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Esercitazioni Metodologie Biochimiche aa 2017-18 Dott. Matilde Forcella “Post-Doc” Dip. BTBS, Biochimica Prof. Stefania Brocca Dip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica Prof. Paola Fusi Dip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica

Esercitazioni Metodologie Biochimiche aa 2017-18

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Esercitazioni Metodologie Biochimiche

aa 2017-18

Dott. Matilde Forcella“Post-Doc”

Dip. BTBS, Biochimica

Prof. Stefania BroccaDip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica

Prof. Paola FusiDip. BTBS, Enzimologia e Ingegneria Proteica

PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE

BIOCHIMICA DI UNA TREALASI DI

INSETTO ESPRESSA COME PROTEINA

ETEROLOGA IN Escherichia coli .

Metodologie biochimiche a.a. 2017-2018

1° giorno: Estrazione e purificazione di trealasi

• Frazionamento proteine solubili, purificazione e dialisi

• Preparazione di campioni analitici per SDS-PAGE

• Preparazione gel

2° giorno: SDS-PAGE, dosaggio proteine

• Elettroforesi

• Dosaggio proteico (metodo di Bradford)

3° giorno: Analisi SDS-PAGE e saggi di attività

• Stima del peso molecolare della trealasi e del grado di purezza

delle preparazioni

• Saggi di attività enzimatica a conc. di substrato saturanti

4° giorno: Cinetica enzimatica

• Cinetica enzimatica e determinazione dei parametri cinetici

5° giorno: Attività enzimatica a diversi pH e denaturazione termica

Metodologie Biochimiche aa 2017-18

Schema delle attività sperimentali

Sampling

Analisi dei

campioni

Preparazione

Elaborazione

dei dati• Concentrazione proteica

• Attività enzimatica

• Attività specifica

(tabella di purificazione)

1a parte

• Analisi SDS-PAGE

• Dosaggio proteico

• Dosaggi di attività

Saggi di attività

(cinetiche enzimatiche)

• Vmax, kcat , kM

• Optimum di pH

• Denaturazione termica

2a parte

estraz. & purificazione Prep.

enzima

I giorno:

Chiarificazione dell’estratto grezzo

Cromatografia di affinità

Preparazione SDS-PAGE

Chironomus riparius

➢ Insetto appartenente all’ordine dei Ditteri.

➢ Il ciclo biologico è suddiviso in quattro stadi:

uovo, larva, pupa e adulto.

➢ Le larve possono sopravvivere in condizioni

proibitive quali carenza di ossigeno e presenza di

inquinanti.

Le larve risultano utili per il monitoraggio dello stato di salute dei bacini idrici.

Alcuni insetticidi alterano la concentrazione di

metaboliti e l’attività di enzimi.

TREALASI

Trealasi

Enzima che catalizza l’idrolisi di una molecola di trealosio in due

molecole di glucosio che diventa disponibile come fonte di energia.

TREALOSIO + H2O 2 GLUCOSIO

Funzioni del trealosio negli insetti:

➢ Principale fonte di energia

➢ Crioprotettore

➢ Preserva le proteine labili dalla

denaturazione in condizioni di

disidratazione

Trealasi di vitale importanza

TREALASI di Chironomus riparius:

CLONAGGIO MOLECOLARE DELLA SEQUENZA CODIFICANTE ED

ESPRESSIONE DELLA PROTEINA IN E. coli

Struttura tridimensionale della

trealasi di C. riparius predetta:

(α/α)6-barrel

Ceppo di E.coli BL21 trasformato con il plasmide

pMAL-c5X che porta la resistenza per l’ampicillina e

che contiene, sotto il controllo del promotore Lac, la

sequenza codificante per la proteina trealasi di

Chironomus riparius che verrà prodotta in fusione con

la maltose binding protein.

lacI

Induttore

(lattosio o

IPTG)

Si lega

all’operatore

Pc lacI Pi O Z Y APc= promotore costitutivo

Lac I= gene regolatore

-previene la

trascrizione

-riconosce e lega

la piccola

molecola di

induttore.

Pi= promotore inducibile

O=operatore

Z,Y,A= geni strutturali

(galattosidasi, permeasi,

transacetilasi)

mRNA policistronico

Il lattosio o l’IPTG si lega alla proteina repressore lac

(codificata dal gene lac I) con conseguente inattivazione.

Quando la proteina repressore lac è inattiva, la sequenza a

valle del promotore viene trascritta dalla polimerasi e poi

tradotta in proteina ricombinante. Senza IPTG la proteina

repressore si lega all’operatore e impedisce la trascrizione

della sequenza a valle del promotore.

ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INDOTTA DA IPTG

Purificazione di trealasi da insetto

Localizzazione:

citoplasma necessaria

lisi meccanica della parete

Fonte:

cellule di Escherichia coli

coltura batch in terreno

ricco (Luria Bertani - LB)

Metodo di estrazione:

rottura meccanica

(French press, 25 kpsi)

METODI PER ROMPERE LE CELLULE

- Metodi BLANDI: lisi per osmosi, digestione enzimatica,

solubilizzazione chimica

- Metodi MODERATI: omogeneizzatori a lame, mortaio e

pestello

- Metodi VIGOROSI: sonicazione, french press, rottura

mediante microsfere

Lisato cellulare

Pellet

Debris cellulari e

proteine insolubili

Sovranatante

Proteine solubili

Prelievo camp

analitico

Aliquota risosp.

in SDS-SB

Proteine totali

campione analitico

Purificazione su resina

coniugata con amilosio

Campione preparativoPrelievo camp.

analitico

Centrifugaz. 15’ a 5000 rpm

Prelievo camp

analitico

CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’

La cromatografia di affinità non sfrutta delle differenze nelle

proprietà fisiche delle molecole ma si basa su interazioni

biologiche specifiche.

La specificità di queste interazioni spesso coinvolge tipi diversi

di legame.

E’ il tipo di cromatografia più selettivo, può essere utilizzato per

la purificazione sia di proteine che di acidi nucleici.

Matrice: destrano, agarosio, poliacrilamide

La matrice ideale deve avere le seguenti caratteristiche:

• avere gruppi chimici adatti ed in numero sufficiente per il legame

covalente con il ligando

• essere stabile nelle condizioni di legame e nella successiva

eluizione

• minimizzare l’adsorbimento aspecifico

• avere buone proprietà di flusso

• Deve essere in grado di legare specificamente e reversibilmente laproteina target

• Deve avere gruppi chimici modificabili per l’attacco alla matrice,senza distruggere l’attività di binding

• La costante di dissociazione KD tra ligando e proteina target deveessere compresa tra 10-4 e 10-8 M

• Se KD è maggiore di 10-4 l’interazione è troppo debole

• Se KD è più bassa di 10-8 l’interazione sarebbe troppo forte el’eluizione difficoltosa

• Il ligando può avere una specificità assoluta, cioè si lega ad un solocomposto, oppure una selettività di gruppo, ossia si lega a gruppiaffini di composti (ad es. il 5’ AMP che lega le deidrogenasi NAD+dipendenti).

LIGANDO

SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

• La matrice, accoppiata al ligando, viene impaccata in colonna

• La colonna viene equilibrata

• Dopo aver caricato il campione e raccolto il picco escluso, la

colonna viene lavata con il tampone di equilibramento, per

rimuovere tutto ciò che non si è legato specificatamente

• Si procede con l’eluizione

L’Eluizione del composto di interesse può avvenire in modo

specifico o non specifico:

• L’eluizione aspecifica viene condotta variando il pH o la forza

ionica.

• L’eluizione specifica (per affinità): facendo flussare in colonna

un composto che ha un’affinità per la molecola di interesse

maggiore di quella del ligando.

ELUIZIONE

Resina coniugata con amilosio

PROCEDURA SPERIMENTALE

➢ Incubare la frazione citosolica con la resina, precedentemente

equilibrata, per 1 h in agitazione su una ruota a T ambiente

➢ Trasferire la sospensione resina-frazione citosolica nella

colonna chiusa con il tappino e lasciare sedimentare la resina

➢ Raccogliere il picco escluso

➢ Lavare con 5 volumi di colonna con il buffer Tris-HCl 20 mM,

pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM (eliminare)

➢ Eluire 5 frazioni da 1 mL ciascuna utilizzando il buffer Tris- HCl

20 mM, pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, maltosio

50 mM

Preparare il tampone di LAVAGGIO (10 mL):

Tris- HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM partendo

dalle seguenti soluzioni madre:

Tris- HCl 200 mM pH 7.4

NaCl 1 M

EDTA 100 mM

DTT 100 mM

Preparare il tampone di ELUIZIONE (10 mL):

Tris- HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 200 mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, maltosio

50 mM partendo dalle seguenti soluzioni madre:

Tris- HCl 200 mM pH 7.4

NaCl 1 M

EDTA 100 mM

DTT 100 mM

Maltosio 500 mM

PREPARZIONE TAMPONI PER LA CROMATOGRAFIA

PREPARAZIONE DEL GEL PER

SDS-PAGE

Il gel viene preparato facendo copolimerizzare l’acrilammide con un

agente in grado di stabilire legami crociati, la bis-acrilamide

LA POLIMERIZZAZIONE

• Avviene attraverso un meccanismo di catalisi radicalica.

• APS (ammonio persolfato) è l’iniziatore

• TEMED (tetrametilendiammina) è il catalizzatore: catalizza la

decomposizione dello ione persolfato, producendo un radicale libero

altamente reattivo:

R*+ A RA*

RA*+ A RAA*

RAA* RAAA*

Gel discontinui (Laemmli gel)

Stacking gel

Running gel

Gel discontinui consentono una più netta separazione delle componenti del

campione. Nello stacking gel, le proteine sono ”impaccate” in una striscia sottile

prima della separazione vera e propria nel running gel.

Si utilizzano tamponi di differente composizione:

Tris-HCl a pH 6.8,

acrilammide 4% (pori larghi)

Tris-HCl a pH 8.8,

acrilammide 12% (pori piccoli)

Buffer elettroforesi

Buffer elettroforesi

II giorno:

Preparazione dei campioni da caricare in

SDS-PAGE

Corsa elettroforetica

Dosaggio proteico

Dialisi

TECNICHE ELETTROFORETICHE

Metodo di separazione basato sulla migrazione di particelle

cariche in un campo elettrico.

Può essere:

1. Analitica – determinazione della massa molecolare, del

punto isoelettrico, di alcune caratteristiche delle proteine

2. Preparativa – purificazione di proteine

L’elettroforesi viene effettuata in una cella elettroforetica,

utilizzando come supporto un gel

Un alimentatore fornisce una corrente continua tra gli elettrodi

SDS-PAGE elettroforesi

Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS; il

detergente è presente:

· nel gel

· nel tampone di corsa

· nell’ SDS-sample buffer

la separazione si basa soltanto sulle DIMENSIONI delle

catene polipeptidiche: per effetto dell’SDS tutte le proteine

acquisiscono un identico rapporto Q/m e hanno la stessa

mobilità elettroforetica.

vengono separate in base all’effetto di setaccio

molecolare

TAMPONE DI CORSA

COMPOSIZIONE: Tris, glicina e SDS

TRIS: tampona le variazioni di pH e fornisce ioni Cl-, che hanno una

mobilita’ superiore al complesso SDS proteina

Glicina: fornisce ioni glicinato

SDS: determina la carica netta negativa delle proteine

PREPARAZIONE DI CAMPIONI PER SDS-PAGE

I campioni da analizzare

- vengono mescolati a “Sample buffer” (SB)

- Incubati a 98 °C per 5 min

❖ Blu di bromofenolo, permette di seguire l’andamento della

corsa elettroforetica

❖ saccarosio o glicerolo, per appesantire il campione

rendendone possibile l’iniezione nel pozzetto di caricamento

❖ b-mercaptoetanolo, per ridurre i ponti disolfuro eventualmente

presenti

❖ SDS, detergente anionico che si lega alle proteine

denaturandole. Questo è presente anche nel tampone del gel e nel

tampone di corsa

“Sample buffer”:

• L’SDS si lega all’incirca ogni 2 aminoacidi, in modo tale che la carica originaria della proteina viene mascherata

• La proteina acquista una carica negativa proporzionale alle sue dimensioni

Distribuzione di proteine tra la frazione

solubile e insolubile

P. insolubili

P. solubili

ANALISI SDS-PAGE(V. risultati sperimentali di ciascun gruppo)

• Saggi di assorbanza:

a 280 nm

• Saggi colorimetrici:

Lowry

Biureto

Bradford

BCA (Bicinchoninic Acid)

Determinazione della concentrazione proteica

le proteine assorbono a 280 nm, grazie agli aminoacidi aromatici

Saggio a 280 nm

Intervallo di concentrazione:

20 g – 3 mg

Agenti interferenti:

detergenti, acidi nucleici

Strumentazione:

spettrofotometro con lampada UV

e cuvette di quarzo

•Principio: Le proteine in ambiente acido, con i loro gruppi basici stabilizzano la forma anionica del colorante Coomassie blu mediante interazioni idrofobiche ed ioniche, spostando il picco di assorbanza da 465 nm a 595 nm.

•Intervallo di utilizzo: 1-20 μg per il micro saggio e 20-200 μg per il macro saggio

•Accuratezza: buona

•Agenti interferenti: nessuno

•Strumentazione: spettrofotometro e cuvette di plastica

Metodo di Bradford

COOMASSIE (G250) COLORS

pH ~ 0

λ max = 470

Net charge = +1

pH ~ 1

Net charge = 0

λ max = 620

pH = 7

Net charge = -1

λ max = 595

Interaction with proteins

stabilizes the anionic

form even at low pH

Analisi:

1 - Preparare la curva standard (retta di taratura) utilizzando

albumina di siero bovino (BSA) e costruire la retta riportando in

ordinata i valori di assorbimento ottenuti e in ascissa i µg di proteina,.

2 - Ricavare la quantita’ di proteina contenuta nel campione dalla

curva standard.

3 - Determinare la concentrazione proteica del campione

considerando il volume utilizzato per il dosaggio.

• Il metodo del biureto non è influenzato dalla

composizione aminoacidica della proteina, ma è poco

sensibile.

• Tutti gli altri metodi (Bradford, Lowry e BCA) reagiscono

con alcuni particolari aminoacidi e quindi danno una

risposta che dipende dalla composizione aminoacidica

della proteina in esame.

• Sono però metodi più sensibili, in particolare il BCA.

Vantaggi e svantaggi dei diversi metodi

Sorgente luminosa:

lampada al tungsteno regione visibile

lampada al deuterio regione UV

• Monocromatore: sistema ottico in grado di fornire, partendo

da una sorgente di radiazione policromatica, una radiazione

monocromatica, teoricamente una radiazione composta da una

sola lunghezza d’onda (rifrazione con un prisma o diffrazione

con un reticolo)

• Compartimento del campione: sito dove viene alloggiata la

cuvetta

• Rivelatore: in genere si tratta di fotocelle/fotomoltiplicatori,

in grado di convertire i quanti della radiazione in energia

elettrica

TRASMITTANZA

Il fenomeno dell’assorbimento viene espresso in termini

quantitativi, mediante il concetto di trasmittanza

T= I

I0

dove I0 è l’intensità della radiazione

incidente ed I quella della radiazione

uscente dal campione

La legge di Lambert e Beer

DIALISI

Le frazioni eluite più ricche in proteine vengono riunite e

dializzate utilizzando una membrana da dialisi con cut off

14000 Da per eliminare il maltosio. Si utilizza 1 L di tampone

Na2HPO4 25 mM, NaCl 75 mM pH 7.4.

III giorno:

Recupero del campione dializzato

Dosaggio proteico dopo dialisi

Dosaggio dell’attività enzimatica

La frazione recuperata dopo dialisi viene dosata nuovamente

utilizzando il metodo di Bradford in modo tale da controllare

eventuali perdite di materiale.

ENZIMA

La misura dell’attività enzimatica viene condotta seguendo la

scomparsa del substrato o la comparsa del prodotto.

• temperatura

• pH

• concentrazione enzimatica

• inibitori

• attivatori

• concentrazione di substrati e prodotti

Fattori che influenzano l’attività enzimatica

• Spettrofotometriche

• Fluorimetriche

• Radioisotopiche

• Cromatografiche

• Elettrochimiche

• Manometriche

• Immunochimiche

L’attività enzimatica può essere misurata con

diverse tecniche

L’unità enzimatica è definita come la quantità di

enzima necessario a trasformare 1 mole di substrato

in un minuto

Attività specifica= unità di enzima/mg totali di proteina

Attività enzimatica= unità di enzima/vol

Tutti i saggi enzimatici vanno condotti:

• In eccesso di substrato (10 volte la Km)

• Misurando la velocità iniziale

• Eseguendo una preincubazione alla

temperatura di reazione

• Analizzando volumi diversi della soluzione da

analizzare

v0 = Vmaxx[S]/(Km+[S])

• Continui

• Discontinui

• Indiretti o accoppiati

Esistono diversi tipi di saggi enzimatici

Si utilizza quando nè substrati nè prodotti hanno

caratteristiche rivelabili e misurabili.

Si utilizza una seconda reazione abbinata alla prima che

possa dare una misura della prima:

A B C

Non colorato non colorato colorato

Molto spesso vengono utilizzate delle deidrogenasi

SAGGIO ACCOPPIATO

SPETTRO DI ASSORBIMENTO NAD E NADH

DOSAGGIO DELL’ENZIMA TREALASI

U/ml= [(Emin-1/340 x d x 2) x (Vtot/Vc )]

La reazione viene fatta partire con l’aggiunta di trealosio

TABELLA DI PURIFICAZIONE(V. risultati sperimentali di ciascun gruppo)

IV giorno:

Cinetica enzimatica

Determinazione massa molecolare

Calcolo della concentrazione molare per il

calcolo della Kcat

Tabella di purificazione

CINETICA ENZIMATICA

Consiste nel valutare l’attività enzimatica in presenza di

concentrazioni crescenti di substrato

Si varia la concentrazione di trealosio: 0.125,

0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM

Si calcolano le corrispondenti U/mL

L’equazione di Michaelis-Menten mette in relazione v0 e [S]:

v0 = Vmax[S]/(Km + [S])

Km è la concentrazione di substrato alla quale la velocità di

reazione è la metà della Vmax ed esprime l’affinità dell’enzima per il

substrato.

Grafico di Michaelis-Menten

Grafico dei doppi reciproci

Determinazione della massa molecolare

CALCOLO DELLA CONCENTRAZIONE MOLARE

PER IL CALCOLO KCAT

TABELLA DI PURIFICAZIONE

Campione Vol.

(mL)

[Prot]

mg/mL

Proteine

totali

mgtot

Attività

U/mL

Attività

totale

Utot

Attività

specifica

Utot/mgtot

Resa

%

Indice

di

purificazione

Estratto

grezzo

Frazione solubile

Cromatografia di

affinità

V giorno:

Effetto del pH sull’attività enzimatica

Saggi di denaturazione termica

• temperatura

• pH

• concentrazione enzimatica

• inibitori

• attivatori

• concentrazione di substrati e prodotti

Fattori che influenzano l’attività enzimatica

L’ATTIVITA’ DI UN ENZIMA DIPENDE DAL pH

La maggior parte degli enzimi mostra un'attività MASSIMA ad un

valore del pH ben definito, diverso da un enzima all'altro.

Allontanandosi dal pH ottimale si provoca una diminuzione

dell'attività, che può anche annullarsi: a valori estremi di pH gli

enzimi, come tutte le proteine, si denaturano.

Finchè un enzima è stabile la velocità

della reazione che esso catalizza

AUMENTA CON LA TEMPERATURA

in modo esponenziale. Tuttavia,

superata una certa temperatura, si

osserva un RAPIDO CROLLO

dell'attività, dovuto ad un fenomeno

comune a tutte le proteine: la

DENATURAZIONE TERMICA.

L’ATTIVITA’ DI UN ENZIMA DIPENDE DALLA TEMPERATURA

DIPENDENZA DELL’ATTIVITÀ DA pH E TEMPERATURA(V. risultati sperimentali di ciascun gruppo)