelos voltem a girar no sentido anti-horário, impulsionando novamente a célula para frente.Para que haja a movimentação, o bastão localizado entre o gancho e o anel M tem a capacidade de rodar livremente na membrana citoplasmática.Acredita-se que o anel S esteja fixo na parede celular, sem a possibilidade de rodar. Os anéis P e L sustentariam o bastão. Há evidências que o corpo basal atuaria como uma estrutura passiva que giraria no interior de um complexo proteíco inserido na membrana, semelhante a um rotor de um motor elétrico, que gira no centro de um anel de eletromagnetos (estator). A energia necessária para a rotação é provida pela força próton motiva. A dissipação do gradiente de prótons cria uma força que gira o flagelo no sentido anti-horário, impelindo o microrganismo. O rotor seria composto pelo bastão central, pelo anel M e por um anel C, ligado ao M através da membrana citoplasmática. Estes anéis são formados por várias proteínas, sendo a FliG bastante importante. No estator, temos as proteínas MotA e MotB, que formam um canal de prótons, sendo que MotB também ancora o complexo ao peptideoglicano.Esquema ilustrando a movimentação de bactérias peritríquias(Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Flagelos periplasmáticos - Estes flagelos são encontrados apenas nos espiroquetas (sendo muitas vezes denominados de filamentos axiais). Como o prórpio nome indica, estes flagelos situam-se no periplasma, localizandose abaixo da membrana externa destas bactérias. Os flagelos periplasmáticos originam-se a partir dos polos celulares, voltando-se em direção ao centro da célula, envolvendo a membrana citoplasmática do corpo bacteriano.Micrografiaeletrônica colorizada, revelando osflagelos periplasmáticos (amarelo)(Adaptado de Tortora et al., 1998 -Microbiology)Micrografia eletrônica revelando o flageloperiplasmático, situado abaixo da membranaexterna(Adaptado de An Electronic Companion toMicrobiology)

Movimentação por meio de deslizamento

Muitos procariotos são móveis, apesar de não possuírem flagelos. Estas bactérias são capazes de se movimentar sobre superfícies sólidas, por um

processo denominado deslizamento. A motilidade por deslizamento é apresentada por vários membros de Bacteria, sendo, no entanto, estudada somente em alguns poucos grupos. O movimento deslizante é consideravelmente mais lento – 10 Pm/seg para algumas bactérias, quando comparado às velocidades atingidas pelo movimento flagelar mas, da mesma forma, permite a locomoção das bactérias em seus habitats.

Mecanismos da Motilidade Por Deslizamento

Embora até o momento nenhum mecanismo de deslizamento tenha sido comprovado, existem alguns modelos definindo o processo, além de evidências sugerindo a existência de mais de um tipo de mecanismo. Em cianobactérias, à medida que as células deslizam, secretam um polissacarídeo limoso em sua superfície externa. Aparentemente, este polissacarídeo estabelece o contato entre a superfície celular e a superfície sólida, contra a qual a célula desliza. À medida que o polissacarídeo limoso excretado se adere à superfície, a célula é gradativamente puxada. Esta hipótese é sustentada pela observação de poros excretores de compostos limosos na superfície de várias cianobactérias filamentosas.

Em Flavobacterium johnsoniae, provavelmente o mecanismo de deslizamento envolve a movimentação de proteínas na superfície celular. De acordo com este modelo, proteínas específicas de motilidade, ancoradas nas membranas citoplasmática e externa, parecem propelir a célula para frente por um mecanismo de cremalheira contínua. Ao que parece, o movimento das proteínas da membrana citoplasmática é promovido pela liberação de energia oriunda da força próton motiva que, de alguma maneira, transmite esta energia às proteínas da membrana externa, localizadas ao longo de uma “pista de corrida” na superfície celular. Acredita-se que o movimento das proteínas da pista de corrida contra uma superfície sólida, literalmente empurre a célula para frente.

Assim como as outras formas de motilidade, o deslizamento apresenta grande relevância ecológica. Este movimento permite que a célula explore novos recursos, ou interaja com outras células, de maneira benéfica.Esquema proposto para a movimentação deslizante de Flavobacterium(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 3)Periplasma (gel periplasmático) - Corresponde a um espaco situado entre a membrana externa e membrana citoplasmatica, encontrado em celulas Gram negativas.Embora questionaveis, relatos esporadicos descrevem a existencia de um espaco observado entre o peptideoglicano e a membrana citoplasmatica de organismos Gram positivos. O periplasma apresenta consistencia de gel, provavelmente devido ao grande numero de proteinas presentes nesta regiao. Em virtude disto, este "espaco" passou a ser denominado gel periplasmatico. O periplasma pode atingir de 1 a cerca de 70 nm de espessura, correspondendo a ate 40% do volume total da celula.

Em Gram negativas, tem grande importancia, pois varias enzimas e outras proteínas estao localizadas, incluindo hidrolases, proteinas de ligacao envolvidas no transporte e quimiorreceptores. Bacterias quimiolitotroficas e denitrifcantes apresentam muitas vezes proteínas transportadoras de eletrons no periplasma, outras apresentam enzimas envolvidas na síntese de peptideoglicano. A presenca do periplasma bacterias Gram positivas e ainda motivo de controvérsias, devido ao enorme potencial secretor que este grupo apresenta.

Membrana Citoplasmática - Estrutura delgada, com cerca de 8 nm, composta por uma bicamada fosfolipidica (podendo apresentar 7 tipos de fosfolipideos diferentes), entremeada de proteinas (cerca de 200 tipos distintos), atuando como importante barreira osmotica, altamente seletiva. Normalmente, as membranas de organismos procariotos apresentam maiores concentracoes

de proteinas que as membranas eucarioticas, tendo em vista a ausencia de organelas citoplasmaticas nas bacterias.A bicamada fosfolipidica e composta por glicerol ligado a duas cadeias de acidos graxos, atraves de ligacoes do tipo ester, com proteinas entremeadas. Tanto as proteinas como os fosfolipideos podem mover-se lateralmente ao longo da membrana. Esta e estabilizada principalmente por interacoes hidrofobicas e por pontes de H.Paralelamente, os ions Ca+2 e Mg+2 tambem participam, interagindo ionicamente com as cargas negativas dos fosfolipideos.Via de regra, os fosfolipideos bacterianos contem acidos graxos com cadeias nao ramificadas de 16 a 18 atomos de carbono. Esta composicao pode ser variavel, de acordo com as condicoes ambientais. Assim, quando cultivadas em temperaturas baixas, ha um aumento da proporcao de acidos graxos insaturados, aumentando consequentemente a fluidez da membrana. Por outro lado, aumetando o grau de saturacao, as cadeias tornam-se mais rigidas, pois as moleculas tem maior capacidade de associacao.Esquema da membrana citoplasmatica bacteriana(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Via de regra, exceto no caso dos micoplasma (bacterias desprovidas de parede celular), micoplasmas, as membranas procarioticas nao apresentam esterois, como observado em eucariotos. Entretanto, muitas bacterias apresentam moleculas pentaciclicas, semelhantes a esterois, denominadas hopanoides, talvez conferindo maior rigidez a membrana. A presenca de esterois na membrana citplasmatica de micoplasmas pode ser justificada pela ausencia da parece celular, neste grupo de organismos.Similaridade estrutural entre os esterois (a), colesterol (b) e hopanoides (c)(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Mesossomos - correpondem a extensas invaginacoes da membrana citoplasmatica, em forma de vesiculas, lamelas ou tubulos. Geralmente sao encontrados com maior abundancia em Gram positivos, mas tambem presentes em Gram negativos. Ate hoje, sua existencia e funcoes sao ainda debatidas pelos pesquisadores. Diversas funcoes tem sido atribuidas aos mesossomos, tais como a participacao na segregacao dos cromossomos durante a divisao, papel respiratorio, papel na esporulacao, ou ate mesmo como sendo um mero artefato decorrente dos procedimentos utilizados para a preparacao microscopica dos especimes. A partir do acahado de extensos mesossomos em bacterias de grandesdimensoes, acredita-se que sua principal funcao seja de aumentar a superficie da membrana, aumentando assim o conteudo enzimatico das celulas.Matriz Citoplasmática - E composta por cerca de 70% de agua, alem dos demais compostos celulares, tais como o DNA, inclusoes e plasmideos. Caracteristicamente, o citoplasma celular apresenta um grande concentracao de ribossomos e proteinas, tais como proteinas atuando como um sistema de citoesqueleto. Nucleóide e plasmídeos- Os procariotos sao organismoshaploides, geralmente apresentando apenas 1 unico cromossomo nao envolto por carioteca. Eventualmente, algumas bacterias podem apresentar 2 ou 3 cromossomos. O cromossomo bacteriano e normalmente cirucular e encontra-se bastante enovelado, em uma regiao celular denominada nucleoide. Em bacterias, o cromossomo nao apresenta-se associado a histonas, sendo estabilizado por outras proteinas de natureza basica. Geralmente o DNA cromossomal corresponde a uma molecula bastante grande, podendo ser 1000 vezes maior que a propria celula. Em E. coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo aproximadamente 1 mm de comprimento, quando linearizado.(Adaptado de An Electronic Companion toMicrobiology)Varias bacterias apresentam tambem moleculas de DNA extracromossomal, denominadas plasmideos, as quais sao geralmente circulares, contendo muitas vezes genes que conferem caracteristicas adaptativas vantajosas ao microrganismo. Seu numero e dimensoes sao bastante variaveis.Corpúsculos de inclusão - Sao granulos de armazenagem, de diferentes naturezas, sendo geralmente utilizados como fonte de material de reserva ou energia, muitas vezes insoluveis. Estes podem apresentar-se sem qualquer envoltorio ou envoltos por uma unica camada lipidica delgada (diferente de uma membrana), ou por proteinas.Dentre os compostos organicos armazenados temos o glicogenio, o amido e poliidroxibutirato. Ja dentre os inorganicos temos polifosfatos (volutina ou metacromaticos) e enxofre.Granulos de poliidroxibutirato(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Os magnetossomos sao particulas intracelulares de magnetita (Fe3O4), que originam um dipolo magnetico na celula, que pode responder aos campos geomagneticos. Estes foram descritos em algumas bacterias aquaticas e algas. Outras bacterias aquaticas apresentam vesiculas de gas, que conferem mobilidade nas diferentes camadas de agua. Sao estrutura sem forma de fuso, ocas,

compostas por proteinas, tendo tamanhos variaveis (30 - 300 nm de diametro e ate 1000 nm de comprimento). Consistem de um orificio oco envolto por uma membrana (armacao) proteica extremamente delgada (2 nm). Nesta membrana encontram-se por 2 tipos de proteinas que originam uma estrutura rigida, impermeavel a agua e permeavel a gases. A proteina predominante tem cerca de 7.5 kDa, contendo A 50% de residuos de aminoacidos hidrofobicos (Ala, Val, Leu, Ile), provavelmente voltados para o interior da particula, evitando a entrada de agua. Células apresentando magnetossomos em seu interior (corpúsculos negros enfileirados)(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)Preparação de magnetossomos(Adaptado de Prescott et al., Microbiology,2000)Bactérias se movendo em direção a um campo magnético(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)Esquema de uma vesícula de ar,indicando como as proteínas que aformam se associam(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology ofMicroorganisms, 2003)

Domínio Archaea

Considerações GeraisPor volta da decada de 70, varios organismos procarioticos foram isolados a partir de uma

serie de ambientes considerados extremamente inospitos, quase que incompativeis com a presenca de seres vivos. Estes ambientes naturais caracterizavam-se por apresentar temperaturas bastante elevadas (proximas a 100oC), extrema acidez (pH proximo a 2), altas salinidades (cerca de 10 a 15%) e, muitas vezes, ausencia completa de oxigenio. Como varias destas caracteristicas correspondiam as possiveis condicoes encontradas na Terra primitiva, os pesquisadores acreditavam que os organismos procarioticos presentes nestes ambientes deveriam corresponder a celulas primitivas, talvez "fosseis vivos", representando as formas de vida ancestrais das bacterias modernas. Por esta razao, estes organismos foram denominados "arqueobacterias".

No entanto, a partir dos trabalhos de Carl Woese e colaboradores (ha cerca de 25 anos), realizando estudos comparativos de sequencias de DNA que codificavam rRNA (16S e 23S) de diferentes organismos, foram definidos 3 grandes dominios compreendendo todos os seres vivos. Assim, de acordo com a proposta de Woese, os seres vivos poderiam ser agrupados em tres grandes dominios: Bacteria (anteriormente denominadas eubacterias), Archaea (as "arqueobacterias") e Eucarya (Eucariotos). Estes tres dominios teriam derivado de um hipotetico ancestral comum de todas as celulas.

A analise da arvore filogenetica apresentada abaixo, revela como a denominacao "arqueobacterias" e inadequada e quao obsoleta e a ideia de que as "arqueobacterias" seriam os ancestrais das bacterias atuais, pois estes organismos nao correspondem aos ancestrais da bacterias atualmente conhecidas.Árvore filogenética universal, apresentando os três domínios da vida(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

Esta arvore revela claramente que as "arqueobacterias" nao correspondem aos ancestrais das bacterias atuais, visto que sua possivel origem ocorre quase que concomitantemente a origem das bacterias mais primitivas.

Outro aspecto que a arvore permite deduzir e o fato das "arqueobacterias" ocuparem uma posicao intermediaria entre os dominios Bacteria e Eucarya, sugerindo que estas correspondem a um grupo de organismos diferentes de bacterias e de celulas eucarioticas. De fato, estudos geneticos e fisiologicos posteriormente revelaram que tais organismos apresentam caracteristicas de bacterias, de eucariotos, alem de caracteristicas exclusivas, não encontradas em qualquer outro dominio. Por esta razao, deixaram de ser denominadas "arqueobacterias", recebendo a denominacao archaea.

Uma questao ainda nao elucidada refere-se ao porque de encontrar-se um grande variedade de archaea extremofilas, habitanto ambientes de altas temperaturas, salinidade, ou extremos de pH. Por outro lado, o acumulo de conhecimentos sobre este grupo vem mostrando que as archaea podem ser encontradas nos mais diversos ecossistemas, desde ambientes aquaticos frios, sistema digestorio do homem e outros animais, em tecidos vegetais. Certamente nao e absurdo cogitar que no futuro sejam descobertas archaea patogenicas ao homem ou outros seres vivos.

As caracteristicas apresentadas por alguns dos membros deste dominio parecem refletir as condicoes primitivas da Terra, quando tal dominio comecou a evoluir como um ramo filogeneticio distinto. Ao que parece, varias archaea conservaram mais do que as eubacterias estas caracteristicas fisiologicas primitivas, o que seria responsavel pela distribuicao atual no planeta.Assim, as archaea compreendem um grupo heterogeneo de microrganismos que podem ser caracterizados, em sua maioria, como habitantes de ambientes inospitos, geralmente crescendo em condicoes consideradas ate entao como extremas e limitrofes para a vida.

Classificação das ArchaeaAtualmente, considera-se que este dominio apresente tres filos: Crenarchaeota, Euryarchaeota e Korarchaeota.Árvore filogenética do domínio Archaea(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Crenarchaeota, separa-se muito proximo da raiz da arvore universal, sendo composto por organismos hipertermofilos (Thermoproteus, Pyrolobus e Pyrodictium), compreendendo os organismos capazes de crescer nas maiores temperaturas conhecidas.

Estes hipertermofilos sao, em sua maioria, quimiolitotroficos autotroficos, sendo entao classificados como produtores primarios. Neste grupo ha tambem organismos isolados (mas ainda nao cultivados em laboratorio) de ambientes frios, tais como aguas oceanicas.

Lagoa quente, rica em enxofre, que e convertido a acido sulfurico, por especies de archaea. Sulfolobus, exemplo de uma archaea do filo Crenarchaeota, habitante da lagoa ilustrada acima.(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Euryarchaeota e um grupo fisiologicamente diverso, sendo composto por dois grupos: 1)as archaea metanogenicas, que sao anaerobias, (Methanococcus, Methanobacterium e Methanosarcina), encontradas em ambientes de condicoes extremas, e 2) as halofilicas extremas, que sao aerobias (Halobacterium, Halococcus). As metanogenicas compreendem os organismos mais anaerobios conhecidos, ou seja, o oxigenio mesmo em concentracoes baixissimas, exerce um efeito extremamente letal sobre estes organismos. Neste filo ha ainda o genero Thermoplasma, composto por bacterias acidofilas, termofilicas, que nao apresentam parede celular. As halofilicas geralmente coram-se como Gram negativas, nao apresentam esporos e, em sua maioria, sao imoveis, geralmente apresentando grandes plasmideos, contendo cerca de 25 a 30% do DNA da celula. Dentre as metanogenicas, encontra-se o genero Methanopyrus, que cresce em temperaturas de ate 110°C.Lago hipersalino no Egito,rico em carbonato de sodio. O pHdestas aguas encontra-se na faixa de10, sendo habitado por archaeahalofilas extremas, tais comoHalobacterium salinarum. A coloracaovermelha e decorrente da presencade pigmentos carotenoides, presentesnestes organismos.Thermoplasma, uma archaea desprovida de parede celular.Pilha de refugo da mineracao decarvao, que muitas vezes sofre autocombustao.Habitat da archaeaThermoplasma.(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)O filo Korarchaeota e composto quase que somente por isolados identificados apenas a partir do sequenciamento de 16S rRNA, sendo considerado um grupo de hipertermofilos. Ate o momento, poucos especimes de Korarchaeota foram cultivados em laboratorio. Pesquisas realizadas em uma fenda termal localizada no fundo do mar da Islandia, em 2002, levaram a identificacao de uma nova especie de archaea apresentando caracteristicas bastante distintas, quando comparada aos demais membros desse dominio. A especie Nanoarchaeum equitans diferencia-se das demais archaea por ser aparentemente muito primitiva (ou modificada), sendo encontrada em associacao com outra archaea (Igniococcus sp.). Este organismo de morfologia arredondada e bastante diminuto, apresentando cerca de 400 nm de diametro e um pequeno genoma, de 0,5 Megabases. De acordo com seus descobridores, as grandes diferencas apresentadas por Nanorachaeum em relacao a sequencia de RNA ribossomal, sugerem que tal organismo seja classificado em um novo filo, proposto como Nanoarchaeota.Micrografia de fluorescencia,empregando um corante especificopara DNA, revelando as celulas deIgniococcus (maiores) e deNanoarchaeum equitans (menores).

No quadro a direita, micrografiaeletronica evidenciando a estreitaassociacao das duas archaea.Boucher & Doolittle (2002) Nature, 417:27-28(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)Micrografia de fluorescenciaempregando corantes especificos para os rRNAsde Igniococcus (verde) e Nanoarchaeum(vermelho)Huber et al. (2002) Nature, 417:63-67.(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)

Estrutura celular das Archaea

Quanto a morfologia, podem ser esfericas, bacilares, espiraladas, achatadas, quadradas, discoides e muitas vezes de morfologia irregular ou pleomorficas. Suas dimensoes são extremamente variaveis, de 0,1 a 15 Um, com alguns filamentosos atingindo 200 Um. As archaea apresentam varias caracteristicas especiais, que permitem seu desenvolvimento em uma vasta gama de ambientes. Estas incluem alteracoes de composicao de membrana, composicao variada de paredes celulares, presenca de proteinas tipo histonas, introns, mecanismos de splicing, entre outros.

Parede celular: Apresenta composicao e estruturacao extremamente variaveis neste grupo de microrganismos. Esta variabilidade sugere que o ancestral comum seria desprovido de parede, sendo as diversas paredes resultantes de evolucao independente, de acordo com os diferentes ambientes e grupos de archaea.

Diferentes composições de parede celular presentes em archaea.(Adaptado de Atlas, R.M. (1997) - Principles of microbiology)

Quando coradas pelo metodo de Gram, algumas archaea comportam-se como Gram positivas e outras como Gram negativas, embora suas paredes sejam completamente distintas daquelas de eubacterias. Como observado na figura acima, suas paredes celulares apresentam uma grande diversidade quanto a composicao quimica e, diferentemente das eubacterias, nao apresentam peptideoglicano. Alem disso, existem tambem outras archaea que nao exibem parede celular (Thermoplasma).

O genero Thermoplasma cresce bem em temperaturas de 55°C e pH 2, em meios complexos. Estes organismos apresentam a membrana citoplasmatica bastante diferente, contendo compostos semelhantes a lipopolissacarideos, contendo ligacoes tetraeter. Um outro genero, filogeneticamente relacionado a Thermoplasma, e Picrophilus, que cresce em pHs de 0,06 a 0,7.

Varias archaea exibem uma parede espessa, rigida, semelhante a parede Gram positiva (Methanobacterium, Methanopyrus, Halococcus), entretanto, os polimeros que compoem a estrutura podem ser: pseudopeptideoglicano ou metanocondroitina. O pseudopeptideoglicano diferencia-se do peptideoglicano pela ocorrencia de acido talosaminuronico em substituicao ao muramico, pela ligacao do tipo b-1,3 ao inves de b-1,4 entre os acucares e pela ausencia de D-aminoacidos nas porcoes peptidicas da molecula.

Nestas bacterias, a lisozima nao exibe qualquer atividade de degradacao da parede, uma vez que seu sitio de acao sao as ligacoes b-1,4. Da mesma forma, a penicilina e ineficaz contra estes organismos porque o mecanismo de sintese de parede e distinto nas archaea.

A metanocondroitina e um polimero de 4 acucares (galactosamina, acido glucoronico, N-acetil-galactosamina e glicose), muito semelhante ao tecido conectivo animal, composto por sulfato de condroitina.

Aquelas archaea que coram-se como Gram negativas podem ter paredes compostas por proteinas, polissacarideos ou glicoproteinas. As paredes proteicas podem variar entre si, podendo ser do tipo monocamada de natureza cristalina, ou policamadas, de proteinas tubulares. As glicoproteinas sao tambem comuns, muitas vezes contendo grandes quantidades de aminoacidos carregados negativamente. As halobacterias sao um exemplo do modelo descrito acima, onde as cargas negativas da parede interagem com os ions Na+ do ambiente, estabilizando a parede.

O genero Halococcus apresenta a parede celular composta por um heteropolissacarideo altamente sulfatado, nunca observado em qualquer outro ser vivo.

Eventualmente, algumas archaea exibem uma camada proteica adicional ao redor da parede celular, ou compondo a propria parede, denominada “camada S”, em um estado cristalizado.

Membrana Citoplasmática: corresponde a uma estrutura unica, apresentando composicao quimica e arranjo totalmente diferentes das membranas citoplasmaticas de quase todas as bacterias e de todos eucariotos.Membrana Bacteria Archaea EucaryaConteúdo protéico alto alto baixoComposição lipídica fosfolipideosSulfolipideos,glicolipideos,hidrocarbonetosramificados, isoprenoides,fosfolipideosFosfolipideosEstrutura doslipídeoscadeia linear cadeia ramificada cadeia linearLigação dos lipídeos ester eter (di e tetraeter) ester

As membranas de archaea geralmente apresentam um alto conteudo proteico e varios lipideos: glicolipideos, sulfolipideos, fosfolipideos (raros) e lipideos apolares do tipo isopreno. A presenca de hidrocarbonetos ramificados aumenta a fluidez da membrana, uma vez que dificultam a formacao de estruturas cristalinas. Dentre os principais lipideos estao aqueles do tipo glicerol-eter-isopreno (hidrocarbonetos de 20, 25 ou 40 Carbonos).

Uma caracteristica da porcao lipidica da membrana e o fato desta nao ser composta por acidos graxos convencionais. Em seu lugar encontram-se longas cadeias de hidrocarboneto ramificadas. Os hidrocarbonetos ligam-se ao glicerol por ligacoes do tipo eter (ao inves de ester) e podem apresentar-se como bicamadas (como em todas as membranas) ou como monocamadas. Quando formam bicamadas, denominam-se glicerol dieter e quando originam monocamadas, diglicerol tetraeter.

Quando ha a monocamada, esta modula sua fluidez atraves da ciclizacao de alguns elementosda cadeia de hidrocarboneto, formando aneis pentaciclicos.

As proteinas de membrana podem ser tambem bastante diferentes daquelas observadas emoutros tipos celulares.Estrutura e composição da membrana presente em várias archaea.(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

Cromossomo: E bastante semelhante ao cromossomo das eubacterias, uma vez que e unico e, na maioria dos casos, circular. Por outro lado, sua organizacao e semelhante aos eucariotos, uma vez que observam-se proteinas (do tipo histona) associando-se ao DNA, atuando na manutencao da estrutura do DNA, afetando tambem a expressao genica. Foi observado que em muitos hipertermofilos a associacao das proteinas ao DNA promove um enovelamente do tipo positivo no DNA, enquanto em eucariotos, este e negativo.

Foi tambem relatada a presenca de introns no cromossomo de Archaea, em genes de RNA de hipertermofilos e halofilos, sendo processado atraves de endonucleases.

Transcrição: Em relacao aos promotores, aparentemente sua estrutura tem maior semelhanca com promotores de eucariotos que de procariotos. A RNA polimerase e mais complexa que a de bacterias, podendo ser composta por 8 polipeptideos em metanogenicas e halofilicas (enquanto em Bacteria sao 4). Nas hipertermofilas, podem existir 10 polipeptideos distintos (assemelhando-se a RNA polimerase de eucariotos).

Ribossomos: Sao do tipo 70S, semelhantes aos de bacterias, entretanto, sua composicao proteica e bastante distinta, tornando-os resistentes aos antibioticos que afetam a sintese proteica bacteriana. A traducao tambem e diferentes das Bacteria, assemelhando-se mais aos Eucarya, sem a participacao da formil-metionina no inicio do processo. A toxina difterica, que inibe a traducao de celulas eucarioticas tambem inibe o processo em Archaea.

Flagelos: Muitas archaea, inclusive aquelas sem parede celular, podem apresentar flagelos. Estes diferem totalmente dos flagelos bacterianos, uma vez que nao apresentam a estruturacao em corpo basal, gancho e filamento. Nas Archaea, o flagelo nao apresenta os aneis observados nas bacterias e, geralmente, e composto por varios tipos de “flagelina”, que exibe composicao similar a varias fimbrias. Ao que parece, o flagelo e composto por flagelina, que se organiza a partir da membrana citoplasmatica, projetando-se para o exterior da celula.

MetabolismoAs archaea apresentam uma enorme diversidade metabolica. Muitas são quimiorganotroficas,

com metabolismo semelhante as demais celulas, outras são quimiolitotroficas, utilizando o H2 como doador de eletrons nas reacoes de oxi-reducao. Varias archaea sao anaerobias e geralmente termofilas e suas vias para obtencao de energia geralmente envolvem1) Reducao do CO2 a metano ou conversao do acetato a CO2 e entao metano; sendo incorporado pela via do Acetil-Coa CO2 + 4H2 k CH4 + 2H2O nas metanogenicas

2) Reducao de SO4 a H2S; SO4 2- + H+ + 4H2 k HS- + 4H2O3) Reducao de Enxofre elementar a H2S. S + H2 k HS- + H+

Assim, pode-se notar que muitas archaea exibem metabolismo quimioautotrofico.

Ecologia de archaeaEmbora inicialmente fossem consideradas organismos restritos a ambientes extremos, muitas

archaea vem sendo isoladas de ambientes favoraveis aos demais organismos procarioticos e eucarioticos. No entanto, dentre as varias archaea descritas ate o momento, a maioria e encontrada em poucos ambientes especializados terrestres e aquaticos, tais como lagos extremamente salinos, ambientes estritamente anaerobios e/ou ambientes extremamente quentes. Ate pouco tempo, a menor temperatura onde foi possivel se fazer o cultivo “in vitro” de archaea era de 30°C.

Dados recentes indicam, por outro lado, que este grupo de microrganismos pode tambem ser isolado de ambientes frios. Atualmente sabemos que estes organismos são importantes membros da microbiota aquatica de regioes frias do planeta. Ao que parece, as archaea podem corresponder a ate 34% da biomassa procariotica das aguas costeiras superficiais da Antartida.

De maneira geral, e pelo fato da maioria das archaea conhecidas serem isoladas de ambientes quentes, salinos e/ou anaerobios, este dominio e didaticamente dividido em tres grandes grupos: termofílicos, halófilos e metanogênicos. No entanto, vale ressaltar mais uma vez que dados mais recentes comprvam a ampla distribuicao geografica e ecologica desse grupo de organismos.

Termofilia: Sabe-se que varias archaea tem temperatura otima superior a 80°C e temperatura maxima de crescimento acima de 100°C (Pyrodictium brockii tem otimo de 105°C e Pyrolobus fumarii de 106°C, embora cresca em ate 113°C). Ainda nao se sabe ate onde pode ir esta faixa de temperatura.

Pyrolobus fumarii foi isolado de uma fenda no Oceano Atlantico, a uma profundidade de 3.650 metros, crescendo em uma faixa de temperatura de 90 a 113°C, pH de 4 a 6.5 e concentracoes de NaCl variando de 1 a 4%. Experimentos realizados em laboratorio mostram que culturas na fase exponencial de crescimento sobrevivem ao tratamento em autoclave (121°C) por 1 hora.A termofilia requer adaptacoes fisiologicas especializadas, pois as proteinas e acidos nucleicos nao podem ser desnaturados e a membrana deve manter-se funcional nestas temperaturas.

Curiosamente, a estrutura primaria (sequencia de aminoacidos) de varias proteinas de Archaea nao exibem diferencas significativas quando comparada a outros organismos.

Provavelmente, o principal fator para esta caracteristica seja o dobramento destas proteinas. Uma caracteristica das proteinas de termofilicos refere-se a substituicao de aminoacidos mais flexiveis por aqueles que conferem maior rigidez a molecula. Alem disso, foi sugerido que as proteinas poderiam ser estabilizadas pela presenca de altos teores de aminoacidos hidrofobicos. As archaea termofilas tambem exibem um enorme numero de chaperonas, que garantem o dobramento correto das proteinas nas temperaturas mais elevadas.

Em termos de genoma, observa-se muitas vezes valores maiores de G+C nas hipertermofilas, estabilizando assim os acidos nucleicos. Entretanto, tal caracteristica nao pode ser considerada como regra. Muitas termofilicas apresentam altas concentracao de 2,3- difosfoglicerato ciclico, um composto que protege contra a depurinizacao. Varias outras produzem uma DNA girase reversa, que enovela o DNA no sentido positivo, que e mais estavel que o negativo, o qual e encontrado na maioria das outras celulas. Alem disso, muitas vezes sao encontradas proteinas do tipo histona ou outras, que se ligam fortemente ao DNA, protegendo-o.

Quanto a membrana, sua funcionalidade e decorrente da presenca de isopreno e da ciclizacao de seus componentes, alem da alta frequencia de membranas do tipo tetraeter. As termofilas podem ser encontradas em fontes geotermicas, fontes vulcanicas (que expelem vapores e compostos sulfurados), fontes termais marinhas, onde erupcoes vulcanicas elevam a temperatura para mais de 100°C. Nestes casos, estas bacterias requerem, adicionalmente, pressoes elevadas para o seu desenvolvimento. Estes organismos sao muito utilizados em biodigestores de esgoto e tambem como fonte de insumos laboratoriais (Taq pol).

Halofilia: Este grupo de archaea habita locais denominados hipersalinos, requerendo grandes quantidades de sal para seu desenvolvimento. Um halofilo extremo requer pelo menos 1,5M de NaCl (9%), podendo variar de 2 a 4M (12 a 23%) para outras especies. Foramdescritos organismos capazes de crescer na presenca de 5,5M de NaCl, o que equivale a 32%, correspondendo ao limite de saturacao para este sal. Embora ambientes salinos sejam comuns, os hipersalinos sao raros, encontrando-se em areas quentes e secas do mundo (lagos salgados, salinas, mar morto). Nestes ambientes, as celulas tenderiam a perdem agua, devido a elevada concentracao externa de sal.

Entretanto, exibem uma adaptacao fisiologica que corresponde ao acumulo de sais ou ions em seu citoplasma, ou pela sintese de compostos organicos intracelulares, denominados solutos compativeis. Assim, o genero de halofilos Halobacterium bombeia grandes quantidade de K+ para o interior da celula, superando a concentracao externa de Na+. Nestes organismos, as enzimas devem exibir maior tolerancia ao sal, tendo em vista que seu funcionamento devera ocorrer em um ambiente muito concentrado. Muitas apresentam bombas de cloro, que constantemente bombeiam este ion para o interior da celula. As paredes podem conter uma grande quantidade de aminoacidos carregados negativamente, ou polissacarideos sulfatados, para interagir com ions Na+ presentes no meio, sendo esta interacao essencial a integridade da parede.

Metanogênicos: Este foi o primeiro grupo de archaea descrito, sendo unico por sua capacidade de sintetizar metano. Sua distribuicao geografica e muito ampla, sendo encontrados no intestino de ruminantes, em cupins, em lagoas, lodos de esgoto, etc. Podem ser quimiolitotroficos ou quimiorganotroficos e, via de regra, sao anaerobio estritos, exibindo enorme sensibilidade ao oxigenio.

Interações microbianasAo que parece, as archaea interagem intensamente com outros organismos, embora sejam

eventos menos frequentes que aqueles observados para as eubacterias. As archaea metanogenicas realizam associacoes com outros microrganismos, uma vez que

necessitam de substrato (principalmente H) para a producao de metano. Assim, em processos de degradacao anaerobia de residuos de industrias de papel, que ocorrem em rios e lagos e tambem no intestino de ruminantes, pode-se observar a ocorrencia de comunidades microbianas contendo metanogenicas, havendo a producao de metano e gas carbonico. Um dos principais produtos da fermentacao de muitos anaerobios e o H2, que e prontamente utilizado pelas metanogenicas, que associado ao CO2, origina o metano. O acido formico pode tambem ser utilizado como doador de eletrons para a reducao do CO2. A producao de metano, por sua vez, garante um ambiente anaerobico. Ja foi descrita a ocorrencia de metanogenicas endossimbiontes em protozoarios que habitam o rumen de vertebrados.

Foi descrita a associacao de archaea com animais e em alguns tecidos vegetais, embora ate o momento nao tenha sido comprovada a capacidade de invadir tecidos ou manifestar potencial patogenico nesses organismos. Em muitos casos a presenca de metanogenicas no rumen pode levar a prejuizos ao gado, uma vez que competem pelo acetato produzido na fermentacao da celulose.

Ha ainda um problema ambiental associado a producao de metano pelas archaea, pois este metano expelido pelas archaea contribui ao agravamento do efeito estufa. Estudos recentes indicam que a quantidade de metano expelida pelas Archaea pode ser de 400 ton3/ano (cerca de 50 litros por dia). Dados recentes revelam a deteccao de archaea em amostras de placa dental subgengival, embora nada tenha sido provado em relacao ao potencial patogenico dos organismos isolados.

Nutrição de microrganismosIntroduçãoOs microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. Em relacao aosprocariotos (Bacteria e Archaea), a nutricao ocorre predominantemente pela absorcao, uma vezque a grande maioria destes organismos possui uma espessa parede celular, impossibilitandoa realizacao de fagocitose.Os seres vivos podem ser classificados de acordo com as fontes de energia e decarbono que utilizam para seu crescimento. Assim, em relacao as fontes de energia, tempos osorganismos fototróficos (que utilizam a energia luminosa) e os quimiotróficos (que utilizam aenergia proveniente de reacoes quimicas). Em relacao as fontes de carbono, temos osorganismos autotróficos (fontes inorganicas) e os heterotróficos (fontes organicas). Dentre osprocariotos, iremos encontrar exemplos em todas as possiveis classes de organismos.Classificação dos seres vivos, de acordo com as fontes de energia e carbono(Adaptado de Tortora et al., Microbiology - An Introduction, 1997)Composição química da célula procarióticaAs celulas procarioticas sao compostas, essencialmente por macromoleculas(proteinas, acidos nucleicos, polissacarideos e lipideos), apresentando tambem uma menorquantidade de outros compostos organicos e inorganicos. Alem destes, encontramos ions eagua. Relativamente, podemos consideram a celula como sendo .90% de agua, .10% demacromoleculas e o restante compreendido pelos demais componentes.A maioria das pequenas moleculas e obtida a partir do meio, sendo as macromoleculassintetizadas em seu interior.

NutrientesOs nutrientes sao definidos como as substancias encontradas no ambiente, que participam do anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos: macronutrientes, que sao necessarios em grandes quantidades e micronutrientes, necessarios em pequenas quantidades. Alguns nutrientes sao utilizados como fonte de material para a biossintese das moleculas, enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessaria aos processos biossinteticos e de manutencao dos organismos. Muitas vezes, diferentes nutrientes podem apresentar os dois papeis descritos acima.Principais MacronutrientesCarbono: corresponde a base de todas as moleculas organicas. Entre os procariotosmelhor estudados ate o momento, a maioria requer algum tipo de composto organico comofonte de carbono, o qual pode ser de diferentes variedades (aminoacidos, acidos organicos,acucares, bases nitrogenadas, etc).Nitrogênio: corresponde ao segundo elemento mais abundante nas celulas, compondoproteinas, acidos nucleicos e peptideoglicano. Podemos encontrar o nitrogenio sob a forma decompostos organicos ou inorganicos, sendo ambas as formas prontamente utilizadas por umgrande numero de procariotos. Assim, a partir da degradacao de proteinas e acidos nucleicos,bem como a partir de amonia e nitrato, os organismos utilizam o nitrogenio presente nanatureza. Embora o nitrogenio esteja em grandes concentracoes na atmosfera, este nao eamplamente utilizado, exceto por aqueles organismos denominados fixadores de N2.Hidrogênio: elemento presente em proteinas, acucares e demais moleculas organicas.Fósforo: encontrado em compostos organicos (acidos nucleicos) ou inorganicos(fosfatos), sendo importante na composicao de acidos nucleicos e fosfolipideos. Em suamaioria, os microrganismos utilizam o fosforo sob a forma de compostos inorganicos.Enxofre: compondo a cisteina e metionina, estando presente tambem em variasvitaminas (tiamina, biotina). Na natureza, o enxofre sofre uma serie de transformacoes, asquais sao exclusivamente realizadas por microrganismos. A principal fonte de enxofre para osmicrorganismos corresponde aos sulfatos inorganicos ou H2S.Potássio: necessario para todos os microrganismos, devido ao seu papel ativador devarias enzimas, tais como aquelas envolvidas na traducao.Magnésio: necessario geralmente em grandes quantidades, uma vez que tem papel naestabilizacao de ribossomos, membranas e acidos nucleicos, sendo tambem importante para ofuncionamento de diferentes enzimas, especialmente aquelas envolvidas na transferencia defosfato.Cálcio: embora nao seja essencial ao crescimento da maioria dos microrganismos, tempapel de estabilizacao da parede celular e de termorresistencia nos esporos.Sódio: importante, especialmente para microrganismos marinhos e certas archaeahalofilas.Ferro: presente em um grande numero de proteinas, especialmente aquelas envolvidasna respiracao.Principais Micronutrientes: Embora necessarios em pequenas quantidades, tem papeltao importante quanto os macronutrientes.Cobalto: necessario apenas para a formacao da vitamina B12.Zinco: tem papel estrutural em varias enzimas (DNA e RNA polimerases) e outrasproteinas de ligacao ao DNA.Molibdênio: presente em certas enzimas como a nitrato redutase assimilativa.Cobre: importante para enzimas respiratorias.Manganês: ativador de muitas enzimas.Níquel: presente em hidrogenases.Fatores de crescimento: correspondem a compostos organicos especificos, que saonecessarios em quantidades muito pequenas devido a incapacidade das celulas ossintetizarem (vitaminas, aminoacidos, purinas e pirimidinas), os quais sao geralmentefornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizadospara o crescimento in vitro dos microrganismos. Na natureza, tais fatores sao normalmenteencontrados nos habitats naturais dos microrganismos. Por exemplo, bacterias do generoPorphyromonas requerem vitamina K como fator de crescimento, sendo esta fornecida peloproprio hospedeiro eucarioto.As vitaminas correspondem ao fator de crescimento mais comum para osmicrorganismos. Estas sao definidas como compostos organicos necessarios em pequenasquantidades, para o crescimento e funcoes nao relacionadas a nutricao, atuando na maioria

das vezes como parte de coenzimas. Estao descritas abaixo algumas das funcoesdesempenhadas pelas principais vitaminas requeridas pelos microrganismos:biotina - Biossintese de acidos graxos, b-decarboxilacoes, fixacao de CO2;tiamina (B1) - a-decarboxilacoes e transcetolasepiridoxina (B6) - transformacoes de aminoacidos e ceto acidoscobalamina (B12) - reducao e transferencia de fragmentos unicos de carbono, sintese dedesoxirribose.As bacterias dos generos Streptococcus e Lactobacillus tem uma necessidade porvitaminas maior do que aquela exibida pelo homem.O processo de nutrição em procariotosNos procariotos contendo parede celular os processos de nutricao ocorrem atraves daabsorcao dos nutientes, a partir do ambiente externo. Entretanto, devido as caracteristicasdiferenciais na composicao e estrutura da parede celular dos organismos Gram positivos eGram negativos, este processo apresenta algumas diferencas nestes dois grupos deorganismos.Nutrição em Gram positivos: Estas bacterias caracterizam-se por sintetizar uma seriede exoenzimas, as quais sao liberadas no meio, clivando os nutrientes, que sao capatados porproteinas transportadoras. Os fungos (celulas eucarioticas), posuem um sistema de nutricaosemelhante ao das bacterias Gram positivas, nutrindo-se pela absorcao, apos a clivagemextracelular de compostos complexos.Nutrição em Gram negativosPapel da parede celular em Gram negativasA parede celular das bacterias Gram positivas e composta por varias camadas depeptideoglicano, enquanto nas Gram negativas observa-se uma maior complexidade quimica eestrutural da parede, decorrente da presenca de camadas lipoproteica e lipopolissacaridica,localizadas externamente a camada de peptideoglicano, originando a membrana externa. Estasdiferencas, por si so, contribuem em grande parte as diferencas observadas na forma decaptacao dos nutrientes.Devido a presenca de uma membrana externa de carater hidrofobico (LPS), asbacterias Gram negativas apresentam um grande numero de porinas associadas a camadalipopolissacaridica. As porinas correspondem a proteinas, formadas por tres subunidadesidenticas, que originam um canal de cerca de 1 nm de diametro, cujo mecanismo de abertura efechamento permanece ainda desconhecido. Desta forma, as porinas permitem a passagem demoleculas hidrofilicas, de baixa massa molecular.Estas proteinas podem atuar de forma inespecifica, formando canais aquosos, ouespecifica, exibindo sitios de ligacao para substratos de ate 5 kDa, ou ainda, acopladas aproteinas transportadoras.Papel das proteínas periplasmáticas em bactérias Gram negativasO periplasma corresponde a porcao celular localizada entre a membrana plasmatica e amembrana externa, geralmente exibindo constituicao gelatinosa, provavelmente devido aogrande numero de enzimas e proteinas presentes, assim como pela propria presenca dopeptideoglicano e lipoproteinas. De forma geral, sao encontrados tres tipos de proteinas noperiplasma de celulas Gram negativas: hidrolases, que atuam na degradacao inicial dosnutrientes; proteínas de ligação, que iniciam os processos de transporte e os quimioreceptores,envolvidos em processos de quimiotaxia. O transporte inicial das moleculas para o citoplasma,a partir do periplasma, e um processo que requer gasto energia, por meio da utilizacao de ATP.Papel da membrana citoplasmática na nutrição de Gram positivos e negativosA membrana citoplasmatica, estrutura vital para qualquer tipo de celula, e uma barreiraque separa o conteudo celular do meio externo. A membrana corresponde a uma barreiraaltamente seletiva, permitindo que as celulas concentrem metabolitos especificos em seuinterior. No dominio Bacteria, a membrana apresenta-se como uma bicamada fosfolipidica,contendo proteinas dispersas por toda sua superficie. A estutura global da membrana eestabilizada atraves de interacoes do tipo pontes de hidrogenio, interacoes hidrofobicas e pelapresenca de ions Ca++ e Mg++, os quais se combinam com as cargas negativas dosfosfolipides. Embora em archaea, a membrana apresente estrutura totalmente distinta,podendo ser do tipo bicamada ou monocamada, muitas vezes desprovida de fosfolipideos, talestrutura desempenha os mesmo papeis fisologicos descritos para as membranas de qualquerser vivo.Assim, a membrana tem papel essencial nos processos de nutricao procariotica, umavez que todos os nutrientes e produtos de degradacao devem atravessa-la. Devido a sua

permeabilidade seletiva, a maioria das moleculas sao incapazes de simplesmente atravessar amembrana de forma passiva. Ao contrario, estas devem ser ativamente transportadas atravesda membrana.O interior de uma celula procariotica consiste em uma solucao aquosa hipertonica emrelacao a maioria dos habitats onde os procariotos sao geralmente encontrados. Assim, a aguatem a capacidade de passar livremente para o citoplasma, pelo processo de osmose. Outroscompostos, tais como pequenas substancias apolares e lipossoluveis (acidos graxos, alcoois,benzeno) sao capazes de solubilizar-se na membrana e entrar na celula. Moleculas carregadascomo ions, aminoacidos, compostos polares, devem ser transportados especificamente umavez que, devido a sua natureza, nao sao capazes de atravessar a membrana.Processos de transporte através da membranaA presenca de proteinas transportadoras na membrana permite que a celula captecompostos que naturalmente nao penetrariam na celula, devido a natureza semi-permeavel damembrana. Estas proteinas podem ser agrupadas em tres classes: uniportadoras,simportadoras e antiportadoras.As proteinas uniportadoras sao aquelas que que transportam uma unica substancia deum lado para outro da membrana. As duas outras classes sao descritas comocotransportadoras, uma vez que para transportar uma substancia qualquer, necessitamtransportar outra, concomitantemente. As simportadoras sao aquelas que carreiam ambos oscompostos em uma mesma direcao enquanto nas antiportadoras o transporte se da emdirecoes opostas.Este tipo de transporte, mediado por proteinas, permite a celula apresentarconcentracoes internas de determinados compostos superiores aquelas encontradas no meioexterno.Uma das principais caracteristicas do processo de transporte mediado por proteinasreside na sua elevada especificidade, assim, determinados transportadores carreiam apenasum unico tipo de molecula, embora a maioria apresente afinidade por uma classe de moleculasTipos de transporte mediado por proteínasDifusão facilitadaNeste tipo de processo, a ligacao do nutriente a proteina transportadora induz umamudanca de conformacao na proteina, formando um canal pelo qual o nutriente tem acesso aocitoplasma. Embora haja a participacao de transportadores neste processo, a acao das leis dasmassas impede que ocorra a formacao de um gradiente de concentracao, mantendo assim asconcentracoes intra e extracelular semelhantes.Este processo de difusao mediada por transportadores e denominado difusao facilitada, o qualnao envolve gasto de energia.Os mecanismos descritos a seguir caracterizam-se por requerem um gasto de energia,uma vez que estes permitem um acumulo dos compostos transportados no interior da celula.Desta forma, estes mecanismos envolvem o transporte contra um gradiente de concentracao,sendo a energia necessaria para o bombeamente dos compostos para o interior da celula.Nestes casos, a energia pode advir da clivagem de ATP ou pela dissipacao de gradientes deprotons ou ions Na+ atraves da membrana. Este gradiente ionico e estabelecido durantereacoes que liberam energia e podem ser utilizados como fonte potencial de energia para acaptacao de nutrientes contra um gradiente de concentracao.Translocação de grupoNeste tipo de transporte, o nutriente sofre uma alteracao quimica durante sua passagematraves da membrana. Uma vez que o produto translocado para o interior da celula e agoradiferente daquele presente no meio externo, nao ha a formacao de um gradiente deconcentracao.Moleculas de acucares tais como glicose, frutose, N-acetilglicosamina, purinas e pirimidinassao exemplos de translocacao de grupo, sendo fosforiladas durante o processo pelo sistemafosfotransferase.Em E. coli, o sistema fosfotransferase e composto por 24 proteinas, sendo 4necessarias para o transporte de um dado acucar.O sistema fosfotransferase tem tambem papel na regulacao do transporte dos acucares, umavez que na presenca de glicose e outro acucar, o sistema fosforila preferencialmente asmoleculas de glicose.Tranporte ativoAlguns acucares, a maioria dos aminoacidos, varios ions inorganicos e acidos organicossao transportados atraves deste tipo de mecanismo. A energia necessaria para efetuar os

processos advem ou do ATP ou, mais comumente, da formacao de um gradiente de protons(ions hidrogenio) por toda a membrana, denominado forca proton motiva. Como resultado, amembrana fica energizada e este potencial eletroquimico e responsavel pela captacao dosnutrientes.Cada transportador tem sitios especificos tanto para o substrato como para os protons.Com a entrada do nutriente, o proton tambem atravessa e membrana e com isso vai diminuindoo gradiente e a forca motiva.Cations tipo K+ podem ser transportados ativamente por uniportadores, em resposta adiferenca de cargas, uma vez que o interior da celula fica carregado negativamente.Os anions provavelmente sao transportados juntamente com protons, porsimportadores. Moleculas nao carregadas, como aminoacidos ou acucares, sao transportadastambem por simportadores, juntamente com um ou mais protons.Alem da forca motora resultante do gradiente de protons, o transporte ativo tambem pode serexecutado utilizando a energia liberada pela hidrolise de ATP, como no caso do transporte demaltose em E. coli.A Cultura de microrganismos in vitro: A partir do conhecimento dos requerimentosnutricionais, podem ser confeccionados meios que permitam o crescimento microbiano in vitro.Cultura pura: corresponde a uma cultura contendo um unico tipo de organismo. Esta eimportante, uma vez que permite o estudo dos microrganismos isoladamente. Para isso,precisamos conhecer as necessidades nutricionais e ambientais dos microrganismos.Os meios de cultura consistem em meios aquosos, adicionados de nutrientes e,eventualmente, agar (polissacarideo = ester sulfato de galactana, retirado de algas - Gelidium),caso se deseje a consistencia solida. Ha duas classes de meios: os quimicamente definidos(sinteticos) e os indefinidos (complexos). Tipos de meios em relacao a consistencia: Liquidos,Semi-solidos e Solidosn Tipos de meios, quanto a composicao: Simples, Enriquecidos,Seletivos, Diferenciais.Crescimento microbianoIntrodução ao Crescimento MicrobianoEm microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do numero de celulas enao ao aumento das dimensoes celulares.Crescimento Populacional: e definido como o aumento do numero, ou da massamicrobiana.A taxa de crescimento e a variacao no numero ou massa por unidade de tempo. Otempo de geração e o intervalo de tempo necessario para que uma celula se duplique. O tempode geracao e variavel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos ate dias,sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo degeracao nao corresponde a um parametro absoluto, uma vez que e dependente de fatoresgeneticos e nutricionais, indicando o estado fisiologico da cultura. O tempo de geracao podeser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela formula abaixo:N=No.2n, onde N= numero final de celulas, No= numero inicial de celulas, n= numero degeracoes.n= log(N) - log(No)/0.301g = t/n , onde g= tmpo de geracao, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.Medidas do crescimento microbianoO crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tecnicas, taiscomo pelo acompanhamento da variacao no numero ou peso de celulas, por exemplo. Dentreas diferentes tecnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos.Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta das celulasem um microscopio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendoaplicados cerca de 10 Ul da suspensao, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras decontagem. A contagem direta e uma tecnica rapida, mas tem como principais limitacoes aimpossibilidade de distincao entre celulas vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo usode corantes vitais, para leveduras) e contagens erroneas, devido as pequenas dimensoes dealgumas celulas, ou pela formacao de agregados celulares.Em preparacoes nao coradas, deve-se utilizar microscopio de contraste de fase, o qualdeve ser empregado apenas quando as celulas nao estao muito diluidas (<106 celulas/ml).Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Ha tambem os contadores eletronicos (do tipo Coulter) usados em hematologia, quepodem ser empregados na contagem de celulas microbianas. Em determinadas situacoes, por

exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-seempregar a contagem proporcional, que corresponde a uma analise comparativa das culturascom suspensoes padrao. Como exemplo de uma suspensao padrao podemos citar a escala deMacFarland, que corresponde a uma serie de tubos contendo uma solucao de BaSO4 emdiferentes concentracoes, apresentando assim, graus de turvacao distintos. Desta forma,comparando-se a turvacao da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obteruma estimativa do numero de celulas presentes na amostra.Contagem de viáveis: Procedimento tambem conhecido como contagem em placa,que estima o numero de celulas viaveis (isto e, capazes de se reproduzir) em uma amostra.Esta metodologia envolve a coleta de aliquotas de uma cultura microbiana em diferentestempos de crescimento, as quais sao entao inoculadas em meio solido. Apos a incubacao dosmeios, geralmente por uma noite, o numero de colonias e contado. Como uma colonianormalmente e originada a partir de um organismo, o total de colonias que se desenvolvem nomeio corresponde ao numero de celulas viaveis presentes na aliquota analisada. Esta tecnicadeve sempre realizada empregando-se varias dilucoes (100 a 104 celulas) das amostras. Acontagem de viaveis pode ser feita pela semeadura em superficie ou em profundidade ("pourplate"). Geralmente o volume a ser inoculado nao deve ultrapassar 0,1 ml, para evitar aconfluencia das colonias. Se a tecnica de semeadura em profundidade for utilizada, pode-seinocular de 0,1 a 1,0 ml de celulas. Esta tecnica e precisa quando o numero de colonias (ouplacas de lise, no caso de particulas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando ascondicoes culturais e ambientais estao adequadas para os microrganismos analisados. Estetipo de contagem esta sujeito a grandes erros (agregados, duas celulas proximas, originandouma colonia), que podem ser minimizados pela realizacao de triplicatas para cada diluicao.Esta metodologia e amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixosnumeros de celulas e permitindo tambem a contagem de diferentes tipos de microrganismos,pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipoou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que alem de favorecerem odesenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, tambem permite sua distincao, a partir dealguma caracteristica fenotipica).Tambem podem ser usadas membranas filtrantes, onde os liquidos sao filtrados e asmembranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.Técnica de contagem de viáveis(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou dopeso umido de uma cultura. Este tipo de procedimento e realizado quando nao e necessariodeterminar o numero preciso de microrganismos presentes.Peso seco: Muito utilizado na quantificacao de fungos, onde o micelio e retirado da cultura,lavado e transferido para um frasco e submetido a secagem. Realizam-se entao sucessivaspesagens, ate o momento onde nao observa-se mais variacoes. Este procedimento podetambem ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou entao secando-o(100 - 150°C/16 horas) e depois pesando-o.Turbidimetria: quantificacao em espectrofotometro ou colorimetro a 660 nm, uma vezque neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura nao interferecom os resultados. Nestes comprimentos, a absorcao de luz por componentes celularescorados e desprezivel mas, se necessario, outros comprimentos de onda podem ser usados.Tal metodologia requer a confeccao de uma curva padrao. Embora a analise turbidimetrica sejamenos sensivel, e de rapida e facil execucao, nao destruindo a amostra. Entretanto, naopermite a determinacao de celulas viaveis.Análises químicas: A partir da quantificacao de proteinas ou de nitrogenio, ou por meioda analise de diferentes atividades metabolicas.Número Mais Provável (NMP): Amplamente utilizado em laboratorios de microbiologiade alimentos ou ambiental, na quantificacao de microrganismos em agua, leite e outrosprodutos. Esta metodologia e basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais ecoliformes fecais, que sao microrganismos indicadores de poluicao fecal, o que pode ter comoconsequencia a presenca de outros organismos, tais como protozoarios e virus. Esta tecnica foidesenvolvida apos analises estatisticas complexas. A determinacao do NMP e realizadainoculando-se 3 series de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 ml da agua ou do produto homogeneizadoem solucao salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durhaminvertidos em seu interior. Estes sao incubados por 48 hs/37°C sendo entao analisados quantoao crescimento e a presenca de gas no interior dos tubos de Durham.

Tal resultado e considerado como positivo para a presenca de coliformes totais.Amostras dos tubos positivos sao entao repicados para caldos seletivos para coliforme fecais,tambem contendo tubos de Durham, os quais sao incubados por mais 24 ou 48 hs a 42°C. Detodos os tubos positivos faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterioridentificacao bioquimica. De acordo com o numero de tubos que apresentam gas determina-seo NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este e um teste apenaspresuntivo para a presenca de coliformes.Curva de crescimento (cultura descontínua)Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionaruma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionaria ede declinio.Curva de Crescimento Padrão, em um sistema fechadoLag: periodo variavel, onde ainda nao ha um aumento significativo da populacao. Aocontrario, e um periodo onde o numero de organismos permanece praticamente inalterado.Esta fase e apenas observada quando o inoculo inicial e proveniente de culturas mais antigas.A fase lag ocorre porque as celulas de fase estacionaria encontram-se depletadas de variascoenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessarios a absorcao dos nutrientespresentes no meio.A fase lag tambem e observada quando as celulas sofrem traumas fisicos (choquetermico, radiacoes) ou quimicos (produtos toxicos), ou quando sao transferidas de um meio ricopara outro de composicao mais pobre, devido a necessidade de sintese de varias enzimas.Assim, durante este periodo observa-se um aumento na quantidade de proteinas, no peso secoe no tamanho celular.Log ou exponencial: nesta etapa, as celulas estao plenamente adaptadas, absorvendoos nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado emconta tambem que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda epequena. A taxa de crescimento exponencial e variavel, de acordo com o tempo de geracao doorganismo em questao. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos.Nesta fase sao realizadas as medidas de tempo de geracao. Geralmente, ao final da fase log,as bacterias passam a apresentar fenotipos novos, decorrentes do processo de comunicacaodenominado "quorum sensing".Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estao escasseando e os produtos toxicos estaotornando-se mais abundantes. Nesta etapa nao ha um crescimento liquido da populacao, ouseja, o numero de celulas que se divide e equivalente ao numero de celulas que morrem. Nafase estacionaria que sao sintetizados varios metabolitos secundarios, que incluem antibioticose algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambem a esporulacao das bacterias.Foram detectados alguns genes (sur) que sao necessarios a sobrevivencia das celulasna fase estacionaria. Alem destes, existem outros genes (fatores s alternativos da RNApolimerase, proteinas protetoras contra dano oxidativo).Declínio: A maioria das celulas esta em processo de morte, embora outras aindaestejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a deviaveis cai lentamente. Em alguns casos ha a lise celular.Culturas descontinuas tendem a sofrer mutacoes que podem repercutir na populacao como umtodo. As proprias condicoes ambientais tendem a promover variacoes de carater fenotipico(reversivel) nas culturas.Crescimento em culturas contínuas: tecnica muito usada nos processos industriaisde obtencao de produtos microbiologicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter ascelulas em fase log ou estacionaria. Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitemum crescimento em equilibrio dinaminco, havendo assim um controle da densidadepopulacional e da taxa de crescimento. Estes sao respectivamente controlados pelaconcetracao do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluicao). Embaixas concentracoes do nutriente limitante, a taxa de crescimento e proporcional aconcentracao do nutriente (que e virtualmente zero).Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam asintese de DNA. Atualmente, utiliza-se metodos de separacao mecanica das celulas menores,recem-divididas. Pode ser feita pela filtracao em varios papeis de filtro, que retem celulasmaiores, em fase de divisao.Efeito dos fatores ambientais no crescimentoO crescimento dos microrganismos e grandemente afetado pelas condicoes fisicas equimicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou

negativamente de acordo com o microrganismo em questao.Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam odesenvolvimento bacteriano. A medida que ha um aumento da temperatura, as reacoesquimicas e enzimaticas na celula tendem a tornar-se mais rapidas, acelerando a taxa decrescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturacaode proteinas e acidos nucleicos, inviabilizando a sobrevivencia celular.Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura ondedesenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturasminima, otima e maxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperaturamaxima provavelmente reflete os processos de desnaturacao mencionados acima, enquanto osfatores que determinam a temperatura minima ainda nao sao bem conhecidos, emboracertamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes niveis termicosbaixos.Temperaturas cardeais dos microrganismos(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas detemperatura, onde para alguns o otimo encontra-se entre 5 e 10°C, enquanto para outros e de90 a 100°C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordocom os otimos de temperatura: psicrofilos (0 a 20°C, otimo de ≈ 15°C - Flavobacterium),mesofilos (12 a 45°C, 37°C - E. coli), termofilos (42 a 68°C, 62°C - Thermococcus), ehipertermofilos (80 a 113°C, 105°C - Pyrodictium brockii).Tipos de bactérias em relação à temperatura(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Psicrófilos: os ambientes frios sao predominantes na Terra (oceanos, polos, solos)entretanto este grupo (bacterias, fungos e algas) e muito pouco estudado. Destes, os maisconhecidos sao as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis),dando coloracao vermelha.Ha os microrganismos psicrotolerantes que sao aqueles cujo otimo encontra-se entre20 e 40°C e que sobrevivem a 0°C. Sao um grupo amplo (bacterias, fungos, algas eprotozoarios) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados.Mesófilos: crescem numa faixa de 20 a 40°C, com um otimo em torno de 37°C, sendoos principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente.Termófilos e Hipertermófilos: otimos de 45 e ≥ 80°C, respectivamente. Saoencontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceanico, em fontes. Geralmentesao procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e proteinastermoestaveis, provavelmente devido a substituicao de aminoacidos, conferindo um novofolding. Tem tambem uma maior concentracao de acidos graxos saturados na MC. As Archaeanao tem acidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentescomprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato, porligacao eter.Os termofilos e hipertermofilos tem grande interesse biotecnologico porque tendem afazer os processo mais rapidamente, com menor contaminacao por outros microrganismos epossuem enzimas mais termoestaveis.pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimentode diferentes tipos de microrganismos.Bacterias - faixa entre 7, com algumas acidofilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com otimo entre 2 e3,5) e outras alcalifilicas (Bacillus e Archaea).Fungos - tendem a ser mais acidofilos que as bacterias (pH <5).Distribuição de alguns microrgansmos, de acordo com o pH(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Tensão de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que osmicrorganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como aerobios,anaerobios facultativos, anaerobios estritos, anaerobios aerotolerantes e microaerofilos(requerem concentracoes baixas de O2).As condicoes de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes redutores nosmeios de cultura, tais como o tioglicolato de sodio, que reage com o oxigenio, formando agua;pela remocao mecanica do oxigenio, sendo substituido por nitrogenio e CO2; pelo uso desistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrogenio e CO2 com um catalisador depaladio. Adiciona-se agua ao sistema, a qual gera hidrogenio, que reage com o oxigenio nasuperficie do catalisador, formando agua; ou ainda pelo uso de "glove box" anaerobias ou amesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.

Classes de organismos, em relação à tensão de oxigênio(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)Água: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. Eo solvente universal, mas sua disponibilidade e variavel (solucoes com acucares ou sais temmenos agua disponivel).Aw: pressao do vapor em equilibrio com a solucao/ pv da agua, variando de 0 a 1.Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de agua e baixadesenvolvem mecanismos para extrair agua do ambiente, pelo aumento da concentracao desolutos internos, seja bombeando ions para o interior ou sintetizando ou concentrando solutosorganicos (solutos compativeis), que podem ser acucares, alcoois ou aminoacidos (prolina,betaine, glicerol).Pressão osmótica: Fator extremamente importante, principalmente a partir do maiorconhecimento sobre as Archaea, visto que varios membros deste dominio requerem altasconcentracoes de sais para seu desenvolvimento.Classes de organismos, em relação à salinidadeFatores adicionais:Fonte luminosa para fototroficos autotroficos. Pressão atmosférica, para aqueles quevivem em profundidades.Reprodução em procariotosIntroduçãoA divisao celular e um processo complexo, que ocorre de variadas maneiras,dependendo do tipo de organismo. Em eucariotos, os microtubulos do fuso mitotico atuamcomo a forca motriz durante a segregacao cromossomal. Nas celulas animais e em fungos, umanel de actina-miosina se forma na porcao mediana de uma celula em divisao, sendo que aforca gerada pela interacao entre estas duas proteinas promove o crescimento interior do septode divisao. Nas plantas, a formacao do septo e complexa, devido a parede celular espessa.Assim, surge na regiao central da celula um “disco”, que cresce de forma centrifuga. Em todosestes casos o sitio de divisao celular e definido indiretamente pelos microtubulos, pois oposicionamento do fuso mitotico parece ser crucial no direcionamento do plano de divisao. Nasplantas um feixe transiente de microtubulos envolve a celula no plano de divisao, com umpossivel papel na selecao do sitio de divisao.Embora intensamente estudado, o processo de divisao celular em procariotos ainda epouco conhecido, existindo alguns modelos propostos. Uma das principais conclusoes obtidasdestes estudos refere-se ao fato da divisao celular em procariotos corresponder a um processoextremamente complexo e regulado, tanto em termos espaciais como temporais. Assim, hauma serie de mecanismos que regulam os eventos de duplicacao e segregacao docromossomo e a formacao do septo de divisao, garantido a eficiencia do processo. Outroimportante achado refere-se a intensa participacao de proteinas citoplasmaticas, atuando comoanalogos do citoesqueleto de celulas eucarioticas, no processo de divisao celular.Ate o momento, os estudos indicam que a maioria dos procariotos se divide por fissaobinaria, originando duas celulas filhas identicas logo apos a duplicacao e segregacaocromossomal. O ciclo celular bacteriano pode ser divido em duas fases: 1) Um ciclo de DNA,que inclui a replicacao e segregacao dos cromossomos e 2) um ciclo de divisao, com acitocinese e separacao das celulas filhas.No entanto, estudos com outras bacterias, tais como a bacteria pedunculada Caulobactercrescentus, revelam um processo mais complexo de divisao, originando celulas distintasmorfologica e fisiologicamente. Relatos mais recentes da literatura descrevem a ocorrencia dediferentes procesos de reproducao no dominio Bacteria.Assim, em Epulopiscium, uma bacteria "gigante" simbionte intestinal do peixe cirurgiao,foi observada a ocorrencia de viviparidade, com a formacao de 1 a 7 celulas filhas ativasmetabolicamente, as quais sao liberadas apos a lise da celula mae. Neste mesmo genero e emMetabacterium polyspora, foi descrita a formacao de multiplos esporos intracelulares. Taisrelatos deixam claro o quanto ainda desconhecemos sobre a reproducao em procariotos e queestes organismos sao capazes de exibir mais de um mecanismo de reproducao.Visando abordar de maneira geral os eventos associados a reproducao procariotica pormeio da fissao binaria, passaremos a descrever os principais resultados obtidos a partir depesquisas realizadas especialmente com Escherichia coli e Bacillus subtilis.O processo de fissão binária - Uma visão geralFissão binária em B. subtilis – Esta bacteria corresponde a um excelente modelo deestudo devido a sua capacidade de originar endosporos, quando em condicoes desfavoraveis.

Neste sentido, um dos aspectos que mais chamou a atencao dos pesquisadores foi quedurante a reproducao o septo de divisao era formado na regiao mediana da celula, enquanto naesporulacao o septo localizava-se na regiao proxima a um dos polos celulares (Fig. 1). A fissaobinaria ocorre quando a celula cresce, atinge cerca do dobro de seu comprimento e se divide.Paralelamente, ha a duplicacao e segregacao do DNA (Fig. 1a). Por outro lado, naesporulacao, ha a duplicacao do cromossomo, mas o septo formado tem localizacao polar,sendo esta a regiao de formacao do endosporo (Fig. 1b).Adaptado de Angert (2005) Nature Rev. Microbiol., 3:214-224.Fig. 1 – Ciclos de vida em B. subtilis. Em (a) ciclo vegetativo. Em condicoesfavoraveis, a celula aumenta de tamanho, replica o cromossomo (azul) e se divide por fissaobinaria. O aparato de divisao e montado, com a proteina FtsZ (verde) formando um anel nomeio da celula, onde ocorre a divisao. Em condicoes de exaustao ambiental (Fig. 1b), a celulaforma esporos. As duas copias do cromossomo assumem uma nova configuracao, que seestende de um polo a outro. A maquinaria de divisao e montada nos dois polos, mas a divisaoocorre somente em um deles. Parte de um dos cromossomos fica presa por um septo dedivisao, sendo empacotado pelas proteinas do septo, em um compartimento fechado (preesporo).O pre-esporo e entao englobado pela celula mae. O pre-esporo e preparado para adormencia, pois proteinas se ligam, protegendo o DNA, o citoplasma e mineralizado e eformada uma barreira proteica ao redor da estrutura.Varios sao os aspectos ainda pouco elucidados sobre a divisao celular. Por exemplo,como ocorre a segregacao do DNA? Como o septo de divisao e localizado corretamente? Osestudos vem mostrando que as bacterias possuem uma serie de proteinas citoplasmaticas queatuam como um verdadeiro citoesqueleto, sendo responsaveis pela correta migracao do DNA eposicionamento do septo. Existem autores que vem utilizando o termo "replissomo" paradescrever a complexa maquinaria celular envolvida no processo de divisao. Alem disso, dadosrecentes tambem revelam que os lipideos de membrana sao importantes componentes doreplissomo. Dentre os diversos componentes da maquinaria, uma proteina denominada MreB,semelhante a actina, esta implicada na segregacao do DNA.Um dos componentes mais estudados corresponde a proteina FtsZ, um homologo estrutural datubulina que, durante a fissao binaria, se organiza como um anel no centro da celula e atuacomo ponto de ancoragem de outros elementos do aparato. Estes outros componentesredirecionam o crescimento da parede celular e protegem o DNA de danos enquanto oenvelope invagina. FtsZ e uma proteina muito conservada e e uma das primeiras proteinas ase organizar no fututro sitio de divisao. Nos proximos topicos discutiremos a proteina FtsZ emmaior detalhe.Em condicoes normais, o septo de divisao somente e formado apos a segregacao doDNA duplicado. Varios sao os processos que resultam em tal situacao. Um deles correspondea propria oclusao do futuro sitio de divisao pelo nucleoide ainda nao segregado. Ao que parece,o DNA se liga a uma serie de lipideos da membrana, nao permitindo que o anel FtsZ sejamontado. Outras proteinas, denominadas sistema MinCD, impedem a montagem do complexoFtsZ nos polos.Alem destas, varias outras vem sendo estudadas, tais como EzrA, que afeta a estabilidade dospolimeros FtsZ, otimizando sua montagem apenas nos locais corretos. No caso de danos aoDNA, as proteinas YneA e SulA desestabilizam o anel, impedindo a divisao.O processo de segregação dos cromossomos bacterianosEsta etapa da divisao celular procariotica foi analisada a partir dos estudos com B. subtilis,como mencionado anteriormente, uma bacteria capaz de esporular. A partir dos estudos commutantes incapazes de realizar o processo completo de segregacao cromossomal, foiverificado que sempre um mesmo segmento de DNA era o primeiro a atingir os polos celulares.O mapeamento deste segmento de DNA revelou que tal sequencia correspondia a regiaosituada adjacente a oriC, que e a origem de replicacao do DNA cromossomal.Em E. coli, a replicacao do cromossomo ocorre quando o complexo proteina DnaA-ATPse liga a sitios em oriC. A ligacao promove o desenovelamento da oriC, o recrutamento de umahelicase (DnaB) e a montagem de um replissoma. A iniciacao da replicacao e regulada,ocorrendo uma vez a cada ciclo celular. A Figura 2 esquematiza o ciclo de iniciacao daduplicacao do DNA mediado pela proteina DnaA.Adaptado de Boeneman, K. & Crooke, E. (2005) Curr. Op. Microbiol., 8:143–148.Fig. 2 – Regulação da atividade de DnaA. Quando na presenca de excesso de ATP, aproteina DnaA se liga ao ATP e se complexa em oriC, iniciando a replicacao do DNA. A DnaAhidrolisa o ATP, originando ADP e passando para a forma inativa. Nesta forma, ha a interacao

de DnaA-ADP ligada a oriC com fosfolipideos acidos da membrana citoplasmatica,promovendo a reciclagem de DnaA para sua forma ativa, ligada ao ATP.O conjunto DnaA/oriC/lipideos de membrana encontra-se situado na porcao mediana dacelula e, a medida que a sintese das moleculas de DNA ocorre, estas migram para os polos,liberando assim a regiao central para a formacao do septo de divisao.Em eucariotos, o movimento e segregacao dos cromossomos e controlado peloscentromeros. Estes, ligam-se aos microtubulos do fuso mitotico atraves de conjuntos proteicosdenominados cinetocoros. O movimento do cromossomo ao longo do fuso ocorre comoresposta a uma forca exercida nos cinetocoros, seja pela acao de proteinas motoras ou pela“montagem-desmontagem” dos microtubulos que formam o fuso.O fato da regiao oriC estar sempre localizada nas vizinhancas do polo celular sugereque esta regiao poderia conter uma sequencia do tipo centromero. Alem disso, pela sualocalizacao sempre igual, foi especulado que deveria haver a participacao de uma ou maisproteinas, desempenhando o papel dos cinetocoros ou das proteinas motoras dos eucariotos.A partir de outros estudos, foi identificada um proteina, denominada Spo0J que, emlinhagens mutantes, promovia alteracoes na segregacao dos cromossomos de celulasvegetativas. Em celulas onde o gene spo0J foi deletado, a oriC deixava de se localizar nospolos celulares, indicando que a proteina Spo0J poderia estar envolvida no posicionamentopolar da oriC.Por meio de estudos microscopicos,verificaram que a proteina Spo0J forma “focos” sese ligam ao DNA em um ou mais sitios, nas proximidades de oriC. Assim, cada copia da regiaoonde esta a origem de replicacao parece ter seu proprio conjunto de Spo0J.O achado mais marcante em relacao a estes eventos de segregacao corresponde arapida migracao deste conjunto (DNA-Spo0J) ao longo do eixo celular. Tal fenomeno sugere aexistencia de proteinas geradoras de forca e a presenca de alguma estrutura analoga a umcitoesqueleto.Dados mais recentes sugerem a participacao de uma proteina, denominada RacA, noprocesso de migracao dos cromossomos para os polos. Ao que parece, esta proteina exerceum papel analogo ao desempenhado pelo fuso mitotico.A replicação bacteriana seria como uma mitose?O conjunto de Spo0J poderia ser comparado funcionalmente aos cinetocoros, que saoas organelas envolvidas na ligacao dos centromeros aos microtubulos do fuso.Alternativamente, Spo0J poderia atuar em uma fase inicial, transformando as regioesoriC recem-replicadas em estruturas com um dobramento tal que seriam entao separadas poroutras proteinas (talvez RacA). Isto poderia ter um papel importante, pois sabe-se que embacterias, os eventos de replicacao se sobrepoem. Nestes casos, a separacao correta evitariao emaranhado de cromossomos.Tais achados nao sao surpresa, uma vez que os eucariotos e os procariotos devem terevoluido a partir de um ancestral comum, que era eficiente na segregacao cromossomal.Assim, nao teria porque este evento ser tao distinto nas bacterias, onde a grande maioria dosprocessos ocorrem de forma similar aos eucariotos.Modelo proposto para a segregação cromossomal, em bactérias(Adaptado de Errington, J. ASM News 64:210-217, 1998)Seleção do sítio de divisão durante a divisão celular simétricaComo a celula seleciona o sitio mediano ainda nao esta precisamente estabelecido, entretantomuitos dados ja existem para explicar esta etapa do processo de divisao celular.Estudos com mutantes de E. coli indicam que as celulas contem tres sitios potenciais dedivisao: na regiao central e nos polos. Normalmente, para que ocorra uma divisao na regiaocentral, os sitios polares devem ser inibidos, sem a inibicao do sitio potencial mediano. Nestascelulas, parece que tal processo se da pela acao cooperativa de um inibidor de divisao com umfator topologico de especificidade, os quais sao codificados pelos genes minC, minD e minE.Papel das proteínas Min, na localizaçào do septo de divisão(Adaptado de Rothfield & Zhao. Cell, 84:183-186, 1996)Parece que, inicialmente, as proteinas MinC e MinD atuariam em conjunto, como uminibidor inespecifico de divisao, capaz de bloquear todos os sitios possiveis de septacao. Estaobservacao se baseia no fato que a divisao fica completamente bloqueada quando minC eminD sao expressos, na ausencia de minE. A proteina MinE, de alguma forma, conferiria aespecificidade topologica ao sistema, de forma que MinCD bloquearia somente os sitiospolares, sem interferir com o sitio mediano.MinE teria duas funcoes: 1) Como antagonista de MinCD e 2) Como fator de especificidade

topologica pois quando se liga ao sitio central, restringe o conjunto MinCD aos sitios polares,nao desejados para a divisao. Estudos indicam que estas funcoes de MinE estao localizadasem dominios distintos na sequencia de 88 aminoacidos da proteina. A funcao antagonica sobreMinCD esta localizada em um pequeno dominio N-terminal (MinE1-22). A funcao topologicaesta associada a um dominio C-terminal (MinE23-81).Assim, o dominio N-terminal atuaria como um antagonista de MinCD, enquanto o Cterminalatuaria, direta ou indiretamente, como um sensor topologico, capaz de distinguir o sitiopotencial mediano daqueles nos polos.Os autores especulam que existiriam uma molecula alvo (topologico) que marcaria o sitiomediano como sendo diferente dos sitios polares. A elevada afinidade da regiao Carboxiterminalde MinE por este alvo levaria a localizacao preferencial da proteina na regiao mediana,enquanto a porcao amino-terminal impediria a acao bloqueadora de MinCD. Como a MinEestaria sequestrada na regiao mediana, a proteina nao estaria disponivel para interferir com aatividade de MinCD nos polos.Dados mais recentes indicam que alem das proteinas Min, os fosfolipideos demembrana tambem teriam papel na selecao do sitio de septacao. Uma das primeiras proteinasque participam do processo de septacao, FtsA ou ZipA, poderiam reconhecer e interagir comum dominio fosfolipidico situado da porcao central da membrana da celula, permitindo assim aligacao de FtsZ.Adaptado de Mileykovskaya, E. & Dowhan, W. (2005) Curr. Op. Microbiol., 8:135–142.Esquema do ciclo celular. (a) A nova celula filha apresenta a origem e a terminacaode replicacao do DNA ("o" verde, oriC e "T" vermelho, de lado, respectivamente); o sistema Min(bolas verdes e rosas) ligado aos polos, ou oscilando entre os polos; dominios lipidicos nospolos (vermelho). (b) O cromossomo sofre uma rotacao, trazendo a oriC para a porcao central,onde e formado um dominio lipidico rico em cardiolipina (vermelho). O DNA comeca a serreplicado pela DnaA, e pela montagem do replissomo (pentagono). (c,d) As origens recemreplicadasse movem em direcao aos polos, liberando o dominio lipidico central para agorainteragir com FtsZ (purpura). (e) Organizacao da maquinaria de divisao (multicolorida) econversao do dominio central em futuros polos. (f) Em E: coli, MinD (rosa) e seu dominio Cterminal(cinza) trocam ADP por ATP (direita), expondo a porcao C-terminal, que interage comlipideos de membrana nos polos. O polimero de MinD-ATP pode crescer em direcao ao centro.Proximo ao centro, a ligacao de MinE (verde) induz a hidrolise de ATP, levando MinD para aconformacao MinD-ADP, despolimerizando-o e voltando para os polos. (g) Varias moleculas deDnaA (amarelo) associadas a ATP ou ADP.Somente quando ligada a ATP a DnaA (diagrama da direita) e capaz de se ligar proximoa oriC (azul e verde), abrir o DNA e permitir a montagem do replissomo. A forma inativa, DnaAADPligada a oriC e reciclada na membrana (vermelho).Formação do septo de divisão e a separação das células filhasEstudos indicam que uma proteina presente em E. coli, denominada FtsZ, desempenhaimportante papel na formacao do septo e separacao das celulas filhas, durante o processo dedivisao celular.A proteina FtsZ forma um anel no sitio da divisao celular, sugerindo um papel estrutural paraesta proteina neste processo. Atualmente sabe-se que a FtsZ tem homologia com as porcoesque se ligam ao GTP da tubulina, sendo os cristais das duas muito semelhantes e que tambematua como GTPase.A FtsZ hidrolisa o GTP apos formar estruturas semelhantes a polimeros de tubulina evem sendo encontrada (ou homologos) em um grande numero de especies de Bacteria eArchaea estudadas ate o momento, formando um anel no sitio de divisao.Homologos de FtsZ ja foram detectados em celulas vegetais, onde mutacoes nestes genesimpedem a divisao dos cloroplastos, reforcando a hipotese de sua participacao na divisaocelular e tambem a teoria da endossimbiose.Componentes da maquinaria de divisão celularDurante a divisao, varias proteinas sao recrutadas para o anel formado por FtsZ: FtsA,FtsQ, FtsW, FtsL, FtsN, FtsK, FtsI (PbP3) e ZipA, que se organizam em um complexo pararealizar a divisao. Exceto por FtsZ, FtsA e ZipA, todas as demais apresentam domininiostransmembranosos e periplasmaticos, indicando que atravessam a membrana citoplasmatica.O anel FtsZ localiza-se exatamente no centro de uma celula vegetativa bacilar, como E. coli,sugerindo uma pre-determinacao do local, provavelmente mediada por MinE.Durante a divisao o anel FtsZ comeca a se contrair, pela remocao sucessiva de suassubunidades, as quais migram para as futuras regioes centrais das novas celulas filhas. Assim,

acredita-se que os sitios de divisao da proxima geracao ja estao presentes nas celulas mae,sendo o processo de montagem e desmontagem bastante rapido.Formação do septo e separação das células filhas(Adaptado de Margolin, W. ASM News 65, 1999)Seleção do sítio de divisão durante a divisão celular assimétricaEm B. subtilis, os sitios polares sao utilizados para a formacao do septo apenas durantea esporulacao. Quando crescendo vegetativamente, B. subtilis utiliza a regiao mediana para aformacao do septo de divisao entretanto, em condicoes desfavoraveis, o sitio de septacaopassa para um dos polos, permitindo a esporulacao.Durante o crescimento vegetativo, B. subtilis seria semelhante a E. coli, com MinCDatua conjuntamente, provavelmente com a proteina de funcao igual a MinE, ainda naodescoberta, que suprimiria o uso dos sitios polares para a divisao. Havendo um estimulo para aesporulacao, a especificidade topologica do sistema seria revertida, ocorrendo liberacao dossitios polares. Um modelo explicativo implicaria na existencia de duas MinE, com diferentespropriedades topologicas, que determinariam a localizacao central ou subterminal do septo.Reprodução pela formação de esporos múltiplos, inativos - MetabacteriumpolysporaEsta bacteria Gram positiva habita o trato GI de cobaias e produz multiplos (ate 9)endosporos. O ciclo de vida desta bacteria requer que o organismo circule pelo trato GI, ouseja, depende da natura coprofaga de seu hospedeiro. Esporos de M. polyspora sao isoladosdas fezes do hospedeiro e somente estes esporos maduros sobrevivem a passagem peloestomago, indo germinar no intestino delgado (figura abaixo). Algumas celulas fazem fissaobinaria neste estagio, mas a maioria esporula. A partir do intestino delgado, as bacterias sedepositam no ceco, ondem terminam de esporular. Ao que parece, os pre-esporos ouendosporos maduros nao sao capazes de realizar fissao binaria. Os esporos passam pelo cecoe finalmente sao eliminados nas fezes, podendo ser novamente ingeridos pelo hospedeiro,recomecando o ciclo.A esporulacao em M. polyspora e diferente, com uma divisao iniciada nos dois polos e oDNA vai para os dois compartimentos. Apos o englobamento, o pre-esporo pode se dividir,produzindo outros pre-esporos que amadurecem. Assim, existem 3 ou mais copias do genoma.Adaptado de Angert, E.R. (2005). Nature Rev. Microbiol., 3:214-224.Formação de múltiplos esporos em M. polyspora. a-g: fluorescencia especifica paramembrana e capas de esporos. a: as celulas se dividem nos dois polos. b: pre-esporosenglobados pela celula mae. c. pre-esporos capazes de fazer fissao binaria (a seta indica umnovo septo de divisao formado). d: divisao e crescimento do pre-esporo. e: amadurecimento dopre-esporo, f: M polyspora com 7 pre-esporos. g: celula que emerge do esporo, se divide nospolos e comeca a esporular. h: micrografia de contraste, mostrando fissao binaria em M.polyspora, um evento raro.O processo de reprodução em Epulopiscium fischelsoni - uma bactéria vivíparaDesde a sua descoberta, o genero Epulopiscium tem fascinado os microbiologistas, porsuas caracteristicas extremamente diferentes daquelas observadas nas bacterias comumenteestudadas. Alem de ser unica por suas dimensoes (podendo atingir cerca de 600 a 800 nm),estes organismos apresentam um tipo viviparo de reproducao.Dados recentes da literatura revelam que as celulas de Epulopiscium sao capazes degerar de 1 a 7 celulas filhas ativas, em seu interior. Ao que parece, o processo se assemelha aesporulacao, envolvendo a condensacao da molecula de DNA duplicada, que normalmentedirige-se aos polos da celula mae.Estudos envolvendo analises microscopicas revelam que apos o periodo decondensacao e migracao do DNA para as extremidades celulares, este se apresentadescondensado, com as celulas filhas ativas metabolicamente.Geralmente, sao produzidas 2 celulas filhas, estando uma em cada polo. No entanto,quando sao geradas mais que 2 celulas filhas, observa-se a condensacao do DNA em regioesmedianas da celula mae, situadas imediatamente abaixo da parede celular.Esquema geral de uma célula de Epulopiscium originando uma célula filha(Adaptado de Angert & Clements (2004) Mol. Microbiol., 51:827–835)Estes resultados sao bastante recentes, embora em 1998 tenha sido publicado umartigo descrevendo a ocorrencia de "vesiculas contendo nucleoides" neste organismo. Muitopouco se sabe ainda sobre o processo de reproducao neste organismo, embora os dadosobtidos no estudo referente a figura acima descrevam tambem a ocorrencia do anel formadopelas proteinas FtsZ.Assim, possivelmente em um futuro nao muito distante, novas informacoes estarao

disponiveis acerca do processo viviparo de reproducao neste procarioto.Metabolismo MicrobianoClasses de organismos, quanto às fontes de energia e carbonoEnergia: e definida como a capacidade de produzir trabalhoOs organismos podem ser classificados em dois grandes grupos, de acordo com a forma queobtem sua energia:os fototroficos, que obtem sua energia a partir da energia luminosa, pelafotossintese e os quimiotroficos, que obtem sua energia a partir da utilizacao de compostosquimicos, envolvendo especialmente reacoes de oxidacao e reducao.Em relacao as fontes de carbono, os organismos podem ainda ser classificados comoautotroficos, quando utilizam fontes inorganicas de carbono (CO2) e heterotrofico, quando asfontes de carbono sao de natureza organica.Inicialmente, serao discutidos os processos de producao de energia em organismosquimiotroficos heterotroficos, uma vez que estes sao bastante conhecidos e estudadosmetabolicamente.Nos organismos quimiotroficos, a energia e obtida basicamente atraves de reacoes deoxirreducao, tendo como substratos os nutrientes adquiridos pelas celulas.Todo e qualquer nutriente, exibem uma energia associada aos eletrons presentes nas ligacoesinteratomicas e, dependendo da estabilidade na distribuicao desta energia, podemos tercompostos com ligacoes “ricas em energia”, ou seja, ligacoes instaveis, que facilmente liberama energia contida. Assim, nos organismos quimiotroficos, pode-se falar em energia quimica:aquela liberada quando compostos organicos ou inorganicos sao oxidados.Reações de oxi-reduçãoOxidacao => remocao de eletrons (ou atomos de hidrogenio) de um atomo ou molecula.Reducao => Ganho de eletrons (ou atomos de hidrogenio) de um atomo ou molecula.Tal definicao decorre do fato de que frequentemente, estas reacoes envolvem atransferencia nao somente de eletrons, mas sim de atomos de hidrogenio (na forma de H+).Como os eletrons nao podem ficar isolados, “soltos”, estes devem fazer parte de atomos oumoleculas. Assim, toda reacao de oxidacao requer acoplada uma reducao. Assim, o compostoque foi oxidado denomina-se de doador de eletrons, enquanto aquele reduzido e o aceptor deeletrons.Mecanismos de geracao de ATPOs organismos apresentam tres mecanismos de fosforilacao para a geracao de ATP:1) Fosforilacao em nivel de substrato: onde o ATP e gerado pela transferencia de umgrupamento fosfato de alta energia a partir de um composto fosforilado ao ADP. Esta ligacaorica em energia geralmente foi adquirida na reacao onde o substrato foi oxidado.2) Fosforilacao oxidativa: Neste caso, os eletrons sao tranferidos do composto organico,atraves de uma serie de carreadores a um aceptor final, sendo que a transferencia dos eletronsentre os diferentes carreadores libera energia, onde parte e utilizada na geracao de ATP, pelaquimiosmose.3) Fotosforilacao: que ocorre em celulas que contem pigmentos que absorvem luz.Neste caso, a energia luminosa, e convertida em ATP e NADPH, que serao utilizados para abiossintese, empregando tambem uma cadeia de transporte de eletrons.Processos onde há a produção de energia, em quimiotróficosA producao de energia nos organismos quimiotroficos: pode, a grosso modo, serdividida em tres categorias: fermentacao, respiracao aerobia e respiracao anarobia.- Fermentacao: processo que ocorre na ausencia de aceptores finais (anaerobio).- Respiracao: oxigenio ou outro agente oxidante atua como aceptor final (aerobia ouanaerobia).Uma vez que estes tres processos envolvem reacoes de oxirreducao, podemosdiferencia-los genericamente, de acordo com os doadores inciais e aceptores finais de eletrons.Assim, temos:Fermentação: processo onde o doador inicial e o aceptor final de eletronscorrespondem a moleculas organicas. Desta forma, a fermentacao e um processo onde ocorreoxidacao parcial dos compostos organicos, que podem ser acucares, proteinas, acidos, entreoutros. Como o processo e parcial, ha apenas uma pequena fracao de energia liberada. Nasfermentacoes, o ATP e gerado a partir da fosforilacao em nivel de substrato.Por exemplo, apos a quebra da glicose, originando acido piruvico, este pode serconvertido a outro composto organico, por um processo de fermentacao. Assim, a fermentacaoe um processo que nao depende do ciclo de Krebs, ou da cadeia de transporte de eletrons.Neste tipo de reacao, os eletrons sao transferidos das coenzimas reduzidas (NADH,

NADPH) ao acido piruvico ou derivados, regenerando-os para novos ciclos de glicolise.Varios tipos de fermentacao sao observados em diferentes microrganismos, sendo osexemplos mais conhecidos a fermentacao alcoolica e a fermentacao latica.Tipos basicos de fermentacao:Latica (homo ou heterolatica) => acidos latico, acetico, formico, etanol (Lactobacillus,Streptococcus, Leuconostoc).Propionica: Propionico, acetico e CO2 (Propionibacterium, Veillonella).Acetona-Butirica: acido butirico, acetona, butanol, isopropanol, acido acetico, acido formico,etanol, H2 e CO2 (Clostridium, Eubacterium, Bacillus).Acetica: acetico, gluconico (Acetobacter).Aerogenes-coli-tifico: Formico, acetico, latico, succinico, etanol, 2,3-butilenoglicol, H2 e CO2

(Escherichia, Enterobacter, Salmonella).Exemplos de fermentações(Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)Respiração: Processo onde o doador inicial de eletrons e oxidado, tendo como aceptorfinal de eletrons e um composto inorganico. Quando o aceptor final e o oxigenio, a respiracao edenominada aeróbia e quando o aceptor e outro composto (Sulfato, nitrato), e denominadaanaeróbia. Em todos os processos de respiracao temos a participacao de uma cadeia detransporte de eletrons.Respiração AeróbiaApos a glicolise, o acido piruvico e convertido a actil-CoA, que entra no ciclo de Krebs,onde ocorrem uma serie de reacoes de oxirreducao, que transferem a energia para coenzimas,principalmente NAD+, reduzindo-as. Esta energia armazenada sera transferida, levando aformacao de ATP, pela cadeia de transporte de eletrons, localizada na membranacitoplasmatica.Esta cadeia de transporte corresponde a uma serie de moleculas transportadoras(flavoproteinas, citocromos e ubiquinonas), que sofrem reacoes de oxirreducao, as quaispromovem uma gradual liberacao de energia, que dirigira a geracao quimiostatica de ATP.As cadeias de transporte snao bastante variaveis nas diferentes bacterias e umamesma bacteria pode apresentar diferentes cadeias de transporte de eletrons.Durante o transporte ha a producao de ATP, atraves da fosforilacao oxidativa, que esta ligadaao estabelecimento de um gradiente de protons atraves da membrana.Quimiosmose: Estas proteinas transportadoras de protons estao orientadas na membrana detal forma que possibilita a separacao entre protons e eletrons, sendo os eletrons mandadospara a face citoplasmatica da membrana, por transportadores especificos e os protons para olado de fora da celula. Ao final do processo, os eletrons sao carreados ao aceptor final (O2 narespiracao aerobia), que e reduzido, formando agua. Para formar agua, precisa de ions H+ docitoplasma, vindos da dissociacao da agua. Em decorrencia destes processos, e gerada umaformacao liquida de OH- no interior da celula, resultando em um gradiente de pH e um potencialeletrico ao longo da membrana (dentro fica negativo e alcalino e fora, positivo e acido). Amembrana fica entao energizada (forca motora de protons). Esta energia eletrica pode entaoser utilizada transporte de ions, movimentacao flagelar ou na formacao de ATP.Formacao de ATP: A enzima ATPase (um canal para o transporte de protons), ligada amembrana, possui 2 partes: uma cabeca em multi-subunidades, presente na face interna, euma cauda, condutora de protons, que atravessa a membrana. Ela cataliza a reacao entre ATPe ADP + Pi. Atuando em uma direcao, ela cataliza a formacao de ATP (fosforilacao oxidativa)pela entrada controlada de protons (a formacao do gradiente e dada com gasto de energia,enquanto sua dissipacao controlada libera energia).Exemplos da respiração aeróbia(Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)Respiração anaeróbia: Neste processo, o aceptor final de eletrons nao e o oxigenio,sendo substituido por nitrato, sulfato ou carbonato. Uma vez que parte do ciclo de Krebs nao efuncional em condicoes de anaerobiose, e tambem pelo menor numero de moleculastransportadoras de eletrons presentes, este processo rende menor quantidade de energia, masainda fornece mais que na fermentacao. Eventualmente, ocorre em organismos que realizamrespiracao aerobia.Fotossíntese: Um dos processos mais importantes na terra, realizado por organismosautotroficos, que possibilita a conversao da energia luminosa em energia quimica, a qual eentao utilizada para a conversao do CO2 da atmosfera em compostos de carbono reduzidos,especialmente acucares.

Neste processo, os eletrons sao obtidos a partir dos atomos de hidrogenio da agua. Afotossintese pode ser dividida em duas etapas: fase clara a energia luminosa e utilizada naconversao de ADP a ATP e na reducao de NADP a NADPH. Ha ainda a fase escura, oseletrons sao utilizados, juntamente com o ATP, para reduzir o CO2 a compostos organicos.Reacoes luminosas: correspondem a fotofosforilacao, onde a energia luminosa eabsorvida pelos pigmentos (clorofila, bacterioclorofila), excitando os eletrons, que passam paraa primeira de uma serie de moleculas transportadoras, semelhante a cadeia de transporte deeletrons. Com isso, ha a passagem de protons pela membrana, com a conversao de ADP emATP.A fotofosforilacao pode ser de dois tipos: ciclica e aciclica. No processo ciclico, o eletronretorna a clorofila, enquanto na aciclica, processo mais comum, os eletrons liberados naoretornam a clorofila, sendo incorporados ao NADPH. Os eletrons perdidos sao subsituidos poroutros, provenientes da agua ou outro composto oxidavel, tal como H2S. (Na ciclica, quanto haa absorcao dos quanta pela bacterioclorofila, a molecula se excita, perdendo um eletron,tornando-se um agente oxidante potente. O eletron e transferido num processo semelhante aCTE (Ferredoxina-ubiquinona-cit b-cit f) e retorna a bacterioclorofila.Entre b e f ha a producao de ATP. Na aciclica (algas) ha dois sistemas de pigmentosque tambem perdem eletrons, passam por um processo semelhante a CTE, mas o eletron eusado para reduzir o NADP a NADPH). Reacoes escuras: nao requerem a luz, para queocorram e incluem o ciclo de Calvin-Benson, onde o CO2 e fixado.Exemplos da fotossíntese(Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)Outros tipos metabólicosFotoautotróficos: Utilizacao de compostos inorganicos como doadores: Ocorre nosquimiolitotroficos, sendo as fontes o H2S, H2 e NH3. Os processos sao similares a respiracaoaerobia. A fonte de carbono e geralmente o CO2.Quimiolitotróficos: O CO2 e reduzido a gliceraldeido 3P (fixacao), que serametabolizado via o ciclo de Calvin. A energia para a realizacao destes processos advem daoxidacao de compostos inorganicos (H2, NH4, NO3).As bacterias purpuras e verdes usam a luz para produzir ATP; produzem NADPH a partir daoxidacao de H2S ou compostos organicos (fotossintese anoxigenica). As algas e cianobacteriasgeralmente obtem o NADPH pela hidrolise da agua, sendo um evento mediado pela luz(oxigenica).Biofilmes MicrobianosIntroduçãoNossa percepcao de bacterias como organismos unicelulares baseia-se essencialmenteno conceito de culturas puras, nas quais as celulas podem ser diluidas e estudadas a partir deculturas liquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiologicosforam adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente ha alguns anoscomecamos a entender que, na realidade, a maioria das bacterias se encontra na naturezavivendo em comunidades, de maior ou menor estruturacao.O tipo de "ecologia" que imaginavamos em relacao aos procariotos, ou seja, celulasindividuais crescendo de maneira planctonica (livres, em suspensao), raramente e encontradona natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra asbacterias sao encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadasa superficies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto e, um ecossistema estruturadoaltamente dinamico, que atua de maneira coordenada.Assim, embora possam ter uma existencia planctonica independente, este tipo de vidaparece ser eventual.Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados porpopulacoes desenvolvidas a partir de uma unica, ou de multiplas especies, podendo serencontrados em uma variedade de superficies bioticas e/ou abioticas. Desta maneira, muitosautores definem biofilmes como associacoes de microrganismos e de seus produtosextracelulares, que se encontram aderidos a superficies bioticas ou abioticas.Geralmente, a dinamica de formacao de um biofilme ocorre em etapas distintas.Inicialmente temos or organismos denominados colonizadores primarios, que se aderem a umasuperficie, geralmente contendo proteinas ou outros compostos organicos. As celulas aderidaspassam a se desenvolver, originando microcolonias que sintetizam uma matrizexopolissacaridica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderencia demicrorganismos denominados colonizadores secundarios. Estes colonizadores secundarios

podem se aderir diretamente aos primarios, ou promoverem a formacao de coagregados comoutros microrganisos e entao se aderirem aos primarios.(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizacao primaria de um substrato; (b)crescimento, divisao celular e producao do exopolissacarideo (EPS), com o desenvolvimentode microcolonias; (c) coadesao de celulas individuais, de celulas coagregadas e grupos decelulas identicas, originando um biofilme jovem, de multiplas especies; (d) maturacao eformacao de mosaicos clonais no biofilme maduro.Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinamica pois, de acordo com osmicrorganismos que o compoem, teremos consicoes fisicas, quimicas e biologicas distintas.Estas alteracoes fazem com que cada biofilme seja unico, de acordo com os microrganismospresentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composicao microbiana dos biofilmesgeralmente sofre alteracoes significativas. A figura abaixo ilustra nao somente a estruturacaofisico-quimica de um biofilme, mas tambem sua evolucao e amadurecimento, dependendo dasrelacoes estabelecidas pelos microrganismos presentes.Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores físicos, biológicos e ambientais(Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001)Comportamento coletivoHa varias decadas, foi proposto que as bacterias poderiam corresponder a organismosinterativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptacao as alteracoesambientais. Para que um biofilme de uma ou varias especies seja formado, e necessario oestabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadasde interacao e comunicacao dos varios organismos. Assim, os biofilmes nao sao simplescamadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biologicos altamenteorganizados, onde as bacterias estabelecem comunidades funcionais estruturadas ecoordenadas.Um dos mecanismos de comunicacao interbacteriana que vem se mostrandoextremamente importante na formacao e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorumsensing.Comunidades associadas às superfíciesOs procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado as formas de vidasuperiores, assim como varios ambientes inospitos a maioria das formas de vida. Tal fato edecorrente de sua inigualavel diversidade metabolica e plasticidade fenotipica. Um dosimportantes aspectos associados a esta ubiquidade esta relacionado a capacidade destesorganismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se propagar. O mecanismo maiscomum que permite a migracao dos procariotos corresponde a motilidade, seja de origemflagelar, deslizante, ou de outro tipo. No entanto, sao conhecidos mecanismos que tambempermitem a migracao bacteriana.Por exemplo, algumas especies podem sintetizar celulose, originando uma pelicula quemantem as celulas proximas a interface ar-agua, ou na superficie de plantas. Bacteriasfotossintetizantes podem se posicionar nas colunas de agua, em resposta a intensidadeluminosa, pela producao de vesiculas de gas. Outras, apresentam magnetossomos,permitindomovimentacoes ao longo dos campos magneticos da Terra. Um importante mecanismo naformacao de comunidades corresponde a agregacao ou aderencia, que otimiza tanto asinteracoes celulares como tambem as taxas de sedimentacao dos organismos.As comunidades bacterianas tem importantes papeis na natureza, seja na producao edegradacao de materia organica, na degradacao de poluentes, ou na reciclagem de nitrogenio,enxofre e varios metais. A maioria destes processos requer o esforco coletivo de organismoscom diferentes capacidades metabolicas. Assim, os biofilmes participam metabolizandoesgotos e aguas contaminadas com petroleo, na nitrificacao, na reciclagem de enxofre oriundode drenados acidos de minas (onde o pH e 0) e em varios outros processos. Outro tipo debiofilme esta associado as particulas em suspensao, muitas vezes denominadas neve marinha,extremamente importante nas transformacoes biogeoquimicas do carbono em ambientespelagicos, na metanogenese, fixacao de nitrogenio e producao de enxofre. Estes achadosrevelam que nos biofilmes podem ser criadas condicoes de anaerobiose, em ambientesnormalmente aerobios.(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolonias centraiscorrespondem a organismos que geram e consomem hidrogenio. Os fermentadores utilizamacucares e produzem acidos organicos, utilizados pelos produtores de hidrogenio. Alem das

interacoes metabolicas, a comunicacao intra e intercelular pode ser mediada por moleculassinalizadoras.As interacoes que permitem a agregacao de diferentes especies, ou mesmo generosmicrobianos em um biofilme geralmente envolvem a participacao de adesinas (moleculas deadesao presentes em fimbrias ou dispersar ao longo da superficie celular), que reconhcemreceptores especificos na superficie de outras celulas, ou em diversos tipos de substratos.Assim, a figura abaixo esquematiza a formacao de um biofilme aquatico, revelando acomplexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As horas correspondem aotempo medio necessario a adesao dos diferentes microrganismos, revelando a dinamica deformacao e estruturacao deste biofilme.Esquema de coagregações envolvendo bactérias aquáticas.(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)Estrutura dos BiofilmesA maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo conjuntos deagregados celulares distribuidos ao longo da matriz exopolissacaridica, que exibem densidadesvariaveis, originando aberturas e canais por onde a agua pode trafegar.Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. A intensidade da cor estáassociada à densidade celular.(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)As microcolonias que compoem um biofilme podem ser de uma ou varias especies,dependendo das condicoes ambientais. Por exemplo, em locais de grande stress mecanico,tais como a superficie dental, o biofilme e bastante compactado e estratificado. Os espacosintersticiais (canais) tambem sao parte importante dos biofilme, pois permitem a circulacao denutrientes e a troca de metabolitos.Por que formar um biofilme?Acredita-se que a formacao de biofilmes esteja associada, por exemplo, a protecaocontra o ambiente, ou seja, bacterias em um biofilme encontram-se abrigadas e em relativahomeostase, gracas a presenca da matriz exopolissacaridica. A matriz contem varioscomponentes: exopolissacarideo, proteinas, acidos nucleicos, entre outros.O exopolissacarideo e secretado para o meio externo, sendo de diferentescomposicoes. Ao que parece, o EPS tem diferentes estruturas e funcoes, dependendo dascomunidades e/ou condicoes ambientais. Este polimero pode impedir fisicamente a penetracaode agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidrofilicos e carregadospositivamente. Em alguns casos o EPS e capaz de sequestrar cations, metais e toxinas. Porestas razoes, os biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de transferencia demetais nos ecossistemas, pois varios organismos marinhos pastadores se alimentam debiofilmes. Foi tambem descrito que o EPS teria papel de protecao contra radiacoes UV,alteracoes de pH, choques osmoticos e dessecacao.Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólicaOs canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatorioprimitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabolitos, assim como a remocao de metabotilospotencialmente toxicos. Em um biofilme, torna-se possivel a cooperacao metabolica. Porexemplo, a degradacao de compostos organicos complexos, originando metano e CO2 duranteuma digestao anaerobia, requer pelo menos tres grupos de organismos. As bacteriasfermentativas iniciam o processo, gerando acidos e alcoois, que sao utilizados por bacteriasacetogenicas. Finalmente, as metanogenicas convertem o acetato, CO2 e hidrogenio,produzindo metano.Os biofilmes sao ambientes ideais para o desenvolvimento de relacoes sintroficas, quee um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem umdo outro para utilizarem certos substratos, na producao de energia.Sintrofia em um grânulo de lodo de um reator metanogênico. Corantesfluorescentes revelam organismos metanogenicos (em verde) e bacterias que oxidampropionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinacao verde e vermelho, revelandomicrocolonias sintroficas interligadas a cadeias de metanogenicos.(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)Aquisição de novas características genéticasVarias bacterias possuem plasmideos, conferindo as mais diversas caracteristicas.Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugacao, para diferentes especiespresentes em um bioflme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadasinicialmente por bacterias do genero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo umtransposon conjugativo albergando genes de resistencia a tetraciclina, foi inserida no sistema e

transferiu este transposon para celulas de Streptococcus.A transducao pode, teoricamente, ser responsavel pela transferencia horizontal degenes em biofilmes. Tal hipotese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de agua docecontem uma enorme abundancia de bacteriofagos (cerca de 108/ml), sendo responsaveis pelalise de um grande numero de bacterias. Diariamente, de 10 a 20% da populacao bacteriana elisada por fagos, os quais tem relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez quepodem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos osniveis troficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou restruturarcomunidades microbianas. Em uma analise, onde uma populacao de cianobacterias foipraticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presenca de novas especies capazes dedegradas os compostos organicos que surgiram.Papel dos biofilmes nas doençasAte o momento, a vasta maioria das doencas infecciosas vem sendo tratadaeficientemente com antibioticos entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes,sabemos que tal tipo de estrategia pode ser ineficaz em duas situacoes: 1) com organismosexibindo resistencia inata a droga e 2) em bacterias presentes em biofilmes.Em um biofilme, as bacterias podem ser 1000 vezes mais resistente a um antibiotico,quando comparadas as mesmas celulas planctonicas, embora os mecanismos envolvidosnesta resistencia sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possiveis mecanismos, acredita-seque possa haver a inativacao da droga por polimeros ou enzimas extracelulares, ou aineficiencia da droga em decorrencia de taxas de crescimento muito lentas no interior dosbiofilmes.Infeccoes assciadas a biofilmes geralmente sao de natureza recorrente, visto que asterapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas planctonicas,deixando as celulas sesseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme apos o tratamento.Para tornar o quadro ainda mais grave, as bacterias presentes nos biofilmes encontram-semais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro.Exemplos tipicos de doencas associadas a biofilmes incluem as infeccoes de implantestais como valvulas cardiacas, cateteres, lentes de contato, etc.Os biofilmes podem ainda promover doencas se formados em tecidos, tais como nas infeccoespulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cistica, quesao suscetiveis a infeccoes cronicas por esta bacteria. A periodontite e outro exemplo dedoenca provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doenca,Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superficies orais direta ou indiretamente,sendo entao capaz de invadir as celulas das mucosas e liberar toxinas.Biofilmes e resistência às drogas, devido a densidade e tipos celulares, exclusaofisica da droga, expressao de genes de resistencia, quorum sensing e alteracoes da superficiecelular. (Adaptado de Mah & O’Toole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental.(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)Genética da formação dos biofilmesQuatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, vem sendointensamente estudados, como modelos na formacao de biofilmes de especies unicas. Esteprocesso pode ser subdivido em etapas: a) Aderencia inicial a superficie, b) Formacao dasmicrocolonias, c) maturacao das microcolonias em um biofilme contendo a matriz de EPS.Estudo microscópico da formação de um biofilmepor V. cholerae(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol.,182:2675–2679, 2000)Etapas que uma nova espécie bacteriana realiza, durantesua incorporação em um biofilme(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–2679, 2000)Ao que parece, o processo se inicia quando as bacterias percebem determinadascondicoes ambientais, que disparam o fenomeno de transicao de celulas planctonicas emsesseis. Assim, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formarbioflmes sob quase todas as condicoes, enquanto E. coli somente os forma se estiver emmeios minimos suplementados com aminoacidos, ou em meios pobres em nutrientes.Diferentes vias geneticas podem ser utilizadas na formacao de biofilmes. Por exemplo,V. cholerae parece ter diferentes vias para realizar a aderencia inicial, dependendo dasuperficie. Assim, quando no intestino, este organismo utiliza a fimbria Tcp para realizar acolonizacao, embora tal estrutura nao tenha papel na etapa inicial de formacao de biofilmes em

superficies abioticas, sendo o processo mediado por um outro tipo de fimbria, denominadaMsh.Início de formação do biofilmeA partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi relatado que, quandoas celulas nao sintetizam flagelos, sao incapazes de realizar as interacoes iniciais com assuperficies. Mutantes que nao produzem a fimbria tipo IV (associada a movimentacao dascelulas em uma superficie) sao capazes de se aderir formando uma monocamada, ao inves demicrocolonias. Existem uma proteina, denominada Crc que, alem de atuar regulando ometabolismo das celulas, tambem regula a expressao de dois genes que codificam proteinasimportantes na montagem da fimbria tipo IV.O LPS da membrana externa tambem tem papel na adesao inicial. Em E. coli, osflagelos tambem sao importantes nesta primeira etapa de formacao do biofilme. Ha ainda aparticipacao de fimbrias do tipo I, uma proteina de membrana externa, Ag43 e do LPS. Em V.chloreae acredita-se que o processo seja bastante similar ao de E. coli.Maturação do biofilmeApos a etapa de interacoes iniciais, comeca a haver a formacao das microcolonias,normalmente associada a producao de EPS. Outra etapa importante corresponde aorganizacao da arquitetura do biofilme que, em P. aeruginosa parece ter a participacao do"quorum sensing".Estágios iniciais na formação de biofilmes de Gram negativos (P. aeruginosa, E.coli, e V. cholerae).(A) Em P. aeruginosa, os flagelos sao necessarios para aproximar a bacteria dasuperficie, enquanto o LPS media as primeiras interacoes, havendo talvez a participacao deproteinas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fimbrias tipo IV mediam omovimento pulsante, necessario a formacao de microcolonias. A producao destas fimbrias eregulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativacao de genes envolvidosna sintese de alginato e repressao de genes flagelares. A formacao do biofilme maduro envolvea participacao de homoserina lactonas sinalizadoras.(B) Em E. coli, os flagelos aproximam as celulas do substrato, enquanto as primeirasinteracoes sao mediadas por fimbris tipo I e a proteina de membrana externa Ag43. O EPS,acido colanico e resonsavel pela arquitetura do biofilme.(C) V. cholerae, tambem usa os flagelos na aproximacao, sendo a ligacao mediada porfimbrias MshA e talvez outras proteinas.(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)DispersãoEm determinados momentos, os biofilmes sofrem dispersao, liberando microrganismosque podem vir a colonizar novos ambientes. Os mecanismos geneticos associados a dispersaonao sao ainda bem conhecidos.Existem tres tipos de processos de dispersao: expansiva, quando parte das celulas de umamicrocolonia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo entao liberadas da estrutura.Outro tipo de dispersao envolve a fragmentação do biofilme, onde porcoes de matrizextracelular associadas a microrganismos sao liberadas. Finalmente, o terceiro tipo dedispersao, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do proprio biofilme como um todo.

Quorum SensingIntroduçãoO quorum sensing (sensor de quorum) corresponde a um processo de comunicacaointra e interespecies microbianas, que permite aos microrganismos apresentarem alteracoesfenotipicas marcantes quando estes se encontram em altas densidades populacionais. Adescoberta deste tipo de interacao microbiana tornou evidente o conceito que, emborageneticamente e estruturalmente mais simples, os microrganismos tem a capacidade de secomportar como organismos complexos, capazes de se comunicar e agir coordenadamente,respondendo a diferentes estimulos de modo unificado.Este interessante processo foi descoberto em bacterias luminescentes marinhas,habitantes de orgaos luminescentes de lulas e certos peixes.Lula exibindo luminescênciaHa muitos anos conhecia-se a existencia de bacterias marinhas (por exemplo Vibriofischeri) capazes de emitir luminescencia. No entanto, este fenomeno era apenas observadoquando os microrganismos encontravam-se confinados nos orgaos de luz dos animais. Quandotais bacterias encontravam-se livres na agua do mar, a luminescencia nao era observada.

Estudos posteriores revelaram que durante o dia as lulas expeliam as bacterias de seus orgaosde luz mas, a medida que a noite se aproximava, estas passavam a acumumular osmicrorganismos, que apos um determinado periodo de tempo tornavam-se luminescentes. Emoutras palavras, a emissao de luminescencia estava associada a densidade populacionalbacteriana.Posteriormente o processo que resultava na luminescencia foi esclarecido, sendodenominado quorum sensing, uma vez que correspondia a um mecanismo de comunicacaoonde os microrganismos monitoravam sua densidade populacional.O mecanismo de Quorum SensingAtualmente esta bem definido que este sensoriamento populacional e realizado pormeio de pequenas moleculas, denominadas autoindutores (AI). Os autoindutores podem ser dediferentes naturezas quimicas: em organismos Gram negativos, via de regra os autoindutoressao do tipo N-acil homoserina lactonas (AHL), que correspondem a pequenas moleculas quese difundem livremente para dentro e para fora das celulas. Em Gram positivos, normalmenteos autoindutores correspondem a pequenos petideos (hepta ou octapeptideos) que se ligam areceptores localizados na superficie das celulas bacterianas.Nos diferentes organismos que realizam o quorum sensing, o processo segue,essencilamente, as mesmas etapas.Durante o crescimento microbiano, todas as celulas produzem e liberam uma pequenaquantidade de autoindutores. Quando a populacao se encontra no meio da fase logaritmica ouno inicio da fase estacionaria de crescimentno, a quantidade de autoindutor produzido alcancauma concentracao limite, suficiente para disparr o processo de alteracao da expressao genica.Em termos bastante simples: os autoindutores se ligam a proteinas receptoras que saoentao ativadas, promovendo a ativacao da expressao de certos genes, podendo ainda inibir aexpressao de outros genes que se encontravam ativos. Assim, o quorum sensing e ativadoquando a concentracao de autoindutor atinge um nivel tal que sua ligacao a uma proteinareceptora e eficiente, permitindo a ativacao transcricional de uma serie de genes.Regulação da bioluminescência em Vibrio fischeriPara melhor ilustrar o mecanismo de quorum sensing, descreveremos o fenomeno debioluminescencia apresentado por Vibrio fischeri.Nealson et al., (1970) revelaram que o sobrenadante de culturas densas de V. fischeri continhaum composto capaz de induzir a luminescencia em culturas de baixa densidade, sendo por issodenominado "autoindutor". Este autoindutor (VAI - Vibrio AutoIndutor) foi identificado em 1981,como uma N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona (OHHL), enquanto os genes regulatorios eestruturais necessarios ao processo de luminescencia (regulon lux) foram descritos em 1984,estando localizados em um segmento de DNA de 9 kb.O regulon lux e composto por dois operons que sao transcritos em direcoes opostas,sendo separados por uma regiao intergenica regulatoria. O operon da esquerda contem o geneluxR, que codifica o ativador transcricional LuxR, que tambem atua como receptor doautoindutor. O operon da direita contem o gene luxI, que codifica a OHHL sintase. Abaixo dogene luxI, encontram-se os genes estruturais luxCDABE, que codificam as proteinasnecessarias ao desenvolvimento da bioluminescencia (subunidades a e b da luciferase - luxA eluxB, a redutase - luxC, transferase - luxD e sintetase - luxE).Assim, em qualquer etapa de seu ciclo de vida, as celulas de V. fischeri estaoproduzindo pequenas quantidades do autoindutor (VAI), que se difunde livremente atraves dasmembranas da bacteria. Nestes estagios onde a populacao microbiana ainda e pequena, estaocorrendo a ligacao do VAI ao seu receptor, LuxR, no entanto, tal ligacao e ainda transiente.No entanto, a medida que a populacao aumenta, a quantidade de VAI tambem aumenta, ateque atinge uma concentracao limiar, que dispara o processo, resultando na ativacao datanscricao dos operons lux.A proteina LuxR e modular, sendo constituida por um dominio C-terminal de ligacao aoDNA e um dominio N-terminal de ligacao a OHHL. A OHHL, produzida pelo gene luxI, liga-se aproteina LuxR, ativando-a. Esta quando ativada liga-se ao DNA, em um sitio especifico,denominado lux box, que corresponde a uma regiao de 20 nucleotideos invertidos repetidos,situada entre os dois operons lux.O complexo VAI-LuxR liga-se ao lux box e estimula a transcricao dos operons, promovendouma maior sintese de autoindutor, de proteina LuxR e de todo o aparato necessario aluminescencia.Regulação do operon lux pelo autoindutor de V. fischeriOutras atividades microbianas associadas ao Quorum Sensing

Atualmente sao conhecidas centenas de especies microbianas que realizam o processode quorum sensing, revelando que tal tipo de comunicacao resulta em uma serie de alteracoesfenotipicas apresentadas pelas culturas.Dentre as principais atividades microbianas associadas ao quorum sensing temos:- producao de antibioticos- expressao de fatores de virulencia- aquisicao do estado de competencia (a capacidade de captar DNA do meio)- transferencia de DNA para outros organismos- fixacao de nitrogenioAlem destas atividades, cada vez mais esta se tornando claro o papel ecologicodesempenhado pelo quorum sensing. Sabe-se que os microrganismos sintetizam autoindutoresbastante especificos, reconhecidos apenas por membros da mesma especie. No entanto,pesquisas revelam que organismos de especies proximas podem sintetizar autoindutoressemelhantes, capazes de interferir no quorum sensing de outros organismos. Por exemplo,Staphylococcus epidermidis, um habitante da microbiota normal, sintetiza autoindutores queinterferem no quorum sensing de S. aureus, um microrgnaismo potencialmente patogenico.Acredita-se que este tipo de interferencia tenha como principal funcao impedir ou dificultar acolonizacao do hospedeiro por organismos invasores.Ha alguns anos foi descoberto um segundo tipo de autoindutor, denominado AI-2, queparece estar envolvido em um processo mais "geral" de cominucacao microbiana. Este AI-2seria reconhecido por um grande numero de especies, talvez atuando como uma molecula quesinaliza aos diferentes organismos a presenca de outros microrganismos. Este seria um tipo demolecula que realizaria um "censo" geral da populacao.A descoberta do quorum sensing trouxe novas e interessantes perspectivas para ocontrole microbiano, especialmente no que se refere ao tratamento de doencas infecciosas.

Controle MicrobianoDefiniçõesEsterilização: Destruicao ou remocao de todas as formas de vida de um objeto ouhabitat.Desinfecção: Processo que promove a inibicao, morte ou remocao de variosmicrorganismos patogenicos e saprofitas, sem eliminar todas as formas de vida.Sanitização: Processo que leva a reducao dos microrganismos, a niveis seguros, deacordo com os padroes de saude publica (elimina 99,9% das formas vegetativas).Anti-séptico: Produto que evita a infeccao em tecidos, seja inibindo ou matando osmicrorganismos. Como sao aplicados em tecidos vivos, os anti-septicos sao, geralmente,menos toxicos que os desinfetantes (agentes aplicadas em materiais inanimados).Germicida: mata microrganismos, mas nao endosporos. “Cida”: Qualquer agente quepromova a morte (ex: bactericida, fungicida, algicida) “Stático”: Qualquer agente que promovaa inibicao do crescimento (ex: bacteriostatico, fungistatico)Padrão de morte microbianaDa mesma forma que no crescimento, a morte microbiana e um evento que ocorre deforma exponencial. Assim, apos uma rapida reducao do numero, a taxa de morte pode tornarsemais lenta, devido a sobrevivencia de celulas mais resistentes.Condicoes que afetam a atividade de um agente antimicrobiano, especialmente se talagente e de natureza quimica.1. Tamanho da população: Quanto maior a populacao, maior o tempo necessario a suaeliminacao.2. Natureza da população: Se nesta populacao de microrganismos existiremendosporos, os quais sao muito mais resistente que formas vegetativas, sua eliminacao naoocorrera tao facilmente. No caso de celulas em diferentes estagios de crescimento - celulasmais jovens tendem a ser mais suscetiveis que celulas em fase estacionaria. Havendo apresenca de membros do genero Mycobacterium, sua eliminacao e mais dificil que de outrasbacterias nao esporuladas, etc.3. Concentração do agente: Geralmente, quanto mais concentrado, melhor (excetoalcool). A relacao entre a concentracao e a eficiencia via de regra nao e linear.4. Tempo de exposição: De acordo com normas da OMS, o tempo minimo de exposicaodeve ser de 30 minutos. Em casos de agentes esterilizantes, a exposicao deve ser tal que achance de haver sobreviventes e de 1 em 106.5. Temperatura: Dentro de limites, o aumento da temperatura torna o processo mais

eficiente. Para agentes quimicos, geralmente o aumento de 1°C da temperatura aumenta em10 vezes a eficiencia do processo, o que tambem permite a diluicao do agente.6. Condições "ambientais": pH do meio - quando e acido, favorece a eliminacao termica;presenca de materia organica - dificulta a acao do produto (necessidade de lavagens dosmateriais antes do controle por agentes quimicos), seja por proteger o microrganismo oucompetir pelo produto em uso. Altas concentracoes de acucar, proteinas ou lipideos diminuema penetrabilidade do calor, enquanto o sal pode aumentar ou diminuir a resistencia ao calor. Aconsistencia do material ou solucao tambem interfere.Controle microbiano por agente físicosOs principais agentes fisicos que promovem o controle microbiano sao: Calor, Filtraçãoe Radiações. Eventualmente, outros agentes, tais como as baixas temperaturas, dessecacao,podem ser utilizados.CALOR - Uso disseminado desde epocas remotas, correspondendo ainda um dosagentes fisicos mais praticos e eficientes para a esterilizacao e/ou desinfeccao. O calor podeser empregado sob duas formas: seco e umido, tendo a vantagem de apresentar, basicamente,apenas 2 parametros a serem controlados: tempo e temperatura.Para todos os organismos sao definidas as temperaturas cardeais, ou seja, astemperaturas minima, maxima e otima de crescimento. Assim, quando estes sao submetidos atemperaturas superiores a temperatura maxima de crescimento, os efeitos letais tornam-seaparentes. A morte e um fenomeno que ocorre de forma exponencial, sendo proporcionalapenas a concentracao inicial da populacao. Ja o tempo para uma determinada fracao dapopulacao a ser morta e independente da populacao inicial.Processos empregando calor:A morte se da pela oxidacao de constituintes celulares e desnaturacao de proteinas eacidos nucleicos. Nao e a melhor maneira de utilizacao do calor, uma vez que o ar e menoscondutor da temperatura que a agua.Calor secoIncineração (E): processo drastico de eliminacao de microrganismos, que destroi oproduto.Ao rubro (E): processo onde os materiis sao levados a incadescencia, promovendo adestruicao de todos os microrganismos.Flambagem (D): processo onde o material e submetido diretamente ao fogo, seja secoou embebido em alcool. Bastante utilizado na desinfeccao de alcas de vidro.Estufa esterilizante (E: 160†C/2 hs ou 180°C/1 h). Amplamente utilizado para vidrarias eoutros materiais.Calor úmido - Como mencionado anteriormente, e um processo mais eficiente devidoao maior poder de penetracao do vapor d’agua. A morte e decorrente da desnaturacao deacidos nucleicos e proteinas, podendo tambem romper membranas. Alem disso, o vapor temmaior capacidade de romper as pontes de hidrogenio.Autoclave (E - 121°C/20 min./1 atm) - Destroi esporos, em um pequeno volume, em 10a 12 minutos. Com volumes maiores, o tempo e maior (5 litros => 70 minutos). Frequentementesao utilizados indicadores da eficiencia de esterilizacao, por exemplo, ampolas contendoesporos de B. stearotermophilus ou de Clostridium PA3679, os quais sao inoculados em meiosde cultura apos o processo de esterilizacao. Caso haja o desenvolvimento de celulasvegetativas, o processo nao foi realizado adequadamente, uma vez que nao houve aesterilzacao.Água em ebulição (D - 100°C/30 min.)A titulo de comparacao, a eliminacao de esporos de C. botulinum pela fervura, requer cerca de5,5 horas. Por outro lado, a 120°C, estes esporos sao eliminados apos 4 a 5 minutos.Pasteurização (D - 62,8°C/30 min - pasteurizacao lenta, ou 71,7°C/15 seg -pasteurizacao rapida)UHT (E): 141°C/2 segundos - processo bastante utilizado para o leite e outros alimentosliquidos.FILTRAÇÃO - Processo muito util na esterilizacao de materiais termolabeis, sendoempregado para liquidos e gases. Estes filtros sao geralmente compostos por celulose,acetato, policarbonato, teflon, ou outro material sintetico. Embora o diametro dos poros possavariar, os mais utilizados sao aqueles de 0,2 Um, que removem os microrganismos (excetovirus) das solucoes e do ar.Dentre os principais tipos de filtros podemos citar:Filtros de profundidade: Correspondem aos filtros mais antigos, constituidos de malha

fibrosa ou granular, a base de papel, asbestos ou fibra de vidro, arranjados de forma a criaruma serie de camadas aleatorias sobrepostas, formando pequenos canais sinuosos. Assim, osmicrorganismos ficam retidos nas malhas e/ou adsorvidos a superficie do material. Estes filtrossao feitos tambem de terra de diatomaceas (Berkefield) ou porcelana (Chamberlain). Napratica, sao usados como pre-filtros, para a remocao de particulas maiores. Muitas vezes saotambem usados na filtracao de ar.Membranas Filtrantes: Correspondem ao tipo mais comum de filtro esterilizante, emmicrobiologia. Sao membranas porosas de acetato de celulose, nitrocelulose ou policarbonato,tendo espessura de ≈ 0,2 mm, contendo poros variando de ≈ 0,1 a 0,5 Um de diametro, queocupam cerca de 80 a 85% da membrana.Filtros Isopore® (nucleopore): Correspondem a filmes extremamente delgados depolicarbonato (10 Um de espessura) que sao tratados com radiacao nuclear, seguida decauterizacao (marcacao) quimica. A radiacao provoca danos localizados na membrana e otratamento quimico aumenta essas falhas, formando orificios, cujo tamanho pode sercontrolado pela forca da solucao cauterizadora e pelo tempo de tratamento. Estes filtrosfuncionam como verdadeiras peneiras, removendo todas as particulas maiores que os orificios.Tem, entretanto, baixa porosidade, sendo muito usados na preparacao de amostras para amicroscopia de varredura, onde os organismos sao retidos no filtro, sendo mantidos em umplano uniforme, no topo do filtro.O ar tambem pode ser filtrado, em fluxos laminares contendo filtros HEPA (HighEfficiency Particulate Air filters), que removem 99,97% de particulas de 0,3 Um.Bactérias retidas na superfície de um filtro do tipo Isopore®(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)RADIAÇÕES - Ionizante e nao ionizanteRadiação Não-Ionizante: A radiacao ultravioleta (de 4 a 400 nm - sendo 260 nm ocomprimento mais eficiente) e bastante letal, mas exibe baixa penetrabilidade, naoatravessando vidros, filmes sujos e outro materiais. Assim, a radiacao UV e extremamenteeficiente na eliminacao de microrganismos presentes em superficies.Como sua maior eficiencia se da a 260 nm, que corresponde ao comprimento de ondaonde se da a maior absorcao pelo DNA, a radiacao UV afeta primariamente este tipo demolecula. Sua acao e principalmente decorrente da formacao de dimeros de pirimidinas(timina), efeito este que pode ser revertido por sistemas de fotorreativacao (enzima de reparoativada pela luz) ou por sistema de reativacao independente da luz (polimerase).Por outro lado, nao podem ser descartados outros efeitos deleterios do UV, uma vezque quando a 340 nm, observa-se dano celular, sem estar primariamente relacionado asmutacoes, uma vez que neste comprimento de onda os acidos nucleicos nao tem mais umagrande capacidade de absorver este tipo de radiacao.Radiação Ionizante: Radiacoes de pequeno comprimento de onda, portanto, dealtissima energia e penetrabilidade. Os dois principais tipos sao a radiacao gama e os Raios X.Estas, sao bastante eficientes, uma vez que promovem a ionizacao de atomos, fazendo-osperderem eletrons. Como consequencia sao gerados radicais livres extremamente reativos,que podem destruir pontes de hidrogenio, duplas ligacoes, estruturas em anel. Quando napresenca de oxigenio, geram radicais hidroxila livres, absolutamente toxicos para as celulas.A radiacao gama e originada geralmente a partir de fontes de 60Co ou 137Ce.Estas radiacoes vem sendo amplamente utilizadas em produtos termolabeis, tais comoplasticos e alguns tipos de alimentos (frutas, vegetais, alimentos marinhos). Nos alimentos seuuso e interessante, uma vez que inativam enzimas autocataliticas que participam do processode degradacao natural.Outros agentes Físicos de controleBaixas temperaturas: A refrigeracao ou o congelamento sao amplamente utilizados nocontrole microbiano de alimentos e produtos biologicos, pois levam a uma diminuicao ouinterrupcao do metabolismo. Como, na maioria dos casos, os microrganismos patogenicos aohomem sao mesofilicos, estas baixas temperaturas sao eficientes no controle. Entretanto,deve-se ter cuidado porque celulas de Clostridium botulinum, quando incubadas a 5°C, saoainda capazes de produzir e secretar a toxina do tipo E.Dessecação: Liofilizacao ou dessecamento natural, que atua diferentemente nosorganismos, dependendo do tipo de meio, do material dessecado e da intensidade doprocesso. Via de regra, os cocos Gram negativos sao mais sensiveis que os Gram positivos,sendo M. tuberculosis um dos exemplos classicos de organismo resistente a dessecacao(varias semanas em escarro seco).

Pressão osmótica: conservas com altos teores de sal ou acucar.Controle de Microrganismos por Agentes QuímicosDurante muito tempo foram mais empregados em processos de desinfeccao e antisepsia,entretanto, atualmente estes vem sendo cada vez mais amplamente utilizados emprocessos de esterilizacao.Cuidados previos: lavagem adequada do material, garantia de pleno contato com oagente.Caracteristicas de um agente quimico ideal: boa atividade antimicrobiana, toxicidadeseletiva, solubilidade, estabilidade, inocuidade, nao interacao com a materia organica,temperatura de acao adequada, alto poder de penetracao, sem poder corrosivo ou tintorial,desprovido de acao danosa ao meio ambiente.Principais Tipos de Agentes Químicos:1) Compostos orgânicos:Fenóis e derivados (cresois (metil-fenol), xilenois): Primeiros a serem usados (Lister,1867 - salas de cirugia). O fenol nao e mais usado como desinfetante ou anti-septico devido asua toxicidade para os tecidos. Os derivados fenolicos (hexaclorofeno, hexilresorcinol) saoempregados principalmente como anti-septicos ou desinfetantes hospitalares. Estes atuamdesnaturando proteinas e rompendo membranas. Sao tuberculocidas, efetivos na presenca demateria organica, permanecem ativos por muito tempo. Entretanto tem odor desagradavel esao irritantes para pele.Hexaclorofeno -associacao de fenol a halogenio (Cl) que e bastante eficaz, sendobastante usado em pastas dentifricias e saboes. No passado, pesquisas indicaram que talcomposto era cumulativo e carcinogenico.Álcoois: Muito usados, efetivos, confiaveis e baratos, atuando como bactericidas,fungicidas e contra virus envelopados. Os mais usados sao etanol e isopropanol, nasconcentracoes entre 70 e 80%. Atuam desnaturando proteinas e dissolvendo lipideos demembrana.Compostos Quaternários de Amônio: sao detergentes cationicos, moleculas organicasderivadas de gorduras, atuando como umectantes e emulsificadores. Apenas os detergentescationicos sao detergentes efetivos, que desnaturam proteinas (Ex: cloreto de benzalconio, quemata a maioria das bacterias).2) Halogênios:Iodo: anti-septico para a pele a 2%, ou em solucao agua-etanol de iodeto de potassio,para procedimentos pre-operatorios. Eficaz contra bacterias, fungos, virus e protozoariosparasitas. Atua oxidando componentes celulares e iodinando proteinas. Em concentracoeselevadas elimina esporos. Tem como desvantagens: danos a pele, manchar e alergenico.Iodoforos: Complexacao de iodo a carreador organico (agentes tensioativos, como aPVP). Sao soluveis em agua, estaveis, sem propriedades tintoriais, liberando o iodolentamente, minimizando a irritacao cutanea. Usado na assepsia pre-operatoria e tambemcomo desinfetante.Cloro: Muito utilizado no tratamento de aguas e nas industrias de laticinios e alimentos.Pode ser aplicado na forma de gas, hipoclorito de sodio ou de calcio, que geraacidohipocloroso e entao O2, promovendo a oxidacao de materiais celulares e causando a morte emcerca de 30 minutos. Eficaz contra fungos, bacterias e virus, com a desvantagem ser descoraralguns materiais. E eficiente, barato, de facil uso, mas altamente reativo com a materiaorganica. Como desvantagem, o uso do cloro em aguas pode produzir pequenas quantidadesde compostos organoclorados, particularmente o trihalometano (THM), um possivel agentecarcinogenico. Como alternativa pode ser usada a cloramina (monocloramina), que reduzdrasticamente os niveis de THM. A monocloramina pode ser gerada diretamente na agua pelaadicao simultanea de amonio e cloro ou hipoclorito.O tratamento da agua presente nas torres de resfriamento de aparelhos ar condicionadoe extremamente importante para o controle de Legionella pneumophila.3) Metais Pesados:Foram muito usados no passado como germicidas (prata, mercurio, zinco e cobre),sendo atualmente substituidos por compostos menos toxicos. Os mais usados sao compostosorganicos de mercurio, prata, cobre e zinco.Nitrato de prata: usado em solucao 1%, para prevenir a oftalmia neonatorum, sendosubstituido em varios hospitais pela eritromicina (que protege contra Chlamydia tambem).Temos ainda o Mercurocromo e mertiolate, usados como como preservantes de soros evacinas. O sulfato de cobre e usado na desinfeccao de aguas, especialmente contra algas.

Estes atuam combinando-se com proteinas, geralmente nos grupos SH, inativando-as.4) OutrosPeróxidos: principalmente agua oxigenada, sobre organismos anaerobios, atuando pelasua acao oxidante.Ozônio: Vem sendo empregado na desinfeccao de agua, com sucesso, na Europa eEstados Unidos. Embora seja um tratamento mais caro, tem a vantagem de nao produzircompostos organoclorados. Por outro lado, devido a sua instabilidade, a agua submetida a estetipo de tratamento esta mais sujeita a contaminacao que quando clorada.Corantes: dividem-se em dois grupos, acridina (que interage com o DNA) e derivadosde rosanilina (Cristal violeta, verde malaquita), que atuam inibindo G+, Candida e Trichomonas.Tem acao aparentemente ao nivel da parede celular das bacterias.Comparação da eficiência de diferentes anti-sépticos(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)Agentes Químicos Esterilizantes:Aldeídos: Formaldeido e Glutaraldeido, moleculas muito reativas, combinam-se comproteinas, inativando-as.Formaldeido 8% dissolvido em agua ou alcool (irritante e deixa residuos) e glutaraldeido2% (menos irritante). Em 12 horas, destroem esporos.Gases esterilizantes: Oxido de etileno, atua pela interacao com proteinas, com altacapacidade de penetracao. Como e explosivo, e dissolvido em misturas de 10 a 20% com CO2

ou freon. Importante a presenca de umidade no ambiente e tambem temperatura.Condicoes: 38°C/5-8 hs ou 54°C/3-4 hs, com 50% de umidade e EtO de 400 a 800mg/litro.Betapropiolactona: eventualmente usado. Nao penetra tao bem e pode sercarcinogenico. Atua em concentracoes muito menores que o EtO.Abaixo temos uma tabela, listando alguns dos principais agentes quimicos utilizados nocontrole microbiano.

Antibióticos e QuimioterápicosIntroduçãoOs antibioticos sao produtos de enorme importancia nao apenas na area de saude,como tambem na economia, visto que apenas nos Estados Unidos, cerca de 100.000 toneladassao produzidas anualmente. Embora aproximadamente 8000 substancias com atividadeantimicrobiana sejam conhecidas e, a cada ano, centenas de novas substancias sejamdescobertas, pouquissimas sao efetivamente aproveitadas e utilizadas como agentesantimicrobianos, visto que muitas destas nao atendem aos requisitos minimos para seuemprego terapeutico. Paralelamente, nao podemos deixar de mencionar o crescente problemaem relacao ao surgimento de especies bacterianas resistentes aos diferentes antibioticos. Estetalvez corresponda ao principal desafio dos pesquisadores, visto que a multirresistencia vem setornando diariamente mais disseminada nas populacoes microbianas, sejam patogenicas ounao.Mais recentemente, outro aspecto que vem sendo cada vez mais levado emconsideracao refere-se a ocorrencia dos biofilmes e sua importancia na terapeuticaantimicrobiana, pois o conhecimento sobre a ocorrencia de biofilmes microbianos em nossoorganismo levou a uma quebra do paradigma de tratamento das doencas infecciosas.Certamente, para que os antibioticos possam ser empregados de forma mais eficaz, seranecessario um maior conhecimento acerca dos biofilmes formados naturalmente em nossoorganismo. Pois, somente a partir da elucidacao da ecologia dos biofilmes naturais do homem,teremos maiores chances de tratar de forma adequada as varias doencas infecciosas.Conceitos• Agente Antimicrobiano: Composto quimico que mata ou inibe o crescimento demicrorganismos, podendo ser natural ou sintetico.• Agentes Quimioterápicos (Antimicrobicos): Agentes quimicos, naturais ou sinteticos,usados no tratamento de doencas. Atuam matando ou inibindo o desenvolvimento dosmicrorganismos, em concentracoes baixas o suficiente para evitar efeitos danosos ao paciente.• Antibióticos: Grupo de agentes quimioterapicos (maioria), que constituem-se emprodutos microbianos ou derivados. Sao produtos do metabolismo secundario (quando a celulaentra em fase estacionaria), nao essenciais para o crescimento ou reproducao, sendo suasintese dependente da composicao do meio (podem ser super produzidos). Sao geralmentecompostos complexos, cuja sintese envolve varias etapas enzimaticas, sendo as enzimas

reguladas separadamente das do metabolismo primario. Via de regra, a producao deantibioticos esta associada ao fenomeno de quorum sensing.• Quimioterápico: Agente quimico sintetico, exibindo as mesmas atividades de umantibiotico.Histórico dos antibióticos e descobertas relacionadasPaul Ehrlich (1854 - 1915): Desenvolveu o conceito de toxicidade seletiva, indicandoque determinado agente exibia uma acao danosa aos microrganismos, sem afetar as celulasdo hospedeiro. Tal conceito tem importante reflexo pratico, pois indica se um agente pode,teoricamente, ser util no tratamento de doencas infecciosas. Este pesquisador trabalhava comcorantes e tecnicas de coloracao de microrganismos, quando verificou que alguns compostoscoravam os microrganismos, mas nao os tecidos animais. Esperava encontrar um corantetoxico aos microrganismos ("bala magica").1904 - Uso pratico do vermelho de tripan, composto ativo contra o tripanossoma quecausava a doenca africana do sono.Ehrlich & Hata: realizacao de testes com compostos arsenicais, em coelhos com sifilis.Descobriram que o composto 606, arsfenamida, era ativo => Em 1910, foi lancado omedicamento Salvarsan (nome comercial da arsfenamida), para o tratamento da sifilis.1927 - Na I. G. Farbenindustrie (Bayer) - G. Domagk: testava corantes e outroscompostos quimicos, quanto a acao em microrganismos e toxicidade em animais.1935 - Vermelho Prontosil: inocuo para animais, protegendo camundongos contraestafilococos e estreptococos patogenicos. Neste mesmo ano, foi descoberto que o prontosilera clivado no organismo, originando a sulfanilamida como um dos produtos. Na realidade, adroga eficaz era a sulfanilamida.1939 - Nobel para Domagk1896 - E. Duchesne: descobriu a penicilina, mas raramente tal pesquisador e citado,pois seus achados nunca foram devidamente publicados ou notificados, sendo esquecidsdurante varios anos.A. Fleming: Busca de um tratamento eficaz para os feridos na II Guerra Mundial. Foi o"segundo" descobridor da penicilina e tentou, sem sucesso, purifica-la em quantidadessuficientes para ser utilizada como medicamento.1939 - H. Florey & E. Chain - testavam atividade bactericida de varias substancias(lisozima, sulfonamidas). Obtiveram a cultura de fungo isolada inicialmente por Fleming,passando a trabalhar na purificacao da penicilina. Injetarama penicilina em camundongosinfectados com estafilococos ou estreptococos e observaram que quase todos sobreviveram.(Trabalho publicado em 1940).1945 - Nobel para Florey, Chain e Fleming1944 - S. Waksman: descobrimento da estreptomicina (Streptomyces griseus), a partirdo teste de cerca de 10.000 linhagens de bacterias e fungos do solo.1952 - Nobel para Waksman.Até 1953 - Isolamento de microrganismos produtores de cloranfenicol, neomicina,terramicina e tetraciclina.A partir de 1953 - a industria investiu centenas de milhares de dolares na busca denovas drogas antimicrobianas, sendo que tal linha de pesquisa perdura ate hoje em todo omundo, empregando diversos tipos de abordagens.Características gerais das drogas antimicrobianas• Toxicidade Seletiva: caracteristica que todo antimicrobiano deveria apresentar, poisreflete-se na capacidade de atuar seleivamente sobre o microrganismo, sem provocar danos aohospedeiro.Esta e expressa em termos do indice terapeutico: relacao B/A, ondeA) Dose terapeutica: concentracao p/ tratamentoB) Dose toxica: concentracao a partir da qual e toxicaDrogas que atuem sobre funcoes microbianas inexistentes em eucariotos geralmente temmaior toxicidade seletiva e indice terapeutico (Penicilina).• Espectro de ação: Refere-se a diversidade de organismos afetados pelo agente.Geralmente os antimicrobianos sao de pequeno ou de amplo espectro. Atualmente, uma seriede laboratorios vem trabalhando em busca de isolar e purificar antimicrobianos de espectrorestrito, que atuam especificamente sobre um ou um pequeno numero de microrganismos. Noentanto, atualmente os antibioticos comercializados enquadram-se nas categorias de pequenoe amplo espectro de acao.Exemplos de diferentes drogas antimicrobianas, classificadas de acordo com o espectro de ação.

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)• Quanto à síntese: Microbiana, quimica ou semi-sinteticaMicrobiana - geralmente por uma ou poucas bacterias (actinomicetos) e varios tipos de fungosfilamentosos. Geralmente correspondem a produtos do metabolismo secundario.Química - Sulfonamidas, Trimetoprim, Cloranfenicol, Isoniazida alem de outros antiviraise antiprotozoarios.Semi-sintéticos - sao antibioticos naturais, modificados pela adicao de grupamentosquimicos, tornando-os menos suscetiveis a inativacao pelos microrganismos (ampicilina,carbencilina, meticilina).• Quanto à ação: "staticos" ou "cidas"Os "cidas" podem ser "staticos" dependendo da concentracao, ou do tipo de organismo.Os "staticos" tem sua acao vinculada a resistencia do hospedeiro.• CMI e CML: 2 parametros que indicam a eficiencia da droga.A droga "cida" geralmente elimina o agente em concentracoes de 2 a 4 vezes maior quea "statica", sendo o inverso falso.• Atingir concentracoes efetivas nos tecidos e entrar em contato com o microrganismo.• Nao alterar os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro.Mecanismos de ação dos antimicrobianosVarios sao os possiveis alvos para os agentes antimicrobianos. O conhecimento dosmecanismos de acao destes agentes permite entender sua natureza e o grau de toxicidadeseletiva de cada droga.Exemplos das principais estruturas ou etapas metabólicas afetadas por antibióticos(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)1) Inibição da síntese da Parede Celular: estes agentes antimicrobianoscorrespondem aos mais seletivos, apresentando um elevado indice terapeutico.penicilinas, ampicilina e cefalosporinas: contem em sua estrutura um anel b-lactamico, queinterage com proteinas denominadas PBPs (Penicillin Binding Protein), inibindo a enzimaenvolvida na transpeptidacao, responsavel pela ligacao entre as cadeias de tetrapeptideos dopeptideoglicano. Com isso, ha o impedimento da formacao das ligacoes entre os tetrapeptideosde cadeias adjacentes de peptideoglicano, ocasionando uma perda na rigidez da paredecelular. Acredita-se tambem que tais drogas podem atuar promovendo a ativacao de enzimasautoliticas, resultando na degradacao da parede.Mecanismo de ação dos antibióticos b-lactâmicos(Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)bacitracina: Interfere com a acao do carreador lipidico que transporta os precursores daparede pela mebrana. Resulta na nao formacao das ligacoes entre o NAM e NAG.vancomicina: liga-se diretamente a porcao tetrapeptidica do peptideoglicano. E ainda adroga de escolha para linhagens resistentes de S. aureus.2) Ligação à Membrana Citoplasmática: sao agentes antimicrobianos que muitasvezes exibem menor grau de toxicidade seletiva.polimixinas: Ligam-se a membrana, entre os fosfolipideos, alterando sua permeabilidade(detergentes). Sao extremamente eficientes contra Gram negativos, pois afetam tanto amembrana citoplasmatica como a membrana externa.Ionoforos: Moleculas hidrofobicas que se imiscuem na Membrana citoplasmatica, permitindo adifusao passiva de compostos ionizados para dentro ou fora da celula.Exemplo de um antibiótico que atua como ionóforo(Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)3) Inibição da síntese de ácidos nucléicos: seletividade variavel.Novobiocina: se liga a DNA girase, afetando o desenovelamento do DNA, impedindosua replicacao.quinolonas: Inibem a DNA girase, afetando a replicacao, transcricao e reparo.Rifampicina: Ligacao a RNA polimerase DNA-dependente, bloqueando a transcricao.4) Inibição da tradução: Sao geralmente bastante seletivos. Correspondem a um dosprincipais grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a sintese proteica corresponde aprocesso altamente complexo, envolvend varias etapas e diversas moleculas e estruturas.Diferentes etapas da tradução que podem ser afetadas por agentes antimicrobianos(Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)estreptomicina e gentamicina: Liga-se a subunidade ribossomal 30S, bloqueando-a epromovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formacao do complexo de iniciacao.tetraciclina: Liga-se a subunidade ribossomal 30S (sitio A), impedindo a ligacao doaminoacil-tRNA.

cloranfenicol: Liga-se a subunidade ribossomal 50S e inibe a ligacao do tRNA e dapeptidil transferase, inibindo a elongacao.eritromicina: Liga-se a subunidade ribossomal 50S e inibe a elongacao.Exemplos de drogas que interferem com a síntese protéica(Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)5) Antagonismo metabólico: geralmente ocorre por um mecanismo deinibicaocompetitiva.Sulfas e derivados: inibicao da sintese do acido folico, pela competicao com o PABA.Trimetoprim: bloqueio da sintese do tetrahidrofolato, inibindo a dihidrofolato redutase.Similaridade estrutural entre a sulfanilamida e o PABA (importante precursor da síntese de purinas)(Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)Isoniazida: afeta o metabolismo do NAD ou piridoxal, inibe a sintese do acido micolico -"fator corda".Resistência microbianaEste tema tornou-se um motivo de preocupacao crescente entre os profissionais daarea de saude, pois a cada ano observamos o aumento de linhagens resistentes aos maisdiversos agentes antimicrobianos.Proporcao de bacterias fecais, isoladas deindividuos normais, resistentes aos diferentesantibioticos.Aumento na proporcao de linhagens de N.gonorrhoaea resistentes a penicilina.(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)A resistencia microbiana aos antimicrobianos pode ser de dois tipos:• Natural: ausencia da estrutura, ou via metabolica alvo.• Adquirida: Atraves de mutacoes espontaneas e selecao, ou por recombinacao apostransferencia de genes.Dentre os principais mecanismos de resistencia podemos citar:Impermeabilidade a droga: Muitas bacterias Gram negativas sao resistentes a penicilina G porserem impermeaveis a droga, ou por apresentarem alteracoes em proteinas de ligacao apenicilina. No caso das sulfonamidas, o microrganismo pode tambem apresentar uma menorpermeabilidade a droga.Inativacao: muitas drogas sao inativadas por enzimas codificadas pelos microrganismos. Porexemplo, a penicilinase (b-lactamase) e uma enzima que cliva o anel b-lactamico inativando adroga. Outras drogas podem ser inativadas em decorrencia de modificacoes introduzidas pelomicrorganismo, tais como a adicao de grupamentos quimicos. Assim, muitos microrganismossao capazes de promover a fosforilacao ou acetilacao de antibioticos.Modificacao de enzima ou estrutura alvo: Por exemplo, alteracoes na molecula do rRNA 23S(no caso de resistencia a eritromicina e cloranfenicol), alteracao da enzima, no caso de drogasque atuam no metabolismo, ou uso de vias metabolicas alternativas.Bombeamento para o meio: Efluxo da droga - No caso da resistencia as tetraciclinas, embacterias entericas.Processos de transferência de genes entre bactériasIntroduçãoSabemos que, embora as mutacoes sejam responsaveis pela expressao de variasnovas caracteristicas por uma celula, muitos dos fenotipos expressos pelos microrganismosprocarioticos sao decorrentes da aquisicao de novos fragmentos de DNA, por meio deprocessos de transferencia horizontal de genes. Tres processos de transferencia genetica entrebacterias sao bastante conhecidos: transformação, conjugação e transdução. Ha ainda umquarto processo, a conversão lisogênica, que envolve a transferencia de DNA de uma particulaviral para uma bacteria, sendo um evento importante na aquisicao de genes muitas vezesassociados a virulencia.Transformação - E definida como um processo de incorporacao de DNA na forma livre,geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstradoformalmente que o DNA era a molecula envolvida na hereditariedade (experimentos iniciadospor F. Griffith, 1928).Varias bacterias Gram positivas e negativas sao naturalmente transformaveis,entretanto, dentro de um genero, nem todas as especies o sao. Na natureza, o processo ocorrequando uma celula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende asofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente acerca de 15 genes, em Bacillus subtilis).

Como uma celula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporcao degenes podem ser transferidos.Inicialmente, para que o processo ocorra, e necessario que a cel. encontre-secompetente, isto e, deve apresentar sitios de superficie para a ligacao do DNA da celuladoadora e apresentar a membrana em uma condicao que permita a passagem deste DNA.Esta propriedade e, provavelmente, uma caracteristica inerente de certas linhagens e, ao queparece, envolve o mecanismo de quorum sensing. O estabelecimento da competencia e umfenomeno controlado, envolvendo a participacao de diferentes proteinas (proteina de ligacaoao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo variavel entre osmicrorganismos.Aparentemente, o numero de sitios disponiveis para a ligacao do DNA e limitado. Estacaptacao parece estar relacionada a uma pequena sequencia, de 10 a 12 pares de bases,presente no DNA exogeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presenca de uma proteina quereconhece e liga-se a uma sequencia 5’ - AAGTGGGTCA - 3’, muito comum no genoma destemicrorganismo, garantindo que somente ocorrera a captacao de DNA de especies muitosimilares.A competencia e um processo que depende de varias condicoes distintas nos diferentesmicrorganismos. Sabe-se que a fase de crescimento e as condicoes ambientais desempenhamum papel de extrema importancia no processo. Alem destes, a temperatura e a concentracaode cations tambem influenciam a eficiencia do processo.A captação do DNA tambem e diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos(G-): Nas G+ o DNA e captado como dupla helice e absorvido como fita simples, sendo umadas fitas degradadas. Nas G-, o DNA e absorvido como fita dupla, embora apenas uma dasfitas participe do processo de recombinacao. Independente do tipo celular, a ligacao do DNA acelula e mais eficiente quando esta como fita dupla.Ligação do DNA: inicialmente e reversivel, tornando-se irreversivel depois. As celulascompetententes ligam o DNA com muito mais eficiencia que celulas nao competentes (1000vezes mais). Streptococcus pneumoniae e capaz de ligar apenas cerca de 10 moleculas deDNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando sao absorvidas, como DNA de fita simples, estaspassam para cerca de 8 kb.Em Haemophilus influenzae, e necessario que o DNA tenha uma sequencia especificade 11 pb, para que haja a ligacao irreversivel e o DNA seja captado.Integração do DNA: O DNA liga-se a proteinas na superficie celular, sendo em seguidaabsorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absorcao. A medidaque o DNA e absorvido no interior da celula, este se associa a proteinas de ligacao ao DNA defita simples, protegendo-o de degradacao. A proteina RecA tambem participa deste processo,associando-se a fita e promovendo a recombinacao. Ha entao a degradacao do que resta dafita simples e formacao de um DNA hibrido, que na replicacao originara uma molecula parentale outra recombinante.Esquema dos eventos envolvidos na transformação em Streptococcus, umorganismo Gram positivo. O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este,promovendo a ativacao de varios genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases eproteina de ligacao ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela celula, enquantoa outra e degradada (6). Ao penetrar na celula a fita simples e protegida por proteinas. Casoeste DNa encontre uma regiao complementar, a proteina RecA auxiliara sua recombinacaocom o DNA endogeno (7).Conjugação - Processo de transferencia de DNA de uma bacteria para outra,envolvendo o contato entre as duas celulas (descoberta por Tatum & Lederberg, 1946). Aconjugacao esta associada a presenca de plasmideos de natureza F. Estes plasmideos contemgenes que permitem a transferencia do DNA plasmidial de uma celula para outra ou, em outraspalavras, a capacidade conjugativa. Quando a celula porta um plasmideo de natureza F edenominada F+, doadora, ou macho, enquanto celulas desprovidas de tais plasmideos saodenominadas F-, receptoras, ou femeas.A capacidade conjugativa esta associada a presenca de determinados geneslocalizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma serie de caracteristicasenvolvidas na conjugacao tais como a sintese do pilus F, responsavel pelo reconhecimento econtato entre as celulas, assim como a transferencia do DNA plasmidial.Eventualmente, os plasmideos podem ser integrados no cromossomo, sendo esteprocesso mediado por pequenas sequencias de DNA denominadas IS (insertion sequences).As celulas apresentados tais plasmideos integrados sao denominadas Hfr (do ingles High

Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmideos podem mobilizar atransferencia de genes cromossomais tambem.Exemplo de um plasmídeo do tipo FEm gram negativos, a conjugacao pode ser de dois tipos: entre celulas F+ e F-,resultando em duas celulas F+ e entre celulas Hfr e F-, resultando em uma celula Hfr e outra F-. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provavel de transferencia do DNA seja pelocirculo rolante, onde apenas uma das fitas e transferida, sendo a fita complementar sintetizadapela celula receptora. Provavelmente, o estimulo para o disparo do processo seja o contato dascelulas. Assim, a conjugacao envolve a passagem de DNA de uma celula F+ para outra F-, quetorna-se entao F+ tambem.Quando o plasmideo encontra-se incorporado ao cromosso, a conjugacao passa aenvolver a transferencia de genes cromossomais, sendo que nestes casos, a celula receptorapermanece F-, porque a regiao tra e a ultima a ser transferida, o que raramente ocorre nanatureza. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da celula Hfr para a receptora,promovendo extensas recombinacoes.(a)(b)(c)(d)Esquema dos eventos associados à conjugação entre células F+ e F-.Eventos associados a conjugacao entre umacelula Hfr e outra F-. Observe que a celula F- permanececomo receptora, uma vez que a regiao tra normalmentenao e transferida.Transdução: (Lederberg & Zinder, 1952) transferencia mediada por virus, podendo sergeneralizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passadospor fagos temperados).

Transdução generalizada: Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo tambem ocorra em outras bacterias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrencia de um ciclo litico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da celula hospedeira, gerando particulas denominadas partículas transdutoras, que correspondem ao capsideo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora nao possam ser descritas como virus, as particulas transdutoras exibem a capacidade de adsorcao a superficie de outras celulas bacterianas. A frequencia com que um determinado gene e transferido e baixa uma vez que cada particula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cel. recebem um determinado gene).

Transdução generalizada: durante um ciclo litico, pode haver a incorporacao de DNA bacteriano no capsideo viral. Este DNA podera ser transferido para outra bacteria, pois os processos de adsorcao e injecao de DNA dependem da estrutura do virus, independente do tipo de DNA contido em seu interior.

Transdução especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferencia de um genes que codificam produtos envolvidos na degradacao de galactose pelo fago l de E. Coli. A etapa inicial no processo corresponde a infeccao e lisogenizacao do fago, que ocorre em sitios especificos do genoma. Neste caso, a integracao do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilizacao de galactose. Pela acao de algum indutor (ex: UV) ha a separacao do fago do genoma (integracao reversa), que normalmente ocorre perfeitamente.

Entretanto, em alguns casos, essa separacao e defeituosa, promovendo a remocao de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na celula. Essas particulas podem ser de dois tipos: aquelas que carregam genes gal e outras que carregam genes bio. Aquelas particulas levando genes gal sao denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são incapazes de formar particulas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteina integrase). Quando estas particulas infectam novas celulas, juntamente com fagos normais (helper), pode haver a transferencia de genes gal, a partir da infeccao e lisogenizacao dos dois fagos.Transdução especializada: este processo e dependente da ocorrencia de um ciclo lisogenico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e apos um determinado periodo de tempo e de acordo com certos estimulos, este fago pode iniciar um ciclo litico. Caso a excisao do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, podera haver a transferencia de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficara incorporado ao genoma bacteriano). Este virus "defeituoso" podera transferir o DNA bacteriano para outras celulas.

Conversão lisogênica: Transferencia de genes de fagos para bacterias. A propria lisogenizacao torna a bacteria imune a outras infeccoes por este fago, mas alem disso, outros fenotipos podem ser adquiridos. O exemplo mais classico consiste na conversao de celulas atoxigenicas de Corynebacterium diphtheriae em toxigenicas, pelo fago s. Assim, a bacteria recebe um gene que codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.