ESPECTROMETRÍA DE MASAS MOLECULAR.

Antecedentes de la espectrometría de masas

La espectrometría de masas es la de mayor aplicación, en el sentido de que esta técnica es capaz de proporcionar información acerca:

Composición elemental de las muestras Estructura de las molecular orgánicas, inorgánicas y biológicas. Composición cualitativas como cuantitativas de mezclas complejas Estructura y composición de superficies sólidas Relaciones Isotópicas

Electrospray (nanoSpray) Ion Source in LTQ-FTICR mass spectrometer

La primera aplicación general de E.M en análisis químico se produjo a principios de los 40´s, cuando esta técnica se comenzó a usar para el análisis cuantitativo en mezclas de hidrocarburos, antes este tipo de análisis se llevaba por destilación fraccionada y posteriores medidas de ind. De refracción. Para completar este tipo de análisis se llevaban aprox. 200hrs o mas.

Sin embargo con el E.M. esta información se obtiene en algunas horas o menos.

En los 80´s las aplicaciones del E.M experimento grandes cambios en consecuencia del desarrollo de métodos de producción de iones de moléculas no volátiles.

Actualmente esta técnica es aplicada en determinación de estructuras de polipéptidos, proteínas y otros biopolímeros de gran PM.

*Analito: etilbenceno

*Masa molecular:10^6 daltons

*Bombardea con haz de electrones para dar la formación de un ión molecular como se muestra en la reacción:

C6H5CH2CH3 + e C6H5CH2CH3(+) + 2e

El ión molecular es un ión radical y tiene el mismo PM que la molécula.

La colisión entre los electrones y las moléculas del analito, proporciona suficiente energía para dejarlas en estado excitado, posteriormente se produce la relajación, con frecuencia mediante la fragmentación de los iones moleculares, que dan iones de masas bajas, por ejemplo en el etilbenceno el producto mayor es: C6H5CH2(+) y aparte CH3.

Los iones positivos producidos por el impacto de electrones pasan a través de la rendija del E.M, de donde salen en relación a su masa y su carga (m/z)

Al pico mas alto se le denomina pico base y se le asigna el valor 100 de forma arbitraria, se considera la altura del resto de los picos como porcentaje de la altura del pico base.

Fuente de Iones

En la E.M. la formación de iones del analito en forma gaseosa y la proyección y utilidad del mismo, esta condicionada por el proceso de ionización.

Fase gaseosa: primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza. Esta está restringida a compuestos térmicamente estables que tengan punto de ebullición menores de 500ºC aprox., esto limita a compuestos de pesos moleculares aproximadamente 10^3 daltons.

Fuentes de desorción: La muestra en estado liquido o sólido se transforma directamente en iones gaseosos. La ventaja de esta es que son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables. Aplicable a compuestos con PM de 10^5 daltons.

Métodos separados en 2 categorías

Las fuentes de iones se clasifican:

Fuentes duras: comunican la energía suficiente a las moléculas de manera que se encuentran en un estado de alta excitación, cuando se relajan se producen iones fragmentados con una relación de masa carga menor que el ión molecular. Nos proporciona información de la naturaleza de los grupos funcionales, así como información estructural de los analitos.

Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentación, así que el E.M. consta de un pico y solo alguno o ningún otro pico. Nos permite la determinación exacta del PM de la molécula o moléculas

Diferencia en E.M de fuente dura y blanda

Fuente de Impacto de Electrones

E.M de impacto de electrones

Con objeto de formar un numero significativo de iones gaseosos en una proporción reproducible, es necesario que los electrones generados por el filamento sean acelerados mediante un potencial mayor de unos 50V, esto logra hacer que se excite las moléculas, la subsecuente relajación tiene lugar a una elevada fragmentación, que da iones de mas baja masa que la del ión molecular, a estos se les llama iones hijos.

Los complejos E.M que se obtienen con ionización por impacto de electrones son útiles para la identificación de compuestos, por otra parte para cierto tipo de moléculas la fragmentación es tan efectiva que no queda ningún ión molecular, por tanto la información para la determinación del PM se pierde.

Picos de los Isótopos

En los EM a veces aparecen picos que corresponden a masas mayores que la del ión molecular, estos picos se atribuyen a iones que tienen la misma formula química pero deferente composición isotópica

Picos resultantes de las colisiones Las colisiones ión-molécula:

pueden producir picos que corresponden a masas mas elevadas que la del ión molecular, sin embargo a presiones normales de la muestra, la única reacción de este tipo que ocurre es la que por medio de colisiones se transfiere un átomo de hidrógeno al ión para dar un ión molecular protonado, el resultado es un pico intenso, la altura de este pico aumenta si aumentamos la presión, así que la detección de esta reacción es posible

Ventajas e Inconvenientes de las fuentes de impacto de electrones

Ventajas:

Las fuentes de impacto de electrones son adecuadas para el uso y producción de corrientes de iones elevadas, obteniéndose buenas sensibilidades.

La extensa fragmentación y el elevado numero de picos nos permite la identificación inequívoca de posibles analitos

Desventajas:

Puede dar la desaparición del ión molecular y esto nos impide establecer el PM del analito.

Necesidad de volatilizar las muestras, por que se puede dar la degradación térmica de las muestras

Ionización química.

Producida por el choque con iones de gas reactivo bombardeado.

Casi siempre iones +.

2º más utilizado.

Modificaciones en zona de ionización.

Relación de concentración reactivo – muestra 103 a 104.

Reactivos.

Metano, (más común). Sus colisiones generan.

Propano.

Isobutano.

Amoniáco.

Ventajas ionización química.

Impacto de electrones.

Ionización química.

Ionización por campo.

Campo eléctrico elevado (10^8 V/cm).

Emisores wolframio (agujas).

Efecto túnel (mecánica cuántica).

Poca fragmentación.

Espectro de ionización por campo.

Ionización por campo.

Impacto de electrones.

Fuentes de desorción.

Muestras: No volátiles. Térmicamente inestables.

No requiere volatilización.

Espectro muy simple.

Desorción por campo.

Emisor con múltiples puntas. Sonda recubierta con muestra. Potencial elevado (puede haber degradación).

Desorcíon/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI).

Descrito en 1988. Sustancia matriz absorbe radiación. Láser pulsante sublima analito. Espectro de tiempo de vuelo. No hay fragmentación.

Sustancias matrices.

Ionización por electronebulización.

Descrita 1984.

Análisis biomoléculas.

Condiciones atmosféricas.

Otros métodos desorción.

Bombardeo con átomos rápidos.

Por plasma.

Iones secundarios.

Termonebulización.

Componentes del instrumento.

Sistemas de entrada de la muestra

Introducción de una muestra representativa en la fuente de iones.

Tipos de entrada: Sistemas indirectos de entrada Entrada por sonda directa Entradas cromatográficas Entrada de electroforesis

capilar

Sistemas indirectos de entrada

Es el más simple

La muestra se volatiliza externamente entra a través de un diafragma de metal o vidrio con varios orificios en la región de ionización (baja presión)

Muestras:

Punto de ebullición 500° C Gaseosas: se recoge el gas entre dos válvulas en el área de medida

que después se expande en el contenedor Líquidos: se introduce en un depósito una cantidad pequeña de la

muestra. (P: 10-5 a 10-4 torr)

Punto de ebullición 150° C se usa un horno y cintas calefactoras para mantener la T elevada.

El sistema de entrada es de vidrio para evitar pérdidas de analitos polares por adsorción.

Entrada por sonda directa

Para introducir líquidos o sólidos no volátiles, se utiliza sonda que se inserta a través de un cierre de vacío.

Cuando la cantidad de muestra es limitada, se pierde menos muestra

Se coloca generalmente en la superficie de un vidrio o tubo capilar de aluminio.

Esta a pocos mm de la fuente de ionización, es posible obtención de espectros de compuestos térmicamente inestables.

La sonda permite el estudio de materiales no volátiles

Sistemas de entrada cromatográficos y de electroforesis capilar

Espectrómetro de masas acoplado a CG, HPLC o columnas de electroforesis capilar, que permiten la separación y determinación compuestos de mezclas.

Analizadores de masas

Separación de iones con diferente relación m/z Sensible a diferencias muy pequeñas de masa Permiten el paso un número de iones suficiente para producir

corrientes iónicas fáciles de medir

Resolución

Capacidad del instrumento de distinguir entre masas:

R = m / Δm

Donde Δm= diferencia de masa entre dos picos adyacentes resueltos

m= masa nominal del primer pico

Dos picos están separados si la altura del valle entre ellos no es mayor de una determinada fracción de su altura (10%)

C2H4+ PM: 28,01313

CH2N+ PM: 28,0187

N3+ PM: 28,0061

CO+ PM: 27,9949Resolución de varios miles

NH3+ PM: 17

CH4+ PM: 16

R < 50

Tipos de analizadores

Analizadores de sector magnético o espectrómetros de enfoque simple

Utilizan un imán permanente o electroimán

El haz procedente de la fuente de iones se desplaza (trayectoria circular 180, 90 o 60°.

Los iones son acelerado a través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico (P = 10-7 torr). Se puede hacer un barrido de los iones de diferente masa variando la fuerza del campo del imán o el potencial de aceleración entre las rendijas A y B.

Estos iones pasan a través de la rendija de salida se recogen en un electrodo colector, dando lugar a una corriente de iones. Se amplifica y se registra

R≤ 2,000

Los iones de la misma carga poseen la misma energía cinética, después de la aceleración independientemente de su masa

Los iones que abandonan la rendija tienen la misma energía cinética . Los iones más pesados se desplazan con velocidades menores.

Espetrómetros de doble enfoque

Combinación de campo magnético y electrostático

R = 10 5

Espectrómetro de masas cuadrupolarTiempos de barrido pequeños Útil para realizar barridos de picos cromatográficos en tiempo real

Analizador de masas de tiempo de vuelo

Fácil acceso a la fuente de iones

Ilimitado intervalo de masas

Resolución y sensibilidad limitada

Analizadores de trampa de iones

Cationes o aniones gaseosos pueden confinarse largos periodos de tiempo

Campo magnético o eléctrico

Instrumentos de transformada de Fourier (FT)

Mejor relación señal/ruido Velocidades mayores Sensibilidad y resolución elevadas Aprovecha el fenómeno de resonancia iónica

ciclotrónica

Espectrómetros de masas computarizados

Software interactivo y fácil de utilizar

APLICACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS MOLECULAR.

Las aplicaciones de la espectrometría de masas son muy numerosas y abarcan demasiados campos.

Identificación de compuestos puros.

El espectro de un compuesto puro proporciona diversos tipos de datos que son útiles para su identificación. Peso molecular del compuesto. Fórmula molecular.

Además el estudio de los modelos de fragmentación que se pone de manifiesto en el espectro de masas, proporciona información sobre la presencia/ausencia de diversos grupos funcionales.

La identidad de un compuesto se puede establecer mediante la comparación de sus espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta llegar a total coincidencia.

Determinación de los pesos moleculares a partir de los espectros de las masas.

Por aquellos compuestos que pueden ionizarse por alguno de los métodos anteriormente descritos, dando un ion molecular o un ion molecular protonado o desprotonado.

El espectrómetro de masas es una herramienta insuperable para la determinación del peso molecular, esta determinación requiere la identificación del pico (M+1)+ o (M-1)+. La localización del pico en la abscisa da el peso molecular una precisión que no se puede alcanzar por ningún otro método.

Una determinación por espectrometría de masas requiere conocer con certeza la identidad del pico del ion molecular.

Es aconsejable ser precavido, en particular con las fuentes de impacto de electrones, donde el pico del ion molecular puede estar ausente o ser pequeño en relación con los picos debidos a las impurezas.

Cuando existen dudas son particularmente útiles los espectros adicionales de ionización química, de ionización por campo y de ionización por desorción.

Formulas moleculares a partir de pesos moleculares exactos.

Las fórmulas moleculares se pueden determinar a partir del espectrómetro de masas de un compuesto, siempre que el pico del ion molecular pueda ser determinado y su masa exacta determinada; sin embargo, esta aplicación requiere un instrumento de alta resolución.

Ejemplo.

Purina Benzamidina Etil Tolueno Acetofenona

Fórmula C5H8N4 C7H8N2 C9H12 C8H80

m 120,044 120,069 120,096 120,058

Si la masa medida del pico del ion molecular es 120.070 (±0,005),

Fórmulas moleculares a partir de relaciones isotópicas.

Los datos de un instrumento de baja resolución que sólo puede discriminar entre iones cuyas masas difieren en un número entero de masa, pueden dar información útil sobre la fórmula de un compuesto, con tal que solo el pico del ion molecular, sea suficientemente intenso para que su altura y las alturas de los picos de los isótopos (M+1)+ y (M+2)+ puedan determinarse con precisión.

Ejemplo. Un pico de ion molecular a una masa de 84 con

valores de (M+1)+ y (M+2)+ de 5,6*100 y 0.3*100 sugiere un compuesto que tenga la fórmula C5H80.

La relación isotópica es particularmente útil para la detección y estimación del número de átomos de azufre, cloro y bromo que hay en una molécula debido a que contribuyen en gran medida a la formación de (M+2)+.

Información estructural a partir de modelos de fragmentación.

Los estudios sistemáticos de modelos de fragmentación de sustancias puras han conducido al establecimiento de ciertas guías que permiten predecir los mecanismo de fragmentación y una serie de reglas generales que son de utilidad para la interpretación de espectros.

Característico de parafinas de cadena lineal. Normalmente los fragmentos de los

hidrocarburos más estables contienen tres o cuatro átomos de carbono y los picos correspondientes son mas grandes.

Los alcoholes tienen un pico de ión molecular muy débil o inexistente pero, a menudo, pierden agua dando un pico intenso a (M-18)+.

Identificación de compuestos por comparación de espectros.

Cuando hay compuestos de referencia disponibles, la identificación final se basa en una comparación de los espectros de masas del analito con los espectros de muestras de referencia de los compuestos esperados.

No se puede suponer que los modelos de fragmentación son únicos debido a los espectros de estereoisómeros o de isómeros geométricos y ocasionalmente tampoco es válida para ciertos tipos de compuestos muy relacionados entre sí.

La ionización por impacto de electrones es el método de elección para la comparación de espectros.

Sistemas computarizados de comparación de espectros.

Los espectrómetros de masas más modernos están equipados con sistemas computarizados de comparación de espectros muy eficaces.

Se dispone de dos tipos de colecciones de espectros: unas muy extensas (>15,000 espectros) disponibles se

comercializan por John Wiley & Sons; se encuentra disponible en CD, con un software (PBM – STIRS) y,

otras más pequeñas pero muy específicas (pocos cientos y algunos miles de espectros aplicables a un área determinada, tal como residuos de pesticidas, drogas o muestras forenses).

Análisis de mezclas por métodos espectrales de masas acoplados.

La espectrometría de masas es insuficiente para el análisis de mezclas, incluso de las más simples, debido al gran número de fragmentos con diferentes valores de m/z producidos en cada caso.

Se han desarrollado métodos en los que el espectrómetro de masas está acoplado a un sistema de separación eficaz. Esto se denomina “método acoplado”.

Cromatografía/espectrometría de masas.

La GC/MS se ha convertido en una de las más poderosas herramientas para el análisis de mezclas orgánicas y bioquímicas complejas.

Electroforesis capilar/espectrometría de masas.

Este método acoplado se ha convertido en una poderosa e importante herramienta para el análisis de grandes hipopolímeros tales como: Proteínas. Polipéptidos. Especies de DNA.

Espectrometría de masas en tándem.

Implica el acoplamiento de un espectrómetro de masas a otro. En este montaje el primer espectrómetro sirve para aislar los iones moleculares de los diferentes componentes de una mezcla.

Estos iones se introducen uno detrás de otro en un segundo espectrómetro de masas donde son fragmentados para dar una serie de espectros de masas, uno por cada uno de los iones moleculares obtenidos en el primer espectrómetro.