PROCESOS AVANZADOSEN BIOTECNOLOGIA Y

BIOINGENIERIA

ESTERILIZACION

Dr. Raymundo ErazoFQIQ - UNMSM

ESTERILIZACIN: AGENTES FSICOS Calor Los microorganismos son afectados,

en distinto grado, por la accin delcalor. Provoca desnaturalizacin deprotenas, fusin y desorganizacinde las membranas y/o procesosoxidativas irreversibles en ellas. Laefectividad depende de:

Temperatura y Tiempo de exposicin

Calor Hmedo Desnaturaliza y coagula protenas,

por dos razones: El agua es muy reactiva y muchas

estructuras biolgicas (DNA, RNA,protenas, etc) se producen a partirde reacciones que eliminan agua.de reacciones que eliminan agua.

Las protenas tienen estructurassecundarias y terciarias que seestabilizan por uniones puente dehidrgeno intramoleculares quepueden ser reemplazadas y rotospor el agua a altas temperaturas

El vapor de agua posee uncoeficiente de transferencia decalor ms elevado que el aire. Estose explica por el calor latente ysensible.

El autoclave es el aparato ms El autoclave es el aparato mscomn utilizado en los laboratoriospara esterilizar tanto los cultivos ylas soluciones, etc. que no formenemulsiones con el agua y que no sedesnaturalicen por encima de 100C.

Ventajas

Alta velocidad de calentamiento ypenetracin.

Destruccin de bacterias y esporasen corto tiempo.en corto tiempo.

No deja residuos txicos. Hay un bajo deterioro del material

expuesto. Econmico.

Desventajas

No permite esterilizar solucionesque formen emulsiones con el agua.que formen emulsiones con el agua.

Es corrosivo con ciertos materialese instrumentos metlicos.

Calor Seco Produce: Desecamiento de la clula. Efectos txicos por niveles elevados

de electrolitos, procesos oxidativos yfusin de membranas.

Por: Por: Transferencia de calor desde los

materiales a los microorganismos queestn en contacto con stos. El airees mal conductor del calor, y penetrams lentamente que el vapor de aguaen materiales porosos.

La accin destructiva del calorsobre protenas y lpidos requieremayor temperatura cuando elmaterial est seco o la actividad deagua del medio es baja.

Esto se debe a que las protenas Esto se debe a que las protenasse estabilizan por uniones puentede hidrgeno intramoleculares queson ms difciles de romper por elcalor seco.

La estufa de esterilizacin es usadoen los laboratorios para esterilizar porcalor seco.

Se requiere mayor temperatura ytiempo que el autoclave.

La temperatura vara entre 120 y La temperatura vara entre 120 y180C.

A 140C se necesitan por lo menos 5horas de exposicin, mientras que a160C se requieren al menos 2 horasde exposicin.

Ventajas

No es corrosivo para metales einstrumentos.

Permite esterilizar sustancias enpolvo y no acuosas, as como desustancias viscosas no voltiles.

Desventajas

Mayor tiempo de esterilizacin,respecto al calor hmedo.

Existen otros mtodos de eliminarmicroorganismos por calor seco:

Incineracin: se utiliza para destruir Incineracin: se utiliza para destruirmaterial descartable contaminado.

Accin directa de llama: elimina alos microorganismos cuando selleva al rojo el material de metalcomo ansas, lancetas, agujas dediseccin.

Radiaciones Su accin depende de: Tipo de radiacin Tiempo de exposicin Dosis Ionizantes Ionizantes Producen iones y radicales libres que

alteran las bases de los cidosnucleicos, estructuras proteicas ylipdicas, y componentes esencialespara la vida de los microorganismos.

Tienen gran penetrabilidad y se lasutiliza para esterilizar materialestermolbiles (termosensibles) comojeringas descartables, sondas, etc.Se utilizan a escala industrial porsus costos.sus costos.

No se utilizan para medios decultivo o soluciones proteicasporque producen alteraciones delos componentes.

Ultravioletas Afectan a las molculas de DNA de

los microorganismos debido a queforman dmeros de pirimidinasadyacentes que inducen errores enla duplicacin y por lo tanto lala duplicacin y por lo tanto laprdida de la viabilidad de lasclulas.

Son escasamente penetrantes y seutilizan para superficies.

ESTERILIZACIN: AGENTES QUMICOS Agentes esterilizantes, desinfectantes

y antispticos. La efectividad de estos agentes

depende de las condiciones bajo lasque actan:que actan:

Concentracin: vara con el tipo deagente y de microorganismo, pues unamisma concentracin del agente puedeproducir un efecto diferente endistintos microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no sonsusceptibles a un agente en la mismaforma, no todos los microorganismosmueren al mismo tiempo.

pH: afecta a los microorganismos y alos agentes qumicos. Por encima de7 incrementa la carga negativa de los7 incrementa la carga negativa de losmicroorganismos, incrementando laconcentracin del agente sobre laclula. Tambin, determina el gradode disociacin y la efectividad delagente qumico, a menor disociacinmayor permeabilidad y por lo tantomayor efectividad.

ESTERILIZACIN: FILTRACIN Se usan membranas filtrantes con

poros de un tamao determinado.El tamao del poro depender deluso al que se va a someter lamuestra. Hay que tener en cuentamuestra. Hay que tener en cuentaque los filtros que se utilizangeneralmente en los laboratorios noretienen virus ni micoplasmas,estos ltimos estn en el lmite deseparacin segn el dimetro deporo que se utilice.

Existen tres tipos bsicos de filtros:

Filtros profundos o Filtros deprofundidad:

consisten de un material fibroso ogranular prensado, plegado,granular prensado, plegado,activado, o pegado dentro de loscanales de flujo. En este tipo defiltros la retencin de las partculasse produce por una combinacin deabsorcin y de retencin mecnicaen la matriz.

Membranas filtrantes:

tienen una estructura continua, y laretencin se debe principalmente altamao de la partcula. Partculasms pequeas al tamao del poroms pequeas al tamao del poroquedan retenidas en la matriz delfiltro debido a efectos electrostticos.

Filtros de huella de nucleacin(Nucleoporo):

son pelculas muy delgadas depolicarbonato que son perforadaspor un tratamiento conjunto conradiacin y sustancias qumicas.Son filtros con orificios muySon filtros con orificios muyregulares que atraviesan lamembrana en forma vertical.Funcionan como tamices, evitandoel paso de toda partcula con untamao mayor al del poro.

La filtracin se utiliza para esterilizaremulsiones oleosas o solucionestermolbiles.

Como: aceites, algunos tipos depomadas, soluciones oftlmicas,pomadas, soluciones oftlmicas,soluciones intravenosas, drogasdiagnsticas, radiofrmacos, mediospara cultivos celulares, y solucionesde antibiticos y vitaminas.

ESTERILIZACIN: CONCEPTOESTADSTICO

La muerte microbiana sigue uncomportamiento de tipo exponencial,por lo que se hace asinttico y no sellega a un valor de microorganismosigual a cero.

N = N0 . e - kt N = nmero de microorganismos

viables a tiempo t de exposicin. N0 = nmero de microorganismos

viables iniciales. k = tasa de muerte (min-1) t = tiempo de exposicin al agente. k depende de las condiciones de

esterilizacin: temperatura, humedad,concentracin del agente qumico) yde la resistencia del microorganismoal proceso de esterilizacin.

Si esta ecuacin se transforma abase 10 resulta:

N = N0 . 10 - t / D En donde D (min) se denomina

tiempo de reduccin decimal, esto esel tiempo requerido para reducir lael tiempo requerido para reducir lapoblacin microbiana un 90% o unorden de magnitud. El valor de D sededuce cuando t = D y por lo tanto N= 0.1N0. Comparando las ecuacionesanteriores se llega a que:

D = ln 10 / K = 2.303 / K D es inverso con k. Graficando el logartmo del nmero

de microorganismos sobrevivientesen funcin del tiempo de exposicina un agente esterilizante, se obtieneuna recta. La pendiente est dadauna recta. La pendiente est dadapor -1/D y la ordenada al origen eslog N0.

La pendiente de la recta estdeterminada por las condiciones deesterilizacin y de la resistencia delmicroorganismo.

Probabilidad de sobrevivencia:cuando log N

Durante el proceso de esterilizacinpor calor debe tenerse en cuentaque el tiempo de esterilizacincomienza cuando se ha alcanzadola temperatura ptima en el interiordel aparato (autoclave o estufa) ydel aparato (autoclave o estufa) yque generalmente el contenido deun autoclave puede requerirtiempos ms largos para alcanzarla temperatura de esterilizacin.

ESTERILIZACION INDUSTRIAL

Todas las etapas deben operar concultivos libres de contaminantes,desde el cultivo preliminar hasta elfermentador de produccin.fermentador de produccin.El fermentador y su equipamiento,as como el medio de cultivodeben estar estriles antes de lainoculacin.

Adems, el aire que se suministradurante la fermentacin debe serestril y no deben existir roturasmecnicas en el fermentador quepodran permitir la entrada demicroorganismos.

Tambin se deben esterilizar losaditivos (antiespumantes), los cidosy bases concentrados no esnecesario esterilizarlos.

Un biorreactor puede seresterilizado, destruyendo losmicroorganismos, por accin decalor, radiacin o un productoqumico o bien separando losqumico o bien separando losorganismos viables mediante unprocedimiento fsico como lafiltracin.

Durante la fermentacin se debenobservar:

- Esterilidad en el medio de cultivo- Esterilidad del aire que entra ysale.

Es necesario una construccin Es necesario una construccinapropiada del biorreactor quefacilite la esterilizacin as como laprevencin de la contaminacindurante la fermentacin.

ESTERILIZACION DEL MEDIO DECULTIVO

Eliminar contaminantes presentes en elmedio de cultivo antes de lainoculacin. Para instalaciones a granescala, el calor es el principalmecanismo utilizado.mecanismo utilizado.

Un conjunto de factores influyen en elxito de la esterilizacin por calor: elnmero y tipo de microorganismospresentes, la composicin del medio decultivo, el valor del pH y el tamao delas partculas en suspensin.

La esterilizacin por filtracin seutiliza frecuentemente para todoslos componentes de la solucin denutrientes que son sensibles alcalorLas vitaminas, los antibiticos oLas vitaminas, los antibiticos olos componentes de la sangre sonejemplos de compuestos lbiles alcalor que deben ser esterilizadospor filtracin

ESTERILIZACIN DISCONTINUA

La mayor parte de los medios decultivo se esterilizan en volmenesdiscontinuos en el biorreactor a121C.121C.

Los tiempos de esterilizacinaproximados pueden ser calculadosa partir de la naturaleza del medio ydel tamao del fermentador.

No solamente debe ser esterilizadoel medio nutritivo, sino tambin lasuniones, vlvulas y electrodos delpropio fermentador.

Por consiguiente, los tiempos deesterilizacin reales sonsignificativamente ms largos quesignificativamente ms largos quelos calculados y deben serdeterminados experimentalmentepara las soluciones especficas denutrientes presentes en elfermentador.

Un mtodo de esterilizacin esinyectar vapor en la camisa delfermentador o en los serpentinesinteriores (esterilizacin indirecta).

Otro mtodo es inyectar vapor enla propia solucin de nutrientesla propia solucin de nutrientes(procedimiento directo), en cuyocaso un pre-requisito es tenervapor puro (libre de aditivosqumicos).

Muchos suministros de vaporindustrial contienen productosqumicos txicos derivados deaditivos anticorrosivos utilizadosen el proceso de produccin delvapor.

Adems, con la inyeccin directa Adems, con la inyeccin directade vapor el condensado seacumula dentro del fermentador yde esta forma el volumen dellquido aumenta durante el procesode esterilizacin

t1: tiempo de calentamientohasta la temperatura deesterilizacin

t2: tiempo de esterilizacin(mantenimiento)

t3: tiempo de enfriamiento tT: tiempo total del proceso

= t1 + t2 + t3

t1 t2 t3Valores tpicost1 1,5 - 2 ht2 , 20 mint3 1 - 1,5 h

LOS INCONVENIENTES DELPROCESO DE ESTERILIZACIN

DISCONTINUA Se necesitan de 2 a 3 horas para

alcanzar la temperatura deesterilizacin (121C).esterilizacin (121C).

Se requieren otros 20 - 60 minutospara el proceso real de muerte,seguidos de enfriamiento duranteuna hora.

Altos costos si no se recupera partede energa.

El calentamiento, esterilizacin yenfriamiento no solamente matan alos microorganismos, sino quetambin alteran severamente lasolucin de nutrientes.

La decoloracin y los cambios en elvalor del pH se originan comovalor del pH se originan comoconsecuencia de la caramelizaciny la reaccin de Maillard. Lasvitaminas se destruyen y la calidaddel medio de cultivo se deteriora. Laextensin en la que es afectada lafermentacin subsecuente dependedel organismo y del proceso.

.NA.e.NdtdN R.T

Ea k

siendo T una funcin del tiempo, T = f(t).

dteA.dt)NNln(

t

0

R.TEt

00

a

k

Definiendo como criterio de esterilizacin (Wang et al. p. 147)Definiendo como criterio de esterilizacin (Wang et al. p. 147)

NN0ln

Se puede realizar el clculo por zona.

toEnfriamienntoMantenimientoCalentamieTotal

dteANNln

1 at

0

R.TE

1

0ntoCalentamie

dteANln2 at

R.TE

1

dteANNln

0

R.T

2

1ntoMantenimie

dteANNln

3 at

0

R.TE

2toEnfriamien

N1: microorganismos viables luego del calentamiento.N2: microorganismos viables luego del mantenimiento.

Variacin de k durante una esterilizacinpor lotes

mpe

ratu

ra,

C

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

k,m

in-1

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

Variacin de k durante la esterilizacin calculado segn lasiguiente ecuacin:

T ie m p o , h o ra s0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0

Tem

2 0

4 0

6 0

0 .0

0 .5k

Tex,k34100

391059

T en K

Variacin de N/N0 durante unaesterilizacin por lotes

log (N/N0)0

-3-6-9

-12-15-18

130

110

90

70

50

Temperatura(C)

-18-21-24

30

10

Tiempo (min)

La mayor destruccin trmica de microorganismos seproduce en la etapa de mantenimientoValores tpicos de mantenimiento/ 0,6 - 0,8 .

Perfil temperatura - tiempo

Tipo de calentamientoo enfriamiento Ecuaciones temperatura vs tiempo

Vapor vivo directo(19)

Calentamiento (20)

ba.t.TT 0 1

10p .TM.C

h.sa Msb

qCalentamientoelctrico

(20)

Calentamientoindirecto con vapor

(21)

Enfriamiento confluido fro

(22)

a.t).(TT 0 10p .TM.C

qa

)b.e.(TT a.tH

1pM.C

U.Aa H

H0T

TTb

)b.e.(TT a.tCO

1

pp

pCw.

U.Aexp.M.C

Cw.a 1

CO

CO0T

TTb

T: temperatura a un tiempo dado (K) t: tiempo (s) T0: temperatura absoluta inicial del medio (K) h: diferencia de entalpa entre el vapor y el medio (kcal/kg) s: flujo msico de vapor (kg/s) M: masa del medio a esterilizar (kg) Cp: capacidad calrica del medio (kcal/kg C) U: coeficiente global de transferencia de calor (kcal/m2s C) TH: temperatura absoluta de la fuente de calor (K) q: velocidad de transferencia de calor (kcal/s) q: velocidad de transferencia de calor (kcal/s) CP: capacidad calrica del enfriante (kcal/kg C) w: flujo msico del enfriante (kg/s) TC0: temperatura absoluta del enfriante

Cuando se usa vapor vivo, el consumo de vapor se puede estimar:consumo de vapor (kg) = M.CP (T - T0)/,

con calor latente de vaporizacin (kcal/kg).

El uso de vapor directo permite mayor velocidad de calentamientopero diluye el medio (tpico 10- 20%) y puede introducir impurezas.

ESTERILIZACIN CONTINUA

La esterilizacin continua es la etapapreliminar lgica en una fermentacincontinua a escala industrial. La raznpara esto se debe a la relacinexponencial entre velocidad de muerteexponencial entre velocidad de muertey temperatura, que hace ms corto eltiempo necesario para la eliminacincompleta de los organismos vivoscuando se utiliza una temperatura msalta.

La esterilizacin continua se lleva acabo normalmente en 30-120 segundosa 140 C.

El calentamiento del medio de cultivopuede ser llevado a cabo medianteinyeccin de vapor o medianteintercambiadores de calor.inyeccin de vapor o medianteintercambiadores de calor.

La esterilizacin con inyeccin devapor se hace inyectando vapor en lasolucin de nutrientes. La temperaturase eleva rpidamente a 140 C y semantiene durante 30-120 segundos.

La formacin de condensados diluyela solucin nutritiva; para corregiresto la solucin caliente se bombeaa travs de una vlvula de expansina un vaporizador y el condensado seretira mediante bombas de vaco.retira mediante bombas de vaco.

La desventaja de este proceso es lasensibilidad que presenta a cambiosen la viscosidad del medio y avariaciones en la presin.

Uso de intercambiadores de calor: lasolucin de nutrientes, en el primerintercambiador, se precalienta a 90-120 C durante 20-30 segundos por lasolucin nutritiva previamenteesterilizada que sale.

En el segundo intercambiador, se En el segundo intercambiador, secalienta indirectamente con vapor a140 C durante 30-120 segundos enuna tubera de mantenimiento yposteriormente en un tercercambiador para refrigeracin a latemperatura del fermentador por 20-30 segundos.

Las soluciones que contienenalmidn, que se hacen viscosascuando se calientan, son difcilesde utilizar en procesos deesterilizacin continua.

Antes de la esterilizacin real debellevarse a cabo una licuefacin ehidrlisis parcial mediante cidos oamilasas.

Si hay partculas en suspensin en lasolucin de nutrientes, los cortostiempos de esterilizacin en elproceso continuo pueden serinsuficientes para que el calorpermanezca completamente a travsde ellas.de ellas.

El tiempo de calentamiento parapartculas de 1 mm es de 1 segundo;para partculas de 1 cm es de 100segundos. Es decir, el tamao de laspartculas debera estar restringido a1-2 mm.

El calentamiento puede serrealizado por:inyeccin directa de vaporintercambiador de calor.

Perfiles temperatura vs tiempo enesterilizadores continuos.

Cuando el flujo es pistn, la velocidad del fluido sobre unradio dado es constante. El tiempo de residencia, esel mismo para todas las porciones de medio. Todo elmedio tendr el mismo tiempo de exposicin a latemperatura de esterilizacin.

Cuando el flujo no es pistn, el tiempo de residenciamedio calculado a partir de la velocidad media, nosiempre corresponder con el tiempo real de cadaporcin de medio. Existen dos situaciones conrespecto a los valores medio de velocidad y de tiemporespecto a los valores medio de velocidad y de tiempode exposicin:

porciones de medio con mayor velocidad que la media,tiempo de posicin menor, estarn sub-expuestasy alcanzarn un menor nivel de muerte.

porciones de medio con menor velocidad, tiempo deexposicin mayor, estarn sobre-expuestas,alcanzarn un nivel mayor de muerte, pero conmayor destruccin de nutrientes.

AF

u

Flujo pistn 1umxima

u

Flujo turbulento

Flujo laminar

0,82umxima

u

Segn modelo de la 1/7 potencia de Prandtl

0,5umxima

u

umximau

ReRe

DuReynoldsdeNmero:Re

F: velocidad de flujo : densidad del medio de cultivoA: rea transversal del cao : viscosidad del medio de cultivoD: dimetro del tuboL: largo del tubo: velocidad media

Para el diseo de un esterilizador continuo se debe conocer la distribucinde tiempos de residencia, o bien la desviacin del rgimen de flujoobtenido con respecto al flujo ideal tipo pistn.

Para estimar dicha desviacin y el diferente grado de destruccin trmicase utiliza el modelo de dispersin, caracterizado por un parmetro, elcoeficiente de dispersin axial o turbulenta, Dz.

dz

Eje z

N N - dN

Eje z

Realizando un balance de microorganismos, considerandovariaciones por arrastre por flujo, dispersin axial y destruccintrmica se tiene:

DZ puede ser estimada usando la correlacin Intensidadde mezcla (Dz/ D) vs Re (Bailey & Ollis, 2nd ed. p. 544, Lee,p. 223). (Levenspiel 1958)

Definiendo el nmero de Peclet(Pe), tambin referido como denmero Bodenstein (Bo):

DLBoPe .uDzDLBoPe .u

Cuando Dz 0 , Pe ,

el flujo se aproxima al flujo pistn.

u DRe

DuzD

Introduciendo en ecuacin 23 el modelo logartmico y los nmerosadimensionales que se definen, se obtiene la ecuacin 25.

NkdtdN

0N

NN Lzz

tt

Definiendo el nmero de reaccin (NR), tambin referido como de

Damkhler (Da):

tk.u

LkDaNR

uR

Siendo L largo del cao yt tiempo de residencia medio:

0NNPezdNdPe

zdNd

R2

2

La solucin de la ecuacin diferencial es la siguiente:

2aPe22aPe2

2Pe

0 eNN

a1a1a4

ee

1/2PeN41a R

Ecuacin 26 graficada

por Aiba et al. (1967).

Wang et al. p. 154,

0NN

Pe

Wang et al. p. 154,

Bailey & Ollis 2nd ed. p. 594,

Aiba et al. 2nd ed. p. 263

NR

Cuando Bo , se tiene flujo pistn y la ecuacin 26se reduce a:

tkN

0

.eeNN R

Desde el punto de vista prctico se puedeconsiderar flujo pistn cuando Bo > 800 -1000.1000.Cuando el flujo no es pistn, el nivel de

destruccin disminuye.Para aproximarse a un flujo cercano al

modelo pistn, el esterilizador se disea:usando caos largos y finosmenor Re en zona turbulenta.

Nivel de esterilizacin, Re y Bo (Pe) en funcin deldimetro del tubo, para un volumen dado de

esterilizador.

Datos k = 8,6

10-9

10-8

10-7

10-6

105

106

0NN

k = 8,6min-1

F = 10L/min

t = 4 min

Dimetro del cao, cm

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

N/N

0

10-16

10-15

10-14

10-13

10-12

10-11

10-10

Re,

Bo

101

102

103

104

Re

Bo

esterilizan 10 m3 de un medio usando unesterilizador continuo a un flujo de 10 L/min demodo de tener un valor de N 0,001. Se tiene lasiguiente informacin:

Volumen del esterilizador = 20 L Concentracin de microorganismos en el medio a

esterilizar = 102 /mL Temperatura de esterilizacin = 140C k = 9,5x1037.e-35000/T (min-1, T temperatura en K) Estimar como afecta el valor de N alcanzado estas Estimar como afecta el valor de N alcanzado estas

situaciones: El esterilizador se repar y qued con un largo un

10% menor Se detect un error de calibracin y la temperatura

de esterilizacin es 138C en lugar de los 140Cledos en el monitor.

Anlisis de una situacin Luego de esterilizar 100 m3 de un medio de cultivo

sobrevive una espora. Se plaquean muestras de 1mL del medio esterilizado. El microorganismo quesobrevive tiene un tiempo de duplicacin de unahora.

Que poblacin debe sobrevivir o desarrollarsepara poder ser detectada por plaqueo?para poder ser detectada por plaqueo?

M.ne1P t2N

P: probabilidad de detectar un microorganismoM: volumen de la muestra, mLn: concentracin de microorganismos viables, clulas/mLN: nmero de clulas viables luego de un tiempo dadot: tiempo, h

Tiempo, h N n, cl/mL P

0 1 1,0x10-8 1,0x10-8

4 16 1,6x10-7 1,6x10-7

8 256 2,6x10-6 2,6x10-6

12 4,1x103 4,1x10-5 4,1x10-5

16 6,6x104 6.6x10-4 6,6x10-4

20 1,0x106 1,0x10-2 0,01

24 1,7x107 0,17 0,15

28 2,7x108 2,7 0,93

32 4,3x109 4,3 1

ASPECTOS CRTICOS A TENER ENCUENTAS

Fallas en el ciclo temperatura - tiempo. Residuos acumulados en grietas o cavidades y

no removidos durante la limpieza. Medio de cultivo con alta concentracin de

slidos en suspensin.slidos en suspensin. Medidores de temperatura descalibrados. Mal funcionamiento de vlvulas, sellos, juntas. Equipo mal mantenido. Equipo mal operado. Equipo no adecuadamente validado no (apto

para el uso pretendido).