Metodologías para la determinación estructural de f ármacos y el estudio de fenómenos de reconocimiento molecular

Programa de doctorado en Química Médica

Estructura 3D de carbohidratos

Virus

Bacteria

GlicoproteinaCelula

Reconocimiento molecular y carbohidratos

Hormona

Enzima Anticuerpo

Toxina

Lectina

Orientación entre ellos dada por los

ángulos dihedros f, y (w) alrededor del

enlace glicosílico, distancias de átomos…

Conformaciones del ciclo (sillas)

La conformación de los carbohidratos

bote

semisilla

silla

Bote torcido

semisilla

· ·

Q

φ

θ

equator

pole

O 210º1S3

O270º

1S5

4C11C4

OO

θ = 0º

2SOBote torcido

O

O

OO

O

O

O

O O

O

O

O

φ = 0º

θ = 0ºθ = 90ºθ = 180º

30º

60º

90º

120º

150º

180º210º

240º

270º

300º

330º

OO

O

30º3S1

O 90º5S1

O

330ºOS2

θ = 180º

O

θ = 90º

Efectos anoméricos

O

H

OR. .

O

CH

OR-. .

+

Efecto anomérico

Efecto exo-anomérico. .

R

H1

C2O5

exo-antiexo

RH1

C2O5

no-exo

R

H1

C2O5

O

O

R

C2

O5 O

OR

O

O

R

Efecto exo-anomérico

Análisis conformacional de carbohidratos

Torsiones Glicosídicas φ, y Ψ

OH

OH

OH

OO OHO

HO

OH

OMeOH

φ ψ

-180-120-60 0 60 120180

φ

ψψ ψψ

-180-120-60 0 60 120 180-180

-120

-60

0

60

120

180

-180

-120

-60

0

60

120

180

φφφφMapa probabilidad

φφφφ-180

-120

-60

0

60

120

180

ψψ ψψ

-180

-120

-60

0

60

120

180-180-120-60 0 60 120180

φ

ψψ ψψ

-180-120-60 0 60 120180-180

-120

-60

0

60

120

180

-180

-120

-60

0

60

120

180

φφφφ120-180-120-60 0 60 180

180120600-60-120-180

Mapa rígido Mapa relajado

Torsión ω del grupo hidroximetilo

HHH

H

H

0.9 10.7 5.0

O

OR

HO

HO

HO H

ωωωωO

OR

HO

HO

HO H

ωωωωO

O

HO

HO

HO H

ωωωω

H6S

6R

6S

H6R

6SH6R

OOO

R

O -H

OO -H

H-

H5,H6R3J

gg (ω ≅−60º) gt (ω ≅ 60º) tg (ω ≅180º)

0.9 10.7 5.0

2.8 3.1 10.7

H5,H6R

H5,H6SJ3

Torsiones de los hidroxilos secundarios

O R

OH

OO

OH

OH

OH

RO

H

H

OO

HO

O

H

O

Oc r

Mecánica y Dinámica Molecular con MM3*

mapa de

16 configuraciones iniciales mapa adiabático

16 mapasrelajados

gtggccgtggcrgtggrcgtggrr

tgggcctgggcrtgggrctgggrr

gtgtccgtgtcrgtgtrcgtgtrr

tggtcctggtcrtggtrctggtrr

6400 estructuras

Constante Dieléctrica: 1, 80

Modelo de disolvente H2O, GB/SA

Simulaciones de MD

mapa de probabilidad6400 estructuras

Rayos-X

Desplazamientos químicos

Pocos cristalizan bien y pocas estructuras se han

resuelto

Se pierde la información dinámica

Técnicas para obtener datos experimentales

RMN

Desplazamientos químicos

Cosntantes de acoplamiento escalar (J)

NOEs

Residual dipolar couplings RDC

Relajación cruzada

Espectros 1D

Experimentos J-resueltos: HSQC

oriented

H1-C1 Gal

ppm (f1)4.004.104.204.304.404.504.604.704.80

H1-C1 Glcββββ

90.0

95.0

100.0

1D - tracest2 coupled HSQC

O

O

O

HO

HO

OHOH

OH

OHOH

OH

13C

t1 coupled CT-CE-HSQC

orientedD2O

D2Oppm (f1)

4.404.504.604.704.80

ppm (f2)4.505.00

90.0

95.0

100.0

ppm (f1)

ppm (f2)4.505.00

ppm (f1)

ppm (f1)5.005.105.205.305.40

Gal 1

Glc 1ββββGlc 1ααααH1-C1 Glcαααα

orientedD2O

1H

13C

1HTolman et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1416-1424

Aproximación basada en pares de spines aislados (ISPA)

Experimentos:

•COSY, TOCSY, HSQC

•NOESY, ROESY

O

HOHO

HO

OH

OO

OHHO

HH H

OH

OH

Distancia fija Depende de φ/ψφ/ψφ/ψφ/ψ

NOE H1’-H4

NOE H1’-H3’=

r-6H1’-H4

r-6H1’-H3’

H1’ H4 H3’

O

HOHO

HO

OH

OO

OHHO

HH H

OH

OH

NOE H1’-H3’ NOE H1’-H3’0 250 500 750 1000 1250 1500

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

NO

E(%

)

Aproximación basada en un par de spines aislado (ISPA)

0 250 500 750 1000 1250 1500

mixing time (ms)

f(t)= P0 (1-eP2t) (1-eP1t)

M (0)= P0*P1

M H1’-H4

M H1’-H3’=

r-6H1’-H4

r-6H1’-H3’

εεεε =1

εεεε =80

MM3*

zz

ψ ψ

2'2'--44

-180 -120 -60 0 60 120 180

0

60

120

180

0

60

120

180

φ

180120600-60-120-180

0

60

120

180

0

60

120

180

ψ

0

ψ

-180-120-60 0 60 120 180φ

ψ

-180

-120

-60

0

60

120

180

-180

-120

-60

0

60

120

180

-180

-120

-60

0

60

120

180

-180

-120

-60

0

60

120

180

-180-120 -60 0 60 120 180

-180-120-60 0 60 120 180 -180 -120 -60 0 60 120 180

ψ

1’

4

1’3

SYN φ /ψφ /ψφ /ψφ /ψ : 60º / 0º

1'1'--44 εεεε =80

H2O

zz

ψ

2'2'--44

1'1'--33-180 -120 -60 0 60 120 180

-180

-120

-60

0

-180

-120

-60

0

60-180-120 -60 0 120 180φ

-180

-120

-60

0

60

120

180

ψ

-180

-120

-60

0

60

120

180

ψ

-180

-120

-60

0

60

120

180

φ-180-120 -60 0 60 120 180

-180-120 -60 0 60 120 180

φφ120-180-120 -60 0 60 180

-180

-120

-60

0

-180

-120

-60

0ψ

-180

-120

-60

0

60

120

180-180-120 -60 0 60 120 180

ANTI φ /ψφ /ψφ /ψφ /ψ : 60º / 180º

G-G φ /ψφ /ψφ /ψφ /ψ : 180º / 0º

2’

4

1'1'--44

Consecuencias de la flexibilidad de oligosacáridos

H H

A BNOE AB = f (r -6

AB )

H H

A B

NOE AB = f ( <r -6AB> )

rAB

A B

H H

Proceso de intercambio Conformación “virtual” de alta energía

RO

OHNH2O

O

R

H2N

OH

OH

HH

H2.7-3.0 A

2.5 A

φ/ψ 0/φ/ψ 0/φ/ψ 0/φ/ψ 0/−−−−60606060

E (Kcal/mol)

Conformación “virtual”

de alta energía

-150-100

-500

50100

150 -180

-120

-60

0

60

120

180

250

300

350

d14=2.3A

d15=2.5A

E (Kcal/mol)

17%

83%

Simulación de NOE: programa NOEPROM

• NOE estacionario, 2D NOESY y 2D ROESY

• Equilibrio conformacional

• Simulación simultánea de toda la red de protones

• Flexibilidad: modelos dinámicos

Características:

DistanciasDistanciasmodelo/smodelo/s

Matriz de Matriz de relajaciónrelajación

Intensidades NOEIntensidades NOE

180120600-60-120-180

O H

O H O H

O

OO

H OH O

O H

O Me

O H

φφφφ ψψψψ1

Gal Glc

Simulación de NOE: programa NOEPROM

φφφφ120-180-120 -60 0 60 180

-180

-120

-60

0

60

120

180

-180

-120

-60

0

60

120

180

ψψ ψψ% NOE% NOE

Intensidad NOE ( % )

Gal

OH

OH OH

OO

OH OH O

OH

OMe

OH

Glc

1’2’

3’

4’

5’

6’

4

1

2

3

5

6

1

Comparación con los datos de RMN

Intensidad NOE ( % )Pareja deprotones

EXP.EXP.500MHz500MHz

MM3-1 MM3-80 MM3-H 2O MM3-80MD

MM3-H 2OMD

AM1

H-1’/H-2’ 6.5 6.4 6.6 6.5 6.6 6.7 5.7H-1’/H-3’ 9.1 8.4 7.6 8.0 8.2 7.7 8.0H-1’/H-4’ -2.3 -1.8 -1.7 -1.8 -1.7 -1.8 -1.5H-1’/H-5’ 10.0 10.9 11.2 10.8 10.9 11.0 8.0H-1’/H-3 3.53.5 0.2 1.51.5 0.0 -0.2 1.11.1 9.29.2H-1’/H-4 12.712.7 17.0 15.215.2 17.8 17.8 12.912.9 10.710.7H-1’/H-5 -- -0.1 0.0 -0.1 -0.3 -0.1 1.9H-1’/H-6R 1.0 0.5 0.8 1.3 -0.4 0.3 1.6H-1’/H-6S 1.0 0.2 1.9 -0.2 1.0 2.0 0.5

Resumen de la determinación estructural en disolución con RMN

NOE Desplazamientos(proteinas)Estructura localizada

de ~1.8 a 4.5 Å

HN, Hα y CαCorrelacionados con estructura

secundaria

Restricciones

de distancia

Restricciones de desplazamiento

1 - 3 enlaces

Acoplamientos

1.8 < dOH < 2.0 Å

Enlaces de H

O

HN

2.7 < d < 3.0 Å

Corr. cruzada

ΓΓΓΓIM,IS

csa,d

d

S

I

Residual dipolar couplings (RDC)

Estructuras con largas distancias

Orientación de un fragmento “rigido” En relación al campo magnético

1 - 3 enlaces

Sin límite de distancia entre fragmentos

Estructura localizada Estructura con larga distancia

Restricciones de ángulos

Restricciones de distancia

O2.7 < dON < 3.0 Å

Restricciones de ángulos

2 - 3 enlaces M

En RMN de líquidos se promedia a 0Aunque se observa como NOE

Acoplamientos dipolares ∝∝∝∝ < 3 cos2 θ θ θ θ –1 1 1 1 >>>> / / / / < < < < r 3333 >>>>B

0

θθθθ

Acoplamientos dipolares

En sólidos estáticos causa desdoblamiento

En sólidos con MAS (Magic spinning angle) se promedia a 0

Or

H

C

Alineamiento al azar Cristal líquido

Bo Bo

DMPC DHPC+

Bicela

Acoplamientos residuales dipolares (RDC)

H O

OH

O

H O

O H

Reordenamiento isotrópicoNo RDC

Reorientación anisotrópicaRDC

Típicos medios

Bicelas DMPC : DHPC

Bicelas CHAPSO:DMPC

CPCl : Hexanol : Brine

Fagos de bacterias

Suspensión de V2O5…..…..

H O

OH

O

H O

O H

acoplamiento: J (escalar) desdoblamiento: J + D