Establecimiento de Líneas Celulares para el desarrollo de ...pages.cnpem.br/bolsasdeverao/wp-content/uploads/... · Labor Omnia Vincit y Labor Laetitia Nostra, lemas del colegio

Establecimiento de Líneas Celulares

para el desarrollo de vacunas

antitumorales y desafío de modelos

animales

Becario/Bolsista

Alejandro Antonio Torres Riquelme

Estudiante de Bioquímica

Universidad de Santiago de Chile

Orientador

Marcio Chaim Bagjelman

Laboratorio de Vectores Virales

Relatório Técnico-Científico apresentado

como requisito parcial exigido no 23º Programa

Bolsas de Verão do CNPEM - Centro Nacional

de Pesquisa em Energia e Materiais.

Campinas, SP, 2014

RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA – 23º PROGRAMA BOLSAS DE VERÃO DO CNPEM

1

Indice

Agradecimientos ··············································································· 3

Resumen ························································································ 4

Abstract ························································································· 5

Índice de Figuras ··············································································· 6

Indice de Tablas ················································································ 6

1. Capítulo 1: Introducción ····································································· 7

1.1. Cáncer ····················································································· 7

1.1.1. Historia

1.1.2. Características Principales

1.1.2.1. Mantención de señales proliferativas

1.1.2.2. Evasión de señales anti-proliferativas

1.1.2.3. Evasión de la Muerte Celular

1.1.2.4. Inmortalidad replicativa

1.1.2.5. Inducción de Angiogénesis

1.1.2.6. Invasión y metástasis

1.1.2.7. Evadir destrucción inmune

1.1.3. Terapias Actuales

1.2. Inmunoterapia ·········································································· 15

1.2.1. Modificación genética de cultivo de células y ensayos n vivo

2. Capítulo 2: Desenvolvimiento ···························································· 17

2.1. Objetivos ················································································ 17

2.1.1. General

2.1.2. Específicos

2.2. Materiales y Metodología ····························································· 17

2.2.1. Vectores plasmidiales y Producción de partículas virales

2.2.2. Cultivo Celular

2.2.2.1. Curva de selección con G418


2

2.2.2.2. Titulación de los vectores virales

2.2.2.3. Transfección de células 4T1

2.2.2.4. Determinación de producción de GM-CSF mediante ELISA

2.2.2.5. Evaluación de los clones mediante Citometría de flujo

2.2.2.6. Mantención de clones B16

2.2.3. Modelo Animal e Inyección de vacunas

2.2.3.1. Establecimiento del modelo de tumor B16

2.2.3.2. Inyección de vacunas

3. Resultados y Discusión ···································································· 25

3.1. Cultivo celular ·········································································· 25

3.1.1. Curva de Selección

3.1.2. Titulación de los Vectores Virales

3.1.3. Establecimiento de Clones 4T1

3.1.4. Expresión de GM-CSF,41bbL y OX40 de células B16

3.2. Modelo Animal e Inyección de vacunas ············································ 24

4. Conclusión ··················································································· 32

5. Referencias ·················································································· 33


3

Agradecimientos

La generación de este trabajo investigativo no podría ser posible sin el

apoyo y confianza que el Centro Nacional de Investigación en Energía y

Materiales (o por sus siglas en portugués, CNPEM) así como el constante apoyo,

dedicación y guía del Comité gestor del proyecto, el Sr. Roberto Medeiros. Cabe

destacar también la guía, comprensión y tutoría del Dr. Marcio Bajgelman, que

sin su apoyo, dedicación y orientación, el transcurso del proyecto tampoco

hubiera tenido el desarrollo que se logró hasta el momento.

Podemos destacar también la participación de los distintos integrantes del

laboratorio de Vectores Virales, de entre los que se destacan Andrea Johanna

Manrique Rincón, Anna Carolina Pereira Vieira de Carvalho, Camila Marques

Beraldo e Igor Frederico de Souza Custodio, que gracias a su constante apoyo,

carisma y ayuda durante el transcurso de este proyecto, no solo hicieron más

grato el ambiente del día a día, sino también la formación de un equipo de

investigación capaz de interactuar mas allá de los que es el trabajo de por si, por

lo tanto les estoy completamente agradecido por el grato pasar de los 2 meses en

los cuales fui aceptado en este laboratorio.

No menos importante son los compañeros becarios, los cuales hacían el

día a día más ameno y tranquilo, ya que con su convivencia y constantes

actividades juntos pudimos entendernos mejor no solo como científicos y

estudiantes, sino también como personas, sin dejar de lado la independencia que

tenemos cada uno con nosotros mismos al igual que con ellos.

Estoy agradecido también con mis padres y mi familia, que sin su apoyo

no estaría acá, debido a que ellos fueron los responsables de mi crianza y

educación.

Labor Omnia Vincit y Labor Laetitia Nostra, lemas del colegio en donde

egresé y la universidad en donde realizo mis estudios actuales. Ambos lemas

importantes en lo que refiere al fortalecimiento personal como profesional,

debido a que el trabajo no solo nos lleva lejos, sino también forma parte de

nosotros, y lo seguirá siendo mientras sigamos trabajando duro por lo que

queremos y necesitamos.


4

Resumen

Los tratamientos convencionales para combatir el cáncer se basan

principalmente en la remoción quirúrgica de estos, y la terapia coadyuvante

mediante la radioterapia y la quimioterapia. Sin embargo estos recursos

utilizados no presentan una forma selectiva de eliminar las células tumorales, por

lo cual generan efectos secundarios, además de la existencia de múltiples

canceres que son resistentes a este tipo de tratamiento debido a su agresividad y

su inestabilidad genómica. En este sentido, el desarrollo de nuevas estrategias

terapéuticas capaces de eliminar selectivamente al cáncer ha estado en boga por

los últimos años. Uno de estos tratamientos corresponde a la Inmunoterapia, la

cual tiene como fin estimular el sistema inmune del mismo paciente y eliminar

las células tumorales que han generado metástasis. Este tipo de tratamiento se

encuentra en un aumento en su popularidad y avances tecnológicos.

En este proyecto participamos en el desarrollo de líneas celulares que

contienen los inmunomoduladores 41bbL, OX40L y GM-CSF, a partir de la

transducción viral de la línea parental 4T1, derivada de cáncer de mama murino.

Por otra parte también se participo en la ejecución de ensayos que implican la

experimentación con animales, para las pruebas de otras líneas celulares que

contienen los mismos inmunomoduladores. Estas líneas celulares B16 derivan de

células de melanoma murino, los cuales pueden simular el modelo de metástasis

pulmonar

Las líneas celulares 4T1 podrán se clonadas y utilizadas en experimentos

posteriores en el LNBio. El experimento realizado con la línea células B16 se

encuentra actualmente en curso y su resultado podrá contribuir para el desarrollo

de nuevos enfoque para el desarrollo de vacunas antitumorales.

Keywords: Melanoma, Cáncer de Mama, Inmunomoduladores, Inmunoterapia

41bbL, OX40L, GM-CSF, Modelos Animales.


5

Abstract

The conventional treatments for cancer are primarily based on the surgical

removal of the tumor and adjuvant therapy with radiotherapy and chemotherapy.

However, these resources lack specificity to eliminate tumor cells, and may

induce adverse effects. In addition, there are multiple cancers that are resistant to

this type of treatment because of its aggressiveness and genomic instability. In

this sense, the development of new therapeutic strategies that provide enhanced

specificity for cancer has been in vogue in recent years. One such treatment is the

immunotherapy, which is intended to stimulate the patient's immune system to

detect and eliminate tumor cells that have metastasized in a selective manner.

Last findings and technological advances have contributed to increase popularity

of immunotherapy among the best in class approaches for new cancer treatments.

In this project we contributed to development of cell lines containing the 41bbL,

OX40L and GM -CSF immunomodulators from viral transduction 4T1 parental

line derived from murine breast cancer. Moreover also participated in the

execution of in vivo studies, testing for other cell lines containing the same

immunomodulators. These cell lines are derived from B16 mouse melanoma

cells, which can simulate a lung metastases model

The 4T1 cell lines may be cloned and used in subsequent experiments at LNBio.

The experiment performed with the cell line B16 is ongoing and the result may

contribute to the development of new approaches for tumor vaccines.

Keywords: Melanoma, Breast Cancer, immunomodulators, Immunotherapy,

41bbL, OX40L, GM-CSF, Animal models


6

Índice de Figuras

Figura 1 Características Principales del cáncer 8

Figura 2 Características Emergentes del cáncer 12

Figura 3 Curva de titulación de los vectores pCL-41bbL y OX40L

mediante Citometría de Flujo. 25

Figura 4 Curva de titulación del Vector pCL-GM-CSF mediante

selección con G418. 26

Figura 5 Ecuación para la determina la concentración de partículas

virales por mililitro 27

Figura 6 Evaluación de la expresión de 41bbL y OX40L de las

células 4T1 mediante Citometría de Flujo. 27

Figura 7 Evaluación de la expresión de GM-CSF de las células 4T1

mediante ELISA. 27

Figura 8 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16

41bbL. 28

Figura 9 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16

OX40L. 28

Índice de Tablas

Tabla 1 Orden de las muestras del ensayo de ELISA 23

Tabla 2 Resultados del ensayo de ELISA 29


7

Capítulo 1: Introducción

1.1 Cáncer

1.1.1 Historia

El cáncer es una enfermedad caracterizada por la aparición de múltiples masas en

el cuerpo de un organismo, también denominados tumores, los cuales se

encuentran compuestos por células que han perdido sus características naturales

y han sufrido un proceso de transformación. Esta transformación celular lleva a

que estas se dupliquen indeterminadamente y formando estas masas que aparecen

en los distintos tejidos del organismo(Hajdu, 2011a).

Debido a que en la actualidad las enfermedades infecciosas están controladas, el

cáncer se ha transformado en la principal causa de muerte en los seres

humanos(Hajdu, 2011a).

Esta enfermedad se catalogó por primera vez en la antigua Grecia por Hipócrates,

refiriéndose a diferentes tipos de la enfermedad como cárcinos y carcinomas (en

referencia a los cangrejos), de entre los diferentes tipos de neoplasias que

diagnosticó. Entre los diferentes canceres que diagnostico se encuentran los

canceres de piel, mama, cérvix, colon y estomago. Tres siglos después de los

descubrimientos de Hipócrates, Aulus Cornelius Celsus, un medico romano

inspirado en los trabajos médicos de la antigua Grecia y Egipto, catalogo

enfermedades que consistían en masas de tejido que aparecían principalmente en

la parte superior del cuerpo de los pacientes, describiendo también diferentes

estadios de la enfermedad, llamando a la primera fase de la enfermedad como

cacoethes (del griego antiguo, κακός (kakos, “mal”) + ἦθος (ēthos, “disposición,

naturaleza”) el cual era el único estadio en donde definió que se podría realizar

un tratamiento(Hajdu, 2011a).

Un milenio y medio después, durante el siglo XVI en el renacimiento, diferentes

científicos como Galileo o Isaac Newton realizaron estudios por primera vez

utilizando el método científico para buscar el origen de esta enfermedad, así

como avances anatómicos en el desarrollo de la enfermedad, en donde Gaspard

Aselli se destaco por el descubrimiento del sistema linfático, donde


8

posteriormente se descubrió la gran importancia que tenia para el desarrollo del

cáncer, principalmente de la participación de este en los procesos de metástasis.

En el siglo XVII, Nicolaes Tulp propuso que la enfermedad era un veneno que

mataba lentamente el cuerpo, lo que llevo a diferentes médicos, como Sennert, a

la conclusión que esta enfermedad era contagiosa, llevando a que los enfermos de

cáncer fueran excluidos de los hospitales por miedo al contagio, conclusión que

posteriormente resulto ser falsa(Hajdu, 2011b).

En el año 1902, un zoólogo alemán llamado Theodor Boveri postuló que el

origen del cáncer debía estar asociado a algún tipo de desregulación génica dada

en células normales del organismo, llevando a la formación de la patología,

mientras realizaba ensayos de generación de células con múltiples cromosomas

en anemonas. Este trabajo fue recientemente traducido, debido que en su tiempo

no tuvo un mayor impacto en la sociedad científica, sin embargo es un enfoque

bastante acercado a lo que se conoce en la actualidad con respecto al genoma de

las células malignas(Boveri, 2008).

Actualmente se ha descubierto que no existe un solo tipo de cáncer, sino que

existen diferentes tipos con características particulares para cada tipo, así como

Figura 1 Principales características del cáncer.(D. Hanahan & Weinberg, 2011) figura representativa de

las diferentes características principales del cáncer, ente ellas la Mantención de las Señales Proliferativas,

Evasión de los supresores de la Proliferación, Evasión de la Muerte Celular, Inducción de Angiogénesis,

Activación de Invasión y Metástasis, y la Inmortalidad Replicativa.


9

diferentes tipos de desregulaciones génicas y metabólicas que permiten la

progresión de la enfermedad. El descubrimiento en la antigüedad, su

clasificación, mas todos estos tipos de canceres y diferentes modelos

desarrollados en animales para el estudio de la enfermedad, han contribuido al

descubrimiento y la búsqueda de terapias más efectivas en la lucha contra el

cáncer.

1.1.2. Características principales

Desde los años 50 en adelante se ha intentado descubrir las principales

características de las células maligna, para así dar un mejor enfoque a posibles

tratamientos contra la enfermedad, llevando a diferentes investigaciones que

explicaban las deficiencias que presentaban las células malignas. El año 2000, los

autores Douglas Hanahan y Robert A. Weinberg(D. Hanahan & Weinberg, 2011)

describieron 6 características principales del cáncer, en lo cual, 11 años más

tarde, se descubrió otra característica principal.

1.1.2.1. Mantención de Señales Proliferativas

En un ambiente celular normal, se mantiene una homeostasis constante para la

mantención e integridad del tejido de los órganos, sin embargo, cuando existe

daño del tejido afectando su integridad, en una etapa posterior a que el sistema

inmune innato tomara acción sobre el tejido, se generan una diversidad de

señales de proliferación que permiten la división de las células endoteliales y

fibroblastoides, las cuales recuperan la integridad del tejido dañado. Cuando se

pierde el control de las señales Proliferativas, tanto extra como intracelularmente,

se genera la proliferación descontrolada de las células, lo que conlleva a la

formación de tumores en el tejido. Estas señales celulares pueden generarse

mediante diferentes tipos de mutaciones en el genoma de una célula, de entre lo

que cabe destacar son las mutaciones en las vías de señalización de las rutas

EGF’s (Proteínas de la familia de GTPasas Ras)(Davies & Samuels, 2010;

Witsch, Sela, & Yarden, 2010), así como la de receptores que responden a estas

señales proliferativas (Her-2/Neu)(Witsch et al., 2010), e incluso factores de

transcripción acoplados a pro -catenina). La


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generación de estas señales de manera constante en el citoplasma de manera

descontrolada genera el fenotipo principal del cáncer.

1.1.2.2. Evasión de señales anti-proliferativas

Un sistema de señalización no es independiente de un sistema de control, debido

a que por cualquier motivo en el cual se active, incluyendo la activación

accidental, el sistema estaría condenado a responder completamente a este

estímulo. Por esta razón los sistemas biológicos cuentan con distintos sistemas de

control para la regulación de las distintas señales intracelulares, para que cuando

una señal supere cierto nivel de umbral, el sistema responda correctamente. Entre

los principales sistemas de control existentes, entre los que cabe destacar en su

participación en la regulación del ciclo celular, se encuentran la proteína

Retinoblastoma (Rb) y el gen TP53 (codifica el factor de transcripción

p53)(Burkhart & Sage, 2008). No menos importantes son las proteínas de

adhesión celular, las cuales al interaccionar con proteínas de adhesión de otras

células producen la señalización de detención del ciclo celular, manteniendo la

célula en un estado quiescente. Entre estos sistemas se encuentran los sistemas de

E-caderinas, las cuales al interaccionar entre sí en distintas células, mantiene b-

catenina en el citoplasma, manteniendo el estado quiescente, lo cual es

denominado inhibición por contacto. Cuando estas interacciones entre las células

se pierden, se permite que se generen señales de proliferación. Una gran cantidad

de canceres contienen este tipo de mutaciones(Curto, Cole, Lallemand, Liu, &

McClatchey, 2007).

1.1.2.3. Evasión de la Muerte celular

Uno de los mecanismos principales por el cual las células evitan la

transformación maligna es la apoptosis, este sistema se encuentra principalmente

mediado por la proteína p53, ya mencionada anteriormente. Al generarse daño en

el DNA y no poder ser reparado, la proteína p53 se acumula, permitiendo la

transcripción de proteínas esenciales en la iniciación de la apoptosis (ej. PUMA,

Bax, etc.), en la mayoría de los canceres, se ha visto que p53 se encuentra

mutado, no solamente en su función de reclutar la maquinaria de reparación del

DNA, sino también en su acción como factor de transcripción, llevando a su


11

acumulación en el citoplasma y el núcleo celular, permitiendo que el cáncer se

desarrolle sin llegar a la vía de la apoptosis(Hamzehloie, Mojarrad, Hasanzadeh

Nazarabadi, & Shekouhi, 2012).

1.1.2.4. Inmortalidad replicativa

En 1961, Leonard Hayflick definio que existia un numero limitado de divisiones

que una celula podia realizar, llamando a esta cifra el limite de Hayflick(Hayflick

& Moorhead, 1961). Este descubrimiento se hizo al contar el numero estimado

de veces que celulas embrionarias se dividian en cultivo celular, siendo este entre

unas 40 a 60 veces(Hayflick, 1965), posteriomente se descubrio que el proceso

involucrado correspondia al acortamiento de los telomeros(Olovnikov, 1996).

Los telomeros son secuencias tandem de hexanucleotidos no codificantes

presentes en los extremos de los cromosomas, los cuales se acortan en cada

proceso de mitosis, llegando a un punto en donde estos desaparecen, llevando a

la celula a un estado latente conocido como senescencia replicativa(Hayflick,

1965). En el cancer no se produce un acortamiento de los telomeros debido a que

se activa una enzima denominada telomerasa, la cual es responsable de la

mantencion de la longitud de los telomeros. Al no haber un acortamiento de los

telomeros, se permite que las celulas se puedan dividir sin un limite

definido(Wright & Shay, 2000).

1.1.2.5. Induccion de Angiogenesis

La angiogénesis es un proceso de generación de nuevos vasos sanguíneos y

corresponde a un proceso normal en los animales, sobretodo en procesos de

reparación de tejidos, embriogénesis, y en el caso de los mamíferos, la

generación del endometrio femenino al interior del útero. En estos procesos las

señales angiogénicas y anti-angiogenicas se encuentran bajo un estricto equilibrio

para la correcta formación de los nuevos vasos sanguíneos, en el cáncer, hay un

desequilibrio en las señales, generando que los canceres sean profusamente

vascularizados, con defectos en la estructura normal de los vasos

sanguíneos(Nagy & Dvorak, 2012), produciéndose un flujo anormal de la sangre

en los sitios del tumor, así como micro hemorragias y una alta proliferación de

las células endoteliales.


12

1.1.2.6. Invasión y metástasis

Una de las principales características que define al cáncer es su capacidad para

invadir tejidos, no solamente el tejido de donde se derivo, sino también la

capacidad de poder viajar por el sistema linfático a otros tejidos y crecer. Un

ejemplo clásico de esto es la capacidad del cáncer de mama de localizarse en los

pulmones y el hígado. La capacidad del cáncer de realizar este tipo de traslado

desde el tejido progenitor hasta un tejido secundario radica en el cambio de las

moléculas de adhesión que expresa, siendo N-caderinas el nuevo tipo, presente

mayoritariamente en células progenitoras de neuronas, en comparación a la E-

caderina, la cual se encuentra presente en el tejido epitelial(Cavallaro &

Christofori, 2004). Mas no solo se necesita este tipo de cambio de moléculas de

adhesión, sino también la expresión de un repertorio de enzimas degradadoras de

matriz extracelular, también denominadas proteínas ADAM, que corresponden a

un tipo de endopeptidasas capaces de degrada la matriz. Este tipo de enzimas se

ha visto que tienen una alta expresión en canceres, especialmente en cáncer de

mama, en donde además de aumentar la capacidad invasiva del tumor, también

activa una vía de proliferación común en este tipo de cáncer(Liu et al., 2006).

Figura 2 Características emergentes del cáncer(D. Hanahan & Weinberg, 2011). Se representan

características que han surgido en los últimos años, las cuales representan nuevos enfoques para el

tratamiento del cáncer. Entre estas la desregulación del metabolismo Energético y la Evasión del Sistema

Inmune


13

1.1.2.7. Reprogramación del metabolismo energético

El cáncer, al tener un alto índice replicativo, requiere una gran cantidad de

energía para realizar las replicaciones y la generación de biomasa que genera en

tan poco tiempo, considerando la energía necesaria que requiere los procesos de

mitosis. Una célula normalmente tiene acceso a oxigeno y glucosa, las fuentes

principales de energía para generar una gran cantidad de ATP necesario, sin

embargo, las células tumorales que se encuentran más al interior del tumor no

tienen esa cantidad de oxigeno presente en su ambiente, dado la capacidad de

difusión que tienen los gases en medios acuosos, al contrario de la glucosa, que

difunde más que el oxigeno, generando que las células tumorales necesiten de

utilizar la ruta de la glicolisis, la cual aunque no genera una gran cantidad de

ATP, es más rápido en comparación con el ciclo de Krebs. Este efecto fue

descrito por Warburg el año 1930, además de la observación que las células

cambiaban el tipo de metabolismo de aeróbico a anaeróbico incluso ante la

presencia de oxigeno(Warburg, Wind, & Negelein, 1927).

1.1.2.8. Evasión del sistema inmune

Para permitir la progresión tumoral en un organismo, las células tumorales deben

inactivar la respuesta inmune del huésped para evitar su eliminación. Esta

función es intrínseca del sistema inmune, de poder reconocer células

transformadas debido a la presencia e una proteína mutada presentada en el MHC

a los linfocitos T, o una mayor frecuencia de los mismos péptidos debido a la

sobreexpresión de ciertas proteínas por parte de las células tumorales. La

presencia de estos antígenos tumorales alertaría al sistema inmune de la presencia

de organismos extraños, eliminando las células tumorales. Sin embargo, ciertos

canceres han generado diferentes estrategias para la evasión de la destrucción por

parte del sistema inmune, permitiendo su progresión.

1.1.3. Terapias actuales

Actualmente entre los tratamientos más efectivos y baratos que pueden

encontrarse para el tratamiento del cáncer se encuentran la escisión del tumor y

las terapias coadyuvantes, donde se encuentran la radioterapia y la quimioterapia.

Lamentablemente la detección de los tumores se realiza de una manera tardía,


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debido principalmente al tamaño mínimo de un tumor para ser detectado,

llegando al punto que estos se detectan cuando estos ya han generado

metástasis(Lind, 2011). Para abordar este problema se generaron las terapias

coadyuvantes, las que tienen como objetivo eliminar las células tumorales que

han invadido otros tejidos, los cuales no son fácilmente detectables.

Entre las distintas terapias coadyuvantes podemos encontrar la radioterapia, la

que utiliza radiación ionizante para generar una gran cantidad de especies

reactivas de oxigeno para generar daño celular, debido al metabolismo acelerado

que tienen las células tumorales, así como generar diferentes mutaciones que lo

hagan inviable la mitosis celular en estas. La segunda opción de terapias

coadyuvantes es la quimioterapia, que consiste en utilizar químicos que imiten

los diferentes sustratos que una célula necesita para la generación de biomasa, y

posteriormente para realizar mitosis, o en la inhibición de una ruta biosintética

para el mismo fin(Lind, 2011).

Entre los diferentes químicos utilizados ampliamente en el tratamiento del

cáncer, podemos dividirlos en varios tipos siendo estos los agentes alquilantes,

antimetabolitos, antraciclinas e inhibidores de procesos involucrados en la

mitosis(Lind, 2011).

Los agentes alquilantes corresponden a químicos capaces de unirse al DNA,

entrecruzándolo, por lo tanto genera errores en la duplicación del DNA. Debido a

que el cáncer tiene una alta tasa de replicación, este genera una mayor cantidad

de errores al duplicarse la célula, generando células inviables que se eliminan con

el tiempo(Lind, 2011).

Los antimetabolitos corresponden a análogos de purinas y pirimidinas, los cuales

son capaces de inhibir la acción de algunas enzimas involucradas en la

biosíntesis de nucleótidos, o capaces de agregarse a la cadena nucleotídica en

formación. Dado que las células tumorales se replican de una manera más rápida

y descontrolada que el resto de las células del organismo. Este tipo de

compuestos, al unirse a la cadena, generan que la cadena se interrumpa de

manera abrupta, truncando la nueva cadena de nucleótidos.

Las antraciclinas pueden participar como agentes alquilantes y antimetabolitos,


15

además de generar estrés oxidativo al interior de las células y la inhibición de las

topoisomerasas. Originalmente estos compuestos son producidos por la especie

Streptomyces y han sido ampliamente utilizadas para el tratamiento del

cáncer(Lind, 2011).

Entre los diferentes inhibidores de enzimas involucradas en el proceso de mitosis

podemos encontrar inhibidores de topoisomerasas, tubulinas y tirosin-kinasas.

Los inhibidores de las topoisomerasas son moléculas capaces de interactuar con

este grupo de enzimas, evitando que actúen sobre el DNA. Las topoisomerasas

son un grupo de enzimas encargadas en liberar la torsión del DNA causado en el

proceso de replicación(Lind, 2011). Los inhibidores de tubulina interactúan con

las unidades de tubulina, evitando que se armen los microtúbulos, o evitando que

se desensamblen, ya que las tubulinas participan activamente en el proceso de

mitosis, mediando la citocinesis, o división de los citoplasmas para formar las

células hijas. Las proteínas tirosin-kinasas son clave en la participación de la

transducción de señales dentro de la células, principalmente en lo que respecta a

señales de proliferación(Lind, 2011). Este tipo de proteínas se encuentra mutado

en la mayoría de los canceres, ya sea por su activación constante o su sobre-

expresión, lo que llevaría a su activación. Entre estas proteínas podemos

destacara Her2/Neu, el cual se encuentra principalmente asociado a la progresión

del cáncer de mama(Lind, 2011).

Todas estas terapias se encuentran actualmente en uso debido a que es lo que ha

mostrado mejores resultados hasta el momento, además de tener un moderado

bajo costo en comparación con las técnicas en desarrollo, sin embargo no son

completamente efectivas para el tratamiento de ciertos canceres, debido a la

inestabilidad genómica, y la agresividad de estos(Douglas Hanahan, 2014).

1.2. Inmunoterapia

Dado que las terapias actuales no tienen una gran efectividad en el tratamiento

del cáncer, diferentes nuevas estrategias se ha desarrollado con los año para

obtener mejores resultados y una mejor prognosis, una de estas estrategias se

denomina inmunoterapia(Hanna et al., 2014).


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La inmunoterapia se desarrollo bajo el precepto de que el cáncer es capaz de la

evasión del sistema inmune, ya que este tiene como fin la erradicación de

organismos patógenos, así como la de células transformadas que puedan

presentar una amenaza para el organismo. El fin de esta terapia consiste en

entrenar al sistema inmune del mismo paciente para que reconozca las células

tumorales como organismos extraños, y así sean eliminadas de manera selectiva

por el repertorio celular inmune(Dayoub & Davis, 2011).

El sistema inmune se clasifica en sistema inmune innato y adaptativo, siendo el

segundo el principal blanco de activación para la inmunoterapia. Este, está

compuesto por un variado repertorio de células, incluyendo células presentadores

de antígenos, Linfocitos T cooperadores o CD4+ y los linfocitos T citotóxicos o

CD8+. Los linfocitos requieren ser activados por Células Presentadoras de

Antígenos (CPA), las cuales procesan y presentan de un péptido cargado en el

complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o II. El reconocimiento

de este complejo por el receptor linfocitario T, mas una segunda señal co-

estimulatoria, induce la activación de los linfocitos T. La principal función de los

linfocitos T cooperadores, es la liberación de citoquinas y quimioquinas capaces

de reclutar otras células del sistema inmune al sitio de alerta, desencadenando

una respuesta inmunológica; mientras que los linfocitos T citotóxicos pueden

destruir células afectadas por virus o agentes intracelulares mediante la liberación

de factores citotóxicos.

Una de las primeras aproximaciones en el uso de la inmunoterapia, y que ha sido

la más efectiva en la lucha contra el melanoma, es el uso de células dendríticas

autólogas cargadas con extractos tumorales, según Mendoza-Naranjo(Mendoza-

Naranjo et al., 2007) y Nestle(Nestle et al., 1998). El análisis exhaustivo de estos

de los casos clínicos descritos ha demostrado que la población respondedora a

terapias inmune y que han detenido el avance de la enfermedad, desarrolla

coincidentemente unas respuestas hipersensibilidad de tipo retardada (DTH)

considerable frente a antígenos tumorales. La respuesta DTH es una respuesta

alérgica de tipo IV, la cual está mediada principalmente por macrófagos y

linfocitos T cooperadores. Este tipo de respuesta se caracteriza por la presencia


17

de un agente extraño al cuerpo, principalmente alérgenos, los cuales son capaces

de desencadenar una respuesta de las células dendríticas y macrófagos aledaños

al sitio de alerta. Posteriormente, cuando se tenga un segundo contacto con el

mismo agente, se desencadenará una respuesta inmune mediada por los linfocitos

T de memoria, los cuales reclutarán macrófagos al sitio afectado. Otro tipo de

inmunoterapia que se encuentra en desarrollo actualmente es el uso de

inmunomoduladores, siendo el GM-CSF uno de los cuales ha mostrado mejores

resultados(Dranoff et al., 1993), así como la generación de diferentes estrategias

que permitan localizar esta citoquina en el sitio de alojamiento del tumor,

generando que ocurra una localización de diferentes células del repertorio

inmune, entre ellos monocitos que, gracias a la acción de esta citoquina, pueden

diferenciarse a células dendríticas, las cuales corresponden a uno de las células

presentadoras de antígenos que genera una mejor respuesta de los linfocitos T, en

comparación a otras APCs(Lonial, 2004).

GM-CSF es una proteína la cual actúa como una señal de diferenciación celular,

además de cómo un factor quimio táctico capaz de reclutar diferentes células del

sistema inmune al sitio de alerta(Lonial, 2004). De entre los principales roles que

es relevante destaca es su rol de diferenciación células, debido a que este factor

es capaz de permitir la diferenciación de diferentes monocitos que invaden el

tejido a células dendríticas(Lonial, 2004). Estas células dendríticas comienzan

como células inmaduras altamente fagocíticas, las cuales en diferentes modelos

tumorales son capaces de fagocitar células tumorales y presentarlos a diferentes

poblaciones linfocitarias T, permitiendo su activación y que estos sean capaces

de actuar contra los tumores(Nestle et al., 1998).

Por el transcurso de los años también se ha descubierto que la presentación de

antígeno de por si no activa a los linfocitos T, sino que es necesaria la activación

de estos por la señalización mediante la interacción de diferentes moléculas co-

estimulatorias que poseen las células presentadoras de antígeno profesionales.

Estas moléculas permiten que los linfocitos se activen, generando que proliferen

y se diferencien a células efectoras y de memoria. Durante los últimos años se ha

observado que dos moléculas en particular, 41bbL y Ox40L, las cuales no solo


18

generan la activación de los linfocitos T, sino también la potencian, obteniéndose

mayor cantidad de células de memoria en comparación con una activación

normal(Croft, 2003, 2009; Rotzschke et al., 2012; Vinay & Kwon, 2012;

Waldmann, 2006).

41bbL es una proteína de superficie perteneciente a la familia de las TNF (del

inglés, Tumor Necrosis Factor) el cual se encuentra principalmente en células

dendríticas. Esta molécula es capaz de inducir la activación de los linfocitos T,

mediante la activación de la cascada por 41bb. Esta activación de los linfocitos

permite el aumento de señales de sobrevivencia de estos, mejora la proliferación,

la expresión de citoquinas por parte de las células T(Croft, 2009; Rotzschke et

al., 2012; Vinay & Kwon, 2012).

Ox40L, al igual que 41bbL, es una proteína de superficie perteneciente a la

familia de las TNF, teniendo el mismo efecto en la estimulación de los linfocitos

T que 41bbL, sin embargo, durante los últimos años se ha descubierto que la

estimulación con OX40L, además de mejorar la activación de los linfocitos T,

también permite que estos no se diferencien a linfocitos T regulatorios, los cuales

son capaces de inhibir la respuesta inmune en contra del cáncer, por lo cual es

una molécula co-estimulatoria la cual se ha utilizado en diversas investigaciones

en terapias antitumorales(Croft, 2003, 2009; Waldmann, 2006).

Nuestro equipo de laboratorio desarrollo una estrategia utilizando células

singénicas de melanoma y cáncer de mama, las cuales después de ser

transfectadas con virus recombinantes para estas moléculas y posteriormente

irradiadas, son capaces de expresar estas moléculas inmunomoduladoras de

manera constitutiva sin generar un nuevo tumor, permitiendo su uso como un

posible modelo de vacuna antitumoral.

1.2.1. Modificación genética de cultivo de células y ensayos in vivo

Las células tumorales presentan tolerancia en receptores singénicos por ser

bajamente inmunogénicas. La modificación genética de las células tumorales

para la expresión de inmunomoduladores puede ser utilizada como estrategia

para inducir una respuesta antitumoral.(Dranoff et al., 1993) De esta forma, las

células tumorales singénicas modificadas pueden ser retro introducidas en


19

animales que reciben tumores parentales, ocasionando la detección y eliminación

de metástasis por el sistema inmune. Los vectores retrovirales posibilitan la

transferencia estable de cassetes de expresión para células de interés, siendo

quela modificación genérica puede perpetuar la progenie celular. En este trabajo

utilizamos vectores retrovirales derivados del virus de la leucemia murina de

Moloney (MoMuLV) los cuales fueron generados por el grupo de Ingeniería de

Vectores y Desarrollo de Estrategias de Terapia Génica y producidos por el

Laboratorio de Vectores Virales del LNBio/CNPEM.la plataforma retroviral

utilizada se basa en el sistema pCL que posibilita la producción de partículas

virales defectuosas, las cuales carecen de la capacidad de replicación.(Bajgelman,

Costanzi-Strauss, & Strauss, 2003; Naviaux, Costanzi, Haas, & Verma, 1996)

2. Desenvolvimiento

2.1. Objetivos

2.1.1. General

Establecer líneas celulares y evaluar su efecto en modelos animales

2.1.2. Específicos

Desarrollar 3 tipos de linajes celulares (OX40L, 4-1BBL y GM-CSF)

Desafiar Animales con líneas celulares singénicas como vacuna

antitumoral

2.2. Materiales y Metodología

2.2.1. Vectores plasmidiales y Producción de partículas virales

Los vectores plásmidos que codifican inmunomoduladores fueron clonados por

los de Ingeniería y Desarrollo de Estrategias vectores para la terapia génica, el

grupo LNBio / CNPEM. Los vectores PCL-41BBL y PCL-OX40L fueron

construidas por Camila M. Beraldo interna PUE. El vector PCL-GM-CSF fue

clonado por Arthur Mauro, un estudiante de la IC. Preparaciones virales fueron

producidas por Anna P.V. Carvalho, técnica del LVV.

2.2.2. Cultivo Celular

2.2.2.1. Curva de Selección con G418

La línea células 4T1 se mantuvo en cultivo en medio RPMI 1640 suplementado

con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10%. Al llegar a confluencia del 80%, se


20

colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se contaron las células en

placa y se sembraron 5x104 células por pocillo en una placa de 6 pocillos, se dejo

incubando con medio RPMI 1640 suplementado con SFB 10% por la noche a

37°C, 5% CO2 para la correcta adhesión de las células. En el día siguiente a la

siembra, se cambio el medio por 2 mL de medio RPMI suplementado fresco, y se

ución stock de G418 a 100mg/mL. La

placa se incubo a 37°C, 5% CO2 por 4 días con un seguimiento constante de la

células en su interior, al 4to día se cambio el medio por medio fresco y se agrego

las mismas cantidades de G418 para la curva de selección. La placa se reviso al

7mo día para determinar la concentración letal de G418.

Posteriormente se realizo el mismo ensayo anterior, cambiando las cantidades

agregadas de la solución stock de G418 100mg/mL, agregando esta vez 0; 0,5; 1;

2; 4 y 8 L. los pocillos se revisaron según el procedimiento anterior.

Titulación de los vectores virales

La línea celular 3T3/NIH se mantuvo en cultivo en medio DMEM 10% de SFB.

Al llegar a confluencia del 80%, se colectaron mediante tripsinización (tripsina al

0,1%). Se sembraron 5x104 células por pocillo en una placa de 24 y 6 pocillos, se

dejo incubando con medio DMEM suplementado con SFB 10% por la noche a

37°C, 5% CO2 para la correcta adhesión de las células. Al día siguiente se

contaron nuevamente las células de un pocillo de la placa de 24 pocillos,

posteriormente se cambio el medio por DMEM 10% SFB con polybrene (PB), se

inocularon 5 y 50L de los vectores retrovirales recombinantes pCL-41bbL;

pCL-OX40L y pCL-41bbR, se incubaron por la noche a 37°C; 5% de CO2. Al

día siguiente se cambio el medio y se dejo incubando un día para el análisis por

citometría de flujo. En la placa de 6 pocillos se cambio el medio por medio

DMEM 10% SFB con PB, posteriormente se inocularon concentraciones 0;

1:1,5x106; 1:1,5x10

5; 1:1,5x10

4; 1:1,5x10

3 del vector retroviral recombinante

pCL-GM-CSF de una solución stock diluida 1000 veces (3L en 3mL de

medio), al último pocillo se le agrego 50L de la solución stock. Se incubo por la

noche a 37°C; 5% de CO2. Al día siguiente se cambio el medio por medio


21

DMEM 10% SFB 800g/mL de G418 y se realizo un seguimiento de las

colonias recombinantes.

Para el análisis por citometría de flujo de las células transfectadas con los

vectores retrovirales pCL-41bbL;pCL-OX40L y pCL-41bbR se colectaron las

células mediante tripsinización (tripsina 0,1%) y se agrego la suspensión de cada

placa a diferentes tubos de citometría de flujo, se inactivo la tripsina con 2mL de

medio DMEM 10% SFB, se centrifugaron los tubos a 400g por 5 minutos, se

descarto el sobrenadante y se agregaron 2 mL de medio IF(PBS con SFB al 5%),

se centrifugo nuevamente a 400g por 5 minutos, se descarto el sobrenadante

dejando 100L en cada tubo. Se agregaron 0,5L de los anticuerpos anti-41bbL

PE; anti-OX40L PE y anti41bbR PE (ebioscience), se incubaron a 4°C por 20

minutos, se agregaron 2mL de medio IF, se centrifugo a 400g por 5 minutos y se

descarto el sobrenadante, dejando 500L en cada tubo.

Transfección de células 4T1

Se sembraron 5x104 células por pocillo de la línea celular 4T1 en una placa de 6

pocillos, se dejo incubando con medio RPMI 1640 suplementado con SFB 10%

por la noche a 37°C, 5% CO2 para la correcta adhesión de las células. Al día

siguiente a la siembra, se cambio el medio por 2 mL de medio RPMI con PB, se

inocularon 150L del vector viral recombinante pCL-GMCSF a la primera

placa; 3L del vector viral recombinante pCL-41bbL y 7L del vector viral

recombinante pCL-OX40L y se dejo incubando la placa por la noche a 37°C, 5%

CO2. Al día siguiente se cambio el medio por RPMI 1640 10% SFB 200g/mL

de G418. Se dejo incubando por 4 días o hasta que las células alcanzaran

confluencia de 80% en la los pocillos, posteriormente fueron colectadas mediante

tripsinización y cambiadas a una placa de 100mm con medio RPMI 1640 10%

SFB 200g/mL de G418.


Se realizo un ensayo de ELISA para determinar la concentración de GM-CSF

mediante el kit DuoSet ELISA, se realizo según las especificaciones del

fabricante.


22

2.2.2.3. Evaluación de los clones mediante Citometría de Flujo

Para el análisis por citometría de flujo de las células transfectadas con los

vectores retrovirales pCL-41bbL;pCL-OX40L y pCL-41bbR se colectaron las

células mediante tripsinización (tripsina 0,1%) y se agrego la suspensión de cada

placa a diferentes tubos de citometría de flujo, se inactivo la tripsina con 2mL de

medio DMEM 10% SFB, se centrifugaron los tubos a 400g por 5 minutos, se

descarto el sobrenadante y se agregaron 2 mL de medio IF(PBS con SFB al 5%),

se centrifugo nuevamente a 400g por 5 minutos, se descarto el sobrenadante

dejando 100L en cada tubo. Se agregaron 0,5L de los anticuerpos anti-41bbL

PE; anti-OX40L PE y anti41bbR PE (ebioscience) , se incubaron a 4°C por 20

minutos, se agregaron 2mL de medio IF, se centrifugo a 400g por 5 minutos y se

descarto el sobrenadante, dejando 500L en cada tubo.

2.2.2.4. Mantención de clones B16

La línea celular B16 recombinante con los vectores pCL-GMCSF; pCL-OX40L;

pCL-41bbL y células facilitadas por Dranoff (B16 recombinante que expresa

GM-CSF) se mantuvo en cultivo en medio DMEM 10% de SFB. Al llegar a

confluencia del 80%, se colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se

llevaron a una suspensión de 5x106 células por mL y se prepararon para la

inyección de vacunas. Se realizo una citometría de flujo a las líneas B16 41bbL y

Ox40L para confirmar la expresión de los inmunomoduladores.


La línea celular B16 recombinante con los vectores pCL-GMCSF se mantuvo en

cultivo en medio DMEM 10% de SFB. Al llegar a confluencia del 80%, se

colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se sembraron 1x106 células

por pocillo en una placa de 100mm, se dejo incubando con medio DMEM

suplementado con SFB 10% por 48 horas a 37°C, 5% CO2. Posteriormente se

colectó 1mL del sobrenadante y se congelo a -80°.

Se realizo un ensayo de ELISA para determinar la concentración de GM-CSF

mediante el kit DuoSet ELISA, se realizo según las especificaciones del


23

fabricante. El orden de las muestras utilizadas para la medición se encuentra

especificado en la Tabla 1. Los ensayos de ELISA fueron planeados y realizados

por la alumna de Doctorado Andrea M. Rincón.

2.2.3. Modelo Animal e Inyección de vacunas

2.2.3.1. Establecimiento del modelo de tumor B16

Se utilizaron ratones de la cepa C57BL/6 de 6 a 12 semanas, obtenidas del

bioterio de CNPEM. Los animales fueron mantenidos con alimentación ad

libitum, bajo un ciclo de luz y oscuridad. Los protocolos se encuentran sometidos

al comité de ética del centro.

La línea celular B16 se mantuvo en cultivo en medio DMEM con SFB al 10% a

37 °C con un 5% de CO2 en placas de 100 x 20 mm. Al llegar a un 80% de

confluencia, éstas fueron colectadas mediante tripsinización, la cual fue

inactivada con DMEM 10% SFB. Las células fueron lavadas con PBS y se

suspendieron a 1x107 células/mL en PBS.

La suspensión de células de la línea B16, se utilizó para inducir la aparición de

tumores en ratonas de la cepa Balb/c, las cuales fueron inyectadas en el torrente

sanguíneo de los ratones mediante la inyección caudal utilizando 1x106 células.

Los ratones fueron observados diariamente, registrando su actividad y su estado.

2.2.3.2. Inyección de vacunas

La línea celular B16 recombinante con los vectores pCL-GMCSF; pCL-OX40L;

pCL-41bbL y células facilitadas por Dranoff (B16 recombinante que expresa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Std 500 Std 500 Std 500 Std 250 Std 250 Std 250 Std 125 Std 125 Std 125 Std 60 Std 60 Std 60

B Std 30 Std 30 Std 30 Std 15 Std 15 Std 15 Std 7,5 Std 7,5 Std 7,5 Std 3,3 Std 3,3 Std 3,3

C Std 0 Std 0 Std 0 Ox40LA Ox40LB Ox40LC 41bbLA 41bbLB 41bbLC

F10

(1:1)

F10

(1:1)

F10

(1:1)

D

F10

(1:10)

F10

(1:10)

F10

(1:10)

F10

(1:100)

F10

(1:100)

F10

(1:100) DR(1:1) DR(1:1) DR(1:1)

DR(1:10

)

DR(1:10

)

DR(1:10

)

E

DR

(1:100)

DR

(1:100)

DR

(1:100)

Gpool

(1:1)

Gpool

(1:1)

Gpool

(1:1)

Gpool

(1:10)

Gpool

(1:10)

Gpool

(1:10)

Gpool

(1:100)

Gpool

(1:100)

Gpool

(1:100)

F G1(1:1) G1(1:1) G1(1:1) G1(1:10) G1(1:10) G1(1:10)

G1(1:10

0)

G1(1:10

0)

G1(1:10

0) G2 G2 G2

G G3 G3 G3 G4 G4 G4 G5 G5 G5 G6 G6 G6

H G7 G7 G7 G8 G8 G8 G9 G9 G9 G10 G10 G10

Tabla 1 Orden de las muestras en el ensayo de ELISA para la determinación de la producción de GM-CSF

por parte de los clones recombinantes. Std: Estándar proveído por el kit; F10: Línea células B16 F10; DR:

Línea Celular de Dranoff; G(x): clon N°x.


24

GM-CSF) se mantuvo en cultivo en medio DMEM 10% de SFB. Al llegar a

confluencia del 80%, se colectaron mediante tripsinización (tripsina al 0,1%). Se

llevaron a una suspensión de 5x106 células por mL, se irradiaron 2 veces por un

periodo de 11,4 minutos a 25 gray, se centrifugaron a 400g por 5 minutos, se

resuspendieron a una cantidad total de 5x106 células por mL en un tubo falcon de

15mL.

Después del establecimiento del modelo de tumor B16, se comenzó el

tratamiento de manera al azar de manera al azar en los diferentes ratones, el

grupo fue inyectado con una cantidad establecida de los clones B16

recombinantes establecidos para la inyección nombrados anteriormente. Los

ratones fueron inyectados los días en los días 1, 4 y 7 post establecimiento del

modelo. El primer grupo de ratones fue inyectado con 5x105 células de Dranoff,

el segundo grupo fue inyectado con los clones B16 pCL-GMCSF establecidos

por el laboratorio. Un tercer grupo fue inyectado con el clon B16 pCL-GMCSF

en la primera inyección, B16 pCL-OX40L en la segunda y B16pCL-41bbL en la

tercera inyección. Se monitorearon todos los grupos diariamente desde el día del

establecimiento del modelo tumoral. Este procedimiento se encuentra aprobado

por el comité de bioética del Centro. La inyección de células tumorales, la

irradiación de GVAX y manejo de los animales fueron hechos por el estudiante

de doctorado Andrea M. Rincón, con la participación e intervención del becado

de verano.

3. Resultados y Discusión

El objetivo principal de este trabajo investigativo es el establecimiento de una

línea celular que pueda ser utilizada como posterior vacuna para el tratamiento

del cáncer, de lo cual pudimos obtener los siguientes resultados.

3.1. Cultivo Celular

3.1.1. Curva de Selección

Al realizar la sensibilidad de las células 4T1 se encontró que la concentración

mínima de toxicida

3.1.2. Titulación de los Vectores Virales


25

Para determinar la titulación de los diferentes vectores virales se observo la

citometría de flujo en busca de poblaciones de células 3T3/NIH 41bbL+, OX40L

+

y 41bbR+, el que

fue utilizado como control. En estos histogramas se observaron

poblaciones positivas en la expresión de las proteínas 41bbL y OX40L, siendo un

43,5% de las células que expresan 41bbL y 24,7% de células que expresan

OX40L, según se puede observar en la Figura 3. Al utilizar la ecuación

representada en la Figura 5, utilizando los parámetros observados en la

citometría de flujo, pudimos observar que la titulación de partículas virales por

parte de los diferentes vectores virales eran 9,7 x 106 para el vector pCL-41bbL y

5,4 x 106 par el vector pCL-Ox40L.

En el caso de la titulación del vector viral pCL-GM-CSF se mantuvieron las

células bajo selección con G418 por 9 días, en donde al noveno día las células

fueron fijadas para su posterior registro de las colonias presentes en cada placa.

Se lograron observar

dilución 1:1000 del virus según se observa en la Figura 4, siendo esta la primera

dilución en la cual se obtuvieron colonias, es la dilución en donde el virus

alcanza a tener efectividad, por lo cual, según la ecuación mostrada en la Figura

Figura 3 Curva de titulación de los vectores pCL-41bbL y OX40L mediante Citometría de Flujo.

Podemos observar una población positiva del 43,5% de las células que expresan con 41bbL y un 27,4%

que expresan OX40L. La cantidad de virus total corresponde a 9,7x106 CFU/mL para el vector pCL-

41bbL; y 5,4x106 CFU/mL para el vector pCL-OX40L.


26

5 podemos concluir que obtuvimos una titulación de 2x106 partículas virales por

micro litro.

2.3.3. Establecimiento de clones 4T1.

Después de transducir las células 4T1 con los diferentes vectores lentivirales, se

procedió a la selección de clones recombinantes mediante el cultivo con el

antibiótico G418, de las cuales se evaluó la expresión de los inmunomoduladores

que contenían los vectores lentivirales utilizados, en los cuales se determino que

una baja cantidad de las células presentes en el pool expresaba la proteína 41bbL,

siendo este un 10% de células positivas de la población total según se observa en

la Figura 6. Al analizar el pool de células 4T1 transfectadas con el vector pCL-

OX40L, se encontró que un 20,7% de las células son positivas en la expresión de

la proteína OX40L, según se observa en la Figura 6.

Figura 4 Evaluación de la expresión de GM-CSF de las células 4T1 mediante ELISA. Se muestra en la

figura que el pool de células 4T1 transducidas con el vector pCL-GM-CSF presenta una expresión alta del

inmunomodulador

1 2 3

4 5 6

# Vol vírus Diluicion colonias título (cfu/mL)

1 0 0 0 0

2 1uL 1000 2 2x10(6)

3 10uL 1000 10

4 100uL 1000 >100

5 1000uL 1000 Confluente

6 50uL 1 Confluente

Figura 5 Ecuación utilizada para el cálculo de la concentración de partículas virales. P: Porcentaje de

células positivas para la proteína expresada; Negative: Células negativas para el control; #Cells: N° de

células el dia de la transducción; Vol: volumen de virus( L); Dilución de virus en Stock.


27

Al analizar la expresión de GM-CSF mediante el ensayo de ELISA por parte del

pool celular 4T1 pCL-GM-CSF, se determino que la expresión llega a alcanzar

270 ng/mL,según se obseva en la Figura 7, una cantidad menor a la línea celular

de Dranoff.

Figura 6 Evaluación de la expresión de 41bbL y OX40L de las células 4T1 mediante ELISA. En la figura

se muestra que hasta un 10% de células 4T1 pCL-41bbL son positivas en la expresión de la proteína

41bbL en su superficie, mientras que un 20,7% de las células 4T1 pCL-OX40L son positivas en la

expresión de la proteína OX40L.

Figura 7 Evaluación de la expresión de GM-CSF de las células 4T1 mediante ELISA. Se

muestra en la figura que el pool de células 4T1 transducidas con el vector pCL-GM-CSF

presentan una expresión alta del inmunomodulador


28

2.3.4. Expresión de GM-CSF, 41bbL y OX40L

Al establecer la línea celular B16 pCL-GMCSF, necesitamos saber la expresión

de esta citoquina por parte de las células recombinantes, por lo cual se realizó un

ensayo de ELISA para determinar su expresión. De esto se obtuvo que la

concentración de GM-CSF por parte de las línea establecidas en el laboratorio

era mucho menor que la línea celular establecida por Dranoff, según se muestra

en la Tabla 2. Aun así estas células del clon G4 fueron utilizadas en la inyección

de la vacuna antitumoral, ya que este clon tuvo la mayor cantidad de producción

de GM-CSF, se utilizo un control en donde se inyectaron células de Dranoff para

comparar con los resultados.

Al revisar que los clones de la línea celular B16 41bbL y OX40L utilizados para

el tratamiento aun expresaran los inmunomoduladores correspondientes, se

realizo una citometría utilizando los anticuerpos anti-41bbL PE y anti-OX40L

PE. En esta se observo la expresión constitutiva de las proteínas, con un mínimo

de 99,4% en las células B16 41bbL y un mínimo de 96,3% en las células B16

OX40L, según se muestran en las figuras 8 y 9.

Entre las principales razones por las cuales se utilizaron los métodos fue

dependiente al tipo de expresión de los inmunomoduladores utilizados.

La citometría de flujo consiste en una técnica en donde la muestra pasa por una

aguja, la cual es capaz de pasarlas célula por célula y es llevado a una fuente de

luz laser, la cual es capaz de emitir a diferentes longitudes de onda de excitación,

además de diferentes detectores a 180° del emisor o Forward Scatter (FSC), el

cual permite medir el tamaño de cada una de las células, y otros detectores

puestos a diferentes ángulos del laser emisor o Side Scatter (SSC) el cual permite

medir la complejidad y granulosidad de las células que son excitadas, además de

diferentes detectores que permiten medir a longitudes de onda de emisión, lo que

permite medir diferentes marcas fluorescentes que contenga la célula. Este

método se utiliza principalmente para medir diferentes subpoblaciones celulares

extraídas de algún tejido, además de poder medir poblaciones que se encuentren

marcadas con algún anticuerpo especifico para alguna proteína que se encuentre

tanto en la membrana como en el interior de la célula(Jaroszeski & Radcliff,


29

1999). Al contrario, en el caso de que una de las proteínas que quiera ser medida

en el exterior de la célula es necesario un ensayo diferente, entre los cuales el

ensayo de ELISA es el más adecuado.

El ensayo de ELISA (del ingles: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) es un

protocolo para la medicion de diferentes proteinas o moleculas de alto peso

molecular especifico, mediante el marcaje con anticuerpos monoclonales los

cuales son capaces de reconocer la molecula de manera especifica, a este

anticuerpo denominado primario se le une posteriormente un anticuerpo capaz de

reconocer el segmento constante del anticuerpo primario, este segundo

anticuerpo se denomina secundario y se encuentra conjugado a una enzima

reportera, la cual es capaz de catalizar una reaccion de un sustrato cuyo producto

puede ser fluorescente o coloreado, el cual se mide mediante un

espectrofotometro, permitiendo la deteccion de su concentración. Este anticuerpo

secundario es capaz de unirse en varios epitopes del segmento constante de la

cadena pesada del anticuerpo primario, permitiendo la amplificacion de la señal

para la detección de la molecula(Lequin, 2005; Yalow & Berson, 1960).

Tabla 2 Resultados de la medición de GM-CSF de los clones B16pCL-GM-CSF mediante ensayo de ELISA. Se

pueden observar los diferentes clones, en donde solamente el clon G4 tuvo una mayor expresión en comparación con

los otros clones generados, aun así es una cantidad 10 veces menor en comparación con la línea celular de Drannof.


30

Figura 8 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16 41bbL. Se puede observar en la figura que

un porcentaje mayor a 99% de las células B16 expresa constitutivamente la proteína 41bbL.


31

Modelo Tumoral B16 y Vacunas

Hasta el momento no se han visto resultados con respecto a la inyección de

los tumores sin embargo, algunos ratones han desarrollado puntos negros en

la cola, lugares en donde se realizo la inyección intravenosa de estos tumores,

lo que representa que el tumor se encuentra en proceso de crecimiento al

interior de los ratones.

Figura 9 Citometría de flujo de los clones recombinantes B16 OX40L. Se puede observar en la figura

que un porcentaje mayor a 99% de las células B16 expresa constitutivamente la proteína OX40L.


32

Las células tumorales B16 y 4T1 fueron modificadas utilizando vectores

retrovirales recombinantes construidos por el grupo de Ingeniería de Vectores y

Desarrollo de Estrategias de Terapia Génica, conforme Citación en Materiales y

métodos. Las partículas virales fueron generadas por el laboratorio de Vectores

Virales, conforme descrito en literatura.(Bajgelman et al., 2003; Naviaux et al.,

1996)

4. Conclusión

El objetivo de este proyecto era desarrollar actividades relacionadas con la línea

de investigación desarrollada el grupo de Ingeniería y Desarrollo de Estrategias

para la Terapia Génica, del LNBio, CNPEM. Por cerca de dos meses hemos sido

capaces de participar en los experimentos relacionados a biología molecular,

cultivo de bacterias, cultivos celulares y en la experimentación in vivo.

En las técnicas de biología molecular hemos participado de preparación de

plásmido y en los mapas de restricción de los vectores utilizados para la

producción de partículas virales utilizados en este estudio. Por otra parte, también

hemos hecho algunas pruebas de clonación vectores plásmidos que aún se

encuentran en curso.

En el cultivo de células, que se inició el establecimiento de tres nuevas líneas

celulares 4T1, derivadas de cáncer de mama murino. Estas líneas fueron

transducidas con vectores retrovirales para efectuar transferencia de casetes de

expresión de genes que codifican inmunomoduladores. La selección de células

4T1 transducidas con retrovirus pCL-41BBL, pCL-OX40L y pCL–GM-CSF. La

selección de células OX40L y 41BBL se evaluaron mediante citometría de flujo,

y las células seleccionadas con GM-CSF son evaluadas mediante ELISA. Estas

células serán utilizadas posteriormente por nuestro grupo para generar clones que

muestran alta expresión del transgén y se pueden usar para el desarrollo de la

modulación inmune anti-tumoral específica.

Además de llevar a cabo experimentos in vitro, también tuvimos la oportunidad

de supervisar la aplicación de un experimento in vivo, participando en la

preparación de las células tumorales, la vacuna de células y la inyección de los

animales. El experimento llevado a cabo el objetivo de verificar la acción


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sinérgica de inmunomoduladores en combinación. El experimento está en curso y

se incluirán los resultados en una futura versión de este informe, en el caso de

contar con el tiempo necesario.

En resumen, la estadía en este programa de becas de verano presentó una intensa

experiencia científica, lo que contribuye al desarrollo y adquisición de nuevos

conocimientos y el desarrollo de nuevas tecnologías para el grupo de

investigación.

5. Referencias

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