ESTRATGIAS DE CONTROLE BIOLGICO DE LARAVAS DE

MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS

ENTOMOPATOGNICOS

CSAR RONALD PEREIRA GOMES

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ NOVEMBRO - 2009

ESTRATGIAS DE CONTROLE BIOLGICO DE LARAVAS DE

MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS

ENTOMOPATOGNICOS

CSAR RONALD PEREIRA GOMES

Tese apresentada ao Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do ttulo de Doutor em Produo Vegetal.

Orientador: Prof. Richard Ian Samuels

CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ NOVEMBRO - 2009

ESTRATGIAS DE CONTROLE BIOLGICO DE LARAVAS DE

MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS

ENTOMOPATOGNICOS

CSAR RONALD PEREIRA GOMES

Tese apresentada ao Centro de

Cincias e Tecnologias

Agropecurias da Universidade

Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro, como parte das

exigncias para obteno do

ttulo de Doutor em Produo

Vegetal.

Aprovada em

Comisso Examinadora:

Prof. Francisco Jos Alves Lemos (Ph.D., Bioqumica) - UENF

Prof. Milton Erthal Junior (D.Sc., Produo Vegetal) - ISTCA-FAETEC

Prof. Claudio Luiz Melo de Souza (D.Sc., Produo Vegetal) - ISTCA-FAETEC

Prof. Richard Ian Samuels (Ph.D., Entomologia) - UENF

Orientador

Dedico esse trabalho de concluso de Doutoramento minha companheira

Elda Albertini pelos nossos trinta anos de luta juntos desde nossa juventude, nas

agruras do exlio, por sua incondicional solidariedade e companheirismo em todos

os projetos aos quais dediquei minha vida profissional.

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle

Biolgico de Vetores, mas principalmente por haver-me ensinado com seu

exemplo pessoal que ser Mestre muito mais do que proporcionar informaes.

Ser Mestre, ensinou-me a convivncia com o Professor Richard, sentir-se

responsvel pelo aprendizado, pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade

social de seus discpulos.

Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estmulo e

colaborao.

Ao Adriano de Paula, Paulo Csar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua

ajuda e companheirismo.

SUMARIO

Pgina

LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii

LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix

RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi

ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii

1 INTRODUO ---------------------------------------------------------------- 1

2 - REVISO BIBLIOGRFICA ----------------------------------------------- 4

2.1 - Dados Biolgicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4

2.2 - Caractersticas do Vrus ---------------------------------------------- 12

2.3 - Controle Qumico e Biolgico de Vetores de Doenas ------- 18

2.3.1 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18

2.4 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sade Humana -------- 22

2.5 - Fungos Entomopatognicos----------------------------------------- 23

2.6 - Utilizao de Fungos Entomopatognicos para o Controle

de Vetores de Doenas Humanas ----------------------------------------

26

3 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28

3.1 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28

3.2 - Objetivos especficos -------------------------------------------------- 28

4 MATERIAL E MTODOS --------------------------------------------------

29

4.1 - Criao das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29

4.2 Bioensaio 1: Teste de Virulncia larval -------------------------- 30

4.3 Preparo das Suspenses de Fungo para os Experimentos

de Laboratrio e de Semi-campo -----------------------------------------

31

4.4 Bioensaio 2: Persistncia da virulncia da Suspenso do 32

Fungo ESALQ 818 em gua. ---------------------------------------------

4.5 Bioensaio 3: Infeco das Larvas com Fungos em Arroz -- 32

4.6 Persistncia da virulncia do Fungo Crescidos e Aderidos

no Gro de Arroz. ------------------------------------------------------------

33

4.7 Virulncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gro de

Arroz em Condies de Semicampo para Larvas de Aedes

aegypti ---------------------------------------------------------------------------

33

4.8 Persistncia da virulncia do Fungo Crescido e Aderido

em Gros de Arroz -----------------------------------------------------------

34

4.9 Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no

Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------

34

4.10 Virulncia em Condies de Laboratrio do Isolado

ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti

oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------

35

4.11 Virulncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em

Gro de Arroz em Condies de Semi-campo para Larvas

Selvagens de Aedes aegypti. ---------------------------------------------

36

4.12 Avaliao da mortalidade das larvas --------------------------- 36

4.13 Forma de Anlise dos Resultados ------------------------------ 36

5. RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38

5.1 Seleo em Laboratrio de Fungos Virulentos para Larvas

de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------

38

5.1.1 Persistncia em gua da Suspenso de Fungo

ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---

40

5.1.2 Virulncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e

Aderido no Gro de Arroz para Larvas Rockefeller -----------

42

5.1.3 Persistncia em gua do Fungo ESALQ 818

Crescido e Aderido no Gro de Arroz ----------------------------

42

5.2 Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti

(Rockefeller) --

44

5.2.1 Virulncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em

duas Quantidades de Gro de Arroz para Larvas de Aedes

aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------

44

5.2.2 Persistncia em gua da Virulncia do Fungo

ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gros de Arroz

para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------

45

5.3 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populao

Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratrio - ------------------

46

5.3.1 Virulncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares

Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------

46

5.3.2 Virulncia de LPP 133 para os Diversos Instares

Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------

46

5.4 Virulncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818

Crescido e Aderido em Gro de Arroz Contra uma Populao

Natural de Larvas de Aedes aegypti em condies de Semi-

campo ----------------------------------------------------------------------------

47

5.5 Influncia da Infeco do ESALQ 818 no desenvolvimento

de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------

49

5.6 Influncia da Infeco do LPP 133 no desenvolvimento de

Aedes aegypti------------------------------------------------------------------

51

6 DISCUSSO ------------------------------------------------------------------- 53

7 CONCLUSES --------------------------------------------------------------- 59

8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ------------------------------------- 60

LISTA DE QUADROS

Pgina

Tabela 1 Isolados de fungos entomopatognicos usados para

virulncia contra larvas de Aedes aegypti. ----------------------------------

30

Tabela 2 Mdia de mortalidade (%) desvio padro das larvas

expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e

oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma).-------------------------------

39

Tabela 3 Sobrevivncia (SOBR) desvio padro (DP) e tempo

mdio de sobrevivncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ

818+Tween inoculado na gua por diferentes perodos (Tempo

zero, 3, 5, 10 dias). O tratamento controle foi feito somente com

Tween. --------------------------------------------------------------------------------

41

Tabela 4 Taxa de sobrevivncia desvio padro (DP) e tempo

mdio sobrevivncia (S50) das larvas expostas ao gro de arroz

com ESALQ 818 inoculado em gua por diferentes perodos

(Tempo zero, 3, 5, 10 dias). O tratamento controle foi feito da

mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo. ----------------------

43

Tabela 5 Sobrevivncia desvio padro (DP) e tempo mdio de

sobrevivncia (S50) das larvas exposta aos gros de arroz com

fungo mantidos em gua por (Tempo zero, 5, 10 e 20 dias). ----------

46

Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e

20 gros de arroz com fungo (% MORT. LARVAL) desvio padro

(DP) da mortalidade de larvas, porcentagem da formao de pupas

das larvas que no foram mortas pelo fungo.---------------------- 48

Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas, pupas e

adultos; formao de pupas e adultos e desvio padro (DP) do

tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle.-------------------

50

Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas, pupas e

adultos; formao de pupas e adultos de insetos tratamentos com

fungo LPP 133 e os tratamentos controles.----------------------------------

52

LISTA DE FIGURAS

Pgina

Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6

Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp. da dengue ---------------------------- 13

Figura 3 - Notificaes de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16

Figura 4 Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro

de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------

17

Figura 5 - Sobrevivncia das larvas tratadas com fungos

entomopatognicos e dos grupos controle com desvio padro.----------

40

Figura 6 Sobrevivncia com desvio padro das larvas expostas ao

Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em gua por diferentes

perodos (Tempo zero, 3, 5 e 10 dias) para a avaliao da

patognicidade do fungo.-----------------------------------------------------------

41

Figura 7 Sobrevivncia com desvio padro das larvas colocadas na

gua com um gro de arroz do isolado ESALQ 818. O tratamento

controle foi feito com um gro de arroz sem condios e autoclavado. --

42

Figura 8 Curvas de sobrevivncia com desvio padro das larvas

expostas ao gro de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes

perodos (Tempo zero, 3, 5, 10 dias). ----------------------------

43

Figura 9- Curvas de Sobrevivncia com desvio padro das larvas da

linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gros de

arroz (10 20 gros) com fungos ESALQ 818. ------------------------------

44

Figura 10 Sobrevivncia com desvio padro das larvas expostas

ao fungo inoculado em gros de arroz que permaneceram em gua

por diferentes tempos (tempo zero, 5, 10, e 20 dias) ---------------------- 45

Figura 11 Sobrevivncia (%) dos diferentes instars larvais

infectados com o isolado ESALQ 818. Os tratamentos controle foram

feitos apenas com 0,05% Tween 80. -------------------------------------------

46

Figura 12 - Porcentagem de sobrevivncia dos diferentes instars

larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 0,05% Tween 80. O

tratamento controle foi feito apenas com 0,05% Tween 80. --------------

47

Figura 13 - Sobrevivncia com desvio padro da populao de larvas

do municpio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes

quantidades de gros de arroz (10 20 gros de arroz). -----------------

48

Figura 14 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos

feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle. -------------

-

50

Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos

feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle. -----------------

51

RESUMO

PEREIRA GOMES, CSAR RONALD; D.Sc. ; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, novembro de 2009, Seleo e Formas de Inoculao de Fungos Entomopatognicos para o Controle Biolgico de Aedes Aegypti (Diptera:Culicidae). Professor orientador: Richard Ian Samuels. Professores Conselheiros: Francisco Jos Alves Lemos, Milton Erthal Junior, Claudio Luiz Melo de Souza.

Dengue uma das mais srias doenas transmitidas por mosquitos o que

instiga pesquisas para novos mtodos de controle do vetor Aedes aegypti. A

patogenicidade e virulncia de vrios isolados do fungo entomopatognico

Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratrio

contra larvas do 2 3 instares de Ae. aegypti. Suspenses de fungo foram

adicionadas em copos de plsticos contendo as larvas dos mosquitos e a

mortalidade foi monitorada diariamente. As larvas expostas aos diferentes

isolados dos fungos tiveram de 6 a 90% de mortalidade. Trs dos isolados foram

considerados virulentos (CG24; CG114; ESALQ818) sem diferena

estatisticamente significativa entre eles. As curvas de sobrevivncia mostraram

que o isolado CG 144 de M. anisopliae causou 50% mortalidade das larvas em 5

dias. Anlise de Probit foi usada para estimar a concentrao letal do CG144. Foi

determinado que o valor do CL50 foi de 3.16 x 105 conidios mL-1. Numa segunda

etapa foi avaliado a virulncia e a persistncia do fungo contra larvas da linhagem

Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos

dos Goytacazes, RJ. Este teste foi feito em condio de semi-campo. O presente

estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 condios mL-1) manteve-se vivel

por 10 dias depois de inoculado em copos plsticos com 50 mL de gua.

Observaes do desenvolvimento das larvas formando pupas, mostrou que

aproximadamente 20% das pupas morreram, ou seja no resultaram em adultos.

Entretanto, dos adultos emergindo das pupas, a longevidade foi considerada

normal. O isolado LPP133 foi re-isolado de cadveres de larvas de Aedes aegypti

e um aumento na virulncia foi subsequentemente observado. O isolado

originalmente causou 8% de mortalidade de larvas enquanto aps o re-

isolamento, o fungo causou 60% mortalidade em 2 dias. Gros de arroz com

fungo aderido tambm foram usados para verificar a virulncia e a persistncia do

fungo na gua. Para isso foi testado virulncia dos condios depois de diferentes

tempos da sua permanncia na gua (Tempo zero, 5, 10 e 20 dias). Foi

adicionado 1 gro de arroz em 50 mL de gua para verificao da persistncia. O

tempo zero representou o controle positivo no sentido que as larvas so

expostas ao fungo imediatamente. Foi observada uma queda na mortalidade

conforme a passagem do tempo entre a inoculao do fungo na gua e a adio

das larvas. Os valores do tempo mdio de sobrevivncia das larvas (S50)

aumentaram gradativamente, sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na

gua por 10 dias antes de colocar as larvas. Porm, a mortalidade ainda foi

considerada alta, com somente 25% de sobrevivncia das larvas. Os prximos

experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gros de arroz

numa simulao de campo. Foi testado o efeito da inoculao de 10 e 20 gros

de arroz em 1 litro de gua. O uso de 20 gros de arroz foi mais eficiente do que

10 gros, com 5% das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento. O valor de

S50 foi o menor de todos os experimentos, sendo de um dia. Este resultado

mostrou que o fungo pode ser promissor no controle biolgico de larvas de Ae.

aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposio de fmeas

do mosquito. Este mtodo reduziria a populao deste inseto e portanto a

incidncia da Dengue.

ABSTRACT

PEREIRA GOMES, CSAR RONALD; D.Sc. ; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, november 2009, Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (Diptera:Culicidae). Supervisor: Richard Ian Samuels. Committee Members: Francisco Jos Alves Lemos, Milton Erthal Junior, Claudio Luiz Melo de Souza.

Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito

vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes

aegypti. The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal

isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were

tested under laboratory conditions against 2nd 3rd instar Ae. aegypti larvae.

Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality

was monitored on a daily basis. The larvae exposed to different isolates showed a

range of virulence, with 6 to 90% mortality. Three of the isolates were considered

virulent (CG24; CG114; ESALQ818) with no statistical difference between them.

Survival curve analysis showed that isolate CG144 M. anisopliae caused 50%

larval mortality within 5 days. Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was

3.16 x 105 conidia mL-1. In the next phase of the experiments, the virulence and

persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-

type larvae, obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes,

RJ. Results showed that ESALQ818 (1x108 condios mL-1) was viable for 10 days

following inoculation in water. Observations of insect development of the larvae

surviving to form pupae, showed approximately 20% mortality of these pupae,

previously exposed to the fungus. However, adult emergence/longevity from

surviving pupae was considered normal. Isolate LPP133 was re-isolated from

Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed,

originally this isolate caused 8% mortality, but following re-isolation, caused 60%

mortality in 2 days. Rice grains on which the fungus had been cultivated were

used in a simplified application technique, adding the rice grains to water

containing larvae. The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20

day time period (time zero, 5, 10 and 20 days). For tests in plastic cups with 50 mL

water, 1 rice grain was added to each cup. Survival curves showed that there was

a gradual decline in virulence over time. The S50 values increased from 2 days for

time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in

the water before adding larvae. However, the mortality was still considered high,

with only 25% of the larvae surviving. Experiments were then carried out under

field conditions. The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of

water. In this case 10 and 20 rice grains were tested. It was seen that 20 rice

grains with fungi were more efficient than 10 rice grains. However, the fungal

persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time. Even so,

the results show that following future studies of fungal formulation, it should be

possible to improve field persistence. Entomopathogenic fungi are an alternative to

currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito

populations will result in reduced incidence of Dengue fever.

1 - INTRODUO

O crescimento da populao de Aedes aegypti, principal mosquito vetor da

Dengue, deve-se ao aumento do uso de recipientes no bio-degradveis oriundos

da estratgia da Obsolescncia Planejada, aos sistemas de coleta de lixo

deficientes, ao aumento da densidade populacional em reas urbanas, m

qualidade das habitaes, decadncia dos sistemas de sade e, principalmente,

s condies precrias de saneamento, s quais a maioria da populao

brasileira est submetida (Alva, 1997).

A persistncia da hiperinfestao de Ae. aegypti deve-se tambm, entre

outros fatores, ao acmulo de gua das chuvas no interior dos objetos de uso

humano lanados nos peridomiclios1 e nos refugos que no so devidamente

acondicionados para recolhimento pelo servio de coleta de lixo urbano, tornando-

se os principais focos de proliferao de mosquitos (FUNASA, 2002).

Normalmente, os criadouros iniciais desses dpteros so os terrenos

baldios, ferros-velhos, recauchutadoras, borracharias e cemitrios. A permanncia

dessas condies predispe o ambiente surtos e/ou epidemias, combatidos

pelos servios de vigilncia sanitria com a aplicao de larvicidas e inseticidas

organofosforados. Mesmo em baixas doses, essas substncias entram no

ecossistema e tm ao cumulativa sobre a flora e a fauna regional, e em longo

prazo, sobre a sade humana. Cabe ressaltar a ocorrncia de populaes de

Aedes sp. resistentes aos organofosforados usados habitualmente como

larvicidas e inseticidas (Montella et al, .2007).

O Dengue vrus (DENV) a mais importante arbovirose que afeta o

homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sade pblica,

especialmente nos pases tropicais. A pandemia de dengue que teve em meados

do sculo XX, vem intensificando-se nas ltimas dcadas, com a expanso da 1-Peridomicilio compreende a rea exterior casa, porm no interior do terreno, como o quintal e os jardins.

distribuio geogrfica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do

vrus. A Organizao Mundial da Sade estima que cerca de 100 milhes de

pessoas se infectem anualmente em 100 pases, de todos os continentes, com

exceo da Europa. Dessas pessoas, cerca de 550 mil necessitam de

hospitalizao e pelo menos 20 mil morrem da doena (Silva Jnior e Pimenta

Jnior, 2008).

At o final da dcada de 1970, devido ao Programa Continental de

Erradicao de Ae. aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente

naquela ocasio, a dengue, nas Amricas, deixou de ser um problema importante

de sade pblica. O programa foi na realidade, executado com o objetivo de

eliminar a febre amarela, e com exceo de poucos pases, como a Venezuela, o

sul dos EUA, as Guianas e algumas reas do Caribe, o vetor desapareceu do

continente americano. Infelizmente, o programa foi suspenso e a partir de ento o

mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das reas onde no

havia sido erradicado (Schatzmayr, 2008).

Desde o comeo do sculo XX os agentes qumicos tm sido usados para

combater e controlar a populao de Ae. aegypti. Aps a descoberta do

Diclorodifeniltricloroetano (DDT), este se tornou o principal mtodo utilizado em

programas tendentes erradicao do mosquito. O uso intensivo e prolongado do

DDT provocou resistncia na populao de Ae. aegypti e, com isso, foi necessria

a sua substituio pelos inseticidas organofosforados. No entanto, o uso intensivo

e prolongado de organofosforados provocou resistncia na populao desse

mosquito (Giannini, 2001). Apesar dos efeitos negativos do uso dos qumicos

contra o mosquito, esses salvaram muitas vidas e durante um perodo foram

bastante eficientes no combate do vetor. O mosquito vetor da dengue foi

erradicado no Brasil com o uso de DDT na dcada de 50 e somente aps o

ressurgimento desse vetor no pas, devido a fatores externos como o no controle

nos pases vizinhos, o DDT passou a no apresentar eficincia contra esse inseto

(Consoli e Oliveira, 1998).

As bactrias so os agentes de controle biolgico dos mosquitos mais

utilizados em todo o mundo. As duas espcies mais estudadas e utilizadas so

Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus, que possuem elevadas propriedades

larvicidas e produzem endotoxinas proticas as quais, quando ingeridas pelas

larvas, atacam e destroem o epitlio do intestino mdio, levando-as morte (Neto

& Oliveira, 1985). Atualmente no Brasil, B. thuringiensis variedade israelensis

(Bti), est sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae.

aegypti, enquanto peritrides esto sendo aplicados para o controle da fase

adulta. Ainda, no existe um programa de uso de controle biolgico para

mosquitos adultos de quaisquer espcies (Vilarinho et al, 1998).

A possibilidade de utilizar fungos entomopatognicos para o controle de

larvas de uma gama de espcies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas

pesquisas, sem chegar ao nvel de programa de controle biolgico (Scholte et al.,

2004b).

O uso de fungos entomopatognicos para o controle de adultos das

espcies de mosquitos vetores da Malaria, recentemente tem gerado muito

interesse, no somente pela possibilidade de reduzir as populaes de vetores,

mas tambm pelo fato, que os mosquitos infectados com os fungos no

transmitem a doena na mesma taxa que os mosquitos no infectados (Thomas e

Read, 2007).

Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos

Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patognicos e virulentos

contra larvas de Ae. aegypti (Pereira et al., 2009), e contra adultos dessa memsa

espcie (Paula et al., 2008).

O presente trabalho investigou a seleo de fungos entomopatognicos

para o controle de larvas de Ae. aegypti, visando sua futura aplicao em campo.

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Dados Biolgicos de Aedes aegypti

O vetor da dengue um inseto domstico, inteiramente relacionado

populao humana, sendo tambm o principal vetor da febre amarela urbana.

Est presente na frica, nas Amricas e na sia, sendo provavelmente originrio

do continente africano (FUNASA, 1998), na regio da Etipia, onde se encontram

trs formas dessa espcie: o Ae. aegypti na forma tpica, o Aedes

queenslandensis e o Aedes formosus, um mosquito silvestre e mais escuro.

Somente as duas primeiras formas so encontradas no continente americano,

que provavelmente foram transportadas em tambores de gua dos barcos durante

as primeiras exploraes e colonizaes europias (Silva Junior e Pimenta Junior,

2008).

Ae. aegypti se adaptou intimamente ao homem em regies ridas,

utilizando seus reservatrios de gua junto s moradias para postura e,

conseqentemente, passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto

sangineo, de preferncia a outros mamferos (Schatzmayr, 2008).

A longa associao de Ae. Aegypti com a espcie humana parece t-lo

dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua vtima durante o

repasto sanguneo. Se o hospedeiro produz algum movimento, mesmo que

suave, a fmea de Ae. Aegypti prontamente o abandona procurando outra vtima

ou voltando a atac-lo depois de cessado o perigo de ser atingido. Esta

peculiaridade tem grande importncia epidemiolgica, pois uma s fmea de Ae.

aegypti infectada pode fazer vrias alimentaes curtas em diferentes

hospedeiros e disseminar rapidamente o vrus da dengue ou da febre amarela

(Consoli e Oliveira, 1998).

Devido s suas caractersticas biolgicas, Ae. aegypti tem criadouros

transitrios, que so condicionados diretamente pelas chuvas, como os seus

preferenciais. Decorrente disso, sua populao de alados sofre flutuao grande e

abrupta de densidade no ciclo anual, isto , seu ciclo anual influenciado pela

quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental. Seus criadouros,

representados pelas poas d'gua e pelos recipientes naturais e artificiais, so

preenchidos quase somente na poca chuvosa. Com o aumento da precipitao

pluviomtrica simultnea s ascenses trmicas que precedem a chegada do

vero e que se mantm durante esta estao, estes criadouros passam a ser

ciclicamente reabastecidos de gua, desencadeando o processo de ecloso dos

ovos depositados ali meses antes. Assim, as chuvas influenciam positivamente na

densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira, 1998).

O ciclo biolgico de Ae. aegypti compreende as seguintes fases: ovo, larva,

pupa e adulto (Figura 1). O ovo tem forma elptica com cor varivel, de marrom a

negra, e possui forma alongada e fusiforme. Seu desenvolvimento embrionrio

dura de 2 a 3 dias. A larva tem antenas cilndricas e curtas, cerdas antenais

curtas e simples. As cerdas ceflicas 5, 6, e 7 so simples. O trax tem espinhos

fortes e laterais no meso e metatorax. No oitavo segmento abdominal existem

espinhos, dispostos em uma fileira nica. O estgio larval tem o perodo entre 5 a

7 dias. A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratrias curtas e escuras.

Abdome tem a cerda n 1 do primeiro segmento com tufo de plos simples ou

bfida e cerda n 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos plos.

A palheta natatria tem plos curtos em sua borda. A fase de pupa tem o ciclo de

2 a 3 dias (Consoli e Oliveira, 1998).

Figura 1 Ciclo biolgico do Aedes aegypti (Fonte: FUNASA, 1998)

Ae. aegypti um pernilongo de colorao escura com faixas brancas no

trax, formando uma lira na parte superior (Figura 1). As pernas possuem anis

brancos e o macho se distingue da fmea pelas antenas, que so mais plumosas.

A fmea pica, preferencialmente, durante o dia e pe seus ovos, tanto em

criadouros naturais, como artificiais, de preferncia naqueles que contenham

gua limpa, pobre em sais e matria orgnica (FUNASA, 1998).

Os machos de Ae. aegypti so atrados pela freqncia vibratria do

batimento das asas da fmea da mesma espcie. Na superfcie interna da bomba

cibarial, em machos e fmeas de Ae. aegypti, encontram-se numerosas clulas

de funo supostamente quimioreceptora que as fmeas utilizam para avaliar as

caractersticas dos possveis locais para oviposio. (Clements, 1963).

Em laboratrio uma fmea pode viver at 2 meses. Em condies normais

uma fmea pode fazer 12 ou mais repastos sangneos em um ms o que de

grande importncia na transmisso da dengue e da febre amarela. Somente as

fmeas dos mosquitos so hematfagas. Os estiletes bucais so introduzidos na

pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes, aglutininas e

substncias eventualmente alergnicas, mas no h evidncias que contenham

enzimas digestivas. O volume de sangue ingerido varia conforme a espcie, em

Ae aegypti tem sido assinalado de 1,5 a 4,2 mm3 (Clements, 1963).

A digesto sangunea ocorre em 2 dias. Pouco aps a ingesto, forma-se

uma camada de material quitinoso, secretado pelas clulas do intestino, a

membrana peritrfica, que separa a superfcie interna do intestino e o sangue

ingerido. Se um segundo repasto sanguneo ocorre antes que o primeiro tenha

sido totalmente digerido, forma-se uma segunda membrana peritrfica

circundando a primeira e o novo sangue ingerido. A membrana peritrfica

permevel s enzimas proteolticas e aos produtos da digesto que so

absorvidos. Diferenas na formao da membrana peritrfica esto relacionadas

com diferenas na suscetibilidade de Ae. aegypti e Anopheles a microorganismos

patognicos para o homem (Consoli e Oliveira, 1998).

Um ou dois dias aps emergirem, os adultos se acasalam, sendo que as

fmeas fazem o repasto sangneo. Em relao ao acasalamento Ae. aegypti se

acasala em pequenos espaos durante o vo ou pousados sobre uma superfcie.

Embora as cpulas intraespecficas sejam a regra, cruzamentos interespecficos

podem ocorrer entre Ae. aegypti e Ae. albopictus. O acasalamento pode se dar

antes ou aps a ingesto do primeiro repasto sanguneo, mas freqentemente

anterior a este (Consoli e Oliveira, 1998).

A escolha do local para oviposio por parte das fmeas o principal fator

responsvel pela distribuio dos mosquitos nos criadouros e da maior

relevncia para a distribuio das espcies na natureza. Fatores fsicos, qumicos

e biolgicos, como a intensidade luminosa, comprimento da onda de luz refletida,

temperatura, grau de salinidade, presena de vegetais, microorganismos e

substncias diversas podem influenciar nessa seleo (Consoli e Oliveira, 1998).

A oviposio ocorre, em geral, em recipientes escuros ou sombreados,

com superfcies speras, preferindo gua limpa e cristalina, ao invs de gua

trbida ou muito poluda com matria orgnica. Em geral, a fmea distribui cada

postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).

O mosquito Ae. aegypti holometablico, ou seja, desenvolve-se atravs

de metamorfose completa. Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com

cada estdio e o tempo de desenvolvimento depende das condies da gua,

temperatura e da alimentao do mosquito em seus estgios iniciais (Consoli e

Oliveira, 1998).

Fase 1 - a do ovo, que para se desenvolver dependente da atividade

hematfaga da fmea em homens ou outros animais. Os ovos tm aspecto

alongado, simetria bilateral e so envolvidos por uma capa composta de 3

camadas: a fina membrana vitelina interna, que envolve o ncleo, o citoplasma e

o vitelo, o endocrio endurecido e grosso; e o exocrio fino e transparente que

constitui o envoltrio externo. O embrio depende da estrutura e propriedades da

casca para sua proteo mecnica, passagem de gases respiratrios e

resistncia perda de gua (Consoli e Oliveira, 1998).

Os ovos se desenvolvem em cerca de trs dias aps a cpula e so postos

isoladamente pela fmea, no havendo formao de nichos. Cada fmea pode

pr de 70 a 150 ovos. Alm disso, so bastante resistentes a perodos de seca e

baixas temperaturas, podendo resistir nessas condies at um ano depois de

postos pela fmea (Secretaria Estadual de Sade, 1998).

As fmeas fixam os ovos, individualmente, nas paredes internas dos

recipientes, na rea mida logo acima da superfcie da gua. Em geral, seu

desenvolvimento embrionrio demora 48 horas, quando o ambiente mido e

quente ou podem suportar longos perodos de dessecao dependendo das

condies ambientais. Em contato novamente com a gua a maioria dos ovos

eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vrias vezes para

eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).

Em geral, os ovos postos 1 a 2 mm prximos superfcie da gua eclodem

assim que completam o seu desenvolvimento embrionrio. Quando deixados fora

da gua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por

perodos mais longos. Aps um perodo de maturao inicial em ambiente mido

(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionrio, a resistncia

dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae.

aegypti (Secretaria Estadual de Sade, 1998).

Pesquisadores da Fundao Oswaldo Cruz descobriram que, 15 horas

depois de postos, os ovos do Ae. aegypti formam uma pelcula protetora com uma

camada transparente e impermevel, que os fazem resistentes a cloro e a

inseticidas. Assim que depositados, os ovos passam a absorver gua, aumentam

de volume, desenvolvem uma casca escura e rgida e tornam-se impermeveis,

adquirindo grande resistncia em ambientes pouco favorveis, onde no existe

gua. Dessa forma, por exemplo, podem sobreviver durante a poca seca do ano

e se desenvolver em larvas somente no incio do vero seguinte, com a chegada

de condies ambientais mais favorveis. Os ovos se tornam rgidos e escuros

em cerca de trs horas aps a postura. (Rezende et al., 2008). A ecloso larvria

auxiliada pelo atrito de um dente quitinoso situado dorsalmente na cabea da

larva de 1 estgio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos

movimentos pulsteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sade, 1998).

A fase 2 - a ecloso de larvas de 1 nstar ocorre a partir de dois a trs dias

at vrios meses aps a postura dos ovos, que eclodem quando em contato com

a gua. As larvas possuem sifo respiratrio, os espirculos se abrem na

extremidade desse rgo e posiciona-se em ngulo com a superfcie lquida. As

larvas so providas de grande mobilidade e tm como funo primria o

crescimento. As larvas se alimentam indistintamente do microplncton existente

nos seus habitats constitudo por algas, rotferos, bactrias, esporos de fungos ou

quaisquer partculas de matria orgnica. O movimento das escovas orais faz

com que a gua flua em direo cabea, trazendo as partculas de alimento

para a parte inicial do aparelho digestivo onde ser filtrada em uma proporo de

at 2 litros por dia. No selecionam alimentos, o que facilita a ao dos larvicidas,

bem como no toleram elevadas concentraes de matria orgnica na gua

(Consoli e Oliveira, 1998).

A durao da fase larval, em condies favorveis de temperatura (25 a

29 C) e de boa oferta de alimentos, de 5 a 10 dias, podendo se prolongar por

algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira, 1998).

As larvas passam por quatro estdios de desenvolvimento, sendo o ltimo

destes o mais prolongado. Os machos tm em mdia um desenvolvimento

larvrio mais rpido do que as fmeas (Consoli e Oliveira 1998). A durao

desses estgios depende da temperatura, da disponibilidade de alimentos e da

densidade larvria no recipiente. Em condies timas, o perodo entre a ecloso

do ovo e a pupao pode no exceder cinco dias, ou, em condies mais

adversas, com baixas temperaturas ou alimentao insuficiente, pode se estender

por vrias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).

As larvas nadam at a superfcie para respirar e descansar, utilizando,

alm das nadadeiras, o sifo respiratrio situado na extremidade do abdmen

para auxiliar o movimento em S caracterstico dessa etapa. A larva assume uma

posio vertical em relao ao nvel aqutico e apresenta fotofobia, reagindo

imediatamente presena da luz (Secretaria Estadual de Sade, 1998).

Embora aquticas, as larvas respiram sempre o oxignio do ar,

necessitando para isso chegar superfcie da gua aspirando o ar atravs do seu

sifo respiratrio. O tempo que as larvas suportam longe da superfcie da gua

varia com a espcie, idade e estado fisiolgico (Clements, 1963).

A presena de substncias oleosas na gua prejudicial s larvas por

dificultar ou impedir mecanicamente a sua respirao e por essa caracterstica

vrios tipos de leos minerais e vegetais combinados ou no com detergentes

foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do

sculo passado (Rosen, 1994).

A temperatura tima para o desenvolvimento larvrio situa-se entre 24 e

28C e Ae. aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma

luz como as galerias de gua ou de esgoto, preferindo entretanto colees de

gua com concentraes salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998).

Aps, aproximadamente, 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas.

So bastante mveis quando perturbadas, mas esto quase sempre paradas em

contato com a superfcie da gua. A pupa possui trombeta alongada, geralmente

de forma cilndrica e de abertura estreita, possui sifes na extremidade da cabea

e palhetas natatrias na extremidade abdominal. No se alimenta e movimenta-se

apenas por contraes. Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu

origem, mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergncia do

adulto. Esta fase dura de dois a trs dias (FUNASA, 2000).

O adulto, alm das caractersticas morfolgicas citadas anteriormente

apresenta uma tromba longa chamada probscida, que a fmea usa para sugar o

sangue necessrio maturao de seus ovos, e os machos a utilizam para se

alimentar do nctar das plantas. Essa fase tem durao de 30 a 35 dias. Ae.

aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa, parede, etc). Assim,

contabilizando a durao das diversas formas, a vida mdia de uma gerao de

Ae. aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas, desde a postura do ovo at o fim

da fase adulta (FUNASA, 2000).

Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem

participao crescente na transmisso da dengue Aedes albopictus, que

tambm se faz presente em outros Estados, como Minas Gerais e Esprito Santo.

Seu ciclo biolgico semelhante ao de Ae. aegypti, e exerce um papel de

fundamental importncia no mecanismo de transmisso da dengue (FUNASA,

2000) pois at hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a

participao de primatas e, ocasionalmente, do homem. Todos os quatro

sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na sia

enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na frica, o que refora o

conceito da origem asitica do vrus (Schatzmayr, 2008).

O Aedes albopictus uma espcie silvestre, que se adaptou aos

ambientes rurais, suburbanos e urbanos. muito menos relacionado ao homem

que o Ae. aegypti, pois se alimenta e faz oviposio no ambiente peridomiciliar,

sendo a sua disperso pelo vo maior que a de Ae. aegypti, em mdia 500

metros, adaptando-se melhor s regies frias, como o norte da sia, onde seus

ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).

Percentuais prximos de 1% de infestao domiciliar so considerados

suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue. Percentuais

prximos de 4% so considerados condio predisponente para epidemias, ou

surtos de febre amarela, caso haja importao para essa rea de casos alctones

originrios de reas de febre amarela silvestre (SES-RJ,1999).

Assim, permanece fortalecida a convico de que a eliminao do vetor ,

at o presente momento, a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a

dengue de uma regio ou de um pas.

2.2 - Caractersticas do vrus

O vrus causador da dengue do tipo RNA, da famlia Flaviviridae e do

gnero Flavivirus (Figura 2). Existem quatro sorotipos da dengue: DENV 1, 2, 3 e

4. Segundo Figueiredo e Fonseca (1996), o gnero Flavivirus compreende 60

vrus diferentes, entre os quais se destacam por sua importncia epidemiolgica o

vrus da dengue, da febre amarela, o vrus rocio e o vrus da encefalite de Saint

Louis (FUNASA, 2000).

O perodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos:

Intrnseco - o que se passa no homem. Comea um dia antes do

aparecimento dos sintomas e vai at o 6 dia da doena. Durante esse perodo, o

vrus est presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar.

Extrnseco - o que se d no mosquito. Os vrus ingeridos juntamente com

o sangue multiplicam-se nas glndulas salivares de 8 a 12 dias aps um repasto

de sangue infectado, os mosquitos se tornam infectantes, isto , capazes de

transmitir a doena e assim continuaro por toda a sua vida (FUNASA, 2000).

O vrus da dengue no se transmite de pessoa a pessoa, nem por qualquer

outro mecanismo que no seja atravs da picada dos mosquitos do gnero

Aedes, principalmente, de Ae. aegypti. Portanto, s possvel interromper o ciclo

da doena com o controle ou erradicao do mosquito transmissor (FUNASA,

2000).

Quando acontece a primo infeco por qualquer sorotipo, habitualmente o

paciente apresenta uma forma benigna da doena chamada de dengue clssica.

Quando ocorre a convivncia simultnea, ou seqencial, de dois ou mais

sorotipos de vrus e o paciente reinfectado por um sorotipo diferente do que o

infectou a primeira vez, particularmente pelo sorotipo 2, podem ocorrer formas

mais graves da doena, como a dengue hemorrgica, que tem maior potencial

de letalidade (FUNASA, 1998).

Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp. da dengue

Fonte: Silva Jnior, J.B. & Pimenta J.F.G. (2008)

Basicamente, o vrus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e

assim poder infectar os indivduos. O mosquito fmea, ao picar um indivduo

infectado, se contamina ao sugar seu sangue onde h vrus circulando. A partir

da, o vrus migra para as glndulas salivares da fmea e para seus ovos, caso j

tenham sido fecundados. A transmisso pode ocorrer a partir de dois

mecanismos: 1) a fmea contaminada pica um indivduo sadio para obter mais

sangue e sustentar seus ovos, contaminando ento a pessoa picada com o vrus

que est alojado nas glndulas salivares; ou 2) a fmea ao picar um indivduo

contaminado, transmite o vrus para os seus ovos fecundados (mecanismo

transovariano), contaminando a gerao seguinte cujas larvas eclodiro j

possuindo em seu interior, o vrus da dengue. Esse mecanismo de transmisso

tambm denominado de transmisso vertical (SES-RJ, 1999).

A Dengue transmitida por picada de mosquitos infectados. Assim, o

conhecimento acerca da interao entre o mosquito e o vrus pode revelar

elementos crticos para o controle desta doena. O perodo de incubao da

doena no homem, ou seja, o perodo entre a picada infectante e o aparecimento

de sintomas, pode variar de 3 a 15 dias, sendo, em mdia, de 5 a 6 dias e o

perodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver vrus no sangue (perodo

de viremia). Este perodo comea um dia antes do aparecimento dos sintomas e

vai at o 6 dia da doena (FUNASA, 2002).

Para infectar uma clula necessria a interao de protenas virais com

molculas presentes na superfcie celular que funcionam como receptores. No

caso do gnero Flavivirus, o papel de adeso e fuso desempenhado pela

protena E (Figura 2). No entanto, o receptor celular utilizado ainda no conhecido

(Martinez, 1999).

Diferentes linhagens de Ae. aegypti apresentam diferentes nveis de

susceptibilidade e refratariedade infeco. Um candidato a mediar esta

susceptibilidade/refratariedade, seria o sistema imune do vetor (Silva, 2008).

Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do

mosquito, possibilitando a infeco persistente e a transmisso do vrus. RNAi um mecanismo de defesa do

genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons, transgenese ou ainda durante a

replicao viral. Este mecanismo tem sido descrito nos ltimos anos em um grande nmero de modelos,

incluindo insetos. possvel que exista uma associao entre virulncia de diferentes cepas de dengue e sua

capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae. aegypti. Existe a hiptese de trabalho de

que populaes de insetos refratrios ao vrus provavelmente apresentam uma forte resposta celular

presena dos mesmos. Em contrapartida, o vrus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta

resposta celular. Assim, o ciclo do vrus no inseto e, consequentemente, o

comportamento cclico da endemia, pode estar relacionado s alteraes dos

mecanismos de escape do vrus s respostas celulares do inseto ou s alteraes

primrias dessas respostas celulares do inseto ou, at mesmo, a concomitncia

de ambos os mecanismos (Petretski et al., 2009).

A epidemia de dengue sorotipo 1 na Amrica do Sul comeou em 1978,

afetando inicialmente Venezuela, Colmbia e as Guianas. Cerca de 702 mil casos

foram reportados Organizao Pan Americana de Sade (OPAS), no perodo de

1977-1980, mas calcula-se, com base em dados da Colmbia e da Venezuela,

que mais de 5 milhes de pessoas se infectaram nesses anos. Essa mesma

amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente, para outros pases da Amrica

do Sul, chegando ao Brasil por Roraima em 1981/1982 e no Rio de Janeiro em

1986. Casos de dengue hemorrgica surgiram, quando da entrada posterior da

dengue sorotipo 2 em pases como Bolvia, Paraguai, Equador, Peru e Argentina

e, em 1990, no Brasil (Schatzmayr, 2008).

No Brasil, o primeiro registro da doena foi no Rio de Janeiro, em 1846,

citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar

provocada pelas mialgias e artralgias tpicas da dengue (Figueredo & Fonseca,

1996). A campanha de erradicao do Ae. aegypti, motivada pela epidemia de

febre amarela, comeou em 1903 com Emlio Ribas e Osvaldo Cruz e, em 1953, o

mosquito foi considerado erradicado do pas, sendo reintroduzido em 1967 e

eliminado em 1973. Reapareceu em 1976, na Bahia, em 1977, no Rio de Janeiro,

e, em Roraima, em 1981-1982. O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir

de 1986-1987, 1990-1991, comportando-se em progresso ascendente desde

1994. Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municpios infestados enquanto que no

ano de 2008 j totalizavam 4006 municpios com presena de A. aegypti

confirmada (Aguiar, 2009).

A incidncia da doena apresentou comportamento ascendente,

hiperendmico, em concordncia com a expanso do vetor, com variaes

cclicas, entretanto, dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes,

disponibilidade de populaes suscetveis, pluviosidade sazonal e outros fatores.

A incidncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares

das duas epidemias anteriores, de 1987, com 89.394 casos notificados e de 1991,

com 97.209 casos notificados, para 56.621 casos notificados em 1994. De 1995 a

1998 o nmero de casos notificados saiu de 128.619 para 528.000 at que em

2002 794.219 casos foram notificados, o que representou na poca um estado

hiperendmico2 de dengue em nvel nacional, sem precedentes na histria do

Brasil (FUNASA, 2008).

No Brasil, desde 1986 vm ocorrendo epidemias de dengue nos principais

centros urbanos do pas foram notificados cerca de 3 milhes de casos

(SESDEC-RJ/SVS/SVEA/CVE/DTI/SDTVZ 2008).

Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento

acentuado da incidncia de casos notificados nas regies Nordeste e Sudeste do

Brasil conforme a figura 3. Do total de 528.000 casos em 1998, o Nordeste

contribuiu com 259.574 casos e o Sudeste com 250.065 casos notificados.

Figura 3 - Notificaes de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte: PNCD,

2009)

A maioria dos casos de dengue notificados refere-se queles que procuram

algum servio mdico, implicando, em mdia, em 3 dias de afastamento do

trabalho. Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da

faixa etria produtiva, a maioria deles notificada exatamente por circunstncias

laborais (Figueiredo e Fonseca, 2006).

2- Hiperendmico a presena habitual da doena, porm com incidncia muito elevada.

O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou

respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1, com 50.000 e 96.000 casos

notificados (Figura 4). No inqurito sorolgico realizado no ano seguinte pelo

Ministrio da Sade, constatou-se a presena de um milho de pessoas

sensibilizadas para o sorotipo responsvel pela epidemia. Essa observao

permite deduzir que para cada caso de dengue notificado, provavelmente ocorram

outros nove casos assintomticos ou oligossintomticos, porm no notificados e,

conseqentemente, no contabilizados (Secretaria Estadual de Sade, 1998).

Figura 4 Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de

1986 a 2009 (SESDEC, 2009).

Esses ndices elevados de infestao esto ocorrendo em uma

comunidade que atualmente registra um altssimo percentual de pessoas com a

presena de anticorpos IgG e presena de clulas de memrias especficas para

vrus da dengue, concausa imprescindvel para eventos de dengue hemorrgica.

Segundo Martinez (1999), Guimares (1999) e Figueredo & Fonseca (1996), a

primoinfeco geralmente provoca a presena de clulas de memria por um

perodo mnimo de cinco anos, podendo significar que a populao

imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorrgica a soma da

populao primoinfectada nos ltimos cinco anos. De acordo com pesquisas

realizadas em Cuba e publicadas em 1999, acredita-se que a primoinfeco deixa

a memria imunolgica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas

(Martinez, 1999).

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008

Na Regio Sudeste, o Estado do Rio de Janeiro apresenta h mais tempo

a convivncia simultnea de dois sorotipos diferentes de vrus desde 1990, com

uma nica interrupo na simultaneidade dessa co-ocorrncia em 1997, sendo

retomada em 1998. No ano 2000 foi registrada a presena do sorotipo 3 pela

primeira vez na Baixada Fluminense, o que contribuiu para agravar o quadro

epidemiolgico do Estado (SES-RJ 2001).

Os primeiros casos de dengue hemorrgica no Estado do Rio de Janeiro

foram notificados no ano de 1990, devido a presena dos dois sorotipos diferentes

simultnea no mesmo perodo (FUNASA, 2000).

O Estado do Rio de Janeiro rene o maior nmero de variveis pr-

disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorrgica na Regio Sudeste,

caso no sejam revertidas essas condies, particularmente aquelas que dizem

respeito aos nveis de infestao domiciliar do mosquito. O Estado do Rio de

Janeiro composto de 92 municpios, dos quais 90 apresentavam no ano 2001

infestaes domiciliares confirmadas pela Fundao Nacional de Sade,

conforme boletim epidemiolgico oficial (FUNASA, 2001).

2.3 - Controle Qumico e Biolgico de Vetores de Doenas

2.3.1 - Controle de Aedes aegypti

As prticas para controle de insetos so muito antigas. H registro de seu

uso na China h mais de 2.000 anos. No final do sculo XIX, descobriu-se que

certas espcies de insetos e outros artrpodes eram responsveis pela

transmisso de algumas das mais importantes doenas. Vacinas ou

medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda no estavam disponveis e o

controle da transmisso era, todavia, fortemente centralizado no combate ao

vetor.

O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle, de acordo

com as condies ambientais e a dinmica populacional do vetor. O manejo

ambiental lana mo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos, ou, ainda,

para impedir o contato homem-vetor, como a eliminao de criadouros, a

drenagem e a instalao de telas em portas e janelas. So selecionados os

mtodos de controle apropriados e as populaes do vetor so mantidas em

nveis que no causam dano sade (Braga & Valle, 2007).

Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilncia,

reduo da fonte (ou manejo ambiental), controle biolgico, controle qumico com

uso de inseticidas e repelentes, armadilhas e manejo da resistncia a inseticidas.

O controle qumico, com inseticidas de origem orgnica ou inorgnica, uma das

metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de

vetores em Sade Pblica (Rose, 2001).

Desde o comeo do sculo XX, os agentes qumicos tm sido usados

para combater e controlar as populaes do mosquito Ae. aegypti. Durante as

primeiras campanhas, diferentes tipos de leos eram colocados em recipientes

com gua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que j

haviam eclodido. Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)

o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos pases, principalmente

do Brasil. No entanto, pases vizinhos ao Brasil no erradicaram o mosquito o que

resultou na reinvaso desse vetor em alguns estados brasileiros. Fato que

corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e conseqentemente

para o aparecimento de populaes de Ae. aegypti resistentes a este composto.

Observado a resistncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser

utilizado para o combate a este vetor. Porm, semelhante ao DDT, os inseticidas

organofosforados causaram o surgimento de populaes resistentes de Ae.

aegypti (Consoli et al., 1986).

O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por perodos

longos foi um dos mais importantes avanos no controle de insetos no sculo XX.

O primeiro inseticida de efeito prolongado, ou propriedade residual, foi o

diclorodifeniltricloroetano (DDT), um organoclorado desenvolvido em 1939, que,

quando aplicado em paredes e tetos de casas, permanecia ativo contra os insetos

por vrios meses (Rozendaal, 1997).

Inseticidas sintticos como os piretroides tm sido usados para o controle

dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados, como o temefs, esto

sendo usados para o controle da fase larval. Uma alternativa ao controle qumico

da fase larval est baseada na eliminao fsica dos criadouros e o uso de

bactrias entomopatognicos. Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido

usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos

(Lacey & Undeen, 1986).

Os inseticidas tm sido bastante usados na agricultura, agropecuria e na

sade pblica. Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaes

resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores. Resistncia tem

sido detectada para todas as classes de inseticidas, afetando direta e

profundamente a re-emergncia das doenas transmitidas por vetores (Brogdon

et al., 1998). Por esse motivo, a partir de 2009 est sendo introduzido o

diflubenzuron que um inibidor da sntese de quitina, nas atividades de controle

das larval de Ae. aegypti (PNCD, 2009).

A resistncia definida pela OMS como a habilidade de uma populao de

insetos tolerar uma dose de inseticida que, em condies normais, causaria sua

morte. A resistncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de

evoluo acelerada de uma populao que responde a uma intensa presso

seletiva, com a conseqente sobrevivncia dos indivduos que possuem alelos

que conferem resistncia. A resistncia pr-adaptativa, resultado de mutaes

(Braga & Valle, 2007).

Alm de provocar resistncia o uso indiscriminado dos inseticidas

clorados e organoclorados causa formao de resduos txicos a sade

humana (DAmato, 2002). Resistncia tem sido detectada para todas as classes

de inseticidas, afetando, a re-emergncia das doenas transmitidas por vetores

(Brogdon & McAllister 1998). Apesar dos importantes avanos alcanados no

desenvolvimento de mtodos alternativos, os inseticidas qumicos continuam

sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose,

2001). Nesse contexto, o monitoramento e o manejo da resistncia, assim como o

uso de substncias com modos de ao diferentes dos inseticidas qumicos

convencionais, so elementos de suma importncia em qualquer programa de

controle de vetores (Ferrari, 1996).

Os mecanismos que tm provocado a resistncia de insetos aos patgenos

incluem mudanas no comportamento, na cutcula, mudana no ciclo das clulas

do intestino mdio, reduo da afinidade de protenas no intestino mdio e

imunidade maturao. O desenvolvimento da resistncia aos patgenos, em

especial aos que no atuam por meio de uma toxina, dever ser de natureza

diferente da resistncia aos inseticidas qumicos e poder progredir mais

lentamente. Desse modo, populaes de insetos, caros e outros artrpodes,

naturalmente, apresentam uma proporo de indivduos que tenham alelos que

lhes confiram resistncia a um determinado produto qumico. Populaes

resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que

matam indivduos com alelos suscetveis e no matam aqueles que possuam

alelos resistentes. Assim, um pequeno nmero de indivduos possui

caractersticas que permitem sua sobrevivncia sob doses de inseticidas

normalmente letais. O prprio inseticida no produz uma mudana gentica; seu

uso continuado, entretanto, pode selecionar indivduos resistentes. Apesar dos

vrios estudos documentados sobre a resistncia, o nmero de mecanismos

envolvidos bastante pequeno e inclui diminuio da taxa de penetrao pela

cutcula, detoxificao metablica aumentada e diminuio da sensibilidade do

stio alvo. (Braga & Valle, 2007).

O manejo por ataque mltiplo envolve a utilizao de dois ou mais produtos

em rotao ou mistura. O princpio da rotao de produtos baseado no fato de

que a freqncia de resistncia a um produto (A) diminui quando produtos

alternativos (por ex. B e C) so utilizados (Georghiou, 1983; Tabashnik, 1989;

Roush, 1989). Sendo assim, para o sucesso da rotao h a necessidade de

assumir que existe custo adaptativo dos indivduos resistentes na ausncia da

presso de seleo e que no existe resistncia cruzada entre os componentes

da rotao. O princpio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que

os indivduos resistentes ao produto A sero controlados pelo produto B e vice-

versa. Porm existe a possibilidade de se encontrarem indivduos resistentes ao

produto A e B atravs da resistncia mltipla. Dentre as vrias condies para o

sucesso da mistura esto: baixa freqncia de resistncia, ausncia de

resistncia cruzada e persistncia biolgica semelhante para os dois compostos.

O surgimento de populaes resistentes tem ocasionado srios problemas para o

controle de mosquitos. Alterao na susceptibilidade tem sido detectada para

todas as classes de inseticidas, afetando diretamente a re-emergncia das

doenas transmitidas por vetores (Brogdon & McAllister, 1998). Apesar de

importantes avanos em metodologias alternativas, os inseticidas qumicos so

uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaro desempenhando papel

importante no controle integrado. Porm, eles possuem desvantagens, como o

custo elevado, riscos a sade humana e a organismos no alvo, bioacumulao e

desenvolvimento de resistncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud

Fonseca et al, 2009), pelo menos at a descoberta de mtodos alternativos

sustentveis que permitam um controle rpido e seguro de vetores. Com a alta

densidade e disperso de Ae. aegypti e Ae. albopictus, muitas vezes coexistindo,

em diversos estados brasileiros, faz-se necessrio, na vigilncia entomolgica, o

monitoramento de mudanas comportamentais que favoream o surgimento de

resistncia destes vetores, fornecendo informaes importantes na transmisso

de arboviroses, como a dengue e a febre amarela. Sobretudo, pensando em

contribuir efetivamente no controle destas espcies de Culicidae ( WHO 1990;

Braks et al. 2003).

Alm dos inseticidas qumicos propriamente ditos, outros produtos vm

sendo usados no controle de vetores. Eles pertencem, principalmente, aos grupos

dos inseticidas biolgicos e com isso foi dada grande importncia ao uso de

microrganismos biolgicos patognicos e virulentos contra populaes de

mosquitos vetores de doenas humanas. Isolados de fungos, bactrias e vrus

entomopatognicos apresentam baixa contaminao ao ambiente especificidade

aos organismos-alvo, baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente, e

ademais possibilita a auto-disperso (Giannini, 2001).

2.4 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sade Humana

Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e

hererogneos e so encontrados nos mais diversos nichos ecolgicos do planeta.

Excluindo-se os insetos, os fungos constituem um dos mais numerosos seres

vivos existentes (Esposito & Azevedo, 2004).

Os fungos so responsveis pela produo de importantes cidos

orgnicos, como o cido ctrico, pela produo de enzimas de interesse industrial

e de elevado valor econmico, destacando-se as celulases, lacases, xilanases,

pectinases e amilases, pelo controle biolgico de insetos-pragas da agricultura,

pelo controle de inmeras molstias que atacam plantas cultivadas e pela

produo de etanol. Mais ainda, so eles que tornam a vida no planeta mais

agradvel, pois sem os fungos no existiriam bebidas fermentadas como as

cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais

os fungos so os principais decompositores de celulose e lignina, os

componentes primrios da madeira (Esposito & Azevedo, 2004).

Fungos ligninolticos, como Phanerochaete chrysosporium, so capazes

degradar vrios poluentes, incluindo o DDT, diferentes PCbs, dioxina, lindane e

benzo[a]pireno (Bumpus et al., 1985). Degradam tambm plsticos

biodegradveis incluindo poliidroxibutirato. Com relao aos metais txicos,

fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e

radioativos, absorveriam esses metais e, por meio de translocao, os

concentrariam nos basidiocarpos, que, eventualmente, seriam colhidos e os

metais extrado e reutilizados, ou ainda, eliminados de maneira apropriada (Gray,

1998). Os fungos tm potencial de serem utilizados tambm na remoo de

corantes e na decomposio de matria orgnica em lagos e crregos de uso

humano.

2.5 - Fungos Entomopatognicos

Os fungos foram os primeiros agentes patognicos de insetos a serem

utilizados no controle de pragas. Em condies naturais a ocorrncia de fungos

entomopatognicos tem sido, no Brasil e em outros pases, um fator importante

para reduzir as populaes de pragas. Aproximadamente 80% das doenas de

insetos tm como agentes etiolgicos os fungos, pertencentes cerca de 90

gneros e mais de 700 espcies (Alves, 1998).

Os fungos entomopatognicos so mais empregados para o controle de

pragas agrcolas, o interesse no uso destes fungos para o controle de artrpodes

vetores de doenas tem sido crescente devido aumento de incidncia de

doenas, tais como a dengue, e pelos altos nveis de resistncia dos mosquitos

aos inseticidas atualmente disponveis no mercado (ffrench-Constant, 2005).

O uso de fungos entomopatognicos para o controle de larvas de mosquitos

tem sido tema de vrios estudos (Clark et al., 1968; Goettel, 1988; Alves et al.,

2002), porm somente um produto baseado na espcie Lagenidium giganteum foi

comercializado at agora (Laginex), embora fosse retirado em 1999 (Scholte et

al., 2004).

Pesquisas com o uso de fungos entomopatognicos para o controle dos

mosquitos transmissores da malria Anopheles gambiae e A. stephensi

demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram

patognicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al., 2003;

Blanford et al., 2005; Scholte et al., 2005). Scholte et al. (2007) mostrou que o

fungo M. anisopliae foi patognico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e

Ae. albopictus, vetores da dengue e da febre amarela. Recentes estudos

demonstraram que vrios isolados de M. anisopliae so virulentos contra adultos

de Ae. aegypti (Paula et al., 2008) com potencial para serem usados em

programas de controle desse vetor.

A grande variabilidade gentica desses entomopatgenos pode ser

considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de

insetos. Com tcnicas apropriadas de bioensaios possvel selecionar isolados

de fungos altamente virulentos, com caractersticas adequadas para serem

utilizados como inseticidas microbianos (Hajek & St. Leger 1994).

Essa caracterstica dos fungos tem despertado interesse crescente no

ambiente cientfico na utilizao dos fungos como agentes de controle microbiano.

Mais de 50% dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano

publicados no Brasil so sobre fungos entomopatognicos, sendo que 90% deles

foi desenvolvido nas duas ltimas dcadas (Alves, 1998).

As espcies que parasitam insetos esto presentes em todos os grupos

taxonmicos de fungos conhecidos. Esses parasitos apresentam, dois modos de

colonizao do hospedeiro: ectoparasitismo e endoparasitismo. Os ectoparasitas

provocam infeces superficiais no hospedeiro, crescendo sobre os tecidos do

inseto e penetrando-o, geralmente, por meio de uma estrutura especializada, o

haustrio, para obteno de alimento. Os fungos endoparasitas so aqueles que

crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracterstica de matar o hospedeiro

em poucas semanas ou dias (Alves, 1998).

M. anisopliae, conhecido anteriormente como anisopliae de

Entomophthora, distribudo habitando o solo. O primeiro uso de M. anisopliae

como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879, quando

Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gro

do trigo, austraca de Anisoplia. Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da

beterraba de acar. Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos, M.

anisopliae categorizado como um fungo verde do muscardine devido cor

verde das colnias em esporulao. M. anisopliae encontra-se naturalmente

sobre mais de 300 espcies de insetos das diferentes ordens (Alves, 1998).

M. anisopliae penetra nos insetos atravs da cutcula. Uma vez dentro do

inseto, o fungo produz uma extenso lateral das hifas que eventualmente

proliferam e consomem os tecidos dos rgos internos do inseto. O crescimento

das hifas continua at que o inseto esteja totalmente colonizado por miclios

(Cole, 2003)

Foram realizados estudos de toxicidade/patogenicidade em ratos

compreendendo estudos de toxicidade/patogenicidade pulmonar aguda, estudos

de toxicidade/patogenicidade aguda com aplicao intravenosa, toxicidade

dermatolgica e de irritao conjuntival em coelhos. Os estudos indicaram que M.

anisopliae incapaz de crescer em temperaturas acima de 35C. Os resultados

dos estudos de toxicidade/patogenicidade no mostraram nenhum efeito txico,

patognico ou adverso. Esses estudos demonstraram que os roedores

neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados

em quantidades elevadas. Os resultados do estudo do crescimento da

temperatura mostram em que o M. anisopliae no pode crescer em temperaturas

dos corpos dos mamferos e, conseqentemente, no crescem em rgos ou

tecidos humanos (Cole, 2003).

Embora M. anisopliae no seja infeccioso ou txico para mamferos, a

inalao dos esporos pode causar reaes alrgicas em indivduos sensveis

(Alves, 1998). A maioria dos produtos resultantes da transformao fngica

menos mutagnica do que os compostos originais, e no caso de poluentes em

geral, a transformao de compostos precursores txicos resulta em compostos

intermedirios mais polares, portanto, mais disponveis, e que sero facilmente

eliminados do ambiente. Como exemplo, os epxidos e as quinonas formados a

partir de hidrocarbonetos aromticos policclicos, so compostos muito instveis

que so fcil e rapidamente eliminados bitica e abioticamente (Silva e Espsito,

2004).

A ocorrncia desses fungos, em condies naturais, tanto enzotica como

epizooticamente, tem sido, aqui e em outros pases, um fator importante na

reduo das populaes de pragas (Alves, 1998).

2.6 - Utilizao de Fungos Entomopatognicos para o Controle de Vetores de

Doenas Humanas

Alm de causarem incmodo, sensao de repulsa, aflio, algumas

espcies de insetos so causadores de doenas que comprometem a sade

humana, o que agrava so os altos ndices de pessoas acometidas por essas

doenas e o elevado nvel de mortalidade entre a populao. A mosca flebtomo

transmite para o homem, atravs de sua picada, a doena leishimaniose (WHO,

1990). Estudos laboratoriais tm demonstrado que os fungos entomopatognicos

so virulentos a estas moscas (Reithinger et al., 1997).

A doena de Chagas, um dos mais graves problemas de sade pblica no

Brasil, tem como causa de infeco a presena do parasito Trypanosoma cruzzi

transmitido pelos insetos triatomideos. Os vetores mais importantes desta doena

so Triatoma infestans, T. brasilienses, Rhodnius prolixux e T. dimidiata, que tem

sido combatido com o uso de fungos entomopatognicos (Costa et al., 2003).

Mosquitos do gnero Culex so vetores da filariose humana, doena

endmica no nordeste do Brasil. A partir de 1970 vrios casos de resistncia

deste tem sido evidenciado neste mosquito como conseqncia do uso excessivo

de inseticidas qumicos (Consoli et al., 1986). Por esses motivos fungos

entomopatognicos como M. anisopliae e Lagenidium giganteum, e tambm

bactrias do gnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle

biolgico desses insetos.

Daoust & Roberts (1982) testaram o fungo M. anisopliae observando alta

virulncia para larvas de Culex pipiens, Ae. aegypti e Anopheles stephens. De

acordo com Riba et al., (1986), o segundo estgio de Ae. aegypti o de maior

resistncia infeco pelo fungo; porm, quando testado, o fungo Penicillium spp.

foi altamente patognico e virulento s larvas de Ae. aegypti.

Scholte et al., (2004a), observou em laboratrio que fmeas adultas de

Anopheles gambiae infectadas com M. anisopliae infectam o macho durante a

cpula. E que, possivelmente, o macho infectado dissemina o fungo para outras

fmeas. Scholte et al., (2005) testaram tecidos pretos, impregnado com o fungo

M. anisopliae suspensas em habitaes humanas na frica, e observaram a

reduo da populao de Anopheles.

Blanford et al., (2005) usando B. bassiana, infectou fmeas de Anopheles

stephensi, previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi, e constatou que

durante a infeco as fmeas param de se alimentar. Com isso,

conseqentemente, ocorre a reduo da transmisso do Plasmodium, o que

diminui a incidncia de malria na populao.

A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadmico um

maior interesse na busca de fungos entomopatognicos virulentos e que infecte

todos os estgios de desenvolvimento: ovo, larva e adultos de mosquitos vetores

de doenas humanas.

3 - OBJETIVOS

3.1 - Objetivo geral

Elaborar estratgias de aplicao de fungos entomopatognicos em

possveis criadouros do mosquito.

3.2 - Objetivos especficos

Determinar em condies de laboratrio a virulncia de isolados de fungos

entomopatognicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae. aegypti.

Avaliar a persistncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para

larvas de segundo e terceiro instar de Ae. aegypti em condies de semi-campo.

Avaliar o efeito da infeco fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de

Ae. aegypti.

4 - MATERIAL E MTODOS

O trabalho foi conduzido no Laboratrio de Entomologia e Fitopatologia

(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Campos dos

Goytacazes, Estado do Rio de Janeiro.

4.1 - Criao das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller

As larvas do mosquito Ae. aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no

insetrio do Laboratrio de Biotecnologia (CBB/UENF).

Para a criao, mosquitos machos e fmeas foram mantidos em uma

gaiola de plstico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento.

As fmeas foram nutridas com sangue de camundongo, o que propiciou a

maturao dos ovos.

Para oviposio, copos plsticos de volume de 100 mL, contendo papel-

filtro em seu interior como stio de oviposio e mantidos com 50 mL de gua,

foram colocados dentro da gaiola para que a fmea ovipositasse. O papel-filtro

contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x

20 cm) com gua estimulando a ecloso das larvas. As larvas foram alimentadas

com rao de camundongo no primeiro dia de ecloso.

A temperatura usada para criao foi de 25C, com Umidade Relativa (UR)

de 70 10 %.

4.2 Bioensaio 1: Teste de Virulncia larval

Foram testados dois isolados de B. bassiana e oito isolados de M. anisopliae

oriundos de diferentes regies do Brasil para selecionar aqueles com maior

virulncia. (Tabela1).

Tabela 1 Isolados de fungos entomopatognicos usados para virulncia contra

larvas de Ae. aegypti

Numerao Espcies Hospedeiro Origem Geogrfica

CG 24 B. bassiana Euschistus heros Fabr.

(Heteroptera: Pentatomidae)

Londrina, Parana

CG 494 B. bassiana

Dptera Rio do Pomba, Bahia,

CG 144 M. anisopliae Piezodorus guildinii

(Heteroptera: Pentatomidae)

Goiania, Goias

ESALQ 818 M. anisopliae Isolado de solo Piracicaba, So Paulo

LPP 96 M. anisopliae

Isolado de solo So Francisco de

Itabapoana, Rio de

Janeiro

LPP 137 M. anisopliae

Isolado de solo Campos, Rio de

Janeiro.

LPP 87 M. anisopliae

Isolado de solo Rondnia, Roraima

LPP 45 M. anisopliae Isolado de solo Rondnia, Roraima

LPP 128 M. anisopliae

Isolado de solo Rondnia, Roraima,

LPP 133 M. anisopliae Isolado de solo Montenegro, Roraima

Os isolados de M. anisopliae e B. bassiana foram obtidos da coleo do

CENARGEN (CG) em Braslia, ESALQ 818 em Piracicaba (So Paulo) e os

isolados denominados LPP, do LEF da Universidade Estadual do Norte

Fluminense. Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g;

peptona 2,5g; extrato de levedura 2,5g; agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias

para depois serem usados nos experimentos.

Isolados de M. anisopliae e B. bassiana foram testados contra larvas de

Ae. aegypti adicionando-se a suspenso de fungo em copos de plsticos

descartveis de 200 mL contendo 50 mL de gua e 10 larvas por copo. Foram

usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3

vezes. Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspenso de fungo com 1 x 108

condios ml-1 (Tween 80 0,05% em gua destilada) sendo a concentrao final de

5 x 105 condios ml-1. As larvas foram alimentadas com 0,5 g da rao animal a

cada copo no incio do experimento. Os copos foram mantidos em BOD em 25C;

UR de 70 10% e fotofase de 12:12 (L/E).

Os ensaios foram realizados com larvas de 2 e 3 instar e descartadas

aquelas que se transformaram em pupas.

Como tratamento controle foram usados cinco copos plsticos contendo

cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae. aegypti em cada copo aos

quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presena de condios para avaliao

da mortalidade natural, se possa aferir a presena de possveis variveis

intervenientes.

Em experimento preliminar condios in-ativados com radiao ultravioleta

por 10 minutos em cmara de fluxo foram usados nos controles para testar os

possveis efeitos fsicos dos condios suspensos na gua na sobrevivncia das

larvas. Um mL de suspenso desses condios de M. anisopliae na concentrao

de 108 condios/mL foi adicionado a cada frasco.

4.3 Preparo das Suspenses de Fungo para os Experimentos de Laboratrio e

de Semi-campo

Todo o processo da coleta de condios do fungo crescidos no arroz foi feito

em cmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com lcool 70% e 15

minutos de exposio UV. A quantificao dos condios foi feita em Cmara de

Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluio consecutiva usando

Tween 80 a 0,05% at a obteno da concentrao de 1x108 condios/mL-1,

suspenso padro usada nos testes. Os tratamentos controles foram feitos

somente com Tween 80 (TW) a 0,05%.

Tambm foram feitos testes usando gros de arroz com condios do fungo

aderidos; Neste caso o tratamento controle foi feito com gros de arroz sem

condios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o

C).

As suspenses do fungo foram preparadas com Tween 80 (0,05%) em

gua destilada estril. Os condios dos isolados dos fungos foram coletados das

placas de cultivo utilizando-se uma ala de platina esterilizada para serem

utilizados como fonte dos inculos. A concentrao de condios foi avaliada por

contagem na cmara de Neubawer. O Tween atua como um dispersante

diminuindo a hidrofobicidade dos condios. Essa suspenso estoque foi preparada

uma concentrao de 109 condios/mL, e diluda e agitada em Vortex de modo a

obter-se uma concentrao final de 108 condios/mL no dia de sua utilizao nos

experimentos

4.4 Bioensaio 2: Persistncia da virulncia da Suspenso do Fungo ESALQ 818

em gua.

Para verificar a persistncia do fungo na gua, 1 mL da suspenso ESALQ

818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plstico com 50 mL de gua

destilada. O copo foi armazenado em BOD a 25C; UR 70 10%; fotofase de

12:12 (L/E) nos perodos de tempo: zero, 3, 5 e 10 dias. Completados os dias de

armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante

os prximos 8 dias. O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 0,05%.

Utilizou-se 3 repeties de 1 copo plstico com 10 larvas 2 e 3 instar de

Ae. aegypti.

4.5 Bioensaio 3: Infeco das Larvas com condios aderidos ao Arroz

Foram utilizados os condios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas

de Petri contendo meio slido SDA (Dextrose 10g; Peptona 2,5g; Extrato de

levedura 2,5g; gar 20g e gua destilada 1L), por duas semanas, a 27o C, em

cmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador.

Para a produo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL

contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de gua destilada como meio de

cultura, autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C).

Aps a autoclavagem os condios foram adicionados ao meio com o auxlio

de uma colher estril. Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os

condios entre os gros de arroz.

Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cmera

climatizada a 27 oC.

4.6 Persistncia da virulncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gro de Arroz.

Para a determinao da persistncia da virulncia do fungo crescidos e

aderidos nos gros de arroz, foram usados copos plstico com 50 mL de gua e

adicionados 1 gro de arroz contendo condios do isolado ESALQ 818, com

concentrao final de 59 x104 . O tratamento controle foi feito com 1 gro de arroz

autoclavado sem fungo.

4.7 Virulncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gro de Arroz em Condies

de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti

Este trabalho foi conduzido na varanda do insetrio do Laboratrio de

Entomologia e Fitopatologia (LEF), da Universidade Estadual do Norte

Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes, RJ. Os testes ficaram protegidos

contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha.

Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste

para verificar a virulncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gros de arroz contra

larvas de Ae. aegypti (linhagem Rockefeller). Dentro de cada balde foi 1 L de

gua e 50 larvas do 2 e 3 instar de Ae. aegypti. Foram adicionados 10 ou 20

gros de arroz em cada balde.

A concentrao final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gros

arroz foi 2,9 x 105. A concentrao final do isolado ESALQ 818 nos baldes

contendo 20 gros arroz foi 5,9 x 105.

4.8 Persistncia da virulncia do Fungo Crescido e Aderido em Gros de Arroz

Foi usado o mesmo procedimento do item 4.7, porm somente 20 gros de

arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de gua e

deixados em condies de semi-campo. Foram realizados trs testes com

diferentes perodos de tempo de inoculao do fungo na gua: Tempo zero, 5, 10

e 20 dias. Completados os dias de inoculao do fungo na gua, as larvas foram

colocadas ento iniciando a avaliao da mortalidade.

4.9 Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes

aegypti

Vinte gros de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes

contendo 1L de gua e 50 larvas do 2 e 3 instar de Ae. aegypti. Durante 14 dias

foi avaliada a mortalidade das larvas e tambm coletada e quantificada o nmero

de pupas que emergiram durante o teste. Estas pupas foram colocadas em copos

plsticos com 100 mL de gua. Os copos com as pupas ficaram dentro de uma

gaiola coberta com tecido de organza at a ecloso dos mosquitos adultos que

foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possvel mortalidade

decorrente da exposio das larvas ao fungo. Os mosquitos adultos foram

alimentados com uma soluo de sacarose (10%). Os mosquitos mortos foram

submersos em lcool 70% por 30 segundos, depois colocados dentro de uma

cmara mida por 10 dias para observar a ocorrncia do processo de

conidiognese, com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela

infeco do fungo.

Em todos os testes feitos em condies de semi-campo foram montados 3

baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle.

O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa

virulncia, foi submetido sucessivas passagens por larvas de Ae. aegypti e

melhorou sua eficincia diminuindo a taxa de sobrevivncia larval.

A concentrao final do isolado ESALQ 818 (20 gros arroz) inoculado em

1000 mL de gua foi de 5,9 x105 condios. A concentrao final do isolado LPP

133 (20 gros arroz) inoculado em 1000 mL de gua foi de 6,5 x 105 condios.

4.10 Virulncia em Condies de Laboratrio do Isolado ESALQ 818 Contra

Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo

Armadilhas