Escuela de Química - revistapuce

Escuela de Química

94

3 DE MAYO-3 DE NOVIEMBRE DE 2012QUITO-ECUADORISSN 1013-89X

Pontificia UniversidadCatólica del EcuadorCentro de PublicacionesEscuela de QuímicaRevista PUCEQuito-Ecuador

RectorDr. Manuel Corrales Pascual, S.J. (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

VicerrectorIng. Pablo Iturralde Ponce (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Director General AcadémicoDr. Carlos Acurio Velasco (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Director del Centro de PublicacionesMagíster Jesús Aguinaga Zumárraga (Pontificia Universidad Católica del Ecuador,Quito-Ecuador)

Directora Escuela de Ciencias Químicas Dra. Lorena Meneses O. Ph.D. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Miembros del Comité Ejecutivo del Centro dePublicaciones (Comité Editorial):

Presidente (Editor en Jefe)Magíster Jesús Aguinaga Zumárraga (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Vocales (Comité Editorial):Dr. Hugo Reinoso Luna (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Dr. Luis María Gavilanes Del Castillo (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Secretario (Coordinador del Comité Editorial)Lcdo. Walter Jiménez Sarabia (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Miembros del Comite Editorial de la Escuela de Ciencias Químicas

Dra. Lorena Meneses (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Mtr. Fernanda Pilaquinga (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador) Mtr. Pablo Pozo (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

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ESCUELA DE QUÍMICA

SecretariaFátima Tasiguano Morales (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Autores Cristina Mena (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Fernanda Pilaquinga (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Lorena Meneses (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Pamela Carrillo (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)David Romero (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Wendy Heredia (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Alejandra Hidalgo (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Alexandra Hidalgo (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Yolanda Jibaja (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Marco Dehesa (Universidad Politécnica Salesiana, Quito-Ecuador)Migdalia Miranda (Universidad de La Habana-Cuba)Fernanda Montaño (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Pablo Pozo (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Pablo López (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)Andrea Guzmán (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Corrector de estilo y ortografíaAlfonso Sánchez (Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito-Ecuador)

Colección n.º 943 de mayo de 2012Publicación SemestralISSN. n.º 1013-89XRegistro de Derecho Autoral n.º 010645

La Revista de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador es una publicación semestral (mayoy noviembre) de su Centro de Publicaciones, que difunde trabajos académicos y científicos, es-trictamente originales en español, en la áreas de Leyes, Pedagogía, Ingeniería, Economía, Bio-logía, Química, Historia, Geografía, Antropología, Sociología, Filosofía, Teología, Co mu ni-cación, Lingüística, Literatura, Medicina, Administración, Arquitectura, Gestión Social, Psico-logía y Diseño, y es arbitrada por especialistas de indiscutible valor, cuyos nombres se mantie-nen en absoluta confidencialidad, recibe trabajos todo el año; el propósito de la Revista PUCEes difundir conocimientos, intercambiar experiencias e incentivar la producción del pensa-miento especializado. El contenido de esta revista está dirigido a docentes, investigadores, es-tudiantes universitarios y público en general.

Los artículos son de responsabilidad exclusiva de sus autoresLos derechos de autor son exclusivos de la PUCESe prohíbe la reimpresión parcial o total con cualquier finalidad

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR

Editorial: (Punto de Venta)Centro de Publicaciones PUCEAv. 12 de Octubre y RoblesApartado n.º 17-01-2184Telf.: 593-02-2991700 2991 700 (TRONCAL). Extensiones: 1013, 1014, 1711, 1122Telf.: 593-02-2991711 (directo)(se aceptan canjes)[email protected].

Impresión:PPL ImpresoresEstados Unidos N16-56 [email protected]

IV

ESCUELA DE QUÍMICA

La Pontificia Universidad Cató-lica del Ecuador, a través de su Centrode Publicaciones, ha editado su colec-ción “Revista Académica de la PUCE”con un total de 93 números, que demanera ininterrumpida se han publi-cado a partir de febrero del año 1972hasta la presente fecha. Se ha llegadocon esta revista al número 94.

Esta gestión ha sido apoyadapor nuestro Rector Dr. Manuel Corra-les Pascual, S.J., ilustre maestro y direc-tivo universitario y ser humanoexcepcional; por la Dra. Lorena Mene-ses Olmedo, Directora de la Escuela deQuímica en la Facultad de CienciasExactas y Naturales de la PUCE, comosu personal docente y administrativo;por los miembros del Comité de Pu-blicaciones: Dr. Hugo Reinoso Luna,Presidente del Consejo Superior de laPUCE; y Dr. Luis María Gavilanes delCastillo; y el personal del Centro dePublicaciones.

El Contenido científico de estarevista, contempla los siguientes te -mas: Aislamiento y caracterización delaceite esencial de albahaca, Ocimumbasilicum L.; Caracterización del meca-nismo de la reacción entre n-Hexeno ymetanal a través de los conceptos defuerza de reacción, cons tante de fuer -za y flujo electrónico de reacción; De -

sa rrollo y validación de un métodopara la determinación de hidrocarbu-ros totales de petróleo (TPH’s) me-diante espectrofotometría de in fra- rrojos con transformadas de Fourier, ensuelos fortificados; Determinación,cuan tificación y comparación de laconcentración de vitamina C en na-ranja (Citrus aurantium), limón (Citrusaurantifolia) y mandarina (Citrus reticu-lata) por HPLC; Formulación de un fi-tofármaco a partir de las hojas de Oco-tea quixos (LAM.) (Kosterm. Ish pingo);Desarrollo y validación de un métodode análisis para compuestos fenólicosen aguas superficiales, residuales y deconsumo, por cromatografía líquida dealta eficiencia; Estudio comparativo dela estructura química del Anetol extra-ído del anís estrellado (Illiciun verum)con el producto sintético y computa-cional; Perfil lipídico y contenido deácidos grasos trans en productos ecua-torianos de mayor consumo.

Los presentes contenidos sonuna evidencia clara y objetiva del in-cuestionable valor científico puesto aconsideración del mundo académicoy del mundo global del conocimientopor parte de la Escuela de Química dela PUCE.

A propósito de los aportes se-ñalados y escritos con profundidad y

V


Editorial

que son también de actualidad, ellos,dejan una gran inyección para nuevasinvestigaciones científicas en esta áreatan importante del conocimientocomo es la Química, habida cuentaque del estudio de ella, depende eldesarrollo de los campos de la indus-tria, la farmacéutica, la biología, la agri-cultura, el ambiente, etc.

Expresamos nuestro reconoci-miento a los autores que han colabo-rado con estos artículos, a la Escuelade Química y la Facultad de CienciasExactas y Naturales, que permanente-mente contribuyen en beneficio de laCiencia.

A nuestros colaboradores, ami-gos y colegas responsables de la Redde Editoriales Universitarias, de la Aso-ciación de Universidades Jesuitas deAmérica Latina (AUSJAL), de EULAC yde REUPDE, lectores permanentes ylectores en general, nuestra gratitudpor sus comentarios y opiniones ele-vadas en relación con esta revista ypor encender permanentemente y dedistintas formas nuestro ánimo e inte-rés para continuar adelante, cada vezcon mayor entusiasmo.

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ESCUELA DE QUÍMICA

Jesús Aguinaga ZumárragaDirector

Química (del árabe kēme, quesignifica tierra) es la ciencia que estu-dia tanto la composición, estructura ypropiedades de la materia, como loscambios que esta experimenta du-rante las reacciones químicas y su re-lación con la energía.

La química es una ciencia bá-sica, debido a su ubicuidad en lasciencias naturales. La química es degran importancia en muchos camposdel conocimiento como la medicina,la biología, la ingeniería, la astronomía,etc. Desde todo punto de vista, el uni-verso está formado de sustancias quí-micas y todos los procesos que en élse llevan a cabo son producto de re-acciones químicas. Todo lo que nosrodea es química: nuestra respiración,lo que nos alimenta, lo que nos abriga,el material del cual está fabricada estapublicación.

El estudio de la química es detal importancia en el desarrollo de lahumanidad, que creemos es nuestrodeber como docentes de la PUCE, y

de manera específica de la Escuela deCiencias Químicas, brindar un aportea la actividad científica, docente y pro-fesional, a través de la difusión de losresultados de trabajos de investiga-ción realizados con esmero y dedica-ción, basados en el método científicoen las distintas ramas de la química,como son la química de alimentos, labioquímica, la fitoquímica, la químicaambiental, la química analítica y la quí-mica computacional.

En nombre de la Escuela deCiencias Químicas, deseo dejar cons-tancia de mi agradecimiento a las au-toridades de la PUCE por su apoyodecidido para continuar con la publi-cación de la Revista Académica PUCE;a los docentes colaboradores de estaobra, sin cuyo invaluable apoyo seríadifícil continuar y de manera especialal equipo editorial de la revista. Desea -mos que este aporte sea una oportu-nidad para fomentar la investiga- ción,la producción científica y el desa rrollode la química en nuestro país.

VII


Presentación

Dra. Lorena Meneses OlmedoDirectora de la Escuela de Ciencias Químicas

CONTENIDO

Revista PUCE, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, ISSN 1013-89X

Número 94, 3 de mayo - 3 de novimbre de 2012

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE ALBAHACA, Ocimum basilicum L. 1

Cristina Mena P.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BASIL’S ESSENTIAL OIL, Ocimum basilicum L. 1

RESUMEN 3

INTRODUCCIÓN 5

I. MATERIALES Y MÉTODOS 6

II. RESULTADOS 8

III. DISCUSIÓN 11

IV. CONCLUSIONES 12

LITERATURA CITADA 14

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS PARA COMPUESTOS FENÓLICOS EN AGUAS SUPERFICIALES, RESIDUALES Y DE CONSUMO, POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA 17

Ana Alejandra Hidalgo A. • Alexandra P. Hidalgo J.

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN ANALYTI METHOD FOR PHENOLIC COMPOUNDS IN SURFACE WATER, WASTEWATER AND DRINKING WATER BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY 17

RESUMEN 19

INTRODUCCIÓN 22


IX


II. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 28

III. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 32


TABLAS 35

FIGURAS 39

CARACTERIZACIÓN DEL MECANISMO DE LA REACCIÓN ENTRE N-HExENO Y METANAL A TRAVÉS DE LOS CONCEPTOS DE FUERZA DE REACCIÓN, CONSTANTE DE FUERZA Y FLUjO ELECTRÓNICO DE REACCIÓN 43

Pamela Carrillo S. • Lorena Meneses O.

MECHANISM CHARACTERIZATION OF THE REACTION BETWEEN N-HExENE AND METHANAL THROUGH REACTION FORCE, REACTION FORCE CONSTANT AND REACTION ELECTRONIC FLUx CONCEPTS 43

RESUMEN 45

INTRODUCCIÓN 46

I. OBjETIVOS 48

II. MARCO TEÓRICO 48

III. MÉTODOS Y DETALLES COMPUTACIONALES 50

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50

V. CONCLUSIÓN 55


DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETRÓLEO (TPH’S) MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA DE INFRARROjOS CON TRANSFORMADAS DE FOURIER,

X

ESCUELA DE QUÍMICA

EN SUELOS FORTIFICADOS 59

David Romero E.• Wendy Heredia R.

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A METHOD FOR THE DETERMINATION OF TOTAL PETROLEUM HYDROCARBONS (TPH’S) BY INFRARED SPECTROPHOTOMETRY WITH FOURIER TRANSFORMS IN FORTIFIED SOILS 61

RESUMEN 61

INTRODUCCIÓN 63


II. RESULTADOS 68

III. DISCUSIÓN 71

IV. CONCLUSIONES 72


DETERMINACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C EN NARANjA (Citrus aurantium), LIMÓN (Citrus aurantifolia) Y MANDARINA (Citrus reticulata) POR HPLCFernanda Montaño A. • Pablo Pozo P. 77

DETERMINATION, QUANTIFICATION AND COMPARISON OF THE CONCENTRATION THE VITAMIN C IN ORANGE (Citrus aurantium), LEMON (Citrus aurantifolia) AND TANGERINE (Citrus reticulata) BY HPLC 77

RESUMEN 79

INTRODUCCIÓN 80

I. METODOLOGÍA 81

II. RESULTADOS 83

III. DISCUSIÓN 87

IV. CONCLUSIONES 88


XI


FORMULACIÓN DE UN FITOFÁRMACO A PARTIR DE LAS HOjAS DE Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. (ISHPINGO) 93

Yolanda Jibaja A.• Marco Dehesa • Migdalia Miranda

FORMULATION OF A PHYTOMEDICINE FROM LEAVES OF Ocotea quixos (Lam.)Kosterm. (ISHPINGO) 93

RESUMEN 95

INTRODUCCIÓN 96

I. OBjETIVOS 97

II. MATERIALES Y MÉTODOS 98

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 100

IV. CONCLUSIONES 109


ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ESTRUCTURA QUÍMICA DEL ANETOL ExTRAÍDO DEL ANÍS ESTRELLADO (Illicium verum) CON EL PRODUCTO SINTÉTICO Y COMPUTACIONAL 113

María Fernanda Pilaquinga • Lorena Meneses

COMPARATIVE STUDY OF THE CHEMICAL STRUCTURE OF ANETHOLE ISOLATED FROM STAR ANISE (Illicium verum) WITH THE SYNTHETIC AND COMPUTATIONAL PRODUCT 113

RESUMEN 115

INTRODUCCIÓN 116

I. OBjETIVO 117

II. MATERIALES Y MÉTODOS 118

III. RESULTADOS 120

IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 121

V. CONCLUSIONES 123


XII

ESCUELA DE QUÍMICA

PERFIL LIPÍDICO Y CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS TRANS EN PRODUCTOS ECUATORIANOS DE MAYOR CONSUMO 125

Pablo López Proaño • Pablo Pozo Pantoja • Andrea Guzmán

LIPID PROFILE AND CONTENT IN TRANS FATTY ACID OF GREATER CONSUMERPRODUCTS ECUADORIANS 125

RESUMEN 127

INTRODUCCIÓN 129

I. MUESTREO 131

II. METODOLOGÍA DE ANÁLISIS 132

III. RESULTADOS 133

IV. DISCUSIÓN 140

V. CONCLUSIONES 142


XIII


AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE

ESENCIAL DE ALBAHACA, Ocimum basilicum L.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION

OF BASIL’S ESSENTIAL OIL, Ocimum basilicum L.

CRISTINA MENA P.

Recibido 26 de marzo de 2012Aceptado 9 de abril de 2012

RESUMEN

En esta investigación se caracte-rizó químicamente el aceite esencial deOcimum basilicum L., y se determinómediante la técnica de Bauer y Kirby laactividad antimicrobiana contra cepasde Escherichia coli, Klebsiella pneumo-niae, Salmonella tiphy, Staphylococcusaureus y Candida albicans.

El aceite esencial se extrajo me-diante destilación por arrastre de vapor,obteniéndose un rendimiento del 1.39%. Se determinaron las características fí-sico-químicas y correspondieron conlas cuales se reportan para esta especie.El análisis químico y la identificación se

realizaron por cromatografía de gasesacoplada a un espectrómetro de masas(CG-EM). El componente mayoritario deOcimum basilicum L., fue el eugenol(59.87%), seguido de cariofileno(12.03%), eucaliptol (4.40%), linalol(2.46%), b elemeno (3.69%), a cariofi-leno (2.21%), además se realizó el tami-zaje fitoquímico donde se evidenció lapresencia de alcaloides, flavonoides, re-sinas, azúcares reductores, fenoles y ta-ninos, lactonas, triterpenos y esteroides.

Los resultados de las pruebasantimicrobianas mostraron que elaceite esencial de albahaca posee unagran actividad inhibitoria contra lascepas gram negativas de Klebsiella

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE

ESENCIAL DE ALBAHACA, Ocimum basilicum L.

Cristina Mena P.1

Palabras Claves: Albahaca, Ocimum basilicum L. aceite esencial, CG-EMKey words: Basil, Ocimum basilicum L. essential oil, GC-MS

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Quito, Ecuador,([email protected]).

3

Revista PUCE. ISSN 1013-89x. Núm. 943 mayo-3 nov 2012, Mena. pp. 1-16

4

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE ALBAHACA, O c i m u m b a s i l i c u m L .

pneumoniae, Salmonella tiphy y menorefectividad sobre organismos gram po-sitivos como Staphylococcus aureus.Para Candida albicans presentó un granpoder antimicótico.

En este estudio se demostró queen el aceite esencial de Ocimum basili-cum L., podrían encontrarse principiosactivos útiles como alternativas tera-péuticas futuras.

ABSTRACT

In this investigation it was char-acterized the essential oil of Ocimumbasilicum chemically L. and it was de-termined by means of the technique ofBauer and Kirby the activity antimicro-biana against stumps of Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae, Salmonella tiphy,Staphylococcus aureus and Candida al-bicans.

The essential oil was extractedby means of distillation by haulage ofvapor, being obtained a yield of 1.39%.The physical characteristics were deter-mined-chemical and they correspon -ded with those that are reported for this

species. The chemical analysis and theidentification were carried out for cro-matografía of gases coupled to a spec-trometer of masses (CG-EM). Thema yority component of Ocimum basi -licum L was the eugenol (59.87%), fol-lowed by cariofileno (12.03%), eu- ca liptol (4.40%), linalol (2.46%), b ele-meno (3.69%) and a cariofileno (2.21%),was also carried out the tamizaje fito-químico where it was evidenced thepresence of alkaloids, flavonoides, resins,sugars reducers, fenoles and tannins,lactonas, triterpenos and steroids.

The antimicrobial test resultsshowed that the essential oil of basil hasa high inhibitory activity against gramnegative strains of Klebsiella pneumo-niae, Salmonella tiphy, and less effectiveon gram positive organisms such asStaphylococcus aureus. For Candida albi-cans antifungal presented a greatpower.

In this study it was demostratedthat in the essential oil of Ocimumbasilicum L. could be useful active prin-ciples as future therapeutic alternatives.

INTRODUCCIÓN

5


El Ecuador es un país con unageografía muy particular, que determinala existencia de una gran variedad depisos climáticos, por lo cual se encuen-tra aproximadamente el 10% de todaslas especies de plantas del mundo. Esposeedor además de una gran riquezaancestral en la utilización de plantascomo medicamentos. Pese a esto, laflora medicinal ecuatoriana ha sido muypoco estudiada en el país ya que noexisten investigaciones dirigidas a eva-luar en forma sistemática el potencialbiológico, principios activos y toxicidadque permitirían su real validación e in-corporación de estos recursos fitotera-péuticos a la farmacopea nacional,(Naranjo & Escaleras, 1995).

Por esta razón, las plantas re-quieren un redescubrimiento científico,siendo imperativo realizar estudios con-ducentes a un mejor aprovechamiento,conservación y búsqueda de substan-cias con acción terapéutica, (Harborne& Baxter, 1993).

Las especies del género Oci-mum, conocidas comúnmente comoalbahacas son plantas aromáticas quetienen importancia económica y cuyosaceites esenciales son usados en la in-dustria de cosméticos, alimentos y pro-ductos farmacéuticos, (Wagner, 1997).

Además, a los aceites esencialespresentes en miembros de la familia La-miaceae se les atribuyen propiedadesantigripales, antipiréticas, antiespasmó-dicas, antidiarreicas, antifúngicas y anti-bacterianas, entre otras, (Janssen &Baerheim, 1987).

Varios investigadores han repor-tado la actividad inhibitoria de los aceitesesenciales provenientes de Ocimum ba-silicum sobre bacterias mesófilas, levadu-ras y hongos filamentosos; sin embargo,no existen los reportes en los cuales sedetermina el poder inhibitorio de losaceites esenciales de las especies del gé-nero Ocimum, contra bacterias que hangenerado mecanismos de resistencia ala terapia antibiótica convencional.

Es por ello que en este estudio serealizó la extracción y caracterización delaceite esencial de Ocimum basilicum L.,a través de la determinación de sus pro-piedades físicas como olor, color, densi-dad relativa, índice de refracción yresiduo de vaporación. El análisis de lacomposición química se realizó en uncromatógrafo de gases acoplado a unespectrómetro de masas.

La actividad inhibitoria del acei -te esencial se analizó mediante la me-

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

La albahaca fue colectada en laReserva Forestal “JATUN SACHA” ubicadaen Misahuallí, Tena, Ecuador, bosque hú-medo tropical (1° 04’ S; 77° 36’W), altitud450 msnm. Luego de la recolección seexaminaron y separaron manualmentelas partes deterioradas, manchadas ycon señales de ataques por insectos. Acontinuación se lavó el material vegetalcon una solución de hipoclorito desodio al 1 % para reducir la carga bacte-riana y se dio paso al proceso de secadoa temperatura ambiente por 5 días. Laidentificación taxonómica se realizó enel Herbario de la PUCE.

valoración de Ocimum basilicum L.

Para el estudio macromorfoló-gico de las hojas se tomó un tamaño demuestra (n = 50) y con la ayuda de unaregla milimetrada se estableció el

ancho y largo de las mismas para luegorealizar un histograma de cada paráme-tro. Para su evaluación fisicoquímica sedeterminaron cenizas totales, solublesen agua e insolubles en ácido.

estudio Químico Cualitativo

Se realizó tamizaje fitoquímicoen extractos acuosos, etéreos y alcohó-licos de la planta a los cuales mediantediferentes reacciones de coloración evi-denciaron la presencia o ausencia devarios constituyentes como: alcaloides,lactonas y coumarinas, triterpenos, ca-tequinas, resinas, saponinas, etc.

extracción y Caracterización delaceite esencial

El aceite esencial se obtuvo me-diante destilación por arrastre de vapor,para lo cual se troceó la planta y se trans-firió a un balón de destilación de 2 L a

6


dición de los halos de inhibición frentea cinco microorganismos multirresis-tentes como Escherichia coli, Klebsiellapneumoniae, Salmonella tiphy, Staphylo-coccus aureus y Candida albicans, com-parados con los controles gentamicinay clotrimazol.

La investigación se comple-menta con el tamizaje fitoquímico quemuestra los metabolitos secundariospresentes en la planta.

7


través del cual se hizo pasar vapor deagua por el lapso de 2 horas. Los voláti-les condensados se recibieron sobreagua saturada con cloruro de sodio. Fi-nalizada la destilación se colocó el des-tilado en un embudo de separación, seañadió una porción de éter dietílico, seagitó y dejó decantar la fase acuosa.

El extracto etéreo se colocó enun frasco ámbar y se añadieron 0.5 g desulfato de sodio anhidro. Se evaporó elsolvente cuidadosamente a tempera-tura ambiente.

Para caracterizar el aceite esen-cial se realizaron una serie de ensayos ocontroles: caracteres organolépticos yespecificaciones de tipo físico y quí-mico como densidad relativa, índice derefracción, residuo de vaporación.

Para comprobar las propiedadesbiológicas del aceite esencial de alba-haca, se llevó una muestra al Centro deInvestigación y Valoración de la Biodi-versidad CIVABI y se aplicó el métododescrito por Bauer y Kirby, en el cual seestableció la actividad antibacteriana,mediante la utilización de 5 microorga-nismos seleccionados: Salmonella typhi,Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, Candida albicanscon el empleo de la técnica de difusiónen agar Muller Hinton en diferentesconcentraciones de aceite: 10, 20 y 30µL, con la utilización del control genta-micina para las bacterias y clotrimazolpara las levaduras y la medición de loshalos de inhibición luego de un perí-odo de incubación de 24 horas.

Los componentes químicos delaceite esencial de albahaca obtenido,fueron separados e identificados me-diante un cromatógrafo de gases Varian3900 acoplado a un espectrómetro demasas Varian Saturn 2100D GC/MS,equipado con una columna capilar desílica fundida de 30 metros de largo y0.25 mm., de diámetro y helio comogas de arrastre (1.2 mL min-1). La ener-gía de los electrones ionizantes fue de70 eV. Se empleó un programa de tem-peratura en el equipo, iniciándose elproceso a 50°C durante 2 minutos,luego se incrementó la temperatura arazón de 20°C/min hasta 100°C y de in-mediato hasta 220°C a razón de5°C/min. La temperatura del inyector semantuvo a 250°C. La relación de repartofue de 1:200. Para la identificación de loscomponentes del aceite se usó la basede datos Nist 2001.

valoración de Ocimum basilicum L.

El material vegetal constituidopor las partes aéreas de la albahaca esde color verde, olor intenso y sabor pi-cante. Los tallos son cuadrangulares ypresentan hojas pecioladas, opuestas,de forma aovado-elípticas, de 5.1 cm.,de largo y 2.4 cm., de ancho y algo ve-llosas en los nervios, ápice agudo y labase redondeada. Las flores en largos ra-milletes terminales son de color blanco.

En la Tabla 1 se muestran los re-sultados de los parámetros fisicoquími-cos conocidos en la especie vegetalestudiada.

Tabla 1: resultados de parámetros fisicoquímicos de Ocimum basilicum L.

eNsayo PorCeNTaJe

Cenizas totales 7.71Cenizas solubles en agua 3.70Cenizas insolubles en ácido clorhídrico 0.84

estudio Químico Cualitativo

Los resultados del tamizaje fito-químico realizados en los extractos eté-reo, alcohólico y acuoso de la planta dealbahaca, se presentan en la Tabla 2.


8

II RESULTADOS

Tabla 2: resultado del tamizaje fitoquímico de Ocimum basilicum L., en diferentes extractos

MeTabolITo eXTraCToetéreo alcohólico acuoso

Aceites y grasas -Alcaloides + + +Lactonas y coumarinas + +Triterpenos y esteroides + +Catequinas -Saponinas - -Resinas +Azúcares reductores + +Fenoles y taninos +Aminoácidos -Flavonoides + +Cardenolidos -Antocianidinas -Quinonas -Taninos +Mucílagos -

(+) presencia, ( - ) ausencia

No aplica enel extracto

extracción y Caracterización del aceite esencial

Tabla 3: Características físico-químicas de Ocimum basilicum L.

Característica resultados

Rendimiento 1.39 %Olor Dulce, agradableColor TransparenteDensidad relativa 0.98Índice de refracción 1.52Residuo de evaporación 21%

Tabla 4: actividad antimicrobiana del aceite esencial de Ocimum basilicum L.

Concentración de Microorganismo aceite esencial antibiótico

10 ml 20 ml 30 ml 10 ml

Halos de inhibición (mm)

Salmonella typhi 12 15 18 13 *Staphylococcus aureus 10 24 39 17 *Escherichia coli 10 15 21 14 *Klebsiella pneumoniae 14 22 33 14 *Candida albicans 12 30 41 15**

* Gentamicina** Clotrimazol


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análisis e Identificación Química delaceite esencial

En la Tabla 5 se indican los com-puestos identificados, con señalamiento

de los 6 componentes mayoritarios: eu-genol (59.87 %), cariofileno (12.03 %),eucaliptol (4.40 %), linalol (2.46 %), b ele-meno (3.69%) y a cariofileno (2.21 %).

Tabla 5: Compuestos identificados en aceite esencial de albahaca, caracterizado por cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas

NúmeroTiempo de

CompuestoÁrea relativa

retención (min) %

1 7.138 a pineno 1.9202 7.233 eucaliptol * 4.3953 8.259 linalol * 2.4604 9.631 Benzofurano 0.3525 9.873 Borneol 0.1126 10.277 a terpineol 0.8427 13.324 Elemeno 0.7738 13.752 Eugenol * 59.8689 14.601 b elemeno * 3.694

10 15.415 Cariofileno * 12.03011 16.246 a cariofileno * 2.21112 16.356 Aromandreno 0.58313 16.819 b cubebeno 0.38614 17.031 b seileno 0.96615 17.450 Eremofileno 0.67316 19.213 óxido de cariofileno 0.460

* Componentes mayoritarios

10


En la Figura 1 se observa el espectro demasas de Eugenol que es el compo-

nente mayoritario de dicho aceite.

Figura 1: espectro de masas de eugenol componente mayoritario del aceite esencial

de albahaca

III DISCUSIÓN

11


El contenido de cenizas totalesen Ocimum basilicum L., fue de 7.71%,valor que se encuentra dentro de los ran-gos establecidos, por Sánchez en el es-tudio farmacognóstico de Ocimumbasilicum L., realizado en Habana, Cubaen el 2000, y de este valor el 50 % son ce-nizas solubles en agua, lo cual indica quese trata de metales de baja toxicidad.

Además, el porcentaje de ceni-zas insolubles en ácido fue de 0.84 %, locual señala que la presencia de sílice, es-pecialmente de arena y tierra silícea esbaja y se encuentra dentro del rangoestablecido para especies vegetales.(Miranda & Cuellar, 2001)

Los bajos valores obtenidos enla determinación de cenizas totales nospermitieron concluir que la albahaca re-

colectada para el análisis no estuvo ex-puesta a productos químicos ni conta-minada con metales pesados.

IV CONCLUSIONES

12


El screening fitoquímico eviden-ció la presencia de alcaloides, lactonasy coumarinas, triterpenos y esteroides,fenoles y taninos, resinas, azúcares re-ductores y flavonoides. Los taninos tie-nen la propiedad de precipitar lasproteínas, por lo cual presentan acciónantimicrobiana e informa que para laespecie Ocimum basilicum L., el compo-nente químico mayoritario son los tani-nos. (Fuentes, 1997)

El porcentaje de rendimientodel aceite esencial de albahaca fue de1.39%, después de 2 horas de destila-ción, con el empleo de la planta secatroceada. Este valor se asemeja al obte-nido mediante hidrodestilación, (Muri-llo & Viña, 1999).

El aceite esencial de albahaca a lamisma concentración del antibióticoGentamicina produjo halos de inhibiciónde tamaños muy parecidos en las cepasbacterianas gram negativas Klebsiellapneumoniae y Salmonella typhi, mientrasque con bacterias gram positivas comoStaphylococcus aureus los halos de inhi-bición fueron de menor tamaño.

Estos resultados avalan lo repor-tado por Acosta-Gonzales en su investi-gación sobre la composición química delos aceites esenciales de Ocimum basili-cum L, Ocimum gratissimum L y Ocimumtenuiflorum L y su efecto antimicrobianosobre bacterias multirresistentes de ori-gen nosocomial, (Jawetz, 2005).

También se obtuvo una buenaactividad inhibitoria contra Candida al-bicans, al comparar los halos de inhibi-ción del aceite esencial con los delantimicótico estándar clotrimazol.

El análisis por cromatografía degases acoplada a espectrometría demasas, permitió conocer la composi-ción química y la abundancia relativa delos principales componentes que con-forman el aceite esencial de albahaca.Estos resultados concuerdan con los ci-tados en la investigación de extraccióndel aceite esencial de albahaca me-diante dióxido de carbono supercrítico,donde el eugenol es el compuesto quí-mico más abundante. (Romero, 2000)

13


El rendimiento del aceite esen-cial de albahaca obtenido mediantedestilación por arrastre de vapor fue de1.39 % lo cual indica que es un métodoeficiente y económico para extracciónde aceites esenciales, frente al rendi-miento obtenido por fluidos supercríti-cos con un valor de 1.89 %, diferenciaque no es muy significativa si se tomaen cuenta, que este último es un mé-todo de mayor complejidad y costo.

Los metabolitos secundarios en-contrados en los extractos etéreo,acuoso y alcohólico como alcaloides,triterpenos y esteroides, resinas, azúca-res reductores, fenoles y taninos, lacto-nas y flavonoides tienen un gran valormedicinal.

El tamizaje fitoquímico mostróuna marcada presencia de taninos locual justifica que a la albahaca se le atri-buyan propiedades antibacterianas.

Se demostró que el aceite esen-cial de albahaca posee principios activosimportantes que pueden ser alternati-vas terapéuticas efectivas contra las in-fecciones producidas por microor ga-nismos resistentes a los antibióticos.Razón por la cual sería interesante inten-sificar las investigaciones para elaborarfitofármacos a partir de este aceite.

Mediante al análisis cromatográ-fico y de espectrometría de masas delaceite esencial de albahaca se identifi-caron 16 compuestos químicos, dondeel eucaliptol, linalol, eugenol, cariofi-leno, a cariofileno y b elemeno fueronlos componentes mayoritarios.

Se encontraron en menor por-centaje el a pineno (1.920%), b seileno(0.966%), a terpineol (0.842%), eremofi-leno (0.673%), aromandreno (0.583%),óxido de cariofileno (0.460%), b cube-beno (0.386%), benzofurano (0.352 %) yborneol (0.112%).

El aceite esencial de albahacamostró buena actividad inhibitoria,equiparable al antibiótico gentamicina,sobre las cepas bacterianas gram nega-tivas Klebsiella pneumoniae (98%) y Sal-monella typhi (93%), probablementedebido a que en su constitución estápresente el eugenol que es un com-puesto fenólico al cual se le atribuye ac-ción antibacteriana. Frente a gérmenesgram positivos como Staphylococcusaureus se obtuvo una actividad inbihi-toria moderada (62%).

Además se obtuvo una buenaactividad inhibitoria (80%) para Candidaalbicans respecto al antimicótico clotri-mazol.

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DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS PARA

COMPUESTOS FENÓLICOS ENAGUAS SUPERFICIALES,

RESIDUALES Y DE CONSUMO, POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

DE ALTA EFICIENCIA

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD FOR PHENOLIC

COMPOUNDS IN SURFACE WATER, WASTEWATERAND DRINKING WATER BY HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Ana Alejandra Hidalgo A.Alexandra P. Hidalgo J.


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RESUMEN

El fenol y sus derivados soncompuestos químicos orgánicos, deamplia utilización en la industria, lo cualconduce a una alta probabilidad de ex-posición a ellos ya sea por inhalación,ingestión o contacto con la piel. Lasprincipales fuentes de contaminacióncon fenoles son las aguas residuales,desechos industriales, agua potable

contaminada, ambientes de trabajocontaminados, entre otros.

Se desarrolló un método quesea confiable técnicamente, para elanálisis de compuestos fenólicos enaguas superficiales, residuales y de con-sumo por Cromatografía Líquida deAlta Eficiencia (CLAE), mediante la utili-zación de extracción en fase sólida (EFS)para la preparación, extracción y con-

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS PARA

COMPUESTOS FENÓLICOS ENAGUAS SUPERFICIALES,

RESIDUALES Y DE CONSUMO, POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

DE ALTA EFICIENCIA

Ana Alejandra Hidalgo A.1, Alexandra P. Hidalgo J.1

Palabras Claves: Fenoles, Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia, Extrac-ción en Fase Sólida, agua

Key words: Phenols, High Performance Liquid Chromatography, Solid PhaseExtraction, water

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, CESAQ, Quito,Ecuador ([email protected]).

Revista PUCE. ISSN 1013-89x. Núm. 943 mayo-3 nov 2012, Hidalgo & Hidalgo. pp. 17-42

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS PARA COMPUESTOS FENÓLICOS EN AGUAS SUPERFICIALES,RESIDUALES Y DE CONSUMO,POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

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centración de muestras. Este métodofue validado y aplicado a muestras rea-les de las matrices mencionadas y final-mente comparado con el métodoestándar SM 5530 Fenoles (Totales)(Gidding, 1973). Esto permitió obtenerun método de análisis que pueda serutilizado para evaluar el grado de con-taminación por fenoles de las diferentesfuentes de agua del Distrito Metropoli-tano de Quito (superficiales, potables,embotelladas y residuales).

El desarrollo del método con-templó la prueba de las condicionesóptimas de EFS: pH, cantidad de mues-tra y eluyente. Se optimizaron las con-diciones cromatográficas para CLAE enuna columna monolítica de fase reversa(RP-C8), al probar las fases móviles (me-tanol, acetonitrilo), pH, flujos, gradientey cuantificación con un detector UV-VIS.

Se evaluaron estadísticamentela exactitud, selectividad, sensibilidad yeficacia del método mediante su valida-ción con estándares, material de refe-rencia certificado y fortificación demuestras de las tres matrices mencio-nadas, encontrándose coeficientes devariación para la precisión de repetibili-dad y reproducibilidad menores al 5%,una recuperación de Material de Refe-rencia Certificado entre 94 y 100%.

Como resultado del desarrollo yla validación, se obtuvo un métodopara el análisis de los siguientes diez fe-noles en el rango de 0.001 a 0.5 mg/Lpara cada uno: fenol; 4-nitrofenol; 2-clo-rofenol; 2-nitrofenol; 2,4-dinitrofenol;2,4-diclorofenol; 4-cloro-3-metilfenol;4,6-dicloro-2-metilfenol; 2,4,6-triclorofe-nol y pentaclorofenol.

El método desarrollado y vali-dado se comparó con el método están-dar SM 5530 por espectrofotometríaultravioleta-visible; se encontró unamejor recuperación de material de re-ferencia al usar el método propuesto,además de tener ventajas como dismi-nución de solventes tóxicos, menorcantidad de muestra y posibilidad decuantificación de fenoles individuales.

El método analítico desarrolladose aplicó posteriormente a un estudiode cuantificación de fenoles en el aguadel Río Papallacta, agua potable de laPlanta de Bellavista, agua embotelladade diferentes marcas y agua residual decuatro industrias locales del Distrito Me-tropolitano de Quito. El propósito delestudio fue evaluar la calidad del re-curso agua en la zona, con relación a losfenoles y a la vez incentivar a la preven-ción de la contaminación.

Los resultados obtenidos del


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análisis de fenoles muestran que noexiste contaminación por dichos com-puestos en las muestras tomadas delRío Papallacta, del agua potable de laPlanta Bellavista y del agua embote-llada. En cuanto a las aguas residualesse observa contaminación por fenolesen las muestras analizadas de la indus-tria hidrocarburífera.

ABSTRACT

Phenol and phenolic com-pounds are organic chemicals widelyused in the industry, this reason leadsto a high probability of exposure for hu-mans either by inhalation, ingestion orskin contact. The main sources of pollu-tion with phenols are sewage, industrialwastes, contaminated drinking water,and contaminated work environments,among others.

In this work a method for theanalysis of phenolic compounds in sur-face water, wastewater and drinkingwater by High Performance LiquidChromatography (HPLC), is developed.Solid Phase Extraction (SPE) is used forpreparation, extraction and concentra-tion of samples. The method is vali-dated, applied to real samples of thementioned matrices, and finally com-pared to the SM 5530 Phenols. (Total)(Gidding, 1973)

The development of the test methodprovides the optimal conditions for SPE:pH, amount of sample and eluent. Thechromatographic conditions for HPLCwere optimized in a monolithic re-versed phase column (RP-C8). The fol-lowing variables were tested: mobilephase (methanol, acetonitrile), pH, flow,gradient and detection with a UV-VISdetector.

The accuracy, selectivity, sensitivity andefficiency of the method were statisti-cally evaluated by the validation. Forthis evaluation we used standards, cer-tified reference material and sample for-tification of the three mentionedmatrices.

As a result yields a method for theanalysis of the following ten phenols inthe range of 0.001 to 0.5 mg/L for eachphenol: 4-nitrophenol, 2-chlorophenol,2-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol,2,4-dichlorophenol, 4-chloro-3-methylphenol, 4,6-dichloro-2-methylphenol, 2,4,6-trichlorophenoland pentachlorophenol.

The developed and validatedmethod was compared with SM 5530using ultraviolet-visible spectrometry,reaching a better recovery of referencematerial using the proposed method. Inaddition the following advantages were


observed in developed method: reduc-tion of used toxic solvents, minimalsample volume required, and the pos-sibility of identifying individual phenols.

The validated method was ap-plied to the quantification of phenols insurface waters of the Papallacta River,drinking water from the treatmentplant Bellavista, and wastewater formfour local industries. The purpose was

to evaluate the water contaminationwith these contaminants in the area,and encourage the prevention of pol-lution by phenols.

The results obtained show thatthe samples analyzed from surfacewater, drinking water and bottle water;doesn’t present phenolic compounds.The wastewater from hydrocarbon in-dustry presents phenols in a high range.

El fenol (ácido fénico o fenílico,hidroxibenceno, bencenol, alcohol fe-nílico) es un compuesto aromático defórmula química C6H5OH, con pesomolecular 94.1 g/mol. Es más densoque el agua y su solubilidad en esta eslimitada, 8.3 g por cada 100 mL. Se pre-senta como un sólido cristalino, puedeencontrarse en estado líquido a tempe-ratura ambiente, en la naturaleza sehalla en desechos animales y materiaorgánica en descomposición. Posee unolor dulce e irritante característico, de-tectable a tan solo 0.05 mg/Kg en elaire. El umbral de olor para fenol enagua se ha reportado en 7.9 mg/L, y elumbral de sabor 0.3 mg/L. (NIH, 1994).

La estructura química del fenolconsiste en un grupo hidroxílico conec-

tado al anillo aromático por un carbonohíbrido sp2; esta estructura es la base detodos los compuestos fenólicos. (Bloch,2006).

Los fenoles o compuestos fenó-licos comprenden todas las sustanciasderivadas del fenol. Se considera quemuchos fenoles, especialmente sintéti-cos, son tóxicos para los seres humanos,animales y vegetación. Existe una granvariedad de compuestos fenólicos, sononce los más importantes desde elpunto de vista analítico:

• Fenol (C6H5OH)• 2,4-dimetilfenol (C8H9OH)• 2-clorofenol (ClC6H4OH)• 4-cloro-3-metilfenol (ClC7H6OH)• 2,4-diclorofenol (Cl2C6H3OH)

INTRODUCCIÓN

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23


• 2,4,6-triclorofenol (Cl3C6H2OH)• Pentaclorofenol (C6Cl5OH)• 2-nitrofenol u o-nitrofenol

(C6H4NO2OH)• 4-nitrofenol o p-nitrofenol

(C6H4NO2OH)• 2,4-dinitrofenol (C6H3N2O4OH)• 2-metil-4,6-dinitrofenol

(C7H5N2O4OH)

Los efectos en la salud por la ex-posición a fenol y compuestos fenóli-cos, son principalmente envenena-miento del sistema nervioso centralque puede ocasionar un colapso ocoma. Además la exposición crónicapuede causar daño en la piel, afeccio-nes en las mucosas de boca y garganta,y efectos en riñones, corazón, fibras ner-viosas e hígado.

Estos compuestos se emiten alambiente por: emisión proveniente dela combustión interna de vehículos,transformación fotoquímica de precur-sores como benceno, tolueno y radica-les hidroxilo, aplicación de plaguicidasy descargas industriales; por ejemplo elplaguicida organofosforado, Paratión aldegradarse forma nitrofenol muy rápi-damente (Gidding, 1973).

El fenol y algunos de sus deriva-dos son considerados tóxicos para elambiente, causando efectos perjudicia-

les para el agua, aire y suelo. Al disolverseen el agua, aun en bajas concentracio-nes, los fenoles forman soluciones tóxi-cas perjudiciales para las fuentes deaguas de consumo y el hábitat de ani-males y plantas. Al entrar en contactocon el aire y calor pueden oxidarse y lle-gar a formar mezclas explosivas. En elsuelo no permanecen por muchotiempo debido a la degradación micro-biana propia de este medio.

La contaminación del recursoagua es un problema global y en la ac-tualidad se invierte mucho esfuerzopara detener y revertir los efectos dañi-nos que causa. Los fenoles, como con-taminantes, causan alteraciones físicasy químicas en el agua. En el aspecto fí-sico le confieren olor y sabor desagra-dables, especialmente si se trata declorofenoles. Químicamente, reaccio-nan con otros contaminantes y en mu-chas ocasiones los productos son aunmás tóxicos. Debido a su solubilidad enel agua, se han encontrado cantidadesmás altas de compuestos fenólicos enaguas naturales que reciben descargasde estos, que en el ambiente que lasrodea. No solo la industria aporta confenoles al agua; además se tiene conta-minación por aplicación de plaguicidasy uso de productos que los contienen.

La contaminación del agua por


La metodología clásica de análi-sis de fenoles totales en agua, usa la de-rivatización (reacción con 4-aminoanti-pirina a pH 10) de estos compuestospara generar un complejo coloreado,que es extraído con cloroformo y seanaliza mediante espectrofotometríaUV-VIS. Dicha técnica requiere de unadestilación ácida previa de la muestrapara eliminar interferencias. Método SMde la American Public Health Associa-tion (APHA) 5530 Fenoles (Totales).(APHA, AWWA, WEF, 2005).

La técnica espectrofotométricano posee la sensibilidad exigida pornormas internacionales y con esta no sepueden determinar los compuestos fe-nólicos individuales. Otro problema esla toxicidad por la gran cantidad de clo-roformo requerida para el análisis.

Métodos más específicos para ladeterminación de fenoles en agua hansido desarrollados con el uso de técni-cas cromatográficas; con estos se llegaa un nivel mayor de sensibilidad y esposible la determinación de compues-tos fenólicos individuales.

I MATERIALES Y MÉTODOS

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compuestos fenólicos genera proble-mas de salud pública y deterioro deeste preciado recurso natural. Al conta-minar aguas naturales con efluentes re-siduales u otros medios que contienenfenoles, estos compuestos pueden lle-gar al agua de consumo que las perso-nas ingieren. Es así que el análisis decompuestos fenólicos en agua es muyimportante, al igual que el desarrollo deuna técnica para analizarlos que sea es-tandarizada, sensible, rápida, limpia yaccesible por su costo.

El presente estudio tiene comoobjetivo desarrollar, optimizar y validarun método de análisis confiable de

compuestos fenólicos en aguas super-ficiales, de consumo y residuales, quepueda ser aplicado para evaluar elgrado de contaminación por fenoles enlas diferentes fuentes de agua del Dis-trito Metropolitano de Quito.

Se plantea desarrollar un métodopara el análisis de fenoles totales en aguamediante Extracción en Fase Sólida yCromatografía Líquida de Alta Eficiencia.Validar el método desarrollado para de-terminación de fenoles por CLAE. Final-mente, aplicar el método de determina-ción de fenoles por CLAE para un estu-dio en aguas superficiales, residuales yde consumo dentro del DMQ.


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La Cromatografía de Gases, conel empleo de los detectores de ioniza-ción de llama, captura de electrones yespectrometría de masas; es muy utili-zada por su sensibilidad y selectividad.Sin embargo, los pasos previos de pre-parar, concentrar y derivar, para el aná-lisis en fase gaseosa son largos y tienenun alto costo. Método SM 6420 Fenoles(Compuestos Individuales) (APHA,AWWA, WEF, 2005).

La Cromatografía Líquida deAlta Eficiencia (CLAE) o sus siglas en in-glés HPLC, es una técnica aplicada re-cientemente que ofrece la enormeventaja de no necesitar que la muestrase encuentre en fase gaseosa para seranalizada. Esta técnica permite analizarun mayor número de muestras amenor costo, así se pueden realizar es-tudios de control y monitoreo ambien-tal de estos contaminantes. La prepa- ración de las muestras consiste en unafiltración (0.45 µm) y concentración porExtracción en Fase Sólida, sus siglas eninglés SPE (Solid Phase Extraction). Porello, se escogió esta técnica analíticapara el desarrollo del método objeto deeste trabajo.

La metodología de estudio con-templó el desarrollo de un método deanálisis que sea confiable, para lo cualfue necesario revisar las diferentes alter-

nativas bibliográficas, realizar modifica-ciones de acuerdo con el desempeño ycon los objetivos planteados, optimizarlas condiciones analíticas y finalmentevalidarlo, a través de repeticiones con-troladas de análisis de estándares, blan-cos, material de referencia certificado yfortificaciones, en las tres matrices deagua (superficial, de consumo y resi-dual). Los resultados se analizaron me-diante técnicas estadísticas y se com-probó el cumplimiento de los objetivosplanteados. Además se compararon losresultados obtenidos por el métododesarrollado con la metodología clásicapor espectrofotometría UV-VIS.

La eficacia del método fue estu-diada mediante la realización de análisisde compuestos fenólicos en agua de di-ferentes fuentes dentro del Distrito Me-tropolitano de Quito.

EQUIPOS

– Cromatógrafo Líquido de Alta Eficien-cia marca HITACHI, modelo EliteLaChrom. Bomba recíproca dual tipoTandem modelo L-2130 con unidadde gradiente de baja presión y desga-sificador, automuestreador modelo L-2200, detector UV-VIS de doble hazmodelo L-2420 y horno de columnasmodelo L-2350

– Columna para cromatógrafo líquido


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de alta eficiencia Waters SymmetryC8 de 5um, 3.0 x 150 mm

– Pre columna Waters Sentry Guard – Cartuchos de Extracción en Fase Só-

lida Oasis HLB, 3 cc, 60 mg. El sor-bente es un copolímero con balancehidrofílico - lipofílico

– Manifold Waters de 20 posiciones – Sistema Purificador de agua ELGA– Balanza Analítica Mettler Toledo con

resolución de 0,1mg– Micropipetas de 20 - 200 µL, marca

Microlit– pHmetro HACH, Sension 1– Bomba de vacío Waters – Rotavapor Heildolph– Ultrasonido Branson

REACTIVOS

– Acetonitrilo grado HPLC – Metanol grado HPLC – Agua grado HPLC (conductividad <

0.1 µS/cm)– Ácido Acético grado HPLC– Ácido Clorhídrico grado analítico, so-

lución al 10%– Ácido Fosfórico grado analítico, solu-

ción al 10%– Éter Etílico grado analítico – Acetato de Sodio grado analítico

ESTÁNDARES Y MATERIALESDE REFERENCIA

– Estándares de compuestos fenólicosindividuales Chemservice

– Estándar Chemservice Mixture #9-Phenols 2000 µg/mL en Cloruro demetilo. Lote 393-64B. Solución stock.Material de Referencia CertificadoERA PriorityPollutnTTM Acidos. LoteP139-712

MATERIALES – Filtros descartables Millipore, Mille de

0.45 µm – Balones aforados clase A calibrados

de 1mL, 5 mL, 10 mL y 100 mL– Pipetas pasteur – Vasos precipitación de 50 mL, 100 mL

y 250 mL– Pipetas volumétricas clase A calibra-

das de 1 mL, 2 mL y 5 mL– Pipetas serológicas de 5 mL – Viales ámbar 4 mL– Jeringas 3 mL

DESARROLLO Y OPTIMIZA-CIÓN DEL MÉTODO ANALÍ-TICO

El método de análisis contemplados etapas: 1) preparación de la mues-tra a través de la Extracción en Fase Só-lida. 2) separación y cuantificación delos analitos, a través del análisis por Cro-


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matografía Líquida de Alta Eficiencia.Por ello, se presentan las actividades re-alizadas tanto en la metodología comoen los resultados, para cada una deestas etapas:

extracción en Fase sólida

Los cartuchos de extracción enfase sólida usados para la preparación delas muestras fueron de marca Waters,Oasis, HLB, 3 cc, 60 mg. Primero se reali-zaron pruebas con el método genéricorecomendado por el fabricante de loscartuchos de extracción en fase sólida(Water Chromatography, 1998). Despuésse realizaron pruebas con la modifica-ción de los solventes de acondiciona-miento y elución, según recomenda-ciones del fabricante de la columna(Waters Corporation, 2002). Para cadaprueba se realizó el análisis por quintu-plicado de un estándar limpio de 0.30mg/L de compuestos fenólicos.

Cromatografía líquida de alta efi-ciencia

Se recomiendan diferentes con-diciones analíticas para la determina-ción de compuestos fenólicos porCromatografía Líquida de Alta Eficiencia(Caledra Castro, Santos Montes & Iz-quierdo Hornillos, 2006; Sarno & Delfino,2007). Estas condiciones fueron proba-

das en el laboratorio para poder deter-minar el método más adecuado para laseparación, detección y cuantificaciónde fenoles. Las pruebas se realizaroncon la inyección de un coctel de fenolesen concentración de 0.3 mg/L y la faseestacionaria utilizada fue una columnade marca Waters Symmetry C8 de 5 µm,3.0x150 mm, con una precolumna Wa-ters Sentry Guard C8. Mediante esta co-lumna se realizaron las pruebas de talladas en la Tabla 1.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO

El método analítico desarrolladoy optimizado para la determinación decompuestos fenólicos en aguas por ex-tracción en fase sólida y cromatografíalíquida de alta eficiencia fue validado deacuerdo con los siguientes parámetrosde desempeño, estableciendo los si-guientes objetivos:

• Linealidad: determinar la linealidadde las curvas de calibración para elanálisis de compuestos fenólicos porEFS-CLAE, cuyo r2>0.99.

• Límite de detección: determinar laconcentración mínima detectablecon un 95% de confianza.

• Límite de cuantificación: determinar laconcentración mínima cuantificable conun 95% de confianza, que sea menor oigual a 0.05 mg/L (U<30%, k=2).


II RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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• Precisión de repetibilidad: obtener uncoeficiente de variación en condicio-nes de repetibilidad menor o igual al5% en todos los niveles.

• Precisión de reproducibilidad: obte-ner un coeficiente de variación encondiciones de reproducibilidadmenor o igual al 5% en todos los ni-veles.

• Exactitud: obtener un error me or oigual al 5% en todos los niveles.

• Intervalo de trabajo: determinar elrango de trabajo para el análisis de fe-noles con un nivel de confianza del95%, (0.001 a 10 mg/L).

• Efecto matriz: obtener recuperacio-nes entre el 90 y 110% en todas lasmatrices analizadas.

Finalmente el método desarro-llado se comparó con el método están-dar SM 5530 Fenoles (Totales). (APHA,AWWA, WEF, 2005).

APLICACIÓN DEL MÉTODO

La aplicación del método des-arrollado para análisis de compuestosfenólicos por extracción en fase sóliday cromatografía líquida de alta eficien-cia, se realizó en muestras aleatorias to-madas de aguas superficiales, potables,embotelladas y residuales. Se planteóaplicar el método en el análisis del con-tenido de fenoles en aguas superficia-les, al tomar como referencia el RíoPapallacta. Además, se analizaron feno-les en aguas de consumo, provenientesde la planta de agua potable de Bella-vista, la de mayor producción del Dis-trito Metropolitano de Quito ( EmpresaMetropolitana de Alcantarillado y AguaPotable Quito, 2008) y en aguas embo-telladas con diferentes métodos de pu-rificación (ozonización, cloración,osmosis inversa), También se analizaronaguas residuales desechadas por indus-trias locales.

El análisis de muestras reales enla presente investigación responde, úni-camente a la necesidad de confirmar laaplicabilidad del método desarrollado,más no representa un estudio estadís-tico de la contaminación por compues-tos fenólicos en las matrices analizadas.

Se desarrolló un método confia-ble para la determinación de compues-tos fenólicos en aguas de consumo,superficiales y residuales, que es aplica-ble a dichas matrices según la valida-ción realizada. Los resultados obtenidosdurante el desarrollo del método, vali-


29

dándolo, aplicándolo a muestras realesy comparándolo con un método están-dar, se detallan a continuación.

DESARROLLO DEL MÉTODO

extracción en Fase sólida

Mediante la técnica de extrac-ción recomendada por el fabricante delos cartuchos de extracción en fase só-lida (Water Chromatography, 1998) seobtuvieron recuperaciones entre el 59 y90%. Dadas las bajas recuperaciones, serealizaron modificaciones en el métodoy se utilizó en lugar de metanol unamezcla metanol/éter etílico (10:90), locual produjo recuperaciones entre el 94y 99 %, por lo cual se aceptó el nuevométodo modificado de extracción parala determinación de compuestos fenó-licos. Se presenta el procedimiento op-timizado en la Figura 1.

Cromatografía líquida de alta efi-ciencia

Se presentan los resultados delas pruebas que se realizaron para de-terminar las condiciones apropiadas delmétodo de cuantificación de fenolespor cromatografía líquida de alta efi-ciencia.

Determinación de la fase móvil apro-piada: las combinaciones más comu-nes de fases móviles recomendadasson: metanol-agua y acetonitrilo-agua.Al analizar los cromatogramas con cadafase, se encontró que existe una mejorresolución de los picos de los analitoscon la fase acetonitrilo-agua, además eltiempo de corrida es menor, de 40 a 50minutos. Por lo tanto se escogió la fasemóvil acetonitrilo-agua para el análisisde compuestos fenólicos.

Se probaron posteriormentedos modificaciones para la fase móvilacetonitrilo - agua: una solución tam-pón de fosfato monopotásico para elagua y la acidificación de ambas fasesal 1% con ácido acético. La solucióntampón ofreció una mejora en la reso-lución de los picos; sin embargo la aci-dificación de las fases además demejorar la resolución, minimizó las colasde los picos y se tuvo un menor riesgode contaminación de la columna pormineralización, por lo cual se escogióesta segunda alternativa.

Determinación del uso de gradiente:inicialmente se probó una separaciónisocrática de: agua 60 % : acetonitrilo 40%, que dio como resultado una corridalarga (45 minutos). Para obtener mejo-res efectos, se probaron diferentes gra-dientes recomendadas por la biblio-


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grafía. (Waters Corporation, 2002), (Ca-ledra Castro, Santos Montes, & Iz-quierdo Hornillos, 2006), (Sarno &Delfino, 2007).

El método recomendado por elfabricante de la columna cromatográ-fica (Waters Corporation, 2002), ofrecióla mejor separación, se obtuvieronpicos con buena resolución, pocascolas y un tiempo de corrida manejablede 38 minutos. Por lo tanto se trabajócon este método, con variación de lascondiciones para mejorar la separacióncromatográfica, ver Figura 2.

Se optimizaron además otras va-riables que deben ser controladas paraobtener una mejor separación y resolu-ción en cromatografía líquida, como:flujo de fase móvil, volumen de inyec-ción, temperatura de la columna y lon-gitud de onda de detección. Luego derealizar varias pruebas se obtuvieron lascondiciones optimizadas para CLAE, de-talladas en la Tabla 2.

Una vez determinadas las condi-ciones cromatográficas adecuadas parala determinación de fenoles, se realiza-ron soluciones de cada uno de los com-puestos fenólicos individuales y sedeterminó su tiempo de retención yorden de elución. La selectividad delmétodo se ve reflejada en la tolerancia

de los tiempos de retención de cadaanalito. Ver Tabla 3.

Los picos de los fenoles, no sesobreponen unos con otros, se obtieneentonces una separación adecuada detodos los compuestos estudiados,como se observa en el cromatogramapresentado en la Figura 3.

La cuantificación de compues-tos fenólicos se realizó mediante curvasde calibración para cada uno de losanalitos, en ellas se relacionó la concen-tración con el área integrada de lospicos cromatográficos.

Una vez desarrolladas y definidaslas condiciones óptimas de trabajo parala determinación de compuestos fenó-licos por cromatografía líquida de altaeficiencia con extracción en fase sólida,se estableció el procedimiento para de-terminación de compuestos fenólicos;este procedimiento se utilizó para vali-dar el método y aplicarlo a muestras re-ales. La figura 4 contiene un esquemadel procedimiento desarrollado.

Para obtener el valor de concen-tración de fenoles totales se realiza lasumatoria de cada uno de los com-puestos fenólicos detectados. Así setiene un índice global.


31

VALIDACIÓN DEL MÉTODO

Se realizó la validación del mé-todo para determinación de compues-tos fenólicos en aguas superficiales,naturales y residuales. Se validaron losdiez fenoles que se nombran a conti-nuación: fenol; 4-nitrofenol; 2-clorofe-nol; 2-nitrofenol; 2,4-dinitrofenol;2,4-diclorofenol; 4-cloro-3-metilfenol;4,6-dicloro-2-metilfenol; 2,4,6-triclorofe-nol y pentaclorofenol. Cada fenol fueanalizado durante cinco días, cada díase inyectaron cuatro concentracionesdiferentes de estándares, por quintupli-cado cada una (un total de 100 análisis).Además se inyectaron blancos, materialde referencia certificado y se realizaronfortificaciones con muestras reales. Enla Tabla 6 se encuentran los resultadosobtenidos para cada parámetro de va-lidación del método, en la cual se ob-serva el cumplimiento de los objetivosplanteados inicialmente.

APLICACIÓN DEL MÉTODO

Una vez validado y aceptado elmétodo desarrollado para determina-ción de fenoles en aguas superficiales,residuales y de consumo por EFS yCLAE, se realizó un pequeño estudio deaplicación del método para las matricesseñaladas. La matriz agua de consumocontempló muestras de agua potable

del sector abastecido por la planta detratamiento de Bellavista en Quito ymuestras de aguas embotelladas decinco marcas diferentes. El agua super-ficial se tomó del río Papallacta, queabastece a la planta Bellavista. Final-mente la matriz de agua residual se di-vidió en cuatro submatrices según elsector productivo: alimentos, florícola,hidrocarburos y textil. En la tabla 7 semuestran los resultados de las diferen-tes muestras analizadas, así como sugrado de cumplimiento con respecto ala legislación ambiental ecuatorianaaplicable.

Se puede comprobar que todasellas cumplen con lo exigido en las nor-mas ambientales, a excepción de lasmuestras de aguas residuales de la in-dustria de hidrocarburos.

COMPARACIÓN CON EL MÉ-TODO ESTÁNDAR

Se debe tomar en cuenta quelos resultados encontrados al realizar elanálisis de compuestos fenólicos porcromatografía líquida de alta eficienciay extracción en fase sólida, deben serexpresados como la sumatoria de todoslos analitos encontrados, para podercompararlos con los resultados del mé-todo estándar APHA 5530 Fenoles (To-tales) (APHA, AWWA, WEF, 2005).


• El método desarrollado para el análisisde compuestos fenólicos en aguas su-perficiales, residuales y de consumopor cromatografía líquida de alta efi-ciencia y extracción en fase sólida, lograel aislamiento, extracción, separación ydetección de diez compuestos fenóli-cos individuales, prioritarios para elcontrol de la contaminación ambiental,en un rango entre 0.001 y 0.5 mg/L.

•La técnica de extracción en fase sólidapara la extracción de compuestos fe-nólicos de las diferentes matrices deagua, presenta una recuperaciónentre 94 y 99%, lo cual la hace una

metodología eficiente y adecuadapara la preparación de muestras parael análisis por cromatografía líquida.

•La validación del método desarrolladoevidencia una adecuada precisión enlos niveles estudiados, ya que se cum-ple el criterio Horwitz para coeficien-tes de variabilidad, tanto encondiciones de repetibilidad, comorepro ducibilidad.

•La recuperación que presenta el mé-todo, al analizar un material de refe-rencia certificado, para los diezfenoles analizados es mayor al 94% y

III CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

32

Se realizaron paralelamente aná-lisis de material de referencia certificadoy muestras de aguas tanto con el mé-todo estándar como con el método des-arrollado de EFS-CLAE (Ver Tablas 4 y 5).

Como se puede observar de losresultados obtenidos, el método des-arrollado presentó una mayor recupe-ración que el método estándar.

Las muestras de agua potable yagua superficial no presentaron fenolesdetectables por los dos métodos. Lasmuestras de aguas residuales tuvieron

fenoles y fue posible deducir una dife-rencia entre la cantidad cuantificadapara cada método, 0.216 mg/L con elmétodo estándar y 0.240 mg/L con elmétodo desarrollado; como en el casodel material de referencia certificado, elmétodo estándar presentó una mayorrecuperación.

Los resultados expuestos de-muestran que el método desarrollado yvalidado es apto para la determinaciónde Fenoles por Cromatografía Líquida deAlta Eficiencia para el análisis de aguasresiduales, superficiales y de consumo.


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en todos los casos se cumple con losvalores aceptables presentados en elcertificado.

•El estudio de efecto matriz realizado enagua potable, agua embotellada, aguasuperficial y agua residual de cuatro di-ferentes industrias, evidencia que elmétodo tiene adecuada precisión y re-cuperación en las matrices analizadas.

•Las muestras de agua de consumo(agua potable y agua embotellada) yagua residual analizadas presentanconcentraciones de compuestos fe-nólicos menores al límite de cuantifi-cación del método. Las muestrascumplen con la legislación.

•Las muestras analizadas de agua resi-dual de cuatro diferentes industriastienen presencia de fenoles en con-centraciones cuantificables con elmétodo usado, solo en un caso losvalores son superiores a los límitespermisibles de la legislación.

•El método cromatográfico desarro-llado presenta algunas ventajas alcompararlo con el método estándarSM 5530 Fenoles (Totales). La recupe-ración de material de referencia ymuestras es mayor; la cromatografíalíquida es una técnica más sensibleque la espectrofotometría UV-VIS, sedisminuye considerablemente el

consumo de solventes orgánicos, seelimina el uso de cloroformo, se uti-liza menor cantidad de muestra, la ex-tracción en fase sólida es máseficiente que la extracción líquido-lí-quido y se pueden analizar compues-tos fenólicos individuales.

•Se recomienda en el uso cotidiano delmétodo, con las siguientes medidasde control de calidad: preparación decurvas de calibración, análisis de du-plicados en condiciones de repetibli-dad y reproducibilidad, análisis deestándares de control en el rango dela curva, con cada “set” de muestras.Además es importante un plan delectura de materiales de referencia yparticipación en ensayos interlabora-torios, para comprobar que el mé-todo se encuentra en control.

•El método desarrollado puede serusado en futuros estudios sobre con-taminación del recurso agua en cual-quiera de las matrices contempladasen la presente investigación o ennuevas matrices que pueden ser es-tudiadas.

•Se recomienda en futuras investiga-ciones introducir el uso de estándarinterno en el método cromatográfico,ya que sería un aporte a la minimiza-ción de efecto matriz en muestrasdesconocidas.


LITERATURA CITADA

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35

TABLAS

Tabla 1: Pruebas de optimización de las condiciones cromatográficas

PARÁMETRO PRUEBAS REALIZADAS

Fase móvil Metanol - AguaAcetonitrilo - Agua

Modificaciones de la fase móvil Buffer de Acetato de sodio al 0.005MAcidificación al 1% con ácido acético

Gradiente Separación isocráticaSeparación con diferentes gradientes

Flujo de fase móvil 1.0 mL/min1.2 mL/min2.0 mL/min

Volumen de inyección 10 µL20 µL30 µL

Temperatura de la columna 25 °C30 °C

Longitud de onda de detección 280 nm360 nm

Tabla 2: Condiciones optimizadas para CLAE

PARÁMETRO CONDICIÓN OPTIMIZADA

Fase móvil A: 1% de ácido acético en aguaC: 1% de ácido acético en acetonitrilo

Gradiente 0 min: A 75 %, C 25 %0 - 1 min: A 75 %, C 25 %1 - 30 min: A 0 %, C 100 %30 - 33 min: A 75 %, C 25 %33 - 38 min: A 75 %, C 25 %

Volumen de inyección 1.2 mL/min

Temperatura de columna 25 °C

Longitud de onda de detección 280 nm

Tabla 3: Orden de elución y tiempo de retención de fenoles

Orden Compuesto Tiempo de Tolerancia Rango de tiempo de elución Retención (min) (min) Retención (min)

1 Fenol 3.650 +/– 2.5 % 3.559 - 3.7412 4-nitrofenol 5.037 +/– 2.5 % 4.911 - 5.1633 2-clorofenol 6.477 +/– 2.5 % 6.315 - 6.6394 2-nitrofenol 6.987 +/– 2.5 % 6.812 - 7.1625 2,4-dinitrofenol 7.373 +/– 2.5 % 7.189 - 7.5576 2,4-dimetilfenol 8.357 +/– 2.5 % 8.148 - 8.5667 4-cloro-3-metilfenol 9.473 +/– 2.5 % 9.236 - 9.7108 4,6-dinitro-2-metilfenol 10.383 +/– 2.5 % 10.123 - 10.6439 2,4,6-triclorofenol 12.653 +/– 2.5 % 12.337 - 12.96910 Pentaclorofenol 16.757 +/– 2.5 % 16.338 - 17.176

Tabla 4: Comparación entre método estándar y método desarrollado. Análisis de Material de referencia certificado

Valor Método estándar

% RecuperaciónMétodo % RecuperaciónCertificado desarrollado

1.010 0.860 85.15% 0.980 97.03%

Tabla 5: Comparación entre método estándar y método desarrollado. Análisis de Muestras

MuestraResultado método Resultado método

estándar desarrollado

Agua Potable < 0.001 mg/L < 0.001 mg/LAgua Superficial < 0.001 mg/L < 0.001 mg/LAgua Residual 0.216 mg/L 0.240 mg/L


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37


Tabla 6: Resultados de la Validación del Método

PARÁMETRO RESULTADO DESCRIPCIÓNVALIDACIÓN

Linealidad Rango de 0.001 mg/L Se determinó la pendiente y la intersección a 0.5 mg/L (fenoles individuales). de las curvas de calibración realizadas, para Rango de 0.001 mg/L a 5.0 mg/L todos los compuestos, en un intervalo de (fenoles totales). 0.1 a 0.5 mg/L de compuestos fenólicos.Coeficientes de correlación para el ajuste de las curvas mayores a 0.99.

Límite detección Límites de detección se encuentran Inyecciones de blancos. Límite de detección entre 0.0001 y 0.0003 mg/L, según del instrumento es la media más tres el compuesto. desviaciones estándar de las mediciones.

Límite cuantificación Límite de cuantificación 0.001 mg/L, Se realizó la extracción en fase sólida decon coeficientes de variación estándares de 0.001 mg/L, 0.005 mg/L y menores al 10%. 0.01 mg/L.

Precisión de repetibilidad Los coeficientes de variabilidad %CV Se realizó repeticiones en condiciones de y reproducibilidad encontrados son menores al 5%. repetibilidad y reproducibilidad de

estándares limpios en distintos niveles de concentración.

Exactitud Se obtuvieron valores de exactitud Se analizó Material de Referencia menores al 5% para todos los Certificado. compuestos fenólicos.

Efecto matriz %CV menores al 10 %, para aguas de Adición de estándar de concentración consumo, superficiales y residuales. conocida en muestras reales.


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Tabla 7: Resultados del análisis de muestras de agua mediante el método desarrollado y validado

Tipo Agua Fuente Resultado Norma Cumplimiento

Consumo Agua Potable Planta Concentraciones INEN Agua Potable. Todas las muestras Bellavista, sitios: Calderón, < 0.001mg/L. Requisitos. 1 108:20011 analizadas Carcelén, Cotocollao, (INEN, 2006). cumplen. Comité del Pueblo, LMP* 2,4,6-triclorofenol La Kennedy, El Batán, es 0.2 mg/L y paraJipijapa, González Suárez, pentaclorofenol esLa Floresta y Alameda. 0.009 mg/L.

Consumo Embotellada. 5 marcas Concentraciones INEN Agua Purificada Todas las muestras comerciales. < 0.001mg/L. Envasada. Requsitos. analizadas

2 200:98 (INEN, 1998). cumplen. LMP* compuestosfenólicos totales es 0.001 mg/L.

Superficiales Tres puntos del Río Concentraciones TULAS, Libro VI, Anexo 1, Todas las muestras Papallacta. < 0.001mg/L. Tabla 3. (Corporación de analizadas

Estudios y Publicaciones, cumplen. 2007).LMP* clorofenoles de 0.5mg/L y fenoles monohídricos de 0.001 mg/L.

Residuales Industrias alimentaria, Concentraciones TULAS, Libro VI, Anexo 1, Todas las muestrasflorícola, hidrocarburos < 0.001mg/L. Tablas 11, 12 y 13. analizadasy textilera. Excepto industria (Corporación de Estudios cumplen,

hidrocarburos: y Publicaciones, 2007). excepto0.240 mg/L. LMP* compuestos hidrocarburos.

fenílicoses 0.2 mg/L.

*LMP: límite máximo permisible


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FIGURAS

Figura 1: Diagrama extracción en fase sólida método modificado


40

Figura 2: Método Cromatográfico Optimizado

Figura 3: Cromatograma de orden de elución de compuestos fenólicos

41


Figura 4: Esquema del procedimiento para determinación de fenoles por CLAE

CARACTERIZACIÓN DEL MECANISMO DE LA REACCIÓNENTRE N-HEXENO Y METANALA TRAVÉS DE LOS CONCEPTOS DE

FUERZA DE REACCIÓN, CONSTANTEDE FUERZA Y FLUJO ELECTRÓNICO

DE REACCIÓN

MECHANISM CHARACTERIZATION OF THE REACTION BETWEEN N-HEXENE AND

METHANAL THROUGH REACTION FORCE, REACTION FORCE CONSTANT AND REACTION

ELECTRONIC FLUX CONCEPTS

Pamela Carrillo S.Lorena Meneses O.


RESUMEN

Mediante los conceptos de fuer -za de reacción, constante de fuerza yperfil de flujo electrónico de reacción secaracterizó el mecanismo de reacciónentre n-hexeno y metanal. Termodiná-micamente, es una reacción exotérmica(ΔEo=-13.6 kcal/mol) con una energíade activación de 34.2 kcal/mol. En el

mecanismo, se distinguen tres pasosimportantes, que inician con el despla-zamiento del hidrógeno desde el n-he-xeno al metanal, a continuación seproduce el reordenamiento electrónicotanto de electrones π como σ y terminacon una relajación estructural y forma-ción de enlaces σ, para dar finalmenteun producto de transferencia de grupo.

CARACTERIZACIÓN DEL MECANISMO DE LA REACCIÓNENTRE N-HEXENO Y METANAL

A TRAVÉS DE LOS CONCEPTOS DEFUERZA DE REACCIÓN,

CONSTANTE DE FUERZA Y FLUJO ELECTRÓNICO DE REACCIÓN

Pamela Carrillo S.1, Lorena Meneses O.1

Palabras Claves: Reacción Alder-eno, fuerza de reacción, constantede fuerza, flujo electrónico

Key words: Alder-ene reaction, reaction force, force constant, electronicflux

2 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Escuela de Ciencias Químicas, Quito Ecuador, ([email protected] ).

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Revista PUCE. ISSN 1013-89x. Núm. 943 mayo-3 nov 2012. Carrillo & Meneses, pp. 43-58

ABSTRACT

The reaction mechanism be-tween n-hexene and methanal wascharacterized through the concepts ofreaction force, force constant and elec-tronic flux. It is an exothermic reaction(ΔEo=-13.6 kcal/mol) with an activationenergy of 34.2 kcal/mol. The mecha-

nism consists of three important reac-tion steps, which begin with the hy -drogen displacement from n-hexene tomethanal, followed by electronic re-arrangement of π and σ electrons, andending with structural relaxation. Fi-nally, σ bonds are produced, to yield agroup transfer product.

INTRODUCCIÓN

En 1928, los alemanes Otto Dielsy Kurt Alder desarrollaron una de lasmás versátiles reacciones sintéticas: lareacción Diels-Alder. Esta reacción esutilizada para la producción de diversoscompuestos como morfina, colesteroly cortisona (Solomons & Fryhle, 2007).

Su variación, la reacción conocidacomo reacción Alder-eno se produceentre el hidrógeno alílico de un alqueno(eno) y un compuesto con un enlacemúltiple (enófilo). En la Figura 1 está re-presentado este tipo de reacción.

Figura 1: representación general de la reacción alder-eno entre un alqueno y un compuesto de enlace múltiple, donde el enlace X=y puede ser carbono-carbono, carbono-oxígeno,

carbono-azufre, carbono-nitrógeno, nitrógeno-nitrógeno, nitrógeno-oxígeno, etc.

La reacción es pericíclica, ya quese caracteriza por tener un estado detransición cíclico, donde se produce unreordenamiento de los electrones parala formación del producto. Es un sis-tema de cuatro electrones donde el

doble enlace se relocaliza y formanuevos enlaces σ. En general, requierede altas temperaturas, sustratos alta-mente activados o un ácido Lewiscomo catalizador, debido a la alta ener -gía de activación y el requerimiento es-

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CARACTERIZACIÓN DEL MECANISMO DE LA REACCIÓN ENTRE N-HEXENO Y METANAL A TRAVÉS DE LOS CONCEPTOS DE FUERZA DE REACCIÓN,CONSTANTE DE FUERZA Y FLUJO ELECTRÓNICO DE REACCIÓN

Figura 2: reacción alder-eno entre n-hexeno y metanal

n-hexeno metanal 3-hepten-1-ol

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térico-electrónico que necesita la rup-tura del enlace σ del C-H. Varios estu-dios teóricos y computacionales se hanrealizado sobre la naturaleza del estadode transición (Deng et a1., 1997; Lon-charich & Houk, 1987; Stephenson et al.,1980; Yamaguchi et al., 1978), sin em-bargo, el mecanismo de reacción soloha sido caracterizado por medio de lainteracción de los orbitales de fronterade los reactivos (Inagaki et al., 1976).

Con la introducción de descrip-tores cuánticos como los perfiles ener-géticos, la fuerza de reacción, laconstante de fuerza y el flujo electrónicode reacción, se pueden caracterizar demanera detallada los mecanismos de re-acción. Los perfiles de energía describenel cambio de energía potencial a lolargo del curso de una reacción química(coordenada de reacción). Este perfilpermite obtener información sobre latermodinámica (entalpías) y la cinética(energía de activación) de las reaccio-nes. Se reconocen tres regiones a lolargo de la coordenada de reacción: lade los reactivos, la del estado de transi-ción y la de los productos.

La fuerza de reacción es el nega-tivo de la derivada de la energía poten-cial con respecto a la coordenada dereacción (ξ). La constante de fuerza dereacción, resulta al derivar negativa-mente la fuerza de reacción. Juntos pro-veen de información sobre elmecanismo de reacción.

Por su parte, el potencial quí-mico y el flujo electrónico de reaccióndescriben el proceso de transferenciaelectrónica. El flujo electrónico de reac-ción se deriva del potencial químicocuando se considera el cambio del gra-diente de la densidad de carga entredos puntos de la reacción.

Para la caracterización del meca-nismo de la reacción Alder-eno se tomócomo ejemplo la reacción entre n-he-xeno y metanal, para producir 3-hep-ten-1-ol, mediante la aplicación de losdescriptores antes mencionados. La re-acción se ilustra en la Figura 2.


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Caracterizar el mecanismo dereacción entre n-hexeno y metanalmediante los conceptos de fuerza dereacción, constante de fuerza de reac-ción y flujo electrónico de reacción.

Utilizar métodos computaciona-les enmarcados dentro de la Teoría del

Funcional de la Densidad (DFT) para ca-racterizar el mecanismo de la reacciónentre n-hexeno y metanal.

Reconocer los principales cam-bios estructurales y electrónicos que seproducen en el transcurso de la reac-ción entre n-hexeno y metanal.

I OBJETIVOS

II MARCO TEÓRICO

Perfiles de energía y fuerza de reacción

Los perfiles de energía son dia-gramas bidimensionales que relacionanla energía potencial de cada punto dela reacción desde que se produce la co-lisión entre reactivos, luego de pasarpor un estado de transición, y final-mente, la formación de productos. Pro-duce información sobre la termodiná-mica de reacción como la obtención delas energías de reacción (entalpías), ytambién sobre la cinética de reacción através de las energías de activación. Lacoordenada intrínseca de reacción(IRC=ξ) (Fukui, 1981), describe el ca-mino que recorre la evolución de unareacción química al relacionar la energíapotencial (E) de reactivos y productosconectados a través de un estado detransición.

Al diferenciar numéricamenteE(ξ) da como resultado la fuerza de re-acción, F(ξ) (Toro-Labbé, 1999; Jaque etal., 2000; Gutiérrez-Oliva et al., 2005;Toro-Labbé et al., 2004; Martínez &Toro-Labbé, 2004; Politzer et al., 2005;Jaque et al., 2008; Flores-Morales et al.,2010), (Ec. 1) que proporciona informa-ción importante sobre el mecanismode un proceso químico.

F(ξ)=− (1)

Se pueden distinguir tres regio-nes importantes entre dos puntos críti-cos de F(ξ) separados por una barreraenergética: un mínimo (ξ1) y un má-ximo (ξ2). Estos definen las regiones dereacción: región de reactivos

(ξR ≤ ξ ≤ ξ1.), región del estado de transición

dEdξ


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(ξ1 ≤ ξ ≤ ξ2) y la región de productos (ξ2 ≤ ξ ≤ ξP),donde ξR y ξP. corresponden a las ener-gías de reactivos y productos, respecti-vamente. En la región de reactivos,estos se preparan para reaccionar a tra-vés de cambios estructurales; en la delestado de transición se da el reordena-miento electrónico; y en la de produc-tos, se da la relajación estructural hastaalcanzar la conformación de los pro-ductos.

Constante de Fuerza

Otro concepto derivado es laconstante de fuerza de reacción κ(ξ),que está definida como la derivada ne-gativa de la Fuerza de reacción F(ξ) conrespecto a la coordenada intrínseca dereacción

κ(ξ)=− (2)

El perfil de la constante defuerza de reacción es positiva en las re-giones de los productos y reactivos

(ξR ξ1 y ξP ξ2)y negativo en la del estado de transición

(ξ1 ξT ξ2). En el máximo y en el mínimo de F(ξ), ξ1

y ξ2, es cero, por lo cual da como resul-tado un máximo y un mínimo en lospuntos de inflexión de F(ξ) (Jaque et al.,2008).

Potencial químico y flujo electrónicode reacción

El potencial químico (Parr &Yang, 1989) es la medida de la tendenciaque poseen los electrones de escaparde un sistema. Así, se define mediantela Ecuación 3 que corresponde a la deMilliken para la electronegatividad perocon signo contrario, donde A es la afini-dad electrónica e I el potencial de ioni-zación del sistema.

m =− = – XM (3)

Al aplicar la aproximación deKoppmans´ da como resultado:

−m = XM = = (4)

Donde eHOMO y eMUMO. son lasenergías de los orbitales moleculares defrontera HOMO (Highest Occupied Mo-lecular Orbital) y LUMO (Lowest Unno-cupied Molecular Orbital). Al evaluar ma lo largo de la coordenada de reacciónse determina el perfil m (ξ), que permitemedir el flujo electrónico entre molécu-las con diferentes valores de m. Por locual se puede establecer el flujo elec-trónico de reacción J(ξ) como (Herrera& Toro-Labbé, 2007; Vogt-Geisse & Toro-Labbé, 2009):

dF(ξ)

dξ

A+I2

A+I2 2

eHOMO + eMUMO


50

J(ξ).=−Q (5)

Donde Q es el coeficiente detransporte, que para este caso, se lo to-mará como Q=1. Al analizar termodiná-

micamente el flujo electrónico, sepuede diferenciar regiones J(ξ)<0 queson relacionadas con cambios espontá-neos de la densidad electrónica y regio-nes J(ξ)>0, asociadas con cambios noespontáneos en la densidad electró-nica.

dm

dξ

III MÉTODOS Y DETALLES COMPUTACIONALES

Para la caracterización de la re-acción Alder-eno entre n-hexeno y me-tanal, se optimizaron las estructuras dereactivos, producto y estado de transi-ción. Para el efecto, se usó un métodohíbrido funcional derivado de la DFT:B3LYP, y la base 6-311G(d,p). Para el casodel estado de transición se usó del key-word TS, además del cálculo de cons-tantes de fuerza con el keywordCALCFC y el cálculo de frecuencias conel keyword FREQ. Para asegurar que seha encontrado un estado de transición,se debe observar la presencia de unafrecuencia imaginaria. Se utilizaron elmismo método y base para la dilucida-

ción de la coordenada intrínseca de re-acción y la determinación del perfilenergético, mediante el uso del key-word: IRC. Se realizaron análisis energé-ticos (single point) de cada estructuraoptimizada a lo largo del IRC, con el mé-todo Hartree-Fock (HF) y el conjunto debases 6-31G(d), para el cálculo de lafuerza de reacción, los potenciales quí-micos y el flujo electrónico de reacción.Para la obtención de estos descriptoresse utilizaron las Ecuaciones 1 a 5. Todoslos cálculos fueron realizados con el pa-quete Gaussian 03. Para la visualizaciónde las geometrías de las estructuras seutilizó el programa GaussView 4.1.

IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 3 se encuentra re-presentada la reacción entre n-hexenoy metanal, donde se observan las es-tructuras de los reactivos, estado detransición y producto. Se puede visua-

lizar y constatar que se produce un es-tado de transición cíclico. El hidrógenoalílico de 9C se adiciona a 20O del me-tanal, mientras se produce una relocali-zación del enlace π de 5C-6C a 6C-7C.


51

Además se produce la formación de unenlace σ entre 1C y 5C y se obtienecomo resultado un producto de trans-

ferencia de grupo donde se forman dosenlaces σ a expensas de un enlace π.

Figura 3. Modelo de bolas para la reacción esquemática entre n-hexeno y metanal, donde se representa en gris los átomos de carbono, en blanco los átomos de hidrógeno

y en rojo los átomos de oxígeno. Cada átomo está numerado para visualizar los cambios estructurales

El perfil energético de la reacción (Fi-gura 4) indica que es una reacción exo-térmica (ΔEo= -13.6 kcal/mol), con unaenergía de activación de 34.2 kcal/mol.Al comparar los resultados termodiná-micos obtenidos en este estudio condatos obtenidos de la literatura, sepuede observar que las reaccionesAlder-eno son reacciones exotérmicas,que liberan energía en forma de calor,ya que la energía de reacción entre eti-leno y propeno realizadas con un mé-todo MP2 y conjunto de bases 6-31g(d)fue de ΔEo=-29.4 kcal/mol (Deng et al.,1997). Además, al relacionar las energíasde activación entre la reacción de pro-peno y etileno de 35 kcal/mol y entrepropeno y metanal de 30 kcal/mol(Deng et al., 1997), se observa que se en-cuentra dentro del rango de energía deactivación encontrado para la reacción

en estudio. La diferencia de la misma sedebe a las diferencias estructurales ylargo de las cadenas de carbono tantode reactivos como de productos. Adi-cionalmente, al comparar la reacciónbajo estudio con una reacción Diels-Alder entre 1,3-butadieno y etileno en lacual la energía de activación es de 25.4kcal/mol (Bach et al., 1989), se confirmaque las energías de activación de las re-acciones Alder-eno son mayores a lasDiels-Alder. En las reacciones Diels-Alderparticipan 6 electrones π, mientras queen la reacción Alder-eno participan 4electrones π y 2 σ, por lo cual se re-quiere mayor energía para alcanzar elestado de transición (Singh, 2005).

Como se puede observar, el per-fil energético nos proporciona informa-ción sobre la termodinámica de la

QUIMICA FINAL:Maquetación 1 10/9/12 11:05 AM Página 51


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reacción. Sobre la cinética de la reac-ción nos proporciona únicamente la es-tructura del estado de transición y laenergía de activación. Sin embargo, noofrece ninguna información respectodel mecanismo de la reacción, es decir,

que cambios estructurales o electróni-cos se llevan a cabo para que los reacti-vos se transformen en productos. Estosaspectos pueden ser analizados pormedio de los descriptores definidos.

Figura 4: Perfil energético, e(ξ), para la reacción n-hexeno- metanal. en el extremo izquierdo está representada la energía de los reactivos. la energía aumenta hasta alcanzar un máximo en la estructura del estado de transición (energía de activación),

para luego decrecer hasta alcanzar la estructura del producto en el extremo derecho

En el perfil de fuerza de reac-ción, F(ξ), (Figura 5) se pueden diferen-ciar tres regiones importantes, separa-das por el mínimo (ξ1) y el máximo (ξ2)indicados por una línea entrecortada.En la región de los reactivos (ξR ≤ ξ ≤ ξ1)se producen principalmente los despla-

zamientos asociados a la transferenciadel hidrógeno. A continuación, se iden-tifica la región del estado de transición(ξ1 ≤ ξ ≤ ξ2), donde se da el reordena-miento electrónico. En esta región sepuede ver la formación de enlaces re-sonantes debido a la relocalización de


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los electrones. Aquí, se da la interaccióndel átomo de hidrógeno con el orbitalHOMO del n-hexeno y el LUMO del me-tanal. Por último, se distingue la regiónde los productos (ξ2 ≤ ξ ≤ ξP), donde seda la relajación de los átomos donado-res y aceptores de electrones, para la for-

mación del producto, produciéndosefundamentalmente el enlace σ entre loscarbonos del metanal y el hexeno. La re-acción Alder-eno comprende un solopaso elemental, por lo cual se distin-guen solo estas tres regiones.

Figura 5: Perfil de fuerza de reacción, F(ξ), para la reacción n-hexeno-metanal. en el extremo izquierdo está representada la fuerza de reacción de los reactivos.

la fuerza de reacción decrece hasta un mínimo en ξ1, pasa por cero en la estructura del estado de transi-ción hasta alcanzar un máximo en ξ2, para luego volver a decrecer en la estructura del producto

Al analizar el perfil de la cons-tante de fuerza de reacción (Figura 6),se puede observar que en la regióndonde es negativa, coincide con la re-gión entre el máximo y mínimo del per-fil de fuerza de reacción (ξ1 ≤ ξ ≤ ξ2). Se

confirma que la reacción no posee unpunto único de estado de transición,sino tiene una región de transicióndonde el sistema pasa de reactivos ac-tivados hacia productos activados(Toro-Labbé et al., 2009). Adicional-


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mente, se observa que la región del es-tado de transición posee una gradientede energía igual a cero para todos losgrados de libertad con una constantede fuerza negativa (Jaque et al., 2008),

lo cual confirma que el estado de tran-sición no solo corresponde a un puntode la coordenada intrínseca de reac-ción, sino a una región a lo largo de lacoordenada intrínseca de reacción.

Figura 6: Perfil de constante de fuerza, κ(ξ), para la reacción n-hexeno-metanal. la constante de fuerza es aproximadamente cero en la región de los reactivos y del producto,

pero decrece radicalmente hasta un mínimo en la región del estado de transición

La Figura 7 muestra la evolucióndel flujo electrónico, J(ξ), a lo largo dela coordenada intrínseca de reacción.Así, se observa que tanto en el área dereactivos (ξR ≤ ξ ≤ ξ1) como de produc-tos (ξ2 ≤ ξ ≤ ξP), existe una tendencia acero del flujo electrónico de reacción,

caracterizándolas como regiones deequilibrio. En estas regiones el flujoelec trónico en direcciones opuestas,está completamente balanceado, sien -do zonas donde se da, esencialmente,el reordenamiento estructural. Por elcontrario, la región del estado de tran-


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sición se diferencia por una dramáticacaída del flujo electrónico desde los re-activos, que adoptan un mínimo cercade la región donde se produce la es-tructura del estado de transición, paranuevamente aumentar al acercarse a lazona de productos. Lo mismo corro-

bora la información obtenida del perfilde fuerza de reacción que en la zonadel estado de transición (ξ1 ≤ ξ ≤ ξ2) seda el reordenamiento electrónico de loselectrones π del n-hexeno y el metanaly los electrones σ del enlace C-H libredel n-hexeno.

Figura 7: Flujo electrónico de reacción, Jm(ξ), para la reacción entre n-hexeno y metanal. el flujo electrónico de reacción es aproximadamente cero en la región de los reactivos

y del producto, pero decrece hasta un mínimo en la región del estado de transición

La reacción Alder-eno entre n-hexeno y metanal, que consta de unsolo paso elemental, ha sido caracteri-zada por medio de la aplicación de des-criptores cuánticos como los conceptos

de fuerza de reacción, constante defuerza de reacción y flujo electrónico dereacción. Se ha determinado que esuna reacción exotérmica que poseeuna energía de activación mayor a re-

IV CONCLUSIÓN


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acciones Diels-Alder similares. Adicio-nalmente, se describió su mecanismode reacción a lo largo de la coordenadaintrínseca de reacción, diferenciándosetres regiones: la de los reactivos (ξR ≤ ξ≤ ξ1), la del estado de transición (ξ1 ≤ ξ≤ ξ2) y la de los productos (ξ2 ≤ ξ ≤ ξP).Al analizar los perfiles de fuerza de re-acción, constante de fuerza de reacción

y flujo electrónico de reacción, se ob-serva que en la región de los reactivosse produce el desplazamiento del hi-drógeno alílico, en la región del estadode transición ocurre el reordenamientoelectrónico; y, por último, en la regiónde los productos, se observa una relaja-ción estructural acompañada de la for-mación de enlaces σ.

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DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UNMÉTODO PARA LA DETERMINACIÓNDE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETRÓLEO (TPH’S) MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA DE

INFRARROJOS CON TRANSFORMADASDE FOURIER, EN SUELOS

FORTIFICADOS

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AMETHOD FOR THE DETERMINATION OF TOTAL

PETROLEUM HYDROCARBONS (TPH’S) BY INFRARED SPECTROPHOTOMETRY WITH

FOURIER TRANSFORMS IN FORTIFIED SOILS

DAVID ROMERO E.WENDY HEREDIA R.


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RESUMEN

En este trabajo se desarrolla y va-lida un método para la extracción y aná-lisis de hidrocarburos totales de petróleoen suelos, utilizando la extracción só-lido-líquido mediante agitación con ul-trasonido y una limpieza (clean up) consílica gel, cuantificando por espectrofo-tometría de infrarrojos con transforma-

das de Fourier. Una vez declarado el mé-todo como validado se lo utiliza paradeterminar hidrocarburos totales de pe-tróleo, en muestras de suelos y aguas depercolación que han sido sometidas enel laboratorio a un proceso de simula-ción de un derrame de petróleo.

En el proceso de validación seevalúa la exactitud, precisión, sensibili-

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UNMÉTODO PARA LA DETERMINACIÓNDE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETRÓLEO (TPH’S) MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA DE

INFRARROJOS CON TRANSFORMADAS DE FOURIER, EN SUELOS FORTIFICADOS

David Romero E.1 , Wendy Heredia R.1

Palabras Claves: TPH´s, hidrocarburos totales de petróleo, espectrofotome-tría de infrarrojos, extracción sólido-líquido, suelo, fortificaciones

Key words: TPH´s, total petroleum hydrocarbons, infrared spectrophotome-try, solid-liquid extraction, soil, fortifications

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Centro de Servicios Ambientales y Químicos, Quito, Ecua-dor ([email protected]) ([email protected]).

REVISTA PUCE. ISSN 1013-89X. NÚM. 943 mayo-3 nov 2012. Romero & Heredia. PP. 59-76

DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETRÓLEO (TPH’S) MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA DE INFRARROJOS CON TRANSFORMADAS DE FOURIER, EN SUELOS FORTIFICADOS

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dad y eficacia del método analíticodesa rrollado, obteniéndose como resul-tados: una exactitud de 94 %, coeficien-tes de variación para la precisión derepetibilidad de 9.92 % y para la preci-sión de reproducibilidad de 9.49 %; unlímite de cuantificación de 100 mg/Kg.El rango de trabajo del método es de100 a 5000 mg/Kg con coeficientes decorrelación lineal mayores a 0.999.

Para el proceso de simulación deun derrame de crudo, se tomaron comoreferencia dos estudios realizados enAgriculture Journals (Kumar, 2006) (Gosh,2007), así se colocó suelos del orden deInceptisoles, suborden Andepts del grangrupo Hidrandepts, en sistemas de co-lumnas verticales, luego se realizó unaremoción física del crudo derramado yse realizó la simulación de precipitacio-nes durante un período comprendidode cuatro semanas. Así, se comprueba lapresencia de TPH’s en suelo, concentra-ciones entre aproximadamente 500 y4500 mg/Kg y en agua de percolaciónen concentraciones de 0.4 a 0.7 mg/L; locual indica que un suelo de tipo Incepti-sol que ha sido sometido a un derramede petróleo, con el tiempo y con elefecto de las precipitaciones, los TPH’spueden llegar a contaminar las aguassubterráneas.

El presente trabajo se realizó en

el Centro de Servicios Ambientales yQuímicos de la Pontificia UniversidadCatólica del Ecuador (CESAQ-PUCE).

ABSTRACT

This work researches and vali-dates a method for extraction andanalysis of total petroleum hydrocar-bons in soil using solid-liquid extractionwith ultrasonic agitation and a clean upwith sili ca gel, quantifying by infraredspectro- photometry with Fouriertransformed. When the method is vali-dated, it is used to determine the totalpetroleum hydrocarbons in samples ofsoil and percolation water, which havebeen subjected to a laboratory simula-tion of a process oil spill.

In the validation process wereevaluated the accuracy, precision, sen-sitivity and efficiency of the analyticalmethod developed, yielding the follow-ing results: an accuracy of 94%, coeffi-cients of variation for the precision of9.92% repeatability and reproducibilityof 9.49%, the recoveries of standard ad-ditions between 93.74% and 104.71%.The working range of the method goesbetween 100 to 5000 mg/Kg with linearcorrelation coefficients upper 0.999.

For the simulation process of anoil spill, was taken as reference two


studies in Agriculture Journals (Kumar,2006) (Ghosh, 2007), which was placedon soils of the order of Inseptisoles, sub-major group Andepts Hidrandepts invertical columns systems, followed for sphysical removal of oil spilled and per-formed the simulation of rainfall duringa period of four weeks. It verifies thepresence of TPH’s in soil, in concentra-tions between about 500 and 4500

mg/kg and concentrations in percola-tion water between 0.4 to 0.7 mg/L,which indicates that the Inceptisol soilused when it has been subjected to anoil spilling over time and with the effectof precipitation, TPH’s can contaminategroundwater. This work was performedat the Centro de Servicios Ambientalesy Químicos de la Pontificia UniversidadCatólica del Ecuador (CESAQ-PUCE).

INTRODUCCIÓN

El petróleo es un líquido naturaloleaginoso e inflamable, constituidopor una mezcla compleja de hidrocarbu-ros que se extrae de lechos geológicoscontinentales o marítimos. Estos hidro-carburos están formados por átomos decarbono (85 a 90 %) e hidrógeno (10 a 14%), junto a otros elementos como: nitró-geno, azufre, oxígeno y metales, espe-cialmente vanadio y níquel.

El petróleo es una de las princi-pales fuentes de energía utilizada encasi todos los procesos industriales, do-mésticos y de transporte; por este mo-tivo, la industria hidrocarburífera es unade las más importantes a nivel mundial;circunstancia que crea la necesidad deestablecer controles en todos los pro-cesos relacionados con esta industria,con la finalidad de evitar cualquier dañoambiental.

Dada la importancia que ennuestros días, se da a la preservación delambiente, es necesario, contar con unmarco legal que permita llevar a cabo elcontrol de los contaminantes en los sis-temas acuáticos y edáficos.

En el Ecuador existen normasambientales generales para todos loscontaminantes, pero dada la importan-cia de los hidrocarburos, existe un apar-tado especial en el cual se trata a loscontaminantes relacionados con el pe-tróleo; este es el Decreto 1215, vigentedesde el año 2001, en donde se presen-tan los límites máximos permisibles delos TPH´s en suelos, los cuales son: 1000mg/kg para protección de ecosistemassensibles, 2500 mg/kg para usos agríco-las y 4000 mg/kg para usos industriales(Decreto 1215, 2001).

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2 Toxicological profile for Total petroleum hydrocarbons (TPH), (1999), www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp123.pdf

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La contaminación de ambientepor los hidrocarburos puede darse porderrames directos de petróleo en elsuelo o en el agua; infiltraciones decombustibles o aceites; fugas de com-bustibles por fallas en instalaciones sub-terráneas. También durante otrosprocesos de la industria hidrocarburíferacomo son la explotación, la extracción yel transporte de petróleo se puedenproducir accidentes que ocasionan con-taminación de suelos y aguas superficia-les (Fernández et al., 2006). En los suelos,la contaminación es crítica porque nosolamente afecta a la flora y fauna ale-dañas, sino que también puede afectara fuentes de agua cercanas o deteriorar-las y dejarlas inertes.

La contaminación por TPH´s seve influenciada por la afinidad que tie-nen estos contaminantes, con los com-puestos de similar condición, no pola-res, como es el caso de la materia orgá-nica de suelo y la fracción arcilla, lo cualpermite que los TPH’s participen en fe-nómenos superficiales de adsorción enlos coloides del suelo. Otros factoresque influyen en los procesos de movili-dad de los TPH’s, a través del suelo sonel contenido de agua o humedad, el ta-maño de partícula del suelo, el conte-nido de la fracción arcilla y de la materia

orgánica de suelo.

También, los TPH’s presentan lapropiedad física de ser poco solubles ensistemas acuosos, lo cual resulta perju-dicial para la vida acuática y subacuá-tica. Así, ciertas fracciones de los hidro-carburos con una densidad menor a ladel agua, forman una capa e impidenque la luz pase al medio. Además estapropiedad física constituye un factorimportante a considerar al momentodel desarrollo de un método analíticoque permita su cuantificación.

Los TPH’s están formados por losBTEX (benceno, tolueno, etilbenceno yxileno), n-hexano, aceites combustiblesy con base mineral, aceites minerales;estos han sido estudiados por la ATSDR(Agency for Toxic Substances and Dise-ase Registry)2, la cual ha creado unaserie de perfiles toxicológicos de loscomponentes individuales y los pro-ductos derivados del petróleo.

En el campo de la química ana-lítica existen diferentes métodos parala extracción y cuantificación de losTPH´s para distintas matrices ambien-tales. Así, para el proceso de extracciónse encuentran algunos métodos adap-tados de la obtención de aceites y gra-

sas, EPA3 1664. Entre las técnicas de ex-tracción se encuentran: soxhlet, micro-ondas, solvente presurizado (PSE) y poragitación, métodos EPA 3550 y 3580.Para el proceso de cuantificación deTPH´s, se encuentran métodos como:espectrofotometría de infrarrojos, lacromatografía de gases que aunque esuna técnica de separación, permitetambién la cuantificación mediante susdetectores de ionización de llama (FID)o acoplado a espectrometría de masas(MS); entre otros (Atlantic RCBA, 2006),(Criteria Working Group, 1998).

Es así como, el objetivo generalde este trabajo es desarrollar un mé-todo analítico para la determinación deTPH’s, con la utilización de la técnica deextracción por agitación en baño de ul-trasonido optimizada, cuantificarlosmediante la técnica de espectrofoto-metría de infrarrojos con transformadasde Fourier y aplicar el método analíticodesarrollado y validado en suelos delorden de Inseptisoles, suborden An-depts del gran grupo Hidrandepts quehan sido sometidos a una simulación

controlada del derrame de petróleo. Sepropone optimizar tanto las condicio-nes de extracción mediante agitaciónpor baño ultrasonido de los TPH’s ensuelos y el proceso de “clean up” con sí-lica gel, como las condiciones de cuan-tificación de los TPH’s, y la técnica deespectrofotometría de infrarrojos contransformadas de Fourier.

Luego, validar el método de ex-tracción y cuantificación para el análisisde TPH’s, en el rango de trabajo de 100 a5000 mg/Kg, con un coeficiente de co-rrelación lineal de 0.99 para las curvas decalibración, coeficientes de variación derepetibilidad y reproducibilidad menoresal 10% y una exactitud de 100 ± 10 %.

Y finalmente, determinar losTPH’s en suelos del orden de Inseptiso-les, suborden Andepts del gran grupoHidrandepts y aguas de percolaciónobtenidas de la simulación en sistemasde columnas verticales de un derramede crudo y posteriores precipitacionesdurante un período comprendido decuatro semanas.


3 Enviromental Protection Agency, 820129, www.epa.gov/osw/hazard/testmethods.

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En este trabajo se desarrolló unmétodo analítico para la determinaciónde hidrocarburos totales de petróleo ensuelos basados en los métodos EPA9:3550, 3630, 8440. Para la preparación dela muestra, se procede a secarla a 60 °Cpor 24 horas. Se realiza una extracciónsólido-líquido; luego se agita en unbaño ultrasonido para asegurar un con-tacto íntimo con el solvente (MétodoEPA 3550). Se realiza una limpieza (cleanup) con sílica gel para eliminar los com-puestos polares como grasas y aceites(Método EPA 3630). Se utiliza la espec-trofotometría de infrarrojos con trans-formadas de Fourier, para la deteccióny cuantificación de los TPH´s (MétodoEPA 8440). Las condiciones de extrac-ción, limpieza y cuantificación son pro-badas y puestas a punto, luego seprocede a la validación del métododesarrollado y se prueba su eficaciaaplicándolo a muestras reales.

equipos:

– Espectrofotómetro Infrarrojo conTrans formadas de Fourrier marca Per-kin Elmer modelo Spectrum BX

– Equipo de Baño de Ultrasonido Bran-son

– Balanza analítica Mettler-Toledo conprecisión de 0.1 mg

– Estufa – Dispensador Eppendorf o similar

reactivos:

– Solvente de extracción S 316 (policlo-rotrifloro etileno) p.a.

– Hexano grado técnico – Ácido Clorhídrico p.a.– Sílica gel de 100 a 200 mesh – Metanol o acetona

estándares y materiales de referencia:

– Material de Referencia Certificadomarca: ERA, Catálogo 570

– Estándar de Hidrocarburos Totales dePetróleo, Marca: Chemservice, Catá-logo: TPH418-1M, Mezcla GRO-DRO

Materiales:

– Celdas de cuarzo Marca Perkin Elmer,camino óptico 1.00 cm

– Puntas Eppendorf de 500 µl y de 5 ml – Espátulas metálicas – Botellas de vidrio ámbar de 100 ml,

boca ancha, con tapa – Pipetas volumétricas clase A de 1 ml,

5 ml, 10 ml, calibradas– Balones de aforo clase A de 10 ml– Pipetas Pasteur – Goteros


I MATERIALES Y MÉTODOS

66


67

soluciones preparadas:

– Soluciones de las curvas de calibra-ción: 10 mg/l, 100 mg/l, 500 mg/l,1000 mg/l y 1500 mg/l

Se utiliza la extracción sólido-lí-quido en la cual se realizan varias prue-bas, para adaptar la técnica a lascondiciones del laboratorio y obtener losmejores porcentajes de recuperación.

Las variables experimentales quese pusieron a punto en esta etapa son:tamaño de muestra, cantidad de sol-vente de extracción, tiempo de extrac-ción, cantidad de sílica gel para lalim pieza (clean up). Con esta técnica seevitan pérdidas de las fracciones voláti-les por incremento de temperatura, sebuscaron las mejores condiciones ex-perimentales para tener porcentajes derecuperación adecuados y disminuir laspérdidas de analito en el proceso. Cadauna de las condiciones son probadasen el laboratorio utilizando material dereferencia certificado y realizando la de-tección y cuantificación mediante el es - pectrofotómetro de infrarrojos contransformadas de Fourier, a la espera deporcentajes de recuperación de 100 ±10%.

El método validado fue aplicadoa muestras de suelos en sistemas de co-lumnas verticales, con una posterior re-

moción física del crudo derramado y si-mulación de precipitaciones fluvialesdurante un período comprendido decuatro semanas.

Se ensambla un sistema de 13columnas, con el fin de analizar los efec-tos del tiempo de remoción y las preci-pitaciones fluviales que sucedandurante un mes, con la migración de losTPH’s del suelo hacia las aguas subterrá-neas (Gosh et al., 2007). Las columnasson de vidrio de 30 cm cada una, encuya base poseen una salida para poderrecolectar el agua de percolación; se re-llenan con cantidades de suelo delorden de Inceptisoles, suborden An-depts del gran grupo Hidrandepts, loscuales poseen como característicasprin cipales, altos contenidos de materiaorgánica y se conforman de un alto por-centaje de arcillas.

Posteriormente se procede alempaque del suelo, uno de los sistemasdebe ser utilizado como blanco del es-tudio, cuatro sistemas para la simula-ción de la remoción de crudo a las 24horas, cuatro sistemas para la simula-ción de remoción a las 48 horas y cuatrosistemas para la simulación de remo-ción a las 72 horas. La remoción se efec-túa físicamente, al extraer el crudo ensu totalidad. Se recolecta además elagua de percolación.


II RESULTADOS

a. validación del método:

• Linealidad: fueron determinadas laspendientes e intersecciones de lascurvas de calibración realizadas en unintervalo de 10 a 1500 mg/L de TPH’spuros. Este es el rango de la curva y sise toma en cuenta la relación del vo-lumen del solvente con el peso desuelo utilizado en el proceso de ex-tracción, se obtiene un rango de 100a 5000 mg/Kg. Los coeficientes de co-rrelación de las curvas de calibraciónutilizadas para este trabajo son mayo-res a 0.999.

• Límite de detección: para la determi-nación de límite de detección, se rea -lizó la lectura de fortificaciones enniveles bajos: 10, 25, 50, 75, 100 y 250mg/kg, obteniéndose como valor dellímite de detección a 25 mg/kg quecorresponde a la menor concentra-ción a la cual el equipo presenta unalectura.

• Límite de cuantificación: el límite decuantificación del método analíticoes la concentración de la fortificaciónque puede ser cuantificada con unarecuperación de 100 ± 10%. Se ob-tuvo una recuperación de 98.4% parala fortificación de 100 mg/kg y se de-termina a esta concentración comoel límite de cuantificación.

• Precisión de repetibilidad y reproduci-bilidad: los resultados de las pruebasde repetibilidad y reproduci bilidadrealizadas en cuatro niveles de con-centración de los TPH´s –100, 500,1000 y 5000 mg/Kg– se pueden apre-ciar en la Tabla 1. Todos los valores delos coeficientes de variación (%CV),tanto en condiciones de repetibilidady de reproducibilidad son menores al10%. Además, se obtienen porcenta-jes de recuperación dentro del obje-tivo de validación planteado: 100 ±10%.

68

Una vez ensamblados los siste-mas, se procede a derramar en la super-ficie del suelo de cada columna, 5 mLde crudo para simular el derrame. Ade-más, para producir un efecto real, dia-riamente se fue añadiendo 5.4 mL de

lluvia simulada. Semanalmente se reco-lectan las percolaciones obtenidas y seanalizan los TPH´s. Al final de las cuatrosemanas del estudio, se examinan losTPH’s de los suelos contenidos dentrode las columnas.


69

• Exactitud: la recuperación que se ob-tiene al utilizar un material de referen-cia certificado es del 96.9%, cumplecon el objetivo de validación. Estevalor es aceptado, si se compara conlos valores estipulados en el certifi-cado del material de referencia.

• Incertidumbre: luego del proceso devalidación se procedió a calcular la in-certidumbre expandida del método,y se obtuvo como resultados: una m(K=2) = 11.89 mg/Kg para el rango100-249 mg/Kg; una m (K=2) = 12.56mg/Kg para el rango 250-499 mg/Kg;una m (K=2) = 10.38 mg/Kg para elrango 500-749 mg/Kg; una m (K=2) =7.07 mg/Kg para el rango 750-999mg/Kg; una m (K=2) = 14.75 mg/Kgpara el rango 1000-1249 mg/Kg; yuna m (K=2) = 11.53 mg/Kg para elrango 1250-5000 mg/Kg.

b. aplicación del Método:

Todos los valores, excepto loscorrespondientes a la cuarta semanadespués de la remoción presentan va-lores de TPH´s menores al límite decuantificación del método analítico uti-lizado; además se observa que el valorde los TPH´s que lograron migrar a tra-vés del agua de percolación, se incre-menta su concentración a medida queaumenta el tiempo de remoción y au-menta las semanas de precipitación, esdecir que el sistema de 24 horas para laremoción, menor contacto del suelocon el crudo tiene un valor de 0.4 mg/L;con un valor de 0.5 en el sistema de 48horas de remoción; alcanzando hastaun valor de 0.7 mg/L en el sistema deremoción a las 72 horas; este últimomantuvo el mayor contacto con elcrudo antes de su remoción. En la figuraNº 1, se observan los incrementos de la

Tabla 1: resultados de precisión de repetibilidad (r) y reproducibilidad (r) para los TPH´s

Nivel Media S r CV r S R CV R Recuperación I m (k=2)% % %

100 mg/kg 104,709 10,4 9,9 9,4 9,5 104,7 11,89500 mg/Kg 468,699 41,4 8,8 37,3 8,8 93,7 10,381000 mg/Kg 995,096 56,9 5,8 62,1 6,2 99,5 14,755000 mg/Kg 4912,847 76,1 1,6 72,9 1,5 98,3 11,53


Figura Nº 1: Comparación de los resultados de la determinación de TPH´sen las muestras de agua de percolación de los tres sistemas de remoción del crudo,

recogidas en función del tiempo

70

En el análisis de los suelos dentrode las columnas se incrementa la con-centración de los TPH’s, al transcurrir eltiempo desde la remoción; incrementoque se observa desde los sistemas de re-moción a las 24 horas del derrame. Estospresentan una menor concentración

con respecto a los sistemas de remocióna las 48 horas que a su vez presentanconcentraciones menores que los siste-mas de remoción a las 72 horas. Estas va-riaciones en la concentración de TPH’sen los sistemas de columnas, puedenconstatarse en la figura Nº 2.

concentración de TPH’s en los sistemasde col umnas correspondientes a la

cuarta semana después de la remoción.


Figura Nº 2: Comparación de las concentraciones de TPH´s de los suelos entre los sistemas de remoción luego del derrame, con respecto al tiempo transcurrido de la simulación

71

Dentro del proceso de puesta a puntodel método, se determinan las condi-ciones óptimas tanto de extracción,“clean up” y cuantificación en las com-probaciones que arrojen resultados deporcentajes de recuperación cercanosa los ideales, es decir de 100%±10.

Las condiciones determinadascomo óptimas, posteriormente son uti-lizadas para el proceso de validación ytambién para la aplicación de las mues-tras reales.

Los resultados de la validacióndel método analítico, permiten la veri-ficación de que este es exacto, preciso,repetible, reproducible, en un rango dedeterminación de 100 a 5000 mg/Kg;además se observa una correlación delos puntos de calibración de las curvasde cuantificación, lo cual demuestraque el ajuste de la función lineal es vá-lido para la relación absorbancia–con-centración. Al utilizar un método relati-vamente sencillo en el cual se obtienenresultados aceptables dentro de los ob-jetivos de validación, en términos de

III DISCUSIÓN


72

recuperación de estándares, se de-muestra la aplicabilidad de este paraposteriores ensayos con muestras rea-les y la robustez del método por su bajasusceptibilidad a interferencias.

En la simulación del derrame decrudo controlado, se observa la presen-cia de hidrocarburos totales de petróleoen las aguas de percolación en la cuartasemana de precipitación y en los suelosdentro de los sistemas de columnas.Esto se debe a que los hidrocarburos lo-gran distribuirse dentro del sistemaedáfico a pesar del continuo paso de laprecipitación simulada, la fina capa decrudo que quedó en la superficie delsuelo en la columna luego de la remo-ción física, fue percolando incremen-tándose así la concentración de TPH´sen el agua recogida. También, el incre-mento puede atribuirse al tiempo decontacto del suelo con el crudo, antesde ser removido.

Al tratarse de contaminación consustancias orgánicas en el suelo, se ob-serva que las fracciones ligeras, comogasolinas y aceites, forman una capa enla superficie y pueden movilizarse deuna manera horizontal; mientras que lasfracciones de hidrocarburos más densas,migran de manera vertical y pueden lle-gar a acuíferos subterráneos. Este fenó-meno migratorio se da principalmente,por procesos de adsorción que alcanzanel equilibrio rápidamente y al saturarse,permiten el desplazamiento de los con-taminantes (Barcelona et al., 1990).

Además, la persistencia de loscontaminantes en el suelo, tiene una es -trecha relación con los componentes delmismo, es así que los suelos con altocontenido de arcilla y de materia orgá-nica de suelo, permiten una mejor aso-ciación con los contaminantes provo-cando que estos permanezcan adsorbi-dos a la matriz por más tiempo.

IV CONCLUSIONES

El método desarrollado para elanálisis de los hidrocarburos totales depetróleo en suelos, mediante la espec-trofotometría de transformadas de Fou-rier, utilizando extracción sólido-líquidopor agitación en ultrasonido, logra elaislamiento, extracción, separación de

interferencias, detección y cuantifica-ción adecuada de dichos compuestos,en un rango de trabajo de 100 a 5000mg/Kg.

La técnica de extracción sólido-líquido mediante agitación en ultraso-


73

nido permite obtener porcentajes derecuperación entre 90 a 100%, lo cual esfavorable conociéndose que los TPH´sson compuestos altamente volátiles yque además pueden ser interferidospor los aceites y grasas de origen ani-mal y vegetal.

El proceso de validación del mé-todo desarrollado da una evidencia ob-jetiva que se tiene una adecuadaprecisión en los niveles efectuados, yaque cumple con lo estipulado para laaceptación de los coeficientes de varia-ción, tanto para repetibilidad comopara reproducibilidad. El método des-arrollado se declara validado por cum-plir los parámetros del objetivo devalidación.

Las recuperaciones del materialde referencia certificado, analizado coneste método, son mayores al 96% y seencuentra dentro de los valores acep-tables del certificado.

Los resultados del estudio de-muestran que cuando sucede un de-rrame de crudo, se puede dar unacontaminación no solamente del re-curso suelo, sino también de las aguasde ríos o reservas subterráneas existen-tes, debido a que los TPH’s logran mi-grar verticalmente por efecto del aguade percolación a través del suelo.


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DETERMINACIÓN, CUANTIFICACIÓNY COMPARACIÓN DE LA

CONCENTRACIÓN DE VITAMINA CEN NARANJA (Citrus aurantium), LIMÓN (Citrus aurantifolia)

Y MANDARINA (Citrus reticulata) POR HPLC

DETERMINATION, QUANTIFICATION ANDCOMPARISON OF THE CONCENTRATION THE

VITAMIN C IN ORANGE (Citrus aurantium), LEMON (Citrus aurantifolia) AND TANGERINE

(Citrus reticulata) BY HPLC

FERNANDA MONTAÑO A.PABLO POZO P.


RESUMEN

Se determinaron las condicio-nes analíticas adecuadas para cuantifi-car vitamina C en: naranja (Citrusaurantium), limón (Citrus aurantifolia) ymandarina (Citrus reticulata), por croma-tografía líquida de alta eficiencia condetector ultravioleta-visible (HPLC UV-VIS), mediante la utilización de ácidometafosfórico al 6%, para la extracción.

El método consistió en determi-nar las condiciones óptimas para cuan-

tificar la concentración de vitamina C,ya que esta es inestable y fotosensible;por ello, fue importante conocer los pa-rámetros que eviten las pérdidas delanalito. Estos parámetros fueron: canti-dad de muestra, eluyente y tiempo deanálisis. Se optimizaron las condicionescromatográficas para HPLC con una co-lumna C18, marca Waters, 5 μm de par-tícula, 150 x 3.9 mm de diámetro, lascondiciones establecidas fueron: fasemóvil metanol: agua con una elusiónisócratica de 90:10, cantidad de muestrade 20 µL, flujo 1.2 mL/min, longitud de

DETERMINACIÓN, CUANTIFICACIÓNY COMPARACIÓN DE LA

CONCENTRACIÓN DE VITAMINA CEN NARANJA (Citrus aurantium), LIMÓN (Citrus aurantifolia)

Y MANDARINA (Citrus reticulata) POR HPLC

Fernanda Montaño A.1 & Pablo Pozo P.1

Palabras Claves: Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia, vitamina C,extracción, fotosensible

Key words: High Perfomance Liquid Chromatography, vitamin C, extrac-tion, photosensitive

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Escuela de Cien-cias Químicas ([email protected]) ([email protected]).

79

Revista PUCE. ISSN 1013-89x. Núm. 943 mayo-3 nov 2012. Montaño & Pozo. pp. 77-92

INTRODUCCIÓN

Las vitaminas son sustancias or-gánicas esenciales para el funciona-miento celular, el crecimiento y eldesarrollo normal. No son sintetizadasen el organismo y por tanto se debenobtener de fuentes externas. Las vitami-

nas son sensibles a diferentes agentesfísicos y químicos, la más sensible detodas es la vitamina C, debido a que sedegrada fácilmente por cambios detemperatura, exposición a la luz solar yconcentración de oxígeno (Ferreira,

80

DETERMINACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE VITAMINA C EN NARANJA (C i t r u s a u r a n t i u m), LIMÓN (C i t r u s a u r a n t i f o l i a) Y MANDARINA (C i t r u s r e t i c u l a t a) POR HPLC

onda 245 nm y se trabajó a temperaturaambiente, evitando siempre la presen-cia de luz solar.

Se determinó la cantidad de vi-tamina C en los frutos cítricos a partir dela elaboración de tres curvas de calibra-ción para cada día de análisis, con elempleo de un estándar de ácido ascór-bico certificado; dando como resultadoque la naranja (Citrus aurantium) con-tiene 56.46 mg/100 g, limón (Citrus au-rantifolia) 41.57 mg/100 g y mandarina(Citrus reticulata) 32.75 mg/100 g.

ABSTRACT

Analytical conditions where de-termined suitable for quantify vitamin Cin: orange (Citrus aurantium), lemon(Citrus aurantifolia) and tangerine (Citrusreticulate), by high performance liquidchromatography with ultraviolet-visi-ble detector (HPLC UV-VIS), using an ex-traction with 6% metaphosphoric acidsolution.

The aplication of this methodwas to try the optimum conditions todetermine the concentration of vitaminC, because this is unestable and photo-sensitive, for that, it was important toknow the circumstances that evadedanalyte loss. These circunstances were:sample amount, eluent and analysistime. The chromatographic conditionswere optimized to HPLC with a C18 col-umn, brand Waters, 5 µm of particle di-ameter, 150 x 3.9 mm diameter, theestablished conditions were: mobilephase methanol : water with an iso-cratic elution of 90:10, sample amountof 20 µL, 1.2mL/min flow, wavelength245nm and room temperature, alwaysevading sunlight presence.

Vitamin C in citric fruits was de-termined from the elaboration of 3 cal-ibration curves for the day of analysis,using a certified ascorbic acid standard;giving results that in orange we have56.46 mg/100 g, lemon, 41.57 mg/100g and tangerine 32.75 mg/100g

I METODOLOGÍA

Preparación de la muestra: lasfrutas se lavan y se rebanan en mitadespara obtener el jugo mediante un ex-tractor eléctrico. Se mide el contenidode los sólidos solubles totales (gradosBrix) del jugo de cada fruta mediante unrefractómetro que determina el puntoóptimo de consumo. Los grados Brix re-

comendados en cítricos fluctúan entre(9 - 12 grados) (Roig et al. 1998).

Después de constatar su puntoóptimo se procede a estabilizar el jugode la fruta extraído, para evitar princi-palmente la oxidación de vitamina C. Sepesa por triplicado 5 g de la muestra y

81


2005). La vitamina C es una vitamina hi-drosoluble que se encuentra de formanatural en varias frutas y verduras.

Debido a que la vitamina C estermolábil se tiene una variación de laconcentración con el paso del tiempopor esto, es importante establecer losmecanismos que afectan su estabilidady que influyen en el tiempo de vida útil.Por su inestabilidad es necesario utilizaruna técnica sensible y rápida que per-mita evaluar su concentración (Serra,2007).

Para este estudio se tomarontres frutos cítricos como variable, consi-derados de mayor consumo, como son:naranja (Citrus aurantium), limón (Citrusaurantifolia) y mandarina (Citrus reticu-lata). La toma de muestras se realizó entres lugares de expendio de frutas; serecolectaron 10 muestras diarias entrenaranjas, limones y mandarinas.

El objetivo de este trabajo fue elde aplicar un método analítico para ex-traer, identificar y cuantificar la vitaminaC en naranja, limón y mandarina, al con-siderar la inestabilidad de esta vitamina.Además, la comparación entre el con-tenido de vitamina C presente en losfrutos analizados.

Para la cuantificación se utilizó latécnica de cromatografía liquida de altaeficiencia (HPLC) con detector (UV-VIS),columna C18, flujo 2 mL/min., y tiempode análisis de 5 min., técnica que ofrecelas siguientes ventajas: menor tiempode análisis, debido a que la técnica esautomática en comparación con méto-dos tradicionales volumétricos y la apli-cación de un agente extractante comoel ácido metafosfórico al 6%, que per-mite estabilizar el ácido L-ascórbico y asípoderlo cuantificar.


82

se afora a 50 mL con ácido metafosfó-rico al 6%. Se analiza por triplicado cadamuestra y por tres días en las mismascondiciones cromatográficas (Tabla 1).

Tabla 1: Número de muestras analizadas para cada día

Muestras

día Curva de Naranja limón Manda-calibración rina

1 1 3 3 42 1 4 3 33 1 3 4 3

ToTal 3 10 10 10

solución de trabajo: a partirdel estándar de ácido ascórbico con pu-reza del 100%, se prepara una soluciónpatrón de 1000 mg/L (se pesa 0.1 g deácido ascórbico en 100 mL de ácidometafosfórico al 6%); esta solución espreparada nuevamente cada día decomparación, se la utiliza para elaborarlas curvas de calibración y para identifi-car la concentración de ácido ascórbicopor comparación.

Ácido metafosfórico al 6%: sepesa 60 g del ácido y se afora a 1L conagua destilada para HPLC.

Tabla 2: volúmenes de ácido ascórbico que se deben tomar para la preparación de

soluciones de calibración a partir de la solución madre

Nivel alícuota volumen Concentra-(ml) de aforo (ml) ción (mg/l)

1 0.5 50 102 2 50 403 2 25 804 5 50 1005 4 25 160

Condiciones cromatográficas• Fase móvil: metanol-agua• Gradiente: (90:10) (V/V)• Flujo: 1.2 mL/min• Volumen de inyección: 20 µL• Temperatura de la columna: 25°C• Detector: UV-VIS• Longitud de onda de detección: 245nm

Una vez determinadas las con-diciones cromatográficas se establecenlas curvas de calibración con las solu-ciones de concentración conocida(Tabla 2) y se determina el tiempo deretención, inmediatamente se inyectanlas disoluciones preparadas con lasmuestras estabilizadas. El tiempo deanálisis del equipo es de 5 min. Las ex-tracciones y estándares se inyectan portriplicado para evaluar la precisión delmétodo, por lo tanto se tendrán 30 re-sultados al día.


83

Para el cálculo de la concentra-ción de ácido L-ascórbico se parte de larelación entre la concentración cono-cida del estándar y el área del pico co-

rrespondiente; así, si se aprecia el áreadel pico de cada muestra, se puede cal-cular su concentración respectiva.

II RESULTADOS

Figura 1: Curva de calibración, a partir de soluciones de concentración conocida, para el análisis del día 1



84

Tabla 3: lectura de los estándares de calibración para el análisis de las muestras, de los días 1, 2 y 3

CoNCeNTraCIÓN

Área (mv*min) esTÁNdares día

(mg/l) 1 2 3

1 0 0 0 0 2 10 0,7 0,6 0,6 3 40 1,6 1,5 1,5 4 80 3,0 2,9 2,9 5 100 3,4 3,7 3,7 6 160 5,8 5,7 5,7


Después de obtener los resul-tados de las tres curvas de calibración,se calcula la media y la desviación es-

tándar de los coeficientes de correla-ción lineal, las pendientes y los inter-ceptos (Tabla 4)


85

Tabla 4: resumen de las curvas de calibración, coeficiente de correlación lineal, interceptos, medias aritméticas y desviación estándar

Curva Coeficiente de Pendiente Intercepto correlación lineal (m) (b)

(r2)

Día 1 0.9956 0,0350 0,1404Día 2 0,9984 0,0349 0,1215Día 3 0,9991 0,0360 0,0693

Medias (x) - 0,0353 0,1104Desviación estándar (s) - 0,0006 0,0368

Límite inferior (x-3s) - 0,0335 0,0000Límite Superior (x+3s) - 0,0371 0,2209

Con los datos anteriores (Tabla4) se definen los límites de aceptacióno rechazo que sirven para determinarparámetros de control en análisis futu-ros, además se demuestra la robustezdel método al generar curvas reprodu-cibles. Los coeficientes de correlaciónpara el ajuste de las curvas de calibra-ción son mayores a 0.99, lo cual de-muestra que el ajuste a una funciónlineal es válido para la relación res-puesta - concentración.

Se pueden observar las me-dias aritméticas de la concentración devitamina C, determinada para la na-ranja, limón y mandarina (Tabla 5).

Tabla 5: resultados del promedio de la concentración por triplicado

para los tres días de análisis

CoNCeNTraCIÓN (mg/100g) MUesTra

día 1 día 2 día 3 X

Naranja 56.20 56.93 56.25 56.46 Mandarina 32.90 32.69 32.67 32.75

Limón 41.31 41.75 41.64 41.57

Para verificar estadísticamente silos resultados presentaron variacionessignificativas, se realizó la prueba esta-dística ANOVA de un factor (Tabla 6).


86

Tabla 6: aNova de un factor

descriptivos

Intervalo de confianza

Muestras/días N Mediadesviación error para la media al 95%

Mínimo Máximotípica típico límite límiteinferior superior

Naranja 1 9 56.2011 10.97176 3.65725 47.7675 64.6348 47.96 71.362 9 56.9322 6.37101 2.12367 52.0350 61.8294 51.16 65.583 12 56.2542 3.25633 .94002 54.1852 58.3231 52.09 62.19

Total 30 56.4417 6.96668 1.27194 53.8403 59.0431 47.96 71.36

Mandarina 1 9 32,6678 ,60369 ,20123 32,2037 33,1318 31,87 33,402 9 32,6844 2,79377 ,93126 30,5370 34,8319 29,16 35,843 12 32,9042 1,86829 ,53933 31,7171 34,0912 29,43 34,66

Total 30 32,7673 1,89490 ,34596 32,0598 33,4749 29,16 35,84

Limón 1 9 41,3078 3,34935 1,11645 38,7332 43,8823 38,04 46,042 9 41,6411 ,73974 ,24658 41,0725 42,2097 40,43 42,723 12 41,7525 1,53695 ,44368 40,7760 42,7290 39,52 43,69

Total 30 41,5857 2,04403 ,37319 40,8224 42,3489 38,04 46,04

aNova

Muestrasuma de

glMedia

F sig.cuadrados cuadrática

Naranja Entre días 3,108 2 1,554 ,030 ,971Dentro de días 1404,396 27 52,015

Total 1407,504 29

Mandarina Entre días ,376 2 ,188 ,049 ,952Dentro de días 103,753 27 3,843

Total 104,128 29

Limón Entre días 1,057 2 ,528 ,119 ,888Dentro de días 120,107 27 4,448

Total 121,164 29


87

Al realizar ANOVA de un factorse puede demostrar que los valores delos resultados entre días de análisis novarían significativamente, día 1 es igualal 2 y al 3; por lo tanto se acepta la hi-

pótesis nula. Otro factor para aceptaresta hipótesis es que al analizar las me-dias no hay diferencia sobre la variaciónde cada grupo el día 1 > 2 > 3.

III DISCUSIÓN

El método de extracción utili-zado en esta investigación es el ade-cuado debido a que presenta recu pera-ciones similares a las obtenidas en otrosestudios realizados (AOAC, 2005), noexisten pérdidas de la cantidad de vita-mina C y los picos obtenidos en la se-paración cromatográfica no presentanninguna interferencia, son fácilmentecuantificables.

La extracción directa del jugo ysu inmediata dilución con ácido meta-fosfórico al 6%, logra obtener la vita-mina C y al mismo tiempo estabilizarla,para proceder con el análisis estable-cido sin realizar ningún proceso poste-rior; esto demuestra cierta ventajafrente a otras alternativas para lograr suestabilidad con la utilización de sustan-cias como: ácido cítrico, ácido benzoico,benzoato de sodio y sorbato de potasio(Cantarow & Schepartz, 1964), (Brauseet al., 2003).

Se escogió la fase móvil meta-nol: agua (90:10) para la determinaciónpor HPLC debido a que, luego de laspruebas realizadas, dicha fase logró unamejor separación del pico (mayor reso-lución) y permitió acortar el tiempo decorrida de 20 min., a 5 y obteniéndoseresultados similares a otras técnicas queutilizan LC y distinta fase móvil para elanálisis (Brause et al., 2003).

La optimización del método serealizó al probar diferentes columnas ci-tadas en la bibliografía (Macrae, 1988),(Cantarow & Schepartz, 1964), la co-lumna que dio mejor resultado es la uti-lizada en este método (Columna C18,marca Waters, 5 μm de tamaño de partí-cula y de diámetro 150 x 3.9 mm), debidoa que los picos tienen una óptima reso-lución (Figura 4).


88

No. ret.Time NoMbre Height Área rel.Área Conc. Type

min mv mv % g/100g

1 3,09 Ácido Ascórbico 21 1,83488 97,197634 50,275 BMb

Nombre de la muestra M1 NaranjaPrograma instrumental: VITAMINA CMétodo de cuantificación: VITAMINA CTiempo de corrida (min): 5,00

Figura 4: Cromatogramas de las concentraciones de vitamina C, utilizados para cuantificar

IV CONCLUSIONES

El proceso de la determinacióndel ácido L-ascórbico utilizado nos per-mite estabilizarlo y tener una adecuadacuantificación sin problemas debido asu inestabilidad y termolabilidad.

El método utilizado para el aná-lisis de la vitamina C en el jugo de frutoscítricos naranja, mandarina y limón, me-diante HPLC, logra el aislamiento, ex-tracción, separación de interferencias,detección y cuantificación adecuada de


89

dichos compuestos en un rango de 10a 160 mg/100g. Cuando la concentra-ción es menor a 10 mg/100g, el mé-todo sería ineficiente debido a su bajareproducibilidad.

Mediante este método analítico,es posible cuantificar ácido L-ascórbicoen corto tiempo (5 minutos por mues-tra) con el uso de pequeñas cantidadesde muestra 20 µl.

La elaboración de curvas de ca-libración diarias, aseguran la confiabili-dad de los resultados, debido a que secuenta con soluciones estándares fres-cas; condición primaria como conse-cuencia de la inestabilidad de lavitamina C.

AGRADECIMIENTO

A los Drs. Carlos López y GermánicoSilva, directivos y al personal de CENTROCE-SAL CIA. LTDA. Quito, Pichincha, Ecuador,

por su valiosa colaboración, al permitirnosla utilización de materiales y equipos para elanálisis.


90

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FORMULACIÓN DE UN FITOFÁRMACO A PARTIR DE LASHOJAS DE Ocotea quixos (Lam.)

Kosterm. (ishpingo)

FORMULATION OF A PHYTOMEDICINEFROM LEAVES OF Ocotea quixos (Lam.)

Kosterm. (ishpingo)

Yolanda Jibaja A.Marco Dehesa

Migdalia Miranda


RESUMEN

En esta investigación se formulóun fitomedicamento a partir de lashojas de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.,para ofrecer a la industria nacional unanueva formulación que debidamenteestandarizada podría beneficiar a las co-munidades indígenas, al contar con unmedicamento de origen natural, efec-tivo y a bajo costo, además posibilitaría

mejorar la situación económica si sedesarrollan cultivos de la especie.

Se estandarizó el extracto fluidode hojas obtenido por maceración, quesirve como materia prima para la elabo-ración del fitomedicamento. Los pará-metros de calidad analizados sonaceptables y por lo tanto permiten se loconsidere como tal. A partir de este ex-tracto se diseñó la formulación: tintura

FORMULACIÓN DE UN FITOFÁRMACO A PARTIR DE LASHOJAS DE Ocotea quixos (Lam.)

Kosterm. (ishpingo)

Yolanda Jibaja A.1, Marco Dehesa2, Migdalia Miranda3

Palabras Claves: Ocotea quixos (Lam.) Kosterm., aceite esencial, fitofármaco,ishpingo, extracto

Key words: Ocotea quixos (Lam.) Kosterm., essential oil, phytomedicine, ish-pingo, extract

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Quito, Ecuador([email protected]).

2 Universidad Politécnica Salesiana, Quito, Ecuador. 3 Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana, Cuba.

95

REVISTA PUCE. ISSN 1013-89X. NÚM. 943 mayo-3 nov 2012. Jibaja, Dehesa & Miranda. PP. 93-111

FORMULACIÓN DE UN FITOFÁRMACO A PARTIR DE LAS HOJASDE Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. (ishpingo)

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al 40% en etanol al 40%, la misma quepresentó características organolépticasaceptables y parámetros de calidad quecorresponden a los establecidos paraeste tipo de formulaciones. La tinturademostró buena estabilidad en vida deestante durante el tiempo que duró elestudio; sin embargo es necesario rea-lizar un estudio de estabilidad a tiem-pos prolongados, con inclusión de suefectividad antimicrobiana.

El estudio se realizó con unamuestra tomada en Archidona, provin-cia del Napo, Ecuador; se desarrolló enlos Laboratorios de la Universidad Poli-técnica Salesiana y contó con el auspi-cio del Proyecto VIS-UPS.

ABSTRACT

This research developed a phy-tomedicine or drug from the leaves ofOcotea Quixos (Lam.) Kosterm, to offerto the national domestic industry a newformulation that properly standardizedcould be a benefit to the community,

we could have a natural medicine, ef-fective and at low cost.

We standardized fluid extractobtained by maceration of leaves, usedas raw material for the production ofphytomedicine or drug. The quality pa-rameters analyzed are acceptable andtherefore allow it considered as such.From this extract is designed the formu-lation: 40% dye in ethanol 40%, thesame presented reliable organolepticcharacteristics and parameters of ac-ceptable quality that correspond withthose established for this type of formu-lations. The dye showed good shelf lifestability during the period of the study,but it is necessary to conduct a study ofprolonged stability, including its antimi-crobial effectiveness.

The study was conducted witha sample taken in Archidona, provinceof Napo, Ecuador; was developed in thelaboratories of the Universidad Politéc-nica Salesiana and was sponsored byProject VIS-UPS.

INTRODUCCIÓN

Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.,es el nombre científico para el ishpingo,una Lauraceae que crece en las estriba-ciones orientales andinas y en la regiónAmazónica del Ecuador y posiblemente

al sur de Colombia, el uso principal enel Ecuador tanto de los cálices leñososcomo de la corteza de las ramas escomo aromatizante; en el campo de lamedicina tradicional se lo ha utilizado


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como infusión para atenuar los doloresestomacales y en forma de tintura paracalmar el dolor de piezas dentales(White, 1985); se ha empleado y aún seemplea como especería para aromati-zar ciertas comidas, como un postre es-pecial que se sirve el 2 de noviembredenominada “colada morada” y tambiénen algunas preparaciones de chicha demaíz.

Es conocido en el Ecuador condiferentes nombres vernáculos, entre loscuales se destacan: canela amazónica,ca ne la de quijos, canela americana, ca-nelo, ispingu o ishpingo. El hábitat natu-ral de este árbol es el bosque húmedotropical de la Amazonía ecuatoriana; seencuentra entre 310 y 1250 msnm y sedestaca por ser endémico de este lugar.Es un árbol perenne de 8-12 m de altura;

las hojas de 14.5-23.5 cm de longitudpor 3.5-6 cm de ancho, olor a canela, florblanco-verdosa, cáliz persistente de seissépalos y fruto ovalado de 4 cm de lon-gitud. La especie florece y fructifica cadados años cuando alcanza por lo menosquince años de madurez.

La parte más utilizada es la cáp-sula (estructura que rodea la base de lasemilla), es dura y en forma de som-brero cónico; molidas se usan para darsabor a dulces y comidas, contiene acei-tes esenciales semejantes a los de la ca-nela. La bibliografía reporta a los cálicesleñosos como la parte del vegetal tradi-cionalmente utilizados con olor a cin-namon (Naranjo, 1981), constituidoprincipalmente por cinnamaldehido, o-metoxicinnamaldehido, ácido cinámicoy metil cinamato (Naranjo et al., 1995).

I OBJETIVOS

objetivo General:

Diseñar un fitofármaco estable y útilcomo antimicrobiano a partir de lashojas de Ocotea quixos.

objetivos específicos:

• Realizar el estudio farmacognóstico delas hojas y cálices de Ocotea quixos.

•Extraer el aceite esencial de las hojas ycálices de Ocotea quixos y compararsu rendimiento y propiedades físico-químicas.

•Determinar la fracción bioactiva de lashojas de Ocotea quixos.


98

recolección y preparación del mate-rial vegetal

Los cálices y las hojas de Ocotea quixosse colectaron según normas estableci-das (CYTED, 1993), en Archidona, pro-vincia del Napo, Ecuador (00° 45´ 00” S77° 48´00´´ W); es una zona de clima cá-lido-húmedo caracterizada por una di-versa flora y fauna, una amplia redhidrográfica, abundantes precipitacio-nes atmosféricas y temperaturas que os-cilan entre 25-30°C. Los ejemplarescolectados se colocaron dentro de hojasde papel periódico dobladas por lamitad, para proceder a su herborizacióny finalmente un ejemplar se envió alHerbario de la Universidad Católica parasu comprobación taxonómica.

Las hojas y cálices se lavaron con aguapotable y desinfectaron con una solu-ción de hipoclorito de sodio al 10% du-rante 30 minutos; se escurrió el agua y secolocaron en bandejas correctamenteidentificadas para el secado a tempera-tura ambiente. El material seco se troceómanualmente y guardó en fundas depapel para protegerlos de la luz.

valoración de las drogas

Para la evaluación macromorfológica

de hojas y cálices, se utilizó una muestrade 50 hojas, se determinó el largo yancho con una regla graduada para elposterior análisis estadístico.

Para la evaluación físico-química se de-terminó el porcentaje de cenizas tota-les, cenizas solubles en ácido y hume-dad, según la norma cubana (NRSP 309,1992).

Se identificaron los metabolitos secun-darios presentes en hojas y cálices porla técnica de Tamizaje fitoquímico des-crita por Miranda & Cuellar (2001).

Control microbiológico de hojas ycálices de Ocotea quixos

Para el control microbiológico se realizóel conteo total de microorganismos y elcontrol de microorganismos específi-cos, se trabajó con la metodología plan-teada por la Organización Mundial de laSalud (OMS, 1998).

extracción, cuantificación y caracte-rización preliminar del aceite esen-cial de Ocotea quixos

Se extrajo el aceite de una muestra secade 100 g, mediante hidrodestilación du-rante dos horas, la emulsión fría aceite-

II MATERIALES Y MÉTODOS


99

agua se saturó con cloruro de sodio. Seañadió éter etílico, se agitó y dejó en re-poso hasta que estén separadas lasfases. Se eliminó el agua de la capa eté-rea con sulfato de sodio anhidro, el éterse retiró por evaporación y se deter-minó el rendimiento.

Se realizó la caracterización físico-quí-mica del aceite esencial (color, olor,densidad relativa y el índice de refrac-ción) y se analizaron muestras de aceiteesencial obtenidos de tres destilacionesseparadas por cromatografía de gases.

determinación de la fracción bioac-tiva de las hojas de Ocotea quixos

Se comprobó la actividad inhibitoria deextractos, fracciones acuosas y aceiteesencial frente a varios microorganis-mos. Para obtener los extractos fluidosse trabajó según la Norma Cubana paraextractos vegetales (NRSP 311, 1992).Para comprobar la actividad antimicro-biana se procedió según la Técnica deBauer-Kirby (CYTED, 1991). Se utilizaronlos microorganismos: Bacillus subtilis(ATCC 6633), Cándida albicans (ATCC10231), Escherichia coli (ATCC 8739),Pseudomona aeruginosa (ATCC 9027),Staphylococcus epidermidis (ATCC12228), Staphylococcus aureus (ATCC6538), Streptococcus sp., y Proteus sp.,

procedentes del laboratorio de Micro-biología de la Universidad Católica.Como controles positivos se emplearonGentamicina, Ampicilina y Fluconazol,procedentes de los Laboratorios LIFE,Acromax y Pfizer y como controles ne-gativos se emplearon los vehículos enlos cuales se encontraban las muestras.

especificaciones de calidad del ex-tracto fluido de hojas de Ocotea qui-xos en etanol al 80%

Se determinaron los parámetros pH, ca-racterísticas organolépticas, índice derefracción, densidad relativa, contenidode sólidos totales, contenido alcohólicoy análisis capilar según la Norma Cu-bana para extractos vegetales (NRSP312, 1992) y el contenido de aceitesesenciales por hidrodestilación (OMS,1998).

Formulación de un fitomedicamentoa partir del extracto fluido de lashojas de Ocotea quixos

Se diseñó la formulación del fitomedi-camento y se evaluaron sus propieda-des organolépticas, pH, densidadrelativa, índice de refracción, contenidoalcohólico, contenido de aceite esencialy estabilidad natural.

FORMULACIÓN DE UN FITOFÁRMACO A PARTIR DE LAS HOJAS DE Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. (ishpingo)

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estudio Farmacognóstico de Ocoteaquixos

La evaluación macromorfológica dehojas y cálices de O. quixos reporta lassiguientes características:

Hojas: forma: peciolada, acuminada,aguda, entera, coniforme, palminervia.Textura: coriáceas. Superficie: glabra.Color: envés verde - amarillento. Olor:muy agradable, dulce al masticar. De13.4 cm de largo y 4.1 cm de ancho.Muy brillantes.

Cálices: forma: semejan pequeños em-budos con los bordes dirigidos al exte-rior de 3 cm de diámetro por 4 cm delargo. Resistentes a la presión manual,de color café oscuro, de olor muy agra-dable, con un peso promedio de 2.67 g.Presentan rugosidades en los bordesexternos.

Las observaciones corresponden conlas señaladas por Gupta (1995) con res-pecto a los cálices; la misma fuente serefiere a las flores frescas de la planta,que no pudieron ser observadas ni co-lectadas, debido a que la fecha de reco-lección (junio) no coincidió con laépoca de floración de la especie.

Parámetros de control de calidad

El contenido de cenizas totales en hojasy cálices (4.78 y 2.8% respectivamente)se encuentra dentro de los rangos esta-blecidos por la OMS (1998) y USP(2001), de esos valores, más del 50% sonsolubles en agua en el caso de las hojas(2.8%) y casi la totalidad de los obteni-dos de cálices (2.7%), lo cual sugiereque se trata de metales de baja toxici-dad o material de tipo orgánico. El por-centaje de humedad residual en hojasy cálices (8 y 12% respectivamente), co-rresponde a valores comprendidosdentro del rango establecido para dro-gas vegetales (Miranda, 2001; Sharapin2000). Tabla 1.

Tabla 1: evaluación físico-química de hojas y

cálices de Ocotea quixos (lam.) Kosterm

eNsayo HoJas CÁlICes

Cenizas totales 4.8 % 2.8 %Cenizas solubles en agua 2.8 % 2.7 %Humedad 8.0 % 12.0 %

Tamizaje fitoquímico:

El tamizaje fitoquímico constituye uno

III RESULTADOS Y DISCUSIÓN


101

de los análisis que se utiliza para la de-terminación cualitativa de los principa-les grupos de constituyentes químicospresentes en las plantas. Los resultados

del tamizaje fitoquímico en los extrac-tos acuoso, alcohólico y etéreo de lashojas y cálices de Ocotea quixos, se pre-sentan en la Tabla 2.

Tabla 2: Tamizaje fitoquímico de hojas y cálices de Ocotea quixos (lam.) Kosterm

eXTraCToMeTabolITo etéreo alcohólico acuoso

Hojas Cálices Hojas Cálices Hojas Cálices

Aceites y grasas +/- +/-

Alcaloides - - - - - -

TriterpenosEsteroides - - - -

Saponinas + + + +

Azúcares Reductores + + + +

Fenoles y taninos + + + +

Aminoácidos - -

Flavonoides + + + +

Cardenolidos + +

Quinonas - -

Antocianidinas + +

Mucilagos - -

Los metabolitos secundarios identifica-dos son saponinas, azúcares reductores,fenoles y taninos, flavonoides y aceitesesenciales, estos aunque no dieron unafranca reacción con Sudán, se detecta-ron por su intenso aroma. Los metabo-litos taninos y glúcidos corresponden a

los componentes mayoritarios identifi-cados en la canela (Hussain, 1988).

Control microbiológico

Los valores de aerobios totales (300UFC/g y 340 UFC/g) en hojas y cálices


102

respectivamente, están dentro de losrangos establecidos por la OMS (WHO,1998), referente a límites permitidos

para drogas crudas no tratadas, el en-sayo para determinar mohos y levadu-ras fue negativo. Tabla 3.

Tabla 3: Control microbiológico de hojas y cálices de Ocotea quixos. Contaje en placa

resUlTadosMICroorGaNIsMos Hojas Cálices límites

máximos*

Aerobios totales 300 UFC/g 340 UFC/g 107 UFC/gMohos y levaduras < 10 upml/g < 10 upml/g 105 upml/g

* (OMS, 1998)

El ensayo para microorganismos espe-cíficos, Tabla 4, reporta la presencia deColiformes, Salmonella y Pseudomona enhojas, revela la contaminación de ladroga en el momento de la colección ytransporte y un mal lavado del materialvegetal en el laboratorio, en el caso delos cálices el ensayo para Salmonella espositivo.

Estos resultados indican la necesidad derealizar controles rigurosos e incremen-tar la desinfección del material vegetal,antes de emplearlo para la elaboraciónde un fitomedicamento

Tabla 4: Control microbiológico para microorganismos específicos

MICroorGaNIsMoPreseNCIa de

MICroorGaNIsMos

Hojas Cálices

Coliformes + -Salmonella + +Staphylococcus aureus - -Pseudomona + -

rendimiento y características físico -químicas del aceite esencial de Oco-tea quixos

Para extraer el aceite esencial de hojasy cálices se empleó el método de hidro-


103

destilación. El rendimiento del aceiteesencial de cálices fue de 1.24%, obte-nido después de 2 horas de destilacióncon el empleo de cálices troceados ma-nualmente. Guerrini et al., (2006) re-portó el 1.9% de rendimiento mediantehidrodestilación acoplada al aparatocomercial Clevenger después de 8horas de destilación; la literatura no in-forma datos respecto a aceite esencialextraído de hojas, pero en este caso elrendimiento fue del 0.88%.

Las características físico - químicas delaceite esencial se indican en la Tabla 5,la densidad relativa e índice de refrac-ción son más altos para el aceite esen-cial de las hojas comparado con el delos cálices.

Tabla 5: Características físico - químicas delaceite esencial de Ocotea quixos

Parámetro Hojas Cálices

Rendimiento 0.88% 1.24%

OlorDulce, Dulce,

agradable agradable

ColorAmarillo Amarillo

claro claro

Índice de 1.59 1.57refracción

Densidad 0.93 0.77

análisis cromatográfico del aceiteesencial de Ocotea quixos

El análisis por Cromatografía de gasesdel aceite de cálices, Figura 1, revela lapresencia de dos picos importantes contiempos de retención: 12.213 y 13.718minutos; en tanto que en el aceite dehojas, Figura 2, se observaron tambiéndos picos importantes con una ligeravariación en sus tiempos de retención(12.117 y 13.677 minutos) respecto alaceite de cálices.


104

De acuerdo con estos resultados se asu-mió que desde el punto de vista cuali-tativo las dos partes del material vegetalpresentan composición muy similar,por lo cual se puede considerar que eluso de las hojas, es la forma más viable

respecto a los cálices ya que estos noestán disponibles todo el tiempo, porcuestiones fisiológicas del ciclo vegeta-tivo del árbol de ishpingo, por estarazón se continuó con la evaluación delas hojas.

Figura 1: análisis cromatográfico, GC, del aceite esencial de cálices de Ocotea quixos (lam.)

Kosterm

Figura 2: análisis cromatográfico, GC, del aceite esencial de hojas de Ocotea quixos (lam.)

Kosterm


105

determinación de la fracción bioac-tiva de las hojas de Ocotea quixos

Los hidrodestilados remanentes de ladestilación (fracción sin aceite) no pre-sentaron actividad antimicrobiana, locual indica que esta no puede atribuirsea ningún componente soluble en agua.

De los extractos fluidos analiza-dos, el obtenido en etanol al 80% pre-sentó actividad frente a los microor-

ganismos ensayados, excepto frente aPseudomona aeruginosa.

El aceite esencial presentómayor actividad, desarrolló halos de in-hibición en todos los casos superiores alos desarrollados por los antimicrobia-nos de síntesis empleados como pa-trón, a pesar que las concentracionesempleadas fueron menores, 20μL.(Tabla 6).

Tabla 6: actividad antimicrobiana de hojas de Ocotea quixos

Halos de inhibición (mm)

extracto extracto extracto Fracción Fracción aceite ampici- Cloran-Microorganismo alcohó- alcohó- alcohó- sin aceite sin aceite esencial lina fenicol

lico lico lico 1 2 Control a Control bal 80% al 50% puro

Staphylococcus epidermidis

9 8 19 0 0 42 0 17

Streptococo sp 10 8 23 0 0 40 23 22

Bacillus subtilis 20 11 22 0 0 40 30 35

Pseudomonaaeruginosa

8 5 11 0 0 29 0 0

Cándida albicans >70 0 >70 0 0 >70 >70 >70

Staphylococcus aureus

12 10 14 0 0 40 16 20.5

Proteus sp 11 8 15 0 0 37 21.5 20.5

Escherichia coli 18 10 15.5 0 0 39 17.5 27.5

El análisis de los controles nega-tivos mostró que la actividad antimicro-biana de las diferentes fracciones no se

debía al efecto antiséptico del etanolcomo se ha demostrado en algunos tra-bajos realizados por Egas (1999).


106

Parámetros de calidad del extractofluido en hojas de Ocotea quixos

Los parámetros de calidad delextracto fluido, Tabla 7, muestran las es-pecificaciones de calidad de la materiaprima utilizada para la preparación delfitofármaco. Los parámetros organolép-ticos del extracto fluido no tienen es-tándares de referencia para sucomparación, ya que estos son propiosy característicos de la especie y de laparte de la planta analizada. Los pará-

metros físicos: el pH, 5.7, demuestra lapresencia de compuestos químicos concaracterísticas ácidas débiles como fla-vonoides, taninos, entre otros; el índicede refracción 1.38 es mayor al del agua,revela la presencia de sustancias disuel-tas; los sólidos totales son inferior al lí-mite mínimo establecido por la OMS; elcontenido alcohólico del extracto fluidoes inferior al valor inicial utilizado parala preparación del mismo, lo cual signi-fica que este se pierde por evaporación.

Tabla 7: Parámetros de calidad del extracto fluido de hojas de Ocotea quixos

ParÁMeTro resUlTados

Descripción organoléptica Olor agradable, dulce, similar al de la canela. Líquido homogéneo de color café claro, translúcido, no se observan partículas suspen-didas.

pH 5.7Índice de refracción 1.38Densidad relativa a 20 o C 0.94

Sólidos totales 2.36%Contenido alcohólico 52.64%Contenido de aceite esencial 0.51%Análisis capilar Imagen coloreada en tono café amarillento; normal (6.2 cm); pre-

senta una franja irregularmente dentada translúcida de color café oscuro, la subfranja de un tenue color café de 1.4 cm de amplitud; la banda de color café intenso de 1.3 cm y la sub-banda muy am-plia de color café verdoso.Por efecto de la luz UV de 366 nm la franja se torna de un color verde intenso, el resto de la imagen toma una coloración café ro-jiza. Con vapores de amoníaco la franja presenta una intensa colo- ración amarilla de 2 mm de ancho y el color de la banda es café oscuro.


107

estudio de estabilidad forzada delextracto fluido en etanol al 80%

El análisis por cromatografía encapa delgada, CCD, demostró que des-pués del tratamiento ácido, básico yoxidativo al cual se sometió al extracto,mostró perfiles cromatográficos dife-rentes al del extracto sin degradar; elperfil cromatográfico del tratamientocon luz UV resultó muy similar al ex-tracto sin degradar.

Las soluciones degradadas seanalizaron cualitativamente por croma-tografía de gases, GC, y comparadascon el extracto sin degradar, presenta-ron resultados diferentes.

diseño de la formulación

De acuerdo con el diseño expe-rimental utilizado, se escogió la concen-tración del extracto fluido en la tinturaa formular, de dos variantes de formu-

lación. El análisis estadístico demostróque la tintura al 40% resultó ser la demayor eficacia por su actividad antimi-crobiana a una concentración de 70 μL,presentó los mejores halos de inhibi-ción en todos los microorganismos en-sayados, Tabla 8.

estudio de la estabilidad de la tin-tura al 40%

La tintura seleccionada se some-tió a un estudio de estabilidad naturaldurante 14 días. Los resultados, Tabla 9,demuestran que los parámetros anali-zados se mantienen estables, el pHvarió de 5.5 a 5.6; el índice de refracciónse mantiene constante, 1.36; el conte-nido alcohólico presenta una disminu-ción, puede ser por evaporación deldisolvente y el contenido de aceiteesencial se mantiene en rangos desde0.008 - 0.0070%, la disminución se atri-buye también a una posible evapora-ción.


108

Tabla 8: actividad antimicrobiana de tinturas de hojas de Ocotea quixos

Halos de inhibición (mm.)

Microorganismo Tintura al 20% Tintura al 40% Controles

30μl 50μl 70μl 30μl 50μl 70μl G50μl C50μl F50μl

10.3 11 12 10 12.6 13.6 29 24 St. epidermidis 10 10 11 10.6 11 11.2 30 22

9.2 11 12 10.3 11 13 30 25

0 0 0 0 0 0 30 0 Pseudomona aeruginosa 0 0 0 0 0 0 30 0

0 0 0 0 0 0 28 0

10 10 10 11 11 14 35 30Bacillus subtilis 10 10 10 10 11 12 35 31

9 10 10 10 11 12 35 30

10 11 12 11 13 13 30 0Cándida albicans 9 10 11 11 12 13 30 0

8 10 10 10 11 12 30 0

0 10 9 10 12 13 24St. aureus 0 8 10 10 11 12 24

0 8 10 10 11 13 24

0 0 0 0 0 0 22E. coli 0 0 0 0 0 0 22

0 0 0 0 0 0 22

0 0 8 7 8 9 24Streptococo sp 0 0 7 7 8 9 24

0 0 7 7 8 9 24

Proteus sp. 0 0 8 0 0 8 120 0 8 0 0 8 13

Leyenda: C: Cloranfenicol, F: Fluconazol, G: Gentamicina


109

Tabla 9: estabilidad natural de la tintura al 40% de hojas de Ocotea quixos

Parámetro Tiempo Tiempo Tiempo0 días 7 días 14 días

Descripción organoléptica Líquido café claro Líquido café claro, Líquido café claro,, translúcido, translúcido, translúcido,

olor agradable, olor agradable, olor agradable, dulce dulce dulce

pH 5.5 5.5 5.6

Índice de refracción 1.36 1.36 1.36

Densidad relativa 0.95 0.95 0.95

Contenido alcohólico 41.6% 41.28% 32.23%

Contenido de aceite esencial 0.008 % 0.0072% 0.0070

Temperatura: 19oCHumedad ambiental: 45%Inicio: 4 de abril del 2003Término: 18 de abril del 2003 Tamaño del lote: 200 mL.Envase de la tintura: vidrio ámbar calidad tipo I y tapa rosca de polipropileno

IV CONCLUSIONES

1. Los parámetros de calidad de lashojas y cálices de Ocotea quixos, seencuentran en el rango establecidopara drogas vegetales.

2. Se obtuvieron los aceites esencialesde hojas y cálices, el rendimiento esmenor en las hojas.

3. La caracterización físico - química delos aceites esenciales demostró queel aceite de las hojas, enseñan mayordensidad relativa e índice de refrac-

ción que el aceite de los cálices ydesde el punto de vista cualitativopresentan una composición similar.

4. A través del estudio de la actividadantimicrobiana se demostró que lafracción bioactiva de las hojas de O.quixos corresponde al aceite esen-cial.

5. El extracto fluido de hojas de O. quixosen etanol al 80%, mostró actividadantimicrobiana.


110

6. El estudio físico - químico del extractofluido de hojas de O. quixos en etanolal 80%, permitió establecer especifi-caciones de calidad del mismo,como materia prima para elaborar fi-tofármacos.

7. Se diseñó una tintura al 40% de hojasde O. quixos de calidad farmacéutica

estable al menos por 14 días, en elenvase estudiado y con las condicio-nes de temperatura y humedad am-bientales analizadas, útil como anti -microbiano frente a Staphylococcusepidermidis, Staphylococcus aureus,Cándida albicans y Bacillus subtilis.


111

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LITERATURA CITADA

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ESTRUCTURA QUÍMICA

DEL ANETOL EXTRAÍDO DEL ANÍS ESTRELLADO (Illicium verum) CON

EL PRODUCTO SINTÉTICO Y COMPUTACIONAL

COMPARATIVE STUDY OF THE CHEMICALSTRUCTURE OF ANETHOLE ISOLATED FROM

STAR ANISE (Illicium verum) WITH THE SYNTHETIC AND COMPUTATIONAL PRODUCT

MARÍA FERNANDA PILAQUINGALORENA MENESES


RESUMEN

En el presente estudio se com-paró la estructura química del anetolextraído del anís de la especie Illiciumverum con el producto sintético y com-putacional. La metodología experimen-tal se basó en la extracción, aislamientoy purificación de anetol natural a partirde muestras comerciales de anís estre-llado. El anetol sintético se preparó anivel de laboratorio mediante una reac-ción selectiva a partir de anisol y clorurode propionilo. El modelamiento com-

putacional de la síntesis química se re-alizó en el software Gaussian03 con elempleo del funcional híbrido B3LYP y elconjunto de bases 6-31G (d) y se obtu-vieron los espectros infrarrojos teóricosde los isómeros geométricos cis y transanetol. La caracterización del anetol na-tural, sintético y teórico se realizó porespectroscopia de infrarrojos. Los resul-tados demostraron que la estructuraquímica del principio activo del anís es-trellado fue trans-anetol y del productosintético cis y trans anetol. En el anís es-trellado el rendimiento de aceite esen-

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ESTRUCTURA QUÍMICA

DEL ANETOL EXTRAÍDO DEL ANÍS ESTRELLADO (Illicium verum) CON EL

PRODUCTO SINTÉTICO Y COMPUTACIONAL

María Fernanda Pilaquinga1, Lorena Meneses1

Palabras Claves: Anetol, anís estrellado, síntesis, B3LYP, espectroscopía deinfrarrojos

Key words: Anethole, star anise, synthesis, B3LYP, infrared spectroscopy

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Escuela de Cien-cias Químicas, Quito, Ecuador ([email protected] ).

115

REVISTA PUCE. ISSN 1013-89X. NÚM. 943 mayo-3 nov 2012. Pilaquinga & Meneses. PP. 113-124

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ESTRUCTURA QUÍMICA DEL ANETOL EXTRAÍDO DEL ANÍS ESTRELLADO (I l l i c i u m v e r u m)CON EL PRODUCTO SINTÉTICO Y COMPUTACIONAL

116

cial fue 2,18 %, del cual 1,44 % corres-ponde al trans-anetol. En el anetol sin-tético se obtuvo un rendimiento del58.18%. Finalmente, se comprobó com-putacionalmente que la estructura quí-mica del trans-anetol es más estableque su análogo cis, debido a una dife-rencia energética de 2.63 kcal/mol, espor ello que presenta mayor abundan-cia relativa en la naturaleza.

ABSTRACT

In this research, the chemicalstructure of anethole extracted fromanise of Illicium verum has been com-pared with the synthetic and computa-tional product. The experimentalmethodology carried out extraction,isolation and purification of naturalanethole starting from commercialsamples of star anise. Synthetic anet-hole was prepared by a selective reac-tion starting from anisole and propionyl

chloride. Computational modeling ofsynthesis reaction was carried out inGaussian03 software using the B3LYPmethod and 6-31G (d) basis set. Char-acterization of natural and syntheticanethole was done by infrared spec-troscopy; theoretical IR spectra of cisand trans-anethole were obtained andoptimized. By analyzing experimentaland theoretical spectra, the resultsshowed that the chemical structure ofthe extracted compound correspondsto trans-anethole meanwhile the syn-thetic product had both cis and transanethole. Isolation yield from star anisewas 2.18 % from which 1.44 was trans-anethole; contrary to the syntheticanethole which had a yield of 58.18%.The chemical structure of trans-anet-hole was studied computationally;compared to cis-anethole it showed anenergy difference of 2.63 kcal/mol.Therefore, trans-anethole has greatabundance in nature.

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de modernos mé-todos de análisis instrumental permiteuna identificación exhaustiva de loscomponentes presentes en diferentesplantas, particularmente los responsa-bles del perfil aromático, sutileza y fi-nura de los productos naturales, lo cual

abre nuevas posibilidades en la obten-ción de compuestos interesantes. Conel avance de la Química Computacio-nal, el modelamiento de rutas sintéticasapuesta a la producción de nuevoscompuestos, para propiciar mayoresadelantos en procesos que permiten


117

modificar productos naturales comple-jos con éxito, o se pueden obtener porsíntesis total en un período relativa-mente corto.

El anetol por ejemplo, es el prin-cipio activo responsable del olor carac-terístico y de las propiedades medici-nales atribuidas principalmente al anísde las especies Illicium verum y Pimpine-lla anisum. La importancia de este com-puesto químico se basa en su potencialinterés industrial y científico, ya que seemplea como materia prima en las in-

dustrias: alimenticia, agroindustrial, cos-mética, farmacéutica, licorera y química.

En cuanto a su obtención a tra-vés de procesos de síntesis química, sepresentan disponibles diferentes tiposde reacciones de acuerdo con el isó-mero geométrico deseado tipo cis otrans (ver Figura 1). Sin embargo, el mo-delamiento computacional de este tipode moléculas orgánicas, es una rama dela química que en nuestro país no regis-tra antecedentes.

Cis-anetol Trans-anetol

Figura 1: Isómeros geométricos del anetol(1-metoxi-4-(1-propenil)benceno)

I OBJETIVO

Comparar la estructura químicadel anetol extraído del anís estrelladode la especie Illicium verum con su co-rrespondiente producto sintético ycomputacional mediante un análisis es-

pectroscópico infrarrojo experimental yteórico, para demostrar de esta manerael tipo de isómero geométrico que pre-senta mayor estabilidad y por lo tantoabundancia en la naturaleza.


118

MUESTREO

Muestra: Anís estrellado (Illicium verum) Tipo de muestreo: Norma ISO 948para especias y condimentos lugar de muestreo: bodegas mayoris-tas de especias y condimentos de dife-rentes locales comerciales en la ciudadde Quito

Período de muestreo: las muestras setomaron en cinco períodos correspon-dientes a un mes cada uno para asegu-rar que pertenezcan a lotes diferentes Número total de muestras: 25 Tipo de muestras: la información delas muestras tomadas se indica en laTabla 1

II MATERIALES Y MÉTODOS

Tabla 1: Información de las muestras analizadas

Marca comercial Presentación Tratamiento posterior a la recolección y secado

Sin marca Cajas de 10 Kg NingunoDoña Petra® Empaques de 100 g Tamizado, secado, selección, empacado El Aroma® Empaques de 50 g Tamizado, secado, selección, empacado El Sabor® Empaques de 50 g Tamizado, secado, selección, empacado Mc Cormick® Empaques de 25 g Tamizado, secado, selección, irradiación, empacado

OBTENCIÓN DEL ANETOLDEL ANÍS DE LA ESPECIE Illi-cium verum

El método de extracción delaceite esencial de anís estrellado se re-alizó mediante una destilación simple(Le Fevre, 2000), debido a las ventajasque presenta sobre otras técnicas comodestilación por arrastre de vapor y Soxh-let. La purificación del anetol obtenidoa partir del aceite esencial se realizó por

cromatografía de columna y su identi-ficación por cromatografía de capa finaal emplear como estándar de anetol99.99% de marca Merck®. Al revelar laplaca con ácido fosfomolíbdico al 20%en etanol se observaron manchas encolor azul oscuro correspondientes alanetol. Para caracterización experimen-tal del compuesto se empleó el espec-trofotómetro Perkin Elmer Spectrum BXIR-TF® modelo 75779.

etapa 1

etapa 2

etapa 3


119

SÍNTESIS DEL TRANS-ANETOL

Para la obtención de anetol sin-tético, se realizó una reacción selectivade anisol y cloruro de propionilo (Groveet al. 2006). La reacción consta de tresetapas, en la primera, el anisol es con-vertido en 4-metoxipropiofenona poruna acilación de Friedel-Crafts. En el si-

guiente paso, el grupo cetónico se re-duce al alcohol correspondiente conborohidruro de sodio (NaBH4). Final-mente, el 1-(4-metoxifenil)-1-propanoles deshidratado en presencia de unacatálisis ácida con sulfato ácido de po-tasio (KHSO4) y convertido en anetol(ver Esquema 1).

esquema 1. Preparación del anetol sintético


120

MODELAMIENTO COMPU-TACIONAL

Se empleó el software Gaussian03 para la optimización de las geome-trías de las moléculas que intervinieronen el proceso de síntesis química reali-zado a nivel de laboratorio. Con los va-lores de energía Hartree Fock (HF)

me diante el uso del funcional híbridoB3LYP y la base 6-31G (d), se observó elperfil energético de la reacción. Poste-riormente las frecuencias de vibraciónmolecular se visualizaron con el pro-grama GaussView 3.09. Y, finalmente seobtuvieron los espectros infrarrojos te-óricos del cis y trans anetol.

RESULTADOS

El rendimiento del aceite esen-cial extraído del anís estrellado fue del2.18%. En la Tabla 2, se indica que el re-sultado promedio de anetol naturalpresente en las muestras analizadas fuedel 1.44%. Las propiedades físicas y quí-micas del anetol se muestran en la Tabla3. Por espectroscopia infrarroja se deter-minó que el isómero geométrico pre-sente en el aceite esencial es 100%trans-anetol.

Tabla 2: rendimiento de anetol obtenido

Muestra % trans-anetol

Sin marca 1.39“Doña Petrona” 1.33

“El Aroma” 1.11“El Sabor” 1.61

“Mc Cormick” 1.78c 1.44σ 0.16

Tabla 3: Propiedades físicas y químicas

valores experimentales

Aspecto CristalesColor Transparente-blanquecinoOlor AnisadoSabor PicantePunto de fusión 22.55 °CSolubilidad Diclorometano, hexano

El rendimiento de la reacción desíntesis química realizada en el labora-torio fue del 58.18%, del cual el 81.45%corresponde a trans-anetol y 18.55% decis-anetol. El análisis espectroscópicoconfirmó la presencia de los dos tiposde isómeros en el producto obtenido.

En cuanto al modelamientocomputacional, los resultados indicaronque la energía potencial se incrementamientras las moléculas reaccionan en -


121

tre sí, alcanzan un máximo y los átomosse reacomodan para formar los enlacesquímicos característicos de los produc-tos que finalmente se obtienen. Al com-parar la energía de los isómeros cis ytrans, se observó una diferencia energé-

tica de 2.63 kcal/mol, resultado queconcuerda con cálculos realizados porGrove y colaboradores a nivel de MM(Molecular mechanics) y AM1 (AustinModel 1) como se puede apreciar en laTabla 4.

IV DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La determinación estructural delanetol natural y sintético se realizó porcomparación con el espectro infrarrojo(IR) del estándar de anetol. Al compararlos espectros IR experimentales con losteóricos mostrados en la Tabla 5, se ob-servó una correlación muy similar entrelos picos característicos. La mínima di-ferencia se debe, a que las moléculasmodeladas computacionalmente seoptimizan en fase gaseosa.

La presencia del isómero trans semuestra en la frecuencia 25 con subanda característica a 962.284cm-1, quees similar a la longitud de onda indicadaen los espectros IR del trans-anetol na-tural y sintético. Los picos a 963 y 837.23cm-1 corresponden a enlaces C-H (tor-sión), que confirman la presencia de untrans-alqueno y un enlace doble para-disustituido. Para el isómero cis-anetol,se observó en la frecuencia 23 una

Tabla 4: diferencia energética entre el cis y trans anetol

cis trans

cis-trans

MM 26.36 24.17 2.19 kcalaM1 -7.66 -9.32 1.66 kcalHF -460.50 -463.13 2.63 kcal


122

banda característica a 939.178 cm-1, se-mejante a la longitud de onda del es-pectro IR del anetol sintético.

Tabla 5: Comparación de bandas de los espectros experimentales y téoricos

del anetol natural, sintético y computacional

cis trans Enlace Enlacecm-1 cm-1 C-H C-O-C

Espectro - 963.09 Aromático: 3022.42 Asimétrico: 1282.09del estándar Alifático: 2911.63 Simétrico: 1033.34

Espectro - 963.00 Aromático: 3022.41 Asimétrico: 1282.13anetol natural Alifático: 2911.77 Simétrico: 1034.00

Espectro 930.22 962.78 Aromático: 3022.13 Asimétrico: 1282.22anetol sintético Alifático: 2928.53 Simétrico: 1034.58

Espectro 939.18 962.28 Aromático cis: 3056.71 Asimétrico cis: 1291.39teórico Aromático trans: 3044.90 Asimétrico trans: 1276.39

Alifático cis: 3000.57 Simétrico cis: 1025.83Alifático trans: 3000.36 Simétrico trans: 1024.88

Los espectros IR teóricos del cis-anetol y trans-anetol se muestran en lasFiguras 2 y 3 respectivamente. El nú-mero de modos vibracionales estádado por la expresión 3n-6, donde

n=23 es el número de átomos de lamolécula (C10H12O), que dan como re-sultado 63 modos vibracionales para elanetol, que es exactamente el númerode bandas que presentan los espectros.


123

Figura 2: espectro Ir teórico cis-anetol Figura 3: espectro Ir teórico trans-anetol

Se concluyó mediante un análi-sis espectroscópico infrarrojo experi-mental y teórico, que el anetol naturalcorresponde al isómero geométricotrans y el anetol sintético a las formas cisy trans.

De acuerdo con el modela-miento computacional realizado, la di-ferencia energética entre los isómeroscis y trans fue de 2.63 kcal/mol, con lo

cual se demuestra que el trans-anetoles un producto químicamente estable;de esta manera, se explica porqué en lanaturaleza se produce en un 99%.

Se demostró que el método queproduce mayor cantidad de trans-anetolse obtiene por procesos sintéticos; sinembargo la separación isomérica y elcosto son sus principales desventajas.

V CONCLUSIONES

AGRADECIMIENTO

A la Lic. Carlota Córdova y al Lic. Ramiro Merino por la revisión final de este estudio.


124

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LITERATURA CITADA

PERFIL LIPÍDICO Y CONTENIDO DE ACIDOS

GRASOS TRANS EN PRODUCTOSECUATORIANOS DE MAYOR

CONSUMO

LIPID PROFILE AND CONTENT IN TRANS FATTYACID OF GREATER CONSUMER PRODUCTS

ECUADORIANS

Pablo López ProañoPablo Pozo Pantoja

Andrea Guzmán


RESUMEN

Ecuador experimenta un cam-bio significativo en la costumbre de ali-mentación de su población, caracterizado por una oferta casi ilimitada de ali-mentos de alta densidad energética amuy bajo costo pero con poco aportede minerales y vitaminas. Este nuevohábito de alimentación, reconocidocomo transición nutricional, trae comoconsecuencia el aparecimiento de unaserie de enfermedades relacionadas

con la dieta, entre las cuales sobresalenla obesidad, la diabetes tipo 2, enferme-dades cardiovasculares y ciertos tiposde cáncer. El propósito del presente es-tudio fue determinar el contenido deácidos grasos en los alimentos procesa-dos que más habitualmente consumenjóvenes residentes en la ciudad deQuito. Se estudiaron ocho variedadesde alimentos que mayormente consu-men jóvenes universitarios de la ciudadde Quito, de entre 20 a 25 años deedad: aceites comestibles, margarinas,

PERFIL LIPÍDICO Y CONTENIDO DE ÁCIDOS

GRASOS TRANS EN PRODUCTOSECUATORIANOS DE MAYOR

CONSUM

Pablo López Proaño1, Pablo Pozo Pantoja2, Andrea Guzmán3

Palabras Claves: grasas saturadas, grasas trans, extracción, cromatografía de gases

Key words: saturated fat, trans fat, extraction, gas chromatography

1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Enfermería, Carrera de Nutrición Humana([email protected]).

2 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Escuela deCiencias Químicas ([email protected]).

3 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Enfermería, Carrera de Nutrición Humana([email protected]).

127

REVISTA PUCE. ISSN 1013-89X. NÚM. 943 mayo-3 nov 2012. López, Pozo & Guzmán. PP. 125-147

PERFIL LIPÍDICO Y CONTENIDO DE ACIDOS GRASOS TRANS EN PRODUCTOS ECUATORIANOS DE MAYOR CONSUMO

128

galletas simples, galletas con relleno,galletas con cobertura, productos depastelería, “snacks” y papas fritas, que seexpenden tanto en cadenas de comi-das rápidas transnacionales, comoaquellas que se venden en restauranteslocales. Se determinó el contenido lipí-dico por el método de extracción degrasas saponificables y el perfil de áci-dos grasos se lo estableció por el mé-todo de cromatografía de gases AOCSCe-1h-05. Los datos del estudio señalanque el contenido de ácidos grasos satu-rados es alto en los productos prenva-sados que se consumen habitualmente. El contenido de AGTrans no muestracantidades significativas, excepto engalletas, especialmente las rellenas yque tienen cobertura de chocolate. Losproductos en términos generalesmues tran un desbalance significativoen la relación omega 6 : omega 3, sien -do más manifiesto en los aceites co-mestibles. Los productos analizadosmuestran importantes concentracionesde AGSaturados en su composición,casi nulo aporte de ácidos grasosomega-3, razón por la cual se nota undesbalance en el contenido lipídicoque podría favorecer la presencia deenfermedades cardiovasculares en lapoblación.

ABSTRACT

Ecuador is experiencing a sig-nificant change in the habit of power ofits population, characterized by an al-most unlimited supply of food with ahigh energy density at a very low cost,but with low supply of minerals and vi-tamins. For the purpose of simplifyingthe tasks, including the preparation ofmeals, the industry has been madeavailable to the market a series of differ-entiated products that are character-ized by being high in calories, especiallyfats and simple sugars, to the detrimentof the preparation of more elaboratedmeals and traditional. It is now possibleto produce meals with an almost unlim-ited combination of flavors, quality andtexture. In fact, the handling of the char-acteristics of the food, makes it difficultfor consumers associate the amount offood with its energy content and evenworse with the type and quantity of thenutrient present in the food. This neweating habit, recognized as nutritiontransition, results in the appearance ofa number of diet-related diseases,among which obesity, type 2 diabetes,cardiovascular disease and certaintypes of cancer. In a concrete way ishave blamed the AGSaturates saturatedfatty acids and fatty acids to the transconfiguration (TFA), as the direct re-sponsibility of this diseases. Objective:


129

the aim of the present study was to in-vestigate the content of fatty acids inprocessed foods that most commonlyconsumed by young people who re-side in the city of Quito, and in this wayraise the best strategies to reduce itsavailability and curb the massive con-sumption of this type of products. Westudied eight varieties of food: edibleoils, margarines, crackers, cookies withfilling, covered biscuits, pastries, snacksand chips that are sold both in transna-tional fast food chains, such as thosethat sold in local restaurants, lipid con-tent was determined by the method ofextraction of saponifiable fat and fattyacid profile was established by gaschromatographic method AOCS Ce-1h-05. The survey data indicate that the

content of saturated fatty acids is highin the packa ged products that are con-sumed regularly. The content of TFAdoes not show significant quantities,except in crackers, especially the stuffedand those that have coverage of choco-late. The products generally show alter-ations in the relationship omega 6 :omega 3, being more overt, as wouldbe expected in the edible oils. The in-dustrialized products show significantconcentrations of AGSaturates. On theother hand, the products analyzed donot show significant contributions ofomega-3 fatty acids, which is why wenote an imbalance in the lipid contentthat could promote the presence of car -diovascular disease in the population.

INTRODUCCIÓN

A pesar que las grasas suelen serseñaladas como sustancias peligrosaspara la salud, estas cumplen roles fun-damentales para el buen funciona-miento del organismo: estructura de lasmembranas celulares, síntesis de los de-rivados eicosanoides, transportadoresde vitaminas liposolubles, proporcionansabor a las comidas y junto con las pro-teínas, proveen sensación de plenitud(Yépez, 2004, Mataix, 2005, Calder,2008). Los ácidos grasos esenciales de

la familia omega-3, entre ellos el doco-sahexaenoico (DHA) y eicosapentae-noico (EPA), contribuyen para el desa-rrollo del sistema nervioso, la integridadvisual fetal y proveen un efecto cardio-protector (Simopoulos, 2001), (NoticiasOPS/OMS. Oncología., 2005). Por sulado, el exceso de grasas saturadas enlas comidas (AGSat), presentes especial-mente en mantecas animales y aceitestropicales, como el de palma, se hallaninvolucradas en la etiopatogenia de la


130

formación de la placa de ateroma y porconsiguiente de la enfermedad cardio-cerebro-vascular (Ramírez, et al., 2010),(Bruce, et al., 2004). Se calcula que en el2004 murieron por enfermedades car-diovasculares (ECV) 17.3 millones depersonas, lo cual representa un 30% detodas las muertes registradas en elmundo; 7.3 millones de esas muertes sedebieron a la cardiopatía coronaria y 6.2millones a los accidentes cerebro vas-culares (ACV). Además, se calcula queen el 2030 morirán cerca de 23.6 millo-nes de personas por ECV, sobre todopor cardiopatías y ACV y se prevé quesigan siendo la principal causa demuerte (OMS, 2011).

La hidrogenación parcial de acei-tes vegetales y la obtención de margari-nas y mantecas vegetales, permitieronsu amplia utilización en panadería, re-postería, galletería, además para la pre-paración de papas fritas, maíz reventado,alimentos congelados, aderezos para en-saladas, potajes y caramelos (Uauy, et al.,2009), (Valenzuela, 2008). Varios estudioshan demostrado que estos productoscontienen importantes concentracionesde ácidos grasos trans (AGTrans) (Chu-lich, et al., 2005), (Peterson, et al., 2006),(Fernández, et al., 2010), (Griguol, et al.,2003), isómeros involucrados en la géne-sis de dislipidemias (Mozaffarian, et al.,2006), disfunción endotelial (Castro-Mar-

tínez, 2010), aumento de la actividad in-flamatoria y oxidativa, arteriosclerosisacelerada (Hunter, et al., 2010) y un au-mento muy significativo de la morbi-mortalidad cardiovascular (Mozaffarian,et al., 2009). Efectivamente, la ingesta deácidos grasos trans (AGTrans), muestranun efecto claro en la elevación de la frac-ción LDL-colesterol, disminución de laconcentración plasmática de HDL-coles-terol (Mozaffarian & Clarke, 2009), pare-cen ciertamente participar en laformación de apolipoproteína (a), activa-ción del factor de coagulación VI, todosellos factores de riesgo asociados con lagénesis de la enfermedad coronaria (Al-meida, et al., 2009). La evidencia con quese cuenta, señala claramente una rela-ción positiva entre el consumo de AG-Trans y el aparecimiento de las enfer-medades antes mencionadas, razón porla cual varios gobiernos en el mundo,han decidido tomar medidas tendientesa disminuir o eliminar el contenido deAGTrans en los alimentos (OPS, 2008).Acorde con estas medidas, ciertos secto-res de la industria alimentaria de maneravoluntaria, se proponen emplear mejo-res materias primas para la elaboraciónde sus productos, así como incorporarprocesos tecnológicos para la elabora-ción de aceites y margarinas libres deAGTrans y remplazándolas por mono ypolinsaturados de forma CIS (Monroy,2009), (Valenzuela, 2008).


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Las estrategias más económicasy que muestran un efecto eficaz en laprevención y control de las enfermeda-des crónicas no transmisible (ECNT) sonaquellas intervenciones de tipo am-biental y multisectorial. Por ejemplo, seha demostrado que el remplazo de losAGTrans con grasas no saturadas, redu-ciría las enfermedades cardiovascularesy diabetes entre 7 y 40% respectiva-mente con un costo de intervenciónque no supera $0.50 por persona poraño; la legislación y la educación sani-taria para reducir el colesterol tiene uncosto de $135 por persona por año;mientras que las medidas que apuntan

a la adopción de terapias individualespueden superar los $ 1200 por personapor año (OPS/OMS, 2007).

En el Ecuador no existe informa-ción sobre el contenido de ácidos gra-sos en los principales alimentos deconsumo; tampoco se han establecidoregulaciones sobre su contenido basa-das en información cierta. Con estos an-tecedentes el presente estudio aportaa este conocimiento, lo cual permiteproponer estrategias tendientes a me-jorar la disponibilidad y consumo de ali-mentos con grasas más saludables.

II MUESTREO

Se escogieron estudiantes uni-versitarios pertenecientes a institucio-nes de educación superior que recibenal mayor número de alumnos en la ciu-dad de Quito. Las universidades selec-cionadas fueron dos públicas y dosprivadas con el propósito de tener re-presentatividad de los diferentes estra-tos socio-económicos de la ciudad. Eltotal de encuestados fue de 283; deestos, 103 hombres (36.4%) y 180 mu-jeres (63.6%). El promedio de edad delos encuestados fue de 21 años±1.18. Alos participantes se les aplicó una en-cuesta para obtener información sobre

los productos que ellos consumían ha-bitualmente y sobre el lugar donde losadquirían. Se consideraron ocho varie-dades de alimentos procesados, elegi-dos por su contenido importante graso,grasas saturadas y grasas Trans, deacuerdo con varios estudios previos enla región (OPS, 2008). De cada grupo dealimentos se pidió señalar la marca onombre comercial del producto y ellugar de compra. Se escogieron los tresproductos de mayor consumo de cadagrupo de alimentos, se los compró, encinco establecimientos ubicados en di-ferentes sectores de la ciudad. De esta


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manera se adquirieron 5 unidades decada variedad de alimentos; las unida-des fueron similares, es decir tenían elmismo peso, presentación, envase, perode diferente lote de producción. Las va-riedades de productos fueron: aceitescomestibles, margarinas, galletas sim-ples, galletas con relleno, galletas concobertura, productos de pastelería,

“snacks” y papas fritas que se expendentanto en cadenas transnacionales decomida rápida, como aquellas que sevenden en restaurantes locales. Lasmuestras fueron llevadas al laboratorioy permanecieron en sus envases origi-nales hasta el procesamiento respec-tivo.

III METODOLOGÍA DE ANÁLISIS

Las cinco muestras adquiridasde cada producto, se homogenizaronmecánicamente mediante el uso de unprocesador de alimentos; en el caso delos aceites simplemente se mezclaronen un recipiente para homogenizarlosy para las margarinas fue necesario lle-varlas a baño María para luego mezclar-las. Una vez homogenizada la muestrase tomó una pequeña porción y sepesó 0.13 g de muestra homogenizadaen un vial. Se añadió al vial con la mues-tra, 2.5 ml de solución de KOH 0.5 M enmetanol, para formar las respectivassales de ácidos grasos por el proceso desaponificación, se tapó el vial y se co-locó en el baño María por 10 minutos atemperatura de ebullición del aguapara que la saponificación sea com-pleta. Se sacó el vial del baño María, selo secó y dejó enfriar, al cabo de lo cual

se le agregó 1 ml de solución de HCl enmetanol (1:4) v/v para regenerar los áci-dos grasos y la formación de KCl; el vialcon tapa nuevamente se calentó abaño María por 25 minutos a una tem-peratura de 50°C para asegurarse que lareacción fue completa. Al vial se lo dejóenfriar y se le añadieron 5 ml de aguadestilada con la finalidad de formar 2fases: la acuosa que contiene KCl y la or-gánica que contiene los ácidos grasoslibres. Se procedió a la extracción de lafase orgánica por tres ocasiones con lautilización para el efecto de 5 ml de éterde petróleo por cada extracción, me-diante una pipeta Pasteur. Se trasladó elextracto etéreo a un nuevo tubo contapa y se lo almacenó en refrigeraciónhasta el día en que se realizó la lecturaen cromatografía de gases CG por elmétodo AOCS Ce-1h-05.


Los aceites muestran niveles deAGTrans que no superan el 1% de sucomposición lipídica. El contenido deAGSaturados representa aproximada-mente una quinta parte del contenidograso de los aceites analizados. En tér-minos generales existe una proporción

baja de ácidos grasos omega 3 en losaceites, especialmente en el aceite abase de girasol, de esta manera, la rela-ción omega 6 : omega 3 es muy ele-vada a expensas del bajo aporte deomega 3 en este aceite comestible,Tabla 1.

Tabla 1: Composición de ácidos grasos en los aceites comestibles más consumidos por estudiantes universitarios de la ciudad de Quito:

aceite mezcla de palma y soya, aceite de girasol, aceite mezcla de oleínas de palma y soya(en porcentaje)

aceite mezcla aceite de aceite mezcla Tipo de Carboxilato de palma y soya girasol de oleínas de

palma y soya

C16:0 Palmítico 15,21 6,03 19,15C18:0 Esteárico 3,78 4,25 3,68C20:0 Araquídico 0,22 0,15 0,22C22:0 Behénico 0,21 0,61 0,14C24:0 Lignocérico — 0,13 —Total saturados 19,42 11,17 23,19C18:1 (n-9) Oleico 27,61 29,00 33,38C18:1 (n-7) Vaccénico 0,41 0,12 0,33C20:1(n-9/n-11) Gadoleico 0,1 0,1 0,0Total Monoinsaturados 28,08 29,20 33,75C18:2 tt 0,18 0,46 0,12C18:2 tc 0,19 0,43 0,13C18:2 (n-6) Linoleico 47,54 58,47 39,38C18:3 ttc 0,26 — 0,16C18:3 tcc 0,29 — —C18:3 (n-3) Linolénico 4,04 0,27 3,28Total Polinsaturados 52,5 59,6 43,1% Trans 0,92 0,89 0,40Σ Insat cis 79,19 87,74 76,04 Σ sat + Trans 20,34 12,06 23,59 Σ sat + Trans – C18:0 16,56 7,81 19,91 Σ sat + Trans – C18:0/ Σ Insat cis 0,20 0,08 0,26 relación n6/n3 11,78 213,38 12,02

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IV RESULTADOS


Las margarinas seleccionadasson comercializadas, en el caso de dosde ellas como “suaves” y la restantecomo “light”. El análisis de su composi-ción indica que estos productos supe-ran el 40% de su contenido porAGSaturados, siendo el ácido palmíticoel principal contribuyente a la cantidadde AGSaturados. El contenido de AG-Trans es superior en la margarina iden-tificada como “light”, pero en términosgenerales no superan 1% de su compo-sición. El contenido de AG de la familian-3 es bajo, sin que en ningún caso lle-guen a superar el 2% de su composi-ción. La proporción de AG polinsatu-rados aporta una tercera parte aproxi-madamente del contenido lipídico delas margarinas, siendo el ácido linoleicosu principal contribuyente. Así, la rela-ción omega-6; omega-3 es alta en lasmargarinas analizadas y muestra undesbalance marcado entre las familiasde estos ácidos grasos, Tabla 2.

En la categoría de productos de-nominados como “snacks” y de pastele-ría, que fueron señalados como los másconsumidos, el porcentaje graso enestos productos proviene preferente-mente de los AGSaturados que superanla mitad de su composición. En el casode las pastas también conocidas comopasteles, presentan cantidades significa-tivas de ácido palmítico, seguido de

ácido esteárico. Aproximadamente, unatercera parte de la composición de losproductos es proporcionada por grasasmonoinsaturadas, especialmente a ba -se de ácido oleico. El aporte de AGPolin-saturados es bajo y el de ácidos de lafamilia de los omega-3 prácticamentenulo. Los productos de pastelería a basede masa de hojaldre como las “milhojas”,son las de mayor contenido de AGTrans,concretamente de ácido elaídico, quesuperan el 2% de su composición, Tabla3. Los productos reconocidos como“poncakes” presentan un contenido deAGTrans por encima del 1%, Tabla 3.

El contenido de AG en papas fri-tas difiere marcadamente de los dife-rentes lugares de comida rápidaseleccionados. Una de las tres muestrasobtenidas en cadenas de comida rá-pida transnacional revela niveles de AG-Saturados, especialmente ácido pal mí- tico, por encima de la mitad de sucomposición. Solo uno de estos localesmuestra positivamente un aporte signi-ficativo de AGMonoinsaturados en sucontenido, a expensas de ácido oleico(51.5%). Predomina en las papas fritaselaboradas en sitios de comida rápidade producción local, la concentraciónde AGSaturados, en la cual una terceraparte de su composición se halla for-mada por AGMonoinsaturados, Tabla 4.En el grupo de las grasas utilizadas para

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frituras, solo una de las seis cadenas es-tudiadas, tiene un perfil lipídico queguarda consistencia con recomenda-ciones internacionales acerca de los lí-

pidos en estas preparaciones. De ma-nera llamativa no se reporta contenidode AGTrans en todas las muestras depapas fritas, Tabla 4.

Tabla 2: Composición de ácidos grasos en las margarinas más consumidas por estudiantes universitarios de la ciudad de Quito: suave, “light”

Margarina Margarina Margarina Tipo de Carboxilato suave 1 “light” suave 2

% % %

C8:0 Caprílico — 0,55 0,29C10:0 Cáprico — 0,47 0,20C12:0 Láurico 13,36 11,01 5,29C14:0 Mirístico 3,23 2,80 2,04C16:0 Palmítico 19,38 20,63 34,24C18:0 Esteárico 7,08 8,57 5,12C20:0 Araquídico — 0,11 0,12Total saturados 43,04 44,13 47,31C18:1 (n-9) Oleico 24,34 23,98 37,81C18:1 (n-7) Vaccénico — 0,19 0,06C20:1 (n-9/n-11) Gadoleico* — 0,1 —Total Monoinsaturados 24,34 24,22 37,87C18:2 tt — 0,10 0,07C18:2 tc — 0,12 0,12C18:2 (n-6) Linoleico 30,92 29,17 14,15 C18:3 ttc — 0,16 — C18:3 tcc — 0,17 — C18:3 (n-3) Linolénico 1,70 1,93 0,49

Total Polinsaturados 32,6 31,7 14,8 % Trans 0,00 0,55 0,19 Σ Insat cis 56,96 55,08 52,45 Σ sat + Trans 43,04 44,68 47,50 Σ sat + Trans – C18:0 35,96 36,11 42,38 Σ sat + Trans – C18:0/ Σ Insat cis 0,63 0,65 0,80 relación n6/n3 18,19 15,15 29,11

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Tabla 3: Composición de ácidos grasos en “snacks” y productos de pastelería más consumidos por estudiantes universitarios de la ciudad de Quito

(en porcentaje)

Papas fritas “snacks” Chifles Pastas “Poncakes” “Milhojas”Tipo de Carboxilato empacadas de maíz empacados

C8:0 Caprílico — — — 1,58 0,92 0,39C10:0 Cáprico — — — 0,78 1,50 0,72C12:0 Láurico 0,30 0,52 0,64 5,82 1,69 2,22C14:0 Mirístico 0,80 1,11 0,99 4,43 1,81 3,01C16:0 Palmítico 41,55 39,41 40,24 30,28 34,13 37,99C18:0 Esteárico 8,74 9,94 8,13 21,37 17,09 10,69C20:0 Araquídico 0,32 0,44 0,33 0,57 0,57 0,37C22:0 Behénico — — — — 0,52 0,26Total saturados 51,71 51,41 50,33 64,82 58,23 55,64C16:1 (n-7) Palmitoleico — — — 0,3 1,2 0,4C17:1 — — — 0,40 0,85 0,42C18:1 t Elaídico — — — — — 1,65C18:1 (n-9) Oleico 37,49 35,04 39,63 22,89 27,43 29,74C18:1 (n-7) Vaccénico 0,40 0,46 0,46 0,46 0,39 0,50C20:1(n-9/n-11) Gadoleico* — 0,1 — 0,6 0,5 0,4Total Monoinsaturados 37,90 35,61 40,09 24,71 30,35 33,19C18:2 tt 0,16 — — — 0,49 0,34C18:2 tc 0,17 — — — 0,88 0,18C18:2 (n-6) Linoleico 10,08 12,81 9,58 10,13 9,43 10,39C18:3 (n-3) Linolénico — 0,17 — 0,34 0,61 0,26Total Polinsaturados 10,4 13,0 9,6 10,5 11,4 11,2 % Trans 0,32 0,00 0,00 0,00 1,37 2,17 Σ Insat cis 47,57 48,02 49,21 33,36 37,47 40,39

Σ sat + Trans 52,03 51,41 50,33 64,82 59,61 57,81 Σ sat + Trans - C18:0 43,29 41,47 42,20 43,45 42,52 47,12 Σ sat + Trans - C18:0/Σ Insat cis 0,91 0,86 0,85 1,30 1,13 1,16 relación n6/n3 — 75,78 — 30,16 15,43 40,76


Tabla 4. Composición de ácidos grasos en papas fritas de locales transnacionalesy nacionales

más consumidas por estudiantes universitarios de la ciudad de Quito(en porcentaje)

Trans- Trans- Trans-Nacionales Nacionales Nacionales

Tipo de Carboxilato nacionales nacionales nacionalesA B C

A B C

C12:0 Láurico 3,87 1,87 1,04 2,28 — 2,86C14:0 Mirístico 2,89 1,35 1,67 1,79 — 3,53C16:0 Palmítico 38,83 13,79 21,77 26,91 33,81 37,76C17:0 Margárico — — — — — —C18:0 Esteárico 11,14 9,64 12,66 14,16 12,42 16,82C20:0 Araquídico — 0,36 0,54 — — —C22:0 Behénico — 0,64 1,04 — — —Total Saturados 56,73 27,65 38,72 45,14 46,23 60,97C18:1 (n-9) Oleico 32,81 51,51 30,31 29,05 34,51 29,79C18:1 (n-7) Vaccénico — 1,59 1,24 — — —C20:1 (n-9/n-11)Gadoleico* — 0,3 — — — —Total Monoinsaturados 32,81 53,35 31,55 29,05 34,51 29,79C18:2 (n-6) Linoleico 10,46 17,77 28,33 24,43 19,26 9,24C18:3 (n-3) Linolénico — 1,23 1,41 1,38 — —Total Polinsaturados 10,5 19,0 29,7 25,8 19,3 9,2% Trans 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00Σ Insat cis 43,27 70,51 60,05 54,86 53,77 39,03 Σ Sat + trans 56,73 27,65 38,72 45,14 46,23 60,97 Σ Sat + trans – C18:0 45,59 18,01 26,06 30,98 33,81 44,15 Σ Sat + trans C18:0/ Σ Insat cis 1,05 0,25 0,43 0,56 0,62 1,13 Relación n6/n3 — 14,47 20,12 17,68 — —

papas fritas, Tabla 4.Entre las galletas simples,

aquellas que tienen chispas de choco-late, son las que muestran niveles ele-vados de AGSaturados, presencia deAGTrans (ácido elaídico) en proporcio-

nes que superan el 2% y bajo nivel deAGPolinsaturados. Las galletas simplesde sal difieren en su composición. Unade las marcas analizadas guarda unaproporción bastante equilibrada entrelos diferentes AG, mientras que de otro

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fabricante muestran un adecuadoaporte de AGMonoinsaturados (ácidooleico), no tienen presencia de AGTrans

pero conservan reducido aporte deomega-6 en dos de las marcas analiza-das, entre 9 y 13% y casi nulo de

Tabla 5. Composición de ácidos grasos en galletas simples más consumidas por estudiantes universitarios de la ciudad de Quito

(en porcentaje)

Simples con Simples Simples Tipo de Carboxilato chispas de de sal de sal

chocolate A B

C12:0 Láurico 4,62 — 0,55C14:0 Mirístico 2,85 — 0,96C16:0 Palmítico 33,89 27,48 26,69C18:0 Esteárico 11,46 7,01 12,56C20:0 Araquídico 0,51 0,42 0,31C22:0 Behénico 0,31 — 0,28C24:0 Lignocérico 0,22 — —Total Saturados 55,23 34,91 41,34C17:1 0,36 — —C18:1 t Elaídico 1,68 — —C18:1 (n-9) Oleico 32,20 30,78 44,40C18:1 (n-7) Vaccénico 0,38 0,74 0,53C20:1 (n-9/n-11) Gadoleico* 0,1 0,2 0,2C22:1 (n-9/n-11) Erúcico — — —Total Monoinsaturados 34,73 31,69 45,13C18:2 tt 0,32 0,41 —C18:2 tc 0,28 0,43 —C18:2 (n-6) Linoleico 9,22 29,45 13,28C18:3 ttc — 0,30 —C18:3 tcc — 0,36 —C18:3 (n-3) Linolénico 0,21 2,45 0,25 Total Polinsaturados 10,0 33,4 13,5 % Trans 2,28 1,50 0,00 Σ Insat cis 41,63 62,68 57,93 Σ Sat + Trans 57,51 36,41 41,34 Σ Sat + Trans – C18:0 46,05 29,40 28,78 Σ Sat + Trans – C18:0/ Σ Insat cis 1,10 0,46 0,49

Relación n6/n3 43,30 12,03 53,77

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* Galletas que no tienen relleno ni cobertura de chocolate


El contenido de AGSaturados engalletas rellenas y/o con cobertura dechocolate indican una proporción queva entre 46 al 59%; no obstante, el ácidoesteárico aporta entre el 9 y 14% a estecomponente. Por su lado, el contenidode AGMonoinsaturados fluctúa entre

31 y 41%. Los niveles de omega-6 ocu-pan tan solo entre 6 y 11% y los deomega-3 son casi inexistentes, Tabla 6.En términos generales el aporte de AG-Trans no es significativo en las galletasanalizadas, Tabla 6.

Tabla 6: Composición de ácidos grasos en galletas con relleno y cobertura más consumidos por estudiantes universitarios de la ciudad de Quito

(en porcentaje)

de chocolate Tipo Con Tipo con relleno “waffle” Con relleno cobertura “waffle”

Tipo de Carboxilato de vainilla con relleno de fresa de con coberturade vainilla chocolate de chocolate

C8:0 Caprílico — — — 0,85 1,10C10:0 Cáprico — — — 0,89 1,00C12:0 Láurico 0,22 0,83 0,74 4,97 4,30C14:0 Mirístico 0,71 1,37 1,25 3,67 3,10C16:0 Palmítico 34,92 40,61 40,90 31,46 33,56C18:0 Esteárico 9,92 9,21 10,10 15,27 14,83C20:0 Araquídico 0,49 0,37 0,53 0,66 0,68C22:0 Behénico 0,17 0,53 — 1,13 1,27Total saturados 46,43 52,93 53,53 58,90 59,84C18:1 t Elaídico 1,31 — — — —C18:1 (n-9) Oleico 40,00 36,95 36,46 30,79 32,01C18:1 (n-7) Vaccénico 0,40 0,40 0,41 0,61 0,53C20:1 (n-9/n-11) Gadoleico* 0,10 — — — —Total Monoinsaturados 41,85 37,36 36,87 31,40 32,54C18:2 tt — — — — 0,43 C18:2 tc — — — 1,10 0,30 C18:2 (n-6) Linoleico 11,43 9,71 9,61 8,60 6,89 C18:3 (n-3) Linolénico 0,30 — — — — Total Polinsaturados 11,7 9,7 9,6 9,7 7,6 % Trans 1,31 0,00 0,00 1,10 0,73 Σ Insat cis 51,73 46,66 46,07 39,39 38,9

Σ sat + Trans 47,74 52,93 53,53 60,00 60,57 Σ sat + Trans - C18:0 37,82 43,72 43,43 44,73 45,74 Σ sat + Trans - C18:0/ Σ Insat cis 0,73 0,93 0,94 1,13 1,17 relación n6/n3 38,35 — — — —

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La mortalidad por enfermedadcardiovascular en el Ecuador se encuen-tra en aumento. La inactividad física, elhábito de fumar y la alimentación in-adecuada son, junto a la predisposicióngenética, los responsables de esta rea-lidad. Entre los nutrientes que repercu-ten negativamente en la salud de losindividuos se encuentran los ácidosgrasos saturados y los insaturados deconfiguración trans (Nishida, R. Uauy,2009), (Valenzuela, 2008). La evidenciacientífica señala que la ingesta de grasassaturadas produce mayor incrementode la colesterolemia en comparacióncon el efecto hipercolesterolémico delcolesterol dietético. Una excepción enla familia de los AGSa tu rados es el ácidoesteárico (18:0) que no parece promo-ver el incremento del colesterol total odel colesterol LDL (Bonanome &Grundy, 1988). En los alimentos estudia-dos, la mayor concentración de AGSa-turados se encuentra presente en lasgalletas con cobertura de chocolate enaproximadamente 59%, galletas sim-ples con chispas de chocolate 55% ygalletas con relleno 53%. Siguen losproductos conocidos como “snacks” yproductos de pastelería, especialmenteen éstas últimas, en las cuales su cuan-tía fluctúa entre 55.6 a 64.8% de sucomposición. Una cadena de comida

rápida transnacional y otra local, pre-sentan en sus papas fritas, niveles deAGSaturados que llegan a 56% y 60%de su composición, respectivamente.

La hidrogenación parcial de acei-tes vegetales empleados por la industriapara la producción de grasas semisóli-das, genera gran cantidad de ácidos gra-sos trans (AGT), y alcanza en algunospaíses hasta 40% de las grasas totales enlos productos envasados, especialmenteen margarinas, panes, galletas dulces ysaladas, golosinas, barras de cereal,baños de repostería, cereales precocidospara niños (Larqué, et al., 2003), (Griguol,et al., 2007), (Tavella, et al.), (Dadán, 2005).El consumo de AGT de origen industrial,se relaciona con alteraciones del meta-bolismo de los lípidos sanguíneos, efectohipercolesterolemiante (Zamorano,2010), (Fernández, et al., 2010), (Díaz &Becerra, 2001), marcada disminución delcolesterol HDL, inflamación vascular ydesarrollo de enfermedades cardio y ce-rebro vasculares (De Luis, et al., 2005),(Granados, et al., 2006). En las muestrasde los alimentos estudiadas no se apre-cian niveles importantes de AGTrans. Losproductos de pastelería como las “milho-jas” y las galletas simples con chispas dechocolate son las que contienen nivelesligeramente por encima del 2% de su

V DISCUSIÓN


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composición. Los aceites comestiblespresentan bajos niveles de ácidos grasostrans y entre las margarinas estudiadasno se hallaron valores de ácido elaídico,pero si una apreciable cantidad de AG-Saturados que oscila entre 43.0 a 47.3%.Este hallazgo puede ser entendido en elhecho de que las materias primas parala elaboración de las margarinas provie-nen básicamente de una mezcla de acei-tes vegetales con cantidades apreciablesde AGSaturados, especialmente aque-llos extraídos de palma. Los locales deexpendio de comida rápida, tantotransnacionales como nacionales, nomuestran AGTrans en la elaboración depapas fritas.

Se conoce que los AGInsatura-dos de configuración CIS, ácido lino-leico (18:2 n-6) y el ácido oleico (18:1 n9cis), disminuyen los niveles de coleste-rol plasmático (Simopoulos, 2009). Enlos productos estudiados, los aceites ymargarinas muestran niveles de ácidosgrasos omega-6 elevados. Los aceitesmezcla de palma y soya presentan ensu composición 39.3% de ácido lino-leico y 58.4 % de aceite de girasol. Lasmargarinas muestran concentracionesde ácido graso linoleico con valores quevan desde 14.8 hasta 32.6%. El resto deproductos muestran niveles bajos deácido graso linoleico, a excepción deuna cadena de comida rápida transna-

cional que elabora papas fritas y unamarca de galletas simples de sal.

Las dietas que incluyen un altoconsumo de aceites monoinsaturadosson tan efectivas en bajar el colesterolLDL, como aquellas ricas en polinsatu-rados, pero en contraste con el efectode las dietas altas en polinsaturadosomega-6, las dietas con ácidos grasosmonoinsaturados no disminuyen el co-lesterol HDL (Perona, et al., 2007), (San-jurjo, et al., 2008). El contenido de ácidooleico, principal AGMmonoinstaurado,se halla distribuido de manera muy re-gular en todos los productos analiza-dos. Los niveles son superiores en unacadena transnacional de papas fritas,cuyos niveles llegan al 53.3% y una va-riedad de galleta de sal (45.1%), en elresto de productos ocupa aproximada-mente una tercera parte de su compo-sición.

El efecto beneficioso en el perfillipídico que muestran los ácidos grasosoleico y linoleico, puede ser potenciadopor el consumo de ácidos grasos de lafamilia n-3 provenientes de los peces(principalmente ácidos eicosapentae-noico y docosahexaenoico) y de aceitesde plantas (ácido alfa linolénico n-3) conefecto protector en la enfermedad co-ronaria del corazón (Carrero, 2005). Noobstante, dado que el sistema enzimá-


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tico que transforma los dos tipos de áci-dos grasos esenciales es el mismo, lino-leico n-6 y linolénico n-3, existe unefecto de competencia entre ellos y porlo tanto es necesario un cierto balanceen el aporte dietario de los mismos. Unexceso de ácido linoleico va a impedir,por efecto de competencia con los sis-temas de elongación y desaturación, latransformación del ácido alfa linolénicoen EPA y DHA. El balance recomendadodebe oscilar entre 4:1 a 6:1 y cuanto másse incline la balanza en ese sentido,mayor será la mortalidad cardiovascular(López, et al., 2006), (Jakobsen, et al.,2009), (Wijendran & Hayes, 2004). En losalimentos analizados se muestra una re-lación desequilibrada de los ácidos gra-sos de la familia n-6:n-3. La despropor-ción es notoria en aceites comestiblescomo el de girasol y algunos tipos de“snacks” enfundados como los de maíz.

La Organización para Agricul-tura y Alimentación señala que los áci-dos grasos polinsaturados totalesdeben representar 6-10% del total de

las grasas y particularmente los ácidosgrasos n-3 deberían corresponder al 1-2% de la energía total (FAO, 2008). Losaceites comestibles analizados en cuyacombinación se halla presente soya,son los que muestran cantidades deácido linolénico que llega entre el 3 y4% de su composición. El resto de ali-mentos analizados muestran en gene-ral un aporte insignificante o casi nulode ácidos grasos omega-3. Si bien losácidos grasos polinsaturados consumi-dos de manera elevada, específica-mente de la familia n-6, tienen efectohipocolesterolemiante, solo incremen-tan el HDL cuando la relación ácidospolinsaturados/ácidos saturados (P/S)no supera 1,5 (Hodson et al., 2001). Enel caso de las muestras analizadas, losaceites a base de girasol, muestran unarelación elevada P/S que llega a 5.2 ypor lo tanto su consumo podría verserelacionado con un efecto negativo aldisminuir HDL. En los otros aceites,mezclas de palma y soya, la relación P/Sva de 2.44 a 1.65.

IV CONCLUSIONES

De los resultados de los análisisse puede observar un alto contenido deácidos grasos saturados en los alimen-tos de mayor consumo en la población

universitaria de la ciudad de Quito, es-pecialmente en galletas con chispas dechocolate, de chocolate y con cober-tura de chocolate, así como también en


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“poncakes” y “milhojas”. Los niveles deAGTrans no muestran cantidades signi-ficativas y su presencia supera ligera-mente el 2% de la composición delproducto en pastas a base de masa dehojaldre y en los aceites comestiblesmezcla de palma y soya En los aceitesanalizados, los producidos a base de gi-rasol muestran cantidades elevadas de li-noleico y bajas concentraciones de n-3.De esta manera, la relación n-6:n-3 noes la adecuada, con un desbalance ma-nifiesto en el aceite de girasol, margari-nas suaves, pastas tipo “milhojas” y papasfritas producidas en una cadena de co-mida rápida transnacional. En general,en los alimentos analizados, las cantida-des de ácidos grasos de la familia n-3

son bajas. Estos datos ameritan a la bre-vedad posible establecer acuerdosentre los diferentes sectores: guberna-mentales, privados y académicos, enaras de emprender acciones intersec-toriales para normar los contenidos deácidos grasos saturados y trans quedeben contener los productos, tecnifi-car la producción de alimentos con al-ternativas que incluyan grasas insa- turadas cis, incluidos los ácidos grasospolinsaturados de la familia omega-3 ymonitorear mediante estudios periódi-cos el contenido de ácidos grasos enlos alimentos, su ingesta y marcadoresbiológicos que indiquen el perfil lipí-dico en la población.


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