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Esterilizacion de Biorreactores

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4. Mtodos de esterilizacin

4.1. Introduccin

En las fermentaciones industriales se requiere de un alto grado de limpieza y asepsia No existe un mtodo cuantitativo seguro y confiable para medir el nmero o la concentracin de contaminantes en el sistema

Posibles elementos de contaminacin en un proceso fermentativo:

El medio El inculo y el proceso de inoculacin El suministro de aire La adicin de nutrientes, antiespumantes, etc. durante el proceso El fermentador en s

4.2. Esterilizacin de medios de cultivoA. Eliminacin fsicaa) b) c) d) e) f) Filtracin Centrifugacin Flotacin Atraccin electrosttica Intercambio inico Adsorcin por carbn de virus

4.2. Esterilizacin de medios de cultivoB. Destruccina) b) c) d) e) Calor hmedo Calor seco Radiacin electromagntica Radiacin snica Agentes qumicos

4.2. Esterilizacin de medios de cultivo

La tcnica de mayor aplicacin a nivel industrial es el tratamiento trmico que se puede llevar a cabo en procesos intermitentes y

continuos

El vapor es el recurso utilizado universalmente para la esterilizacin del medio de fermentacin

Cintica de esterilizacin

La destruccin de microorganismos por vapor (calor hmedo) puede ser descrita como una reaccin qumica de primer orden: - dN = KN dq (1)

Donde: N q K

No. de m.o. viables presentes Tiempo del tratamiento de esterilizacin Constante de reaccin

Constantes de velocidad de reaccin (K) y tiempos de reduccin decimal de diferentes esporas bacterianas suspendidas en buffer a 121CEspecie Ka 121C (min-1) Da 121C (min)

Bacillus subtilis FS 5230Bacillus stearothermophilus FS 1518 Bacillus stearothermophilus FS617 Clostridium sporogenes PA 3679

3.8-2.60.77 2.9 1.8

0.6-0.93.0 0.8 1.3

Cintica de esterilizacin

Integrando la ecuacin (1):Nq = e-Kq N0 (2)

Donde: Nq N0

No. de m.o. viables al tiempo q No. de m.o. Viables presentes al inicio del tratamiento de esterilizacin

Cintica de esterilizacin

Otra forma de expresar la ecuacin (2):ln Nq = -Kq N0 (3)

Donde: Nq N0

No. de m.o. viables al tiempo q No. de m.o. viables presentes al inicio del tratamiento de esterilizacin

Representacin grfica de la ecuacin (2)

Nq/N0

q

Representacin grfica de la ecuacin (3)

ln (Nq/N0)

q

Cintica de esterilizacin

La esterilizacin total nunca puede alcanzarse Valores de Nq < 1 se deben considerar en trminos de la probabilidad de que un microorganismo sobreviva al tratamiento Las grficas representadas anteriormente slo se observan cuando se lleva a cabo la esterilizacin de un cultivo puro bajo condiciones ideales de esterilizacin

Cintica de esterilizacin

El valor de K no slo depende de las especies, sino tambin depende de la forma fisiolgica de la clula Ejemplo: las endoesporas del gnero Bacillus son ms resistentes que las clulas vegetativas Richards gener una serie de grficas ilustrando las desviaciones que en la prctica se presentan de la teora

Efecto del tiempo de tratamiento trmico sobre la sobrevivencia de una poblacin de endoesporasa) La activacin de esporas es significativamente mayor que su destruccin durante los primeros estados del proceso

ln (Nq/N0)

q

Efecto del tiempo de tratamiento trmico sobre la sobrevivencia de una poblacin de endoesporasb) La activacin de esporas es balanceada por su muerte durante los primeros estados del proceso

ln (Nq/N0)

q

Efecto del tiempo de tratamiento trmico sobre la sobrevivencia de una poblacin de endoesporasc) La activacin de esporas es menor que su muerte durante los primeros estados del proceso

ln (Nq/N0)

q

Efecto del tiempo de tratamiento trmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezcladosd) Mezcla constituida principalmente por el microorganismo menos resistente trmicamente Microorganismo sensitivo Microorganismo resistente

ln (Nq)

q

Efecto del tiempo de tratamiento trmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezcladose) Mezcla constituida principalmente por el microorganismo ms resistente trmicamente Microorganismo sensitivo Microorganismo resistente

ln (Nq)

q

Relacin entre la temperatura y la constante de reaccin: tipo Arrheniusd ln K = Ea dT RT2 Donde: Ea R T Energa de activacin Constante de los gases Temperatura absoluta (4)

Relacin entre la temperatura y la constante de reaccin: tipo Arrhenius

Integrando la ecuacin (4): ln K = ln A - Ea RT (5)

Ecuacin para la esterilizacin trmica de un cultivo puro:

Combinando las ecuaciones (3) y (5): ln N0 = A q e-E/RT Nq (6)

Factor DEL o Factor NABLA (V)

Definido por Deinoerfer y Humprey (1959) como un criterio de diseo para la esterilizacin: V = ln N0 Nq (7)

De donde:

V = A q e-EA/RT

(8)

Factor DEL o Factor NABLA (V)

Rearreglando la ecuacin (8):ln q = E + ln V RT A (9)

Este factor es una medida de la reduccin fraccional de organismos viables producido por un cierto rgimen de tiempo y temperatura

Efecto del tiempo de esterilizacin y de la temperatura sobre el factor DEL alcanzado en el procesoln q69

234.6 2.3

Factores DEL

1/T

Diseo de proceso de esterilizacin de medios de fermentacin

El mismo grado de esterilizacin se puede obtener a partir de un gran nmero de combinaciones de tiempo y temperatura De acuerdo a Deindoerfer y Humprey (1959), Richards (1968) y Banks (1979) un factor de riesgo de que un batch de mil est contaminado se utiliza frecuentemente en la industria de las fermentaciones

Diseo de proceso de esterilizacin de medios de fermentacin

Se supone presentes

que los nicos contaminantes son esporas de Bacillus stearothermophilus, que es de los microorganismos ms termorresistentes, cuyas caractersticas son: Ea = 67.7 Kcal/mol A= 1 x 10 36.2 seg-1 Una serie de reacciones deteriorativas pueden presentarse en el medio durante su esterilizacin, resultando en una prdida de la calidad nutritiva

Efecto deteriorativo del incremento del tiempo de tratamiento sobre la productividad del proceso de fermentacin

% de la mxima productividad

Duracin de la esterilizacin (min)

Prdida de calidad nutritiva del medio durante la esterilizacin

Dos tipos de reacciones bsicas contribuyen a la prdida de calidad nutritiva durante la esterilizacin: i. Interacciones entre nutrientes constituyentes del medio, Ejem: reaccin de Maillard ii. Degradacin de componentes termolbiles como vitaminas y aminocidos Para evitar reacciones deteriorativas se recomiendan sistemas de esterilizacin continuos de alta temperatura y corto tiempo (HTST)

4.2.1. Esterilizacin intermitente

Existen diferentes tipos de equipo utilizado para la esterilizacin del medio de cultivo, dependiendo del mtodo empleado para el calentamiento

1. Inyeccin de vapor

VVVV

2. Calentamiento elctrico

VVVV

3. Calentamiento con vapor Fuente isotrmica de calor

4. Enfriamiento con refrigerante Refrigerante no isotrmico

Perfiles de temperatura en esterilizacin batchTipo Ecuacin de perfil a, b, g

1

T = T0 1 +

at 1 + gt Hiperblico

a = hs g = S/M MCpT0 a= q MCpT0

23 4

T = T0 (1 + at) LinealT = TH (1 + be-at) Exponencial T = TCo (1 + be-at) Exponencial

a = UA b = T0 TH MCp TH a = WCp 1 exp -UA MCp WCp b = (T0 TCo)/TCo

TerminologaA Cp Cp h M q S T0 TH TCo U rea de transferencia de calor (m2) calor especfico del medio (Kcal/Kg C) calor especfico del refrigerante (Kcal/Kg C) contenido entlpico del vapor (Kcal/Kg) masa inicial del medio velocidad de transferencia de calor (Kcal/seg) flujo msico de vapor (Kg/seg, Kg/min, Kg/hr) temperatura inicial del medio (K) temperatura de la fuente de calor (K) temperatura inicial del refrigerante (K) coeficiente global de transferencia (Kcal/m2 hr C)

Criterio de diseo ( total) de esterilizaciones batchtotal = ln N0 = N

t

0

Kdt = a e-E/RT dt0

total

calent

D

D

D

=

+

reten +

D

t

D

D

enfr

Criterio de diseo ( total) de esterilizaciones batchcalent = ln N0 = N1 reten = ln N1 = N2 enfr

t1

0

Kdt = a e-Ea/RT dt0

t2

0

Kdt = a e-Ea/RT dt0

= ln N2 = N

t3

0

Kdt = a e-Ea/RT dt0

D

t1

D D D

t2

t3

Criterio de diseo ( total) de esterilizaciones batch

Donde:

t = t 1 + t2 + t 3

N N0

N1N2

nivel de esterilidad (No. de m.o. despus de la esterilizacin) nivel de contaminacin (No. de m.o. antes de la esterilizacin) No. de m.o. contaminantes despus del perodo de calentamiento, t1 No. de m.o. contaminantes despus del perodo de retencin, t2

D

4.2.2. Esterilizacin continua

Menos utilizados en la industria que los intermitentes Equipo ms utilizado para la esterilizacin continua del medio de fermentacin:

Esterilizador tipo inyeccin Intercambiador de placas

Esterilizacin continua por inyeccin

Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaa.

Perfil de temperatura tiempo en esterilizadores continuos por inyeccin de vapor

Esterilizacin continua con intercambiadores de calor

Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaa.

Perfil de temperatura tiempo en esterilizadores continuos de intercambiador de platos

Ventajas de la esterilizacin CONTINUA sobre la BATCH

Mantenimiento superior de la calidad del medio Fcil escalamiento Fcil control automtico Reduccin del tiempo de esterilizacin Reduccin de corrosin en el fermentador

Ventajas de la esterilizacin BATCH sobre la CONTINUA

Control manual simple Fcil de aplicarse a un medio que contenga una alta proporcin de material slido

4.3. Esterilizacin del aire

En los procesos de fermentacin se necesita aire estril, por lo que es comn el uso de un sistema de filtracin y uno de esterilizacin El tamao de los microorganismos vara desde unas milimicras hasta cientos de micras Los microorganismos ms pequeos suelen ser absorbidos en el polvo del aire, lo que facilita su eliminacin durante la filtracin

4.3. Esterilizacin del aire

Durante el proceso de esterilizacin del aire se eliminan las partculas de tamao entre 0.5 y 1.0 micra Para poder disear un sistema de esterilizacin es necesario conocer el tamao de las partculas y el nmero de microorganismos presentes en el aire, as como la cantidad de otras partculas. En Inglaterra se han reportado valores promedio de 3 a 9 x 103 partculas/m3 y en Japn 12 x 103 El proceso de esterilizacin del aire ms utilizado es el de FILTRACIN

Requisitos de un sistema de filtracin1. El sistema debe ser de diseo sencillo2. Su operacin debe ser barata 3. Debe ser estable y resistente a varias esterilizaciones con vapor 4. Debe acondicionar el aire, ajustando temperatura y humedad

Tipos de filtros

Tipos de filtros

Escala pequea:

Filtros millipore, de asbesto o porcelana Filtros fibrosos de lana de vidrio o materiales similares

Escala mayor:

Filtros granulados, partculas de carbn Filtros fibrosos

4.3.1. Anlisis fundamental

El comportamiento de un filtro para aire se define de la siguiente manera:

h- = N N0 x 100 (%)N0

(10)

- la eficiencia total de retencin Siendo hdel filtro

Mecanismos de retencin de partculas finas por filtros de airea) Impactob) Intercepcin

c) Difusind) Sedimentacin e) Atraccin electromagntica

Lneas de corriente de aire producidas por el flujo alrededor de una fibra cilndrica

b

q

Df

Impacto inercial (h1)

La retencin por este mtodo se expresa como: h1 = b/Df (11)

b = Df + 2DpDonde: b Df Dp ancho especfico de la corriente (m, cm) dimetro de la fibra (m, cm) dimetro de la partcula (m, cm)

(12)

Impacto inercial (h1)Masa de partcula muy pequea o Velocidad de aire muy baja

Fuerza inercial insuficiente para que la partcula choque con la fibra

Velocidad crtica, Vc, en la que los efectos inerciales se vuelven mnimos

Velocidad Crtica (Vc)Vc = 1.125 ma Df C r p D p2(13)

Donde: Vc ma rp C

velocidad superficial crtica del aire viscosidad del aire densidad de la partcula factor de correlacin basado en la Ley de Stokes

Velocidad Crtica (Vc)

Para bacterias de 1 micra de dimetro: Vc = 0.066 DfVc en ft/seg Df en micras(14)

Intercepcin (h2)

Para partculas esfricas: h2 = 1 [(1+Re)ln(1+Re)2 (1+Re) + 1/(Re+1)] 2(2-lnRe) (15)

Donde:

Re = Df v r m v velocidad del aire

(16)

Difusin (h3)

La difusividad de las partculas finas, D, puede expresarse como una funcin de Dp y considerando como Do el dimetro efectivo de desplazamiento de la partcula por difusin se tiene: h3 = 1 [2(K)lnK K + 1/K] 2(2-lnRe) (17)

-

Difusin (h3)

Donde:

K = 1 + 2 Do/Df Do/Df = 2.24 (2 lnRe) D VDf D= CKT 3pmDp

(18)1/3

-

(19)

-

(20)

K T

constante de Boltzman (1.38x10-16 erg/K) temperatura absoluta

Relacin entre la eficiencia total (h) y las eficiencias de una sola fibra (h0)

h0 = h1 + h2 + h3

(21)

Para un filtro real, la eficiencia se define:

ha = p (1 a) Df ln 1 4aL 1-h h0 h-

(22)

Eficiencia de coleccin de una sola fibra cuya fraccin volumtrica es a Eficiencia total de recoleccin de un filtro

Relacin entre la eficiencia total (h) y las eficiencias de una sola fibra (h0)

Experimentalmente se ha encontrado: ha = (1 4.5 a) h0 (23)

Para:

0 < a < 0.1

4.3.2. Diseo de filtros

La penetracin de microorganismos en un filtro es de naturaleza logartmica: dN = K N dL ln N = -K L N0(24)

(25)

4.3.2. Diseo de filtros

Donde:N0 N Nmero de microorganismos que entran al filtro Nmero de microorganismos que salen del filtro Longitud del filtro Constante de filtracin

L K

4.3.2. Diseo de filtrosK es funcin de: La velocidad del aire Densidad del filtro Tamao de las fibras Tamao y densidad del microorganismo eliminado K se puede expresar en trminos de la profundidad del filtro, como la longitud para eliminar el 90% de N0, L90.

4.3.2. Diseo de filtrosln N0 = 2.3 (L) N L90ln N0 = 1.23 h0 (1 + 4.5a) L N (1 a) Df

(26)

(27)

Criterio de diseo: N = 10-3