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Espectroscopia de
luminescência molecular
Fotoluminescência e Quimiluminescência Fluorescência Molecular – Absorção de fótons → emissão de fótons Fosforescência – Absorção de fótons → emissão de fótons
Fotoluminescência
Qualitativa Quantitativo
Espectros característicos Baixos valores de limites de detecção (LOD ~ ppb)
Líquidos, sólidos e gasosos Ampla linearidade
Alta especificidade
Desvantagem
Os estados excitados são suscetíveis à desativação pelas colisões e outros processos, muitas moléculas não apresentam fluorescência ou fosforescência.
Por isso os métodos luminescentes quantitativos estão sujeito a sérios efeitos de interferência.
E comum utilizar esta técnica combinada com técnicas de separação como cromatografia e eletroforese.
Aplicações
Quimiluminescência– Excitação química → emissão de fótons.
Fluorescência x Fosforescência Fluorescência atômica – Sódio: 3s → 3p → 3s – Absorve 589 nm → emite 589 nm – Fluorescência ressonante Fluorescência molecular – fluoresceína: n → π* → n – Absorve 490 nm → emite 520 nm – Deslocamento de Stokes Fosforescência – antraceno: → π π* → π – Absorve 280 nm → emite 480 nm – perda de energia? Estados excitados Singleto e Tripleto
Diagrama de Níveis Energéticos de Moléculas Fotoluminescentes
Também chamado de diagrama Jablonski
Velocidade de absorção ocorre em cerca de 10-14 a 10-15s.
A emissão de fluorescência ocorre em 10-5 a 10-10s.
Já a emissão de fosforescência ocorre em um tempo de 10-4 a 10s.
Transição singleto para tripleto e improvável (proibida)
Processos de Desativação
A molécula excitada pode retornar ao seu estado fundamental pela combinação de varias etapas mecânicas.
Duas destas formas a fluorescência e a fosforescência envolve a emissão de radiação.
As outros processos de desativação são não radioativos.
Só será possível observar fluorescência e fosforescência se a trajetória para o estado fundamental seja aquela que minimiza o tempo de vida no estado excitado
Relaxação vibracional
Imediata (10-12 s) dissipação por vibração
Colisão com moléculas do solvente
Aumento mínimo de temperatura do sistema
Dissipação de energia = perda de energia ⇒
Deslocamento de Stokes
λemissão > λexcitação ∴ E emitida < E absorvida
Conversão interna Processo intermolecular. Proximidade entre níveis
eletrônicos excitado e níveis vibracionais de um estado eletrônico excitado de menor energia(níveis superpostos)
Resultado prático:
não importa qual λexcfluorescência ⇒ λem
Processos de Desativação
Conversão externa
Envolve transferência de energia da molécula excitada para moléculas de solvente.
Obviamente depende de condições intrínsecas ao solvente e fatores que aumentem ou diminuam o número de colisões:
Tipo de solventeTemperaturaViscosidade
Presença de supressores
Cruzamento intersistema
Ocorre com a inversão do spin de elétron excitado o que altera a multiplicidade da molécula.
A probabilidade desta transição depende da proximidade entre os níveis energéticos vibracionais.
Fosforescência
Transição triplete → singlete é menos provável que a transição singlete → singlete tempo de vida ∴médio grande.
Evento raro: observado em baixas temperaturas, solventes viscosos ou mesmo em sólidos.
Processos de Desativação
Rendimento Quântico
É a razão entre o número de moléculas luminescentes e o número total de moléculas excitadas; ou seja:
Levando em consideração a discussão feita sobre os processos de desativação sugere que o rendimento seja determinado pelas constantes de velocidade relativas para cada processo.
Variáveis que Afetam Luminescência
Fluorescência e estrutura Estruturas aromáticas condensadas e/ou com alto grau de
conjugação apresentam alta eficiência quântica Ex: Heterocíclicos: não fluorescem Heterocíclicos condensados fluorescem!
Heterocíclicos
Heterocíclicos Condensados
Variáveis que Afetam Luminescência
Fluorescência e estrutura A substituição em anéis aromáticos afetam a intensidade
relativa de fluorescência e os valores dos max de λabsorção/emissão
Variáveis que Afetam Luminescência
Fluorescência e estrutura Moléculas flexíveis tendem a relaxar por vibração A flexibilidade causa aumento da constante de conversão
interna (kci) o que leva a desativação não-radiativa.
φ ≅ 1 φ ≅ 0,2
Variáveis que Afetam Luminescência
Solvente e Temperatura Aumento de T ou diminuição de viscosidade do solvente
levam a um aumento no número de colisões e portanto aumenta a probabilidade por conversão externa (supressão colisional)
pH A fluorescência de compostos aromáticos com
funcionalidades ácidas ou básicas apresentam forte dependência com o pH
Ex.: anilina/anilínio e fenol/fenolato Obs: pKa de substâncias no estado excitado podem variar
de 3 a 4 unidades em relação ao estado fundamental
Variáveis que Afetam Luminescência
Oxigênio dissolvido Oxigênio e outras espécies paramagnéticas tendem a
diminuir a fluorescência pelo aumento do cruzamento intersistemas (fosforescência). Também é possível a oxidação da espécie fluorescente
Outras moléculas em solução Moléculas com átomos pesados (tetrabrometo de carbono
e iodeto de etila) aumentam a velocidade de inversão de spin.
Ex: Acrilamida e proteínas
Intensidade de Fluorescência e concentraçãoA potência da emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de excitação que é absorvido pelo sistema.
F= K’ (P0 – P )P0 : potência do feixe radiante
P: potência após atravessar uma distância b do meio K´: constante dependente da eficiência quântica
Relacionando com a Lei de Beer:
Ao considerarmos : F = Kc ....Temos que um gráfico da potência da fluorescência de uma solução em função da concentração das espécies emitidas deve ser linear em baixas concentrações. ( A < 0,05 )
Desvios da linearidade: – Altas concentrações
– Auto-supressão – Auto-absorção
Espectros de emissão e excitação.
InstrumentaçãoComponentes de um espectofluorimetro:
Instrumentação - Componentes Fontes de Radiação
Lâmpadas: (custo) Lâmpada de vapor de mercúrio – várias linhas intensas
para promover a excitação – uso de filtros de absorção ou de interferência.
Lâmpada de arco de xenônio a alta pressão – fonte contínua ~ radiação do corpo negro.
Lasers: (sensibilidade) Lasers de corantes sintonizáveis bombeados por laser
pulsado de N2 ou laser Nd:YAG .
Instrumentação - Componentes
Filtros e Monocromadores – Filtros são comuns em fluorímetros enquanto que mono-
cromadores são essenciais em espectrofluorímetros
Transdutores (detectores) – Fotomultiplicadoras (PMT) ou contador de fótons – Arranjo de diodos e dispositivos de carga acoplada (CCD)
Instrumentação - Fluorímetros
Instrumentação – Espectrofluorimetro
Instrumentação – Instrumentos baseados em arranjos de detectores
Aplicações e Métodos de Fotoluminescência
Essencialmente Cátions
Moléculas Orgânicas:
Fluorescência nativaAgentes derivatizantes
Reagentes Fluorimetricos
Métodos Fosforimétricos
Aplicações variadas – Grande seletividade Bioquímica (ácidos nucléicos, proteínas, etc.) Indústria do petróleo (hidrocarbonetos poliaromáticos)
A fluorescência excitada por laser é particularmente importante para esse tipo de aplicação porque o feixe pode ser facilmente focalizado e um tamanho adequado ao diâmetro da coluna
Detecção da Fluorescência por cromatografia líquida
Medidas de Tempo de Vida
Possibilita análise qualitativa - Permite análise de mistura de
moléculas fluorescentes (com espectros similares)
Instrumentação mais sofisticada – Lasers – PMT de resposta rápida – Contadores de tempo de alta
sincronização
Métodos de Fluorescência por Imagem
Combinação da espectroscopia de fluorescência com a microscopia óptica para produzir imagens localizadas de fluoróforos em matrizes complexas tais como uma única célula.
Ex: neurobiologia Corante Fura-2 usado para monitorar a concentração de cálcio intracelular livre de acordo com estímulos farmacológicos ou elétricos.
Quimiluminescência É produzida quando uma reação química produz uma espécie eletronicamente excitada que emite luz quando retorna ao seu estado fundamental.
É encontrado em sistemas biológicos nos quais o processo é denominado bioluminescência.
QuimiluminescênciaA + B → C* D C* → C + h ν
Número limitado de reações – maiores exemplos vêm dos sistemas biológicos – bioluminescência: vagalumes (luciferase),
águas-vivas, crustáceos, etc. (altas profundezas) • Elevada seletividade esimplicidade instrumental • Atualmente apresenta grande importância biotecnológica – GFP – proteína fluorescente verde • Luminol
Aplicações Analíticas da Quimiluminescência Altamente sensíveis : baixos níveis de luz são
facilmente monitorados na ausência de ruído. Atenuação por radiação por filtro ou
monocromador não é necessário. Os limites de detecção são detectados pela pureza
d o reagente. Limites de Detecção típicos situam-se nas faixas de
ppb ou até ppm. A precisão das determinações varia dependendo da
instrumentação e do cuidado tomado na analise.
Espectrofluorometria como sistema de Detecção Acoplamento com métodos de separação em fase líquida: – HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência – µLC – cromatografia líquida capilar – CE – eletroforese capilar – LIF – fluorescência induzida a laser Maiores níveis de sensibilidade – 10-9 mol/L a 10-12mol/L – Detecção de uma única molécula
Sequenciamento de DNA – Resolução espectral + alta sensibilidade
Referência Bibliográfica: SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH, Fundamentos de
Química Analítica, Tradução da 8ª Edição norte-americana,Editora Thomson, São Paulo-SP, 2006.
Obrigado!!!
Integrantes:
Arthur Henrique de CastroPaula Loureiro Moura