Espectrometría de masas

• MALDI-MS

• ESI-MS

• TÁNDEM (MS/MS)

Espinosa Ruiz Ivonne NallelyTorres Torres Yahaira DesireeTerán Infante Laura Viridiana

Bioquímica I 7 octubre 2015

¿Qué es un espectrómetro de masas?

Los espectrómetros de masas se pueden describir como “instrumentos que pesan moléculas”, que son muy pequeñas para ser pesadas en una escala tradicional.

Utilizan una propiedad que poseen todas las moléculas: la masa. Cada molécula tiene una masa única, por ejemplo, una molécula de agua pesa 3x10-23 gramos; la masa de una molécula de cloruro de sodio (sal de mesa) es 9.6x10-23 gramos

Se obtiene el informe de qué moléculas está compuesta una mezcla y en qué cantidad está presente cada una de ellas.

¿Cómo está constituido un espectrómetro de masas? Un equipo de espectrometría de masas consta de cinco módulos fundamentales:

1. Sistema de introducción de muestra

2. Fuente de ionización

3. Analizador de masas

4. Detector

5. Procesador de datos

Aplicar energía a la muestra para generar moléculas cargadas positiva o negativamente, ya que para medir las moléculas por EM éstas deben estar “eléctricamente cargadas” (se consigue por bombardeo mediante electrones )

1) Como sistema de introducción de muestra existen dos métodos cromatográficos distintos: El de líquido de alta resolución (HPLC) y el de gases (GC).

2) La función de la fuente de ionización en un equipo de EM es:

Los iones provenientes de la fuente de ionización pasan al analizador de masas, que tiene como función separarlos y ordenarlos de acuerdo a su m/z. El intervalo de m/z, su precisión y exactitud dependen del tipo de analizador que se utilice

3) Analizador de masas

4) Detector Registra y amplifica la señal proveniente del analizador de masas

5) Procesador de datos Es en donde esta información se registra en forma de espectro de masas, que es una representación gráfica de los iones separados por su valor de m/z y ajustados de acuerdo al porcentaje de las especies más abundantes en la muestra

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Esta técnica de ionización, comúnmente llamada MALDI, fue descrita por Karas y Hillenkamp en 1988.

MS (Mass spectrometry) Es una técnica analítica para la determinación de la composición elemental de una muestra.

Proceso

En este método de ionización los analitos son disueltos en una solución de un compuesto que absorbe UV, llamado matriz (matrix).

Los solventes se van secando, los compuestos de la matriz cristalizan y los analitos quedan contenidos dentro de la matriz de cristales.

Pulsos de láser de luz UV (3-5 ns, 337 nm, 107 W/cm2) son utilizados para vaporizar pequeñas cantidades de la matriz donde se incluyen los iones del analito y llevados a fase gaseosa en el proceso.

Debido a que con la desorción por láser la producción de iones es discreta y es pequeños paquetes, el MALDI esta comúnmente combinado con un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad.

Debido a que con la desorción por láser la producción de iones es discreta y es pequeños paquetes, el MALDI esta comúnmente combinado con un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad.

La ionización del analito puede ser afectada por deprotonación, al aceptar o ceder un electrón, por unión de cationes o fotoionización, por lo que los iones generados por MALDI son de una amplia variedad de moléculas, ya que dependiendo de la combinación entre el analito y la matriz será el tipo de iones predominantes en el espectro obtenido.

IONIZACIÓN POR ELECTROESPRAY es una técnica utilizada en espectrometría de masas para producir iones

(ESI-MS). Es especialmente útil en la producción de iones a partir de macromoléculas, pues supera la propensión de estas a fragmentarse cuando se ionizan.

El uso de la fuente de ionización por electrospray como un medio de establecer una interfaz entre un cromatógrafo de líquidos y un espectrómetro de masas vino directamente de la obra de Dole, et al. y fue inventada por vez primera como una unidad LC-Electro-Spray-Ionización-MS por Horton a finales de 1975 (publicado en 1979 en una patente de Phillips Petroleum Co.) La técnica fue reinventada por Fite y publicado en 1980. Debido a que la unidad LC-ESI-MS aún no estaba totalmente preparada para la industria de análisis comercial, estos inventos son anteriores a un hito importante, el trabajo de John Bennett Fenn et al., que persistieron desde finales de los años 1980 en adelante con el refinamiento, desarrollo y consultoría para ayudar a la comercialización de la tecnología, lo que llevo finalmente a que fuera galardonado con el premio Nobel de química en 2002. por el desarrollo de la ionización por electroespray para el análisis de macromoléculas biológicas

FUNCIONAMIENTO

Se introduce el analito (que será ionizado) disuelto en un solvente más volátil por un capilar de metal muy pequeño y cargado.

Debido a la repulsión de las cargas eléctricas, el líquido se sale del capilar y forma un aerosol, una nube de pequeñas gotas (10 μm) altamente cargadas.

Conforme el solvente se evapora, las moléculas de analito se aproximan, se repelen y finalmente, cuando la repulsión de las cargas positivas vence la tensión superficial, estallan las gotas (Explosión de Coulomb).

El proceso se repite hasta que el analito está libre de solvente, de modo que no quedan más que iones.

Los iones se mueven hacia el analizador de masa.

Ventajas Desventajas Campo de aplicación

La muestra en solución se hace pasar a través de un capilar al que se aplica un alto potencial eléctrico, a la salida del capilar la solución se dispersa en forma de spray formado por pequeñas gotas cargadas, las cuales se evaporan rápidamente bien por un proceso de desorción del campo eléctrico ó de evaporación del solvente, liberando moléculas (péptidos ó proteínas) protonadas a la fase gaseosa. Los iones generados pueden estar protonados de forma múltiple dando lugar a diferentes especies para una misma molécula. En el caso de péptidos y proteínas, el extremo N-terminal y los residuos de histidina, arginina y lisina son los candidatos a protonarse. Todo el proceso de ionización se realiza a presión atmosférica. Al igual que la ionización MALDI es un método de ionización suave ya que no se detecta fragmentación de las moléculas

¿Qué es un espectrómetro de masas Tándem (MS/MS)?Es una técnica analítica que permite la separación, identificación y cuantificación de múltiples metabolitos, basada en su relación masa/carga (m/z), en diferentes matrices (líquidas, sólidas), después de su ionización en diferentes matrices biológicas, en un tiempo muy corto y de manera simultánea. Presentan los resultados en la forma de espectro de masas.

Un espectro de masas es una gráfica que muestra cada molécula específica por peso y cantidad de moléculas presentes.

Ha tenido diversas aplicaciones para el análisis de: Compuestos presentes en nuestro organismo, en el ambiente, los medicamentos, materiales manufacturados, alimentos, toxicología y medicina forense.

Una de las aplicaciones más comunes de la EM en tándem es el tamiz neonatal.

Un equipo de MS/MS está constituido de siete componentes básicos:

1.- Sistema de introducción de muestra.

2.-Fuente de ionización.

3.- Primer

analizador de masas (MS1 ).

4.-Cámara o celda de colisión.

5.-Segundo

analizador de masas (MS2 ).

6.- Detector.

7.-Procesador de datos.

HP GC

ESI MALDI APC CI EI

FAB FD/FI TSP

Q TOF MS

ESFT-ICR

Q TOF MS ES FT-ICR PM EM MP

Esquema general de un sistema MS/MS con ejemplos de cada módulo en la parte inferior. Abreviaturas: HPLC High Performance Liquid Chromatography, GC Gas Chromatography, ESI Electrospray Ionisation, MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation; APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation; CI Chemical Ionisation; EI Electron Impact; FAB Fast Atom Bombardment; FD/FI Field Desorption/Field Ionisation, TSP Thermospray Ionisation, Q Quadrupole, TOF Time of Flight, MS Magnetic sector, ES Electronic sector, FT-ICR Fourier transform, PM Photomultiplier, EM electron multiplier, MP Microchannel Plate.

1.- Introducción de muestras.

2.- Fuerza de ionización.

3.- Primer analizador de masas (MS1 ).

4.- Cámara o celda de colisión.

5.- Segundo analizador de masas (MS2 ).

6.- Detector.

7.- Procesador de datos.

Sufre una ionización suave por ESI para adquirir carga.

Posteriormente pasa al MS1 en donde los componentes de la muestra se separan y ordenan de acuerdo a su m/z.

Los iones pasan por la celda de colisión en donde se generan fragmentos como producto de su colisión con un gas inerte.

Los fragmentos generados pasan por el MS2, los cuales se pueden correlacionar con las moléculas intactas producidas en el MS1.

Con esta técnica se pueden detectar y cuantificar selectivamente múltiples analitos dentro de una familia de compuestos.

También se puede obtener información estructural acerca de un compuesto a través de la formación de fragmentos específicos y es útil para descubrir compuestos en mezclas complejas de acuerdo a su patrón de fragmentación.

Gracias al desarrollo de este tipo de tecnologías, la química clínica está pasando por un periodo de transición de los análisis individuales, aquellos en los que se utilizaba una muestra de sangre (del orden de mililitros) para la determinación de un solo metabolito, hacia la obtención de “perfiles” en los que se obtiene una gran cantidad de información a partir de una muestra de aproximadamente 100 microlitros de sangre, en un tiempo muy corto.

¿Qué es el tamiz?

Es un estudio que se realiza a recién nacidos con fines preventivos.

Se busca identificar enfermedades congénitas.

Se debe realizar entre las primeras 24 y 72 horas de vida, una vez que se haya normalizado su alimentación.

Éste consiste en tomar sangre del talón mediante una punción con lanceta, la sangre se coloca en papel filtro y se envía al laboratorio.

Una sencilla muestra de un recién nacido contiene miles de moléculas que van desde moléculas pequeñas tales como sales hasta proteínas grandes como lo es la hemoglobina.

Cuando se agrega alcohol a la mancha de sangre seca, se extraen varios cientos de moléculas las cuales pueden ser estudiadas

¿Por qué es el MS/MS el mejor método para tamiz de recién nacidos?El espectrómetro de masas tándem mide muchas moléculas diferentes en una sola prueba. Métodos más antiguos de prueba requieren del uso de varios exámenes para observar diferentes tipos de moléculas resultando en un alto consumo de tiempo y alto costo.

Con el espectrómetro de masas tándem los resultados están disponibles rápidamente y además son más exactos.

Las principales enfermedades que detecta el tamiz son:

Hipotiroidismo congénito: deficiencia de la hormona tiroidea que puede provocar retardo mental y en el desarrollo del cerebro.

Hiperplasia adrenal congénita: carencia de una enzima requerida por las glándulas suprarrenales para producir hormonas cortisol y aldosterona; sin ellas, el cuerpo produce más andrógenos, que es un tipo de hormona sexual masculina. Esto puede afectar el desarrollo de los genitales y causar la muerte por pérdida excesiva de sodio a través de los riñones

Fibrosis quística: enfermedad hereditaria que afecta fundamentalmente a los aparatos digestivo y respiratorio, y suele caracterizarse por enfermedad pulmonar obstructiva Afecta a las glándulas que producen moco, sudor, saliva y sustancias (enzimas) que participan en la digestión de los alimentos.

Anemia falciforme o drepanocítica: los glóbulos rojos de la sangre se deforman, lo que puede causar mala oxigenación y episodios de dolor y daño a órganos vitales como pulmones y riñones.

Fenilcetonuria: los bebés que tienen este padecimiento no pueden procesar un aminoácido y eso puede causar retraso mental

La enfermedad de la orina con olor a jarabe de maple: es un trastorno del metabolismo es hereditario, en el cual el cuerpo no puede descomponer ciertas partes de proteínas.

Homocistinuria: causada por la deficiencia de una enzima que bloquea el metabolismo de un aminoácido. Si no se detecta a tiempo puede promover retraso mental y osteoporosis (pérdida de minerales en los huesos).

Acidemia propiónica: el organismo del niño que sufre este padecimiento no puede romper adecuadamente las proteínas y algunas grasas en partes más pequeñas. Este defecto provoca la acumulación de toxinas y ácidos dañinos para todos los órganos.

Galactosemia: estos bebés no tienen la enzima que convierte la galactosa en glucosa y, como resultado, es necesario suspender todos los lácteos de la dieta del bebé. Si no se hace esto, la acumulación de la galactosa en los tejidos provoca ceguera y retardo mental.

Deficiencia de la biotinidasa: los bebés con este problema no tienen suficiente biotinidasa, una enzima que recicla el biotín (una de las vitaminas de complejo B del organismo). Esa deficiencia puede causar convulsiones, control pobre de la musculatura, debilidad del sistema inmunitario, pérdida del oído, retraso mental, coma e, incluso, la muerte.

BIBLIOGRAFÍA

https://journalmex.wordpress.com/2008/11/07/programa-de-estudios-de-tamiz-neonatal/

http://www.medigraphic.com/pdfs/actpedmex/apm-2009/apm095e.pdf

http://www.perkinelmer.com/industries/healthcare/spanishnewborntestingservices/tecnologia/espectrometria-de-masas%20.xhtml

http://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S1020-49892010000400010&script=sci_arttext