Esercitazioni. Software Textpad (editor di testo) Arlequin (Pacchetto per genetica di popolazioni) Past (analisi varie)

Esercitazioni

Software

Textpad (editor di testo)

Arlequin (Pacchetto per genetica di popolazioni)

Past (analisi varie)

Esercitazioni: Contenuti

Stima parametri Intra-popolazione (MtDNA, Y Chr.)

Stima parametri demografici (MtDNA)

Stima parametri Inter-popolazione (MtDNA, Y Chr.)

Rappresentazioni grafiche (PAST) (MtDNA, Y Chr.)

Flusso genico differenziale Pigmei Bantu

PIGMEI•Cacciatori raccoglitori•Piccole dimensioni•Bassa taglia effettiva•Struttura sociale variabile

BANTU•Agricoltori•Grandi dimensioni•Alta taglia effettiva•Patrilocali•Poliginia

Paolo

e il numero di individui con pari probabilità di riproduzione che determinerebbero l'entità dei fenomeni evolutivi osservatiAd esempio, se una popolazione perde variabilità genetica ad un tasso che sarebbe caratteristico di una popolazione di 100 individui con pari probabilità produttiva, noi diremo che la sua dimensione effettiva è 100, anche se la dimensione censita fosse di 1000 individui


<5000 BPAreale di distribuzione

delle popolazioni Pigmee

Flusso genico elevato tra popolazioni Pigmee


5000 – 3000 BP

Areale di distribuzione delle popolazioni

Pigmee

Origine espansione Bantu

Frammentazione dell’areale dei Pigmei

Diminuzione del flusso genico tra i Pigmei


Cavalli Sforza



L’ipotesi


Impedimenti di natura socioculturale

Pigmei Bantu

La donna Pigmea va a vivere insieme al marito Bantu.

Nel caso di decesso o divorzio la donna Pigmea torna al suo villaggio portando con se i figli.


Valutare la presenza di questo pattern attraverso gli effetti sulla variabilità genetica

BANTUPIGMEI

Variabilità interna

mtDNA

Y chr

Variabilità inter-popolazione

•mtDNA diversità più marcata tra Bantu e Pigmei

•Y chr Diversità meno marcata tra Bantu e Pigmei

Parametri demografici

•Bantu segnali di espansione

•Pigmei segnali di stazionarietà


PIGMEIBabingaBakaBakolaBiakaMbenzele

BANTUBakakaBassaBatekeEwondoNgoumba

DNA mitocondriale (HVR1) Cromosoma Y (6 STR)

Arlequin

Arlequin è un pacchetto di software per analisi che fornisce all’utente di genetica di popolazione un gran numero di metodi di base e test statistici, al fine di estrarre informazioni sulle caratteristiche genetiche e demografiche di una raccolta di campioni di popolazione.

Settaggio e preparazione file Arlequin[Profile] NbSamples=1 DataType=STANDARD # - {DNA, RFLP, MICROSAT, STANDARD, FREQUENCY} GenotypicData=0 # - {0, 1} GameticPhase=1 # - {0, 1} LocusSeparator=WHITESPACE # - {TAB, WHITESPACE, NONE} RecessiveData=0 # - {0, 1} MissingData='?' # A single character specifying missing data# Some advanced settings the experienced user can uncomment# Frequency= ABS # - {ABS, REL}# FrequencyThreshold= 1.0e-5 # - (Any real number, usually between 1.0e-7 and 1.e-3)# EpsilonValue= 1.0e-7 # - (Any real number, usually between 1.0e-12 and 1.0e-5)

[Data]

[[Samples]]

SampleName="Name of Population number 1" SampleSize= 6 #Fictive number, but must match the sume of haplotype frequencies given below

SampleData= { #Example of a sample consisiting of haplotypic data (2 haplotypes, 2 loci): h1 2 TC h2 4 GT }

Variabilità Intra-Popolazione (MtDNA e cromosoma Y)

Arlequin: Variabilità Intra-Popolazione (MtDNA)

S: Number of polymorphic sites (numero di siti polimorfi)Numero di posizioni dove è presente una mutazione (SNP). Relazionando questo numero alla lunghezza della sequenza considerata si ha un’idea della variabilità nucleotidica (Nucleotide diversity)H: Number of Haplotypes (numero di aplotipi diversi)Il numero di aplotipi diversi trovati nella popolazione

HD: Haplotype diversity (Gene diversity)La probabilità che due aplotipi (alleli) presi a caso all’interno del pool siano diversi.

n= numero di individuiK= numero diverso di aplotipiP= frequenza dell’i-esimo aplotipoPermette di fare confronti dal momento che tiene in considerazione la taglia

del campione (N)

Arlequin: Variabilità Intra-Popolazione (MtDNA)

MNPD: Mean number of paiwise differences (numero medio di differenze a coppie)Numero di differenze ,al livello di sequenze, tra tutti gli individui della popolazione confrontati a coppie.

k= il numero di differenze tra le sequenze generiche i e jn= numero di sequenze nel campionen(n-1)/2=numero di confronti totaleAMOVA: Analysis of Molecular Variance

Analisi per valutare il grado di strutturazione delle popolazioni.Un analisi gerarchica della varianza basata sulle frequenze geniche e le differenze tra aplotipi:La varianza è poi suddivisa in componenti relative a:•Diversità all’interno delle popolazioni•Diversità tra popolazioni all’interno dei gruppi•Diversità tra gruppi

Arlequin: Variabilità Intra-Popolazione (Cromosoma Y)

h, Hd, MNPD, AMOVA

Garza-Williamson index (G-W)Indice sensibile a recenti colli di bottiglia

k=numero di alleli in un dato locusR= range allelico

Valori bassi di G-W: collo di bottigliaValori prossimi a 1 di G-W: popolazione stazionaria

R: Allelic range (range allelico)Il range di alleli differenti per ogni locus

S: Number of alleles (numero di alleli)Numero di alleli per ogni locus

Parametri demografici(MtDNA)

Arlequin: Parametri demografici (mtDNA)

Test di selezione basati sul confronto tra i vari stimatori del parametro =4Nµ (2Nµ per i sistemi aploidi). MtDNA e Cromosoma Y non soggetti a selezione quindi i test stimano gli effetti della demografia sulla struttura genetica delle popolazioni

(Hom): una stima che si ottiene dall’omozigosità osservata (S): una stima che si ottiene dal numero osservato di siti segreganti (k): una stima che si ottiene dal numero osservato di alleli (π): una stima che si ottiene dal numero medio di differenze a coppie

Le variazioni della taglia effettiva di una popolazione nel tempo

•Non tutti i metodi sono utilizzabili con i diversi marcatori•In definitiva tutti questi metodi dovrebbero dare lo stesso risultato•Dal momento che ogni metodo fa delle assunzioni a priori e differenze nella stima possono essere interpretate come una violazione di tali assunzioni


TAJIMA’S DTest basato sul modello a siti infiniti senza ricombinazione quindi adatto per MtDNA

Tante mutazioni di cui poche condivise tra aplotipi diversi D>0Selezione bilanciante o Espansione demografica

Poche mutazioni di cui molte condivise tra aplotipi diversi D<0Neutralità selettiva o Stazionarietà

La significatività è calcolata tramite simulazioni di popolazioni in equilibrio.Il P-Value è la probabilità di ottenere valori di D minori o uguali all’osservato.


P-Value del D è calcolato attraverso un approccio di simulazione che fornisce la probabilità di ottenere valori di D minori o uguali da una popolazione selettivamente neutrale generata a random.

Espansione

Stazionarietà

Stazionarietà


Fs di FuTest basato sul modello a siti infiniti senza ricombinazione quindi adatto per MtDNAValuta la differenza tra la variabilità osservata e quella attesa secondo un modello di evoluzione neutrale.

Si calcola prima la probabilità (S’) di osservare un campione neutrale con un numero di alleli minore o uguale al valore osservato, dato il numero di differenze a coppie (stima di )

Fs positivo: il numero di alleli minore rispetto all’attesoselezione positiva o bottleneck recenteFs negativo: il numero di alleli maggiore rispetto all’attesoselezione bilanciante o espansione demograficaFs vicino allo zero: assunzioni modello rispettateNeutralità selettiva o popolazione stazionaria

Anche per Fs di Fu la significatività è calcolata tramite simulazioni di popolazioni in equilibrio.Il P-Value è la probabilità di ottenere valori di Fs minori o uguali all’osservato.


Mismatch distributionLa distribuzione delle differenze a coppie tra sequenze

La forma della distribuzione fornisce indizi sulla storia demografica della popolazione

I II III IV V p.d. N Freq.

I A G T C T T A C G T A T C I - 0 1 0,1

II A G T C T T G C G T A T C II 1 - 1 5 0,5

III A G T T T T A C G T A T C III 1 2 - 2 3 0,3

IV A G T C T T G C G T C T C IV 2 1 3 - 3 1 0,1

V A G T C T T A C G T A T C V 0 1 1 2 -

1 2 3 40

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6


RAGGEDNESS: indice che permette di distinguere tra i due tipi di distribuzione

Robustezza (raggedness) r, somma dei quadrati delle differenze tra due picchi vicini.

r più basso per le distribuzioni a campana

r <0,03 per i dati di sequenza, indica un’espansione della popolazione nel passato.

Variabilità Inter-Popolazione (MtDNA e cromosoma Y)

Arlequin:Variabilità inter-popolazione

Una metapopolazione è una popolazione suddivisa in sottopopolazioni parzialmente isolate; ciò determina un deficit di eterozigoti (no equilibrio Hardy Weinberg).

Il processo di suddivisione genera una struttura gerarchica della popolazione. Ogni volta che i dati non rispecchiano il random mating possiamo pensare ad una struttura nella popolazione e quindi possiamo misurare la distribuzione di variabilità.

Fst

Parametro di distanza genetica che misura il grado di variabilità di una metapopolazione suddivisa in subpopolazioni.

Fst = Vp/ p (1-p)

dove p e Vp sono la media e la varianza delle frequenze geniche tra le due subpopolazioni;Misura la porzione di varianza totale nelle frequenze alleliche tra le

subpopolazioni

0<Fst<1

Arlequin:Variabilità inter-popolazione DISTANZA GENETICA Fst TRA DUE POPOLAZIONI AD UN LOCUS CON DUE ALLELI

Fst= Vp / P (1-P)

p = frequenza allelica

P = frequenza allelica media

1 e 2 = popolazione 1 e 2

Varianza =(X-Xm)2/N

La devianza/N

Devianza = (X- Xm)2

Somma degli scarti al

quadrato

scarto: un valore X sottratto

rispetto alla media

aritmeticaFst = (p1-P)2 + (p2-P)2

2x

1

P (1-P)

Arlequin:Variabilità inter-popolazione ESEMPIO DI CALCOLO DELLA DISTANZA GENETICA Fst

POP 1 POP 2

p1=0,3 p2=0,7

POP 1 POP 2

p1=0,1 p2=0,9

P=0,5 P=0,5

(0,3-0,5)2 + (0,7-0,5)2

2 x [0,5 x (1-0,5)]= =0,16 Fst

(0,1-0,5)2 + (0,9-0,5)2

2 x [0,5 x (1-0,5)]= =0,64


Rst:Misura della distanza genetica equivalente all’Fst ma adattata ai loci microsatellite. Assume un modello stepwise ad alto tasso di mutazione.

Ax-yi = Numero di ripetizioni per il locus i nelle popolazioni x e y


Bisogna valutare se il valore ottenuto sia significativo, quindi se la suddivisione della popolazione è maggiore di quella attesa per caso

Bisogna escludere che:

•La popolazione non sia differenziata

•Le differenze tra le frequenze alleliche siano dovute al campionamento

•L’accoppiamento sia casuale

Il test è realizzato mediante permutazioni o Monte-Carlo method (si usano numeri casuali).


I dati sono presi a caso più volte, ogni allele è assegnato casualmente a una subpopolazione, in modo che la freq di ogni allele resti costante nella metapopolazione. La misura di interesse (Fst) viene calcolata per i 1000 datasets simulati. Perché il valore osservato di Fst sia significativamente diverso da 0, deve essere più grande di una certa porzione (X) dei valori simulati, dove 1-X è il limite di significatività.

Per es. se il valore di Fst è più grande in più di 950 simulazioni su 1000, il livello di significatività sarà del 5%.

MONTE-CARLO PERMUTATION TEST

Past: rappresentazioni grafiche

ANALISI MULTIVARIATE

CLUSTER ANALISYSSeleziona e raggruppa elementi omogenei all’interno di un set di dati. Esistono diversi metodi (algoritmi) suddivisi principalmente in due categorie

Clustering partitivo: L’appartenenza ad un gruppo è definita dalla distanza da un punto rappresentativo del cluster (centriode etc..) avendo determinato a priori il numero di cluster (K-means)

Clustering gerarchico: Si costruisce una gerarchia di partizioni caratterizzata da un numero decrescente di cluster (UPGMA, Neighbour joining etc..)

Past: rappresentazioni grafiche

Una matrice di distanza genetiche ha tante dimensioni quante sono le popolazioni quindi è impossibile da visualizzare graficamente a meno che non si riassume l’informazione in modo che possa essere rappresentata in due dimensioni.

MDS (Multidimensional scaling)

costrizione delle distanze genetiche in uno spazio a due dimensioni

con la minor perdita di informazione possibile (minore distorsione

possibile)

La distorsione è rappresentata dal parametro stress

Flusso differenziale Pigmei BantuRISULTATI

Bakola

Babinga

Mbe

nzele

Baka

Biaka

Batek

e

Bakak

a

Ewon

do

Ngoum

ba

Bassa

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

HD mtDNA

Ewon

do

Bakak

a

Bassa

Babinga

Batek

e

Biaka

Bakola

Baka

Ngoum

ba

Mbe

nzele

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

HD Y chromosome

Flusso differenziale Pigmei BantuRISULTATI

MNPD mtDNA

MNPD Y chromosome

Ewon

do

Bakak

a

Bassa

Batek

e

Ngoum

ba

Bakola

Mbe

nzele

Baka

Babinga

Biaka

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Bakola

Babinga

Mbe

nzele

Baka

Batek

e

Biaka

Ngoum

ba

Bassa

Bakak

a

Ewon

do0

2

4

6

8

10

12

Flusso differenziale Pigmei Bantu

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

BAKOLA

0 2 4 6 8 10 12 14 160

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

BATEKE


BakaBakola

Mbenzele

Babinga

Biaka

BassaBakaka

Bateke

Ew ondo Ngoumba

-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4

Coordinate 1

-0,36

-0,3

-0,24

-0,18

-0,12

-0,06

0

0,06

0,12

Coo

rdin

ate

2

mtDNA

Among pop. p-value

Pigmies 26.85 0.00

Bantu 1.91 0.00


Baka

Bakola

Mbenzele

Babinga

Biaka

Bassa

Bakaka

Bateke

Ew ondo

Ngoumba

-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Coordinate 1

-0,24

-0,16

-0,08

0

0,08

0,16

0,24

0,32

Coo

rdin

ate

2

Y chromosome

Among pop. p-value

Pigmies 5.36 0.00

Bantu 11.36 0.00

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Esercitazioni. Software Textpad (editor di testo) Arlequin (Pacchetto per genetica di popolazioni) Past (analisi varie)