UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

E.A.P. MICROBIOLOGA Y

PARASITOLOGA

ANLISIS BIOINFORMTICO

SECUENCIAS NUCLEOTDICAS

CURSO:

Biologa Molecular

PROFESORA:

ALUMNOS:

Mg. Giovanna Sotil

Garro Salvador Natalia Ximena

Villegas Coblentz Julio Cesar

Gonzales Dahua Jean Patrick

Llanos Rosales Carlos Daniel

Ramirez Montano Luis Fernando

Sullca Sulca Franklin Alberto

INTRODUCCIN

El uso de la informtica (en especial la internet) ha permitido el avance acelerado de

muchas ramas de la ciencia, en particular la Biologa, durante estos ltimos aos. De

este modo, muchas empresas y/o organizaciones han hecho uso de esta gran

herramienta. Entre los diferentes modos de usos, en el presente trabajo hablaremos

en especial sobre el uso de base de datos bioinformticos, las que como su mismo

nombre dice almacena informacin de las diversas especies del mundo.

Lo que ms agrada de estas base s de datos, es que la gran mayora son libres, es

decir, donde quiera y a la hora que se desea, se puede buscar informacin gratis de

muchas especies, as como secuencias nucleotdicas y proteicas presentes en las

diversas especies de seres vivos y/o virus (algunos son de paga, pero al menos lo que

haremos en esta prctica es gratis).

Algunas base de datos son especializados en secuencias proteicas (como ProtParam

Tool o Protein Data Bank), otras almacenas artculos de diversas revistas, secuencias

de genes especficos y sus estudios consecuentes, estudios taxonmicos de diversas

especies, todo en conjunto (como NCBI), o algunos que permite observar la estructura

tridimensional de algunas protenas (como Protein Data Bank, con ayuda de la

herramienta Java).

En particular usaremos programas como CLUSTAL W2 (en la misma pgina web),

BioEdit, BLAST (tambin en la misma pgina web). Estos son programas que funcionan

como base de datos las cuales, en este caso, nos ayudar a predecir a qu secuencia

de nucletidos completa se parece en lo mayor posible una fraccin de nucletidos

dado.

Adems de predecir, tambin podemos editar dichas secuencias completas en los

formatos y colores que ms deseamos (por ejemplo, con el programa BioEdit).

OBJETIVOS

Aprender a usar las diferentes bases de datos informticos que se puede

disponer en la internet.

Determinar a qu especie pertenece (o al menos ms parece) la secuencia

dada por la profesora, con el uso de la base de datos BLAST.

Analizar con el uso del CLUSTAL W2 la mejor manera de distribuir los genes

seleccionados, de tal manera que tenga la mayor interseccin posible (el

mayor parecido) entre ellos.

Editar las secuencias mltiples con el objetivo que sean lo ms comprensibles

posibles segn lo que se desea explicar

MARCO TERICO

National Center for Biotechnology Information - NCBI

El Centro Nacional para la Informacin Biotecnolgica o National Center for

Biotechnology Information (NCBI) es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de

Estados Unidos (National Library of Medicine), una rama de los Institutos Nacionales

de Salud (National Institutes of Health o NIH). Tiene la misin de ser una importante

fuente de informacin de biologa molecular. Almacena y constantemente actualiza la

informacin referente a secuencias genmicas en GenBank, un ndice de artculos

cientficos referentes a biomedicina, biotecnologa, bioqumica, gentica y genmica

en PubMed, una recopilacin de enfermedades genticas humanas en OMIM, adems

de otros datos biotecnolgicos de relevancia en diversas bases de datos.

Todas las bases de datos del NCBI estn disponibles en lnea de manera gratuita .

El NCBI ofrece adems algunas herramientas bioinformticas para el anlisis de

secuencias de ADN, ARN y protenas, siendo BLAST una de las ms usadas.

NCBI alberga genoma secuenciado en GenBank, y un ndice de los artculos

biomdicos de investigacin en PubMed Central y PubMed, as como otra informacin

relevante a la biotecnologa.

El NCBI es dirigido por David Lipman, uno de los autores originales del programa de

alineacin de secuencias BLAST y una figura extensamente respetada en

bioinformtica.

Basic Local Alignment Search Tool BLAST

BLAST es un programa informtico de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea

de ADN, ARN o de protenas. El programa es capaz de comparar una secuencia

problema (tambin denominada en la literatura secuencia query) contra una gran

cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos. El algoritmo

encuentra las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la

secuencia problema. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurstico

por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solucin correcta. Sin

embargo, BLAST es capaz de calcular la significacin de sus resultados, por lo que nos

provee de un parmetro para juzgar los resultados que se obtienen.

Normalmente el BLAST es usado para encontrar probables genes homlogos. Por lo

general, cuando una nueva secuencia es obtenida, se usa el BLAST para compararla

con otras secuencias que han sido previamente caracterizadas, para as poder inferir

su funcin.

La aplicacin local de BLAST tiene la ventaja de que permite manejar varios

parmetros que en las bsquedas de NCBI estn estandarizados, por lo que provee

una mayor flexibilidad para los usuarios avanzados.

Algoritmo del BLAST

BLAST usa el algoritmo Smith-Waterman para realizar sus alineamientos . BLAST usa

una matriz de sustitucin de aminocidos o nucletidos para calificar sus

alineamientos. Dicha matriz contiene la puntuacin (tambin llamada score) que se le

da al alinear un nucletido o un aminocido X de la secuencia A con otro aminocido

Y de la secuencia B. Las matrices ms usadas para calificar alineamientos de protenas

son la BLOSUM y la PAM (ambas fueron obtenidas midiendo la frecuencia de los

aminocidos en una gran muestra de protenas). Tambin se permite al usuario

definir su propia matriz. El tipo de matriz usada es determinante para los resultados

que se obtendrn, el uso de una matriz incorrecta puede llevar a calificar

errneamente los alineamientos y por lo tanto obtener resultados equivocados.

El algoritmo de BLAST tiene tres etapas princ ipales: ensemillado, extensin y

evaluacin. A continuacin se describen brevemente cada una de ellas:

o Primera etapa: ensemillado o seeding.

En esta etapa se buscan "palabras" pequeas en las secu encias de la base de datos,

que corresponden a fragmentos de la secuencia problema. BLAST asume que los

alineamientos significativos deben contener estas palabras. Slo se consideran

significativas las palabras que tengan una puntuacin mayor a T (T es un parmetro

que se pueda modificar al usar el programa) y que se encuentren al menos a una

distancia A de otra palabra. W es otro parmetro usado por BLAST y se refiere al

tamao de las palabras a buscar. Ajustando los parmetros T, A y W se puede escoger

entre hacer un alineamiento sensible pero lento, o uno ms rpido pero con menor

sensibilidad.

o Segunda etapa: extensin.

Una vez obtenidas las palabras que cumplen con los criterios dados, se pasa a la etapa

de extensin. En esta etapa el alineamiento se va extendiendo a ambos lados de las

palabras. La extensin realizada en este punto se realiza haciendo uso del algoritmo

de Smith-Waterman. BLAST va extendiendo el alineamiento hasta que la puntuacin

del alineamiento descienda X o ms puntos con respecto a la puntuacin ms alta

obtenida anteriormente. Aqu reside el factor heurstico del BLAST, ya que al imponer

el lmite X, evita extender a lo largo de toda la secuencia todos los alineamientos

(proceso que llevara demasiado tiempo). El peligro que esto conlleva es que el

programa se puede quedar atorado en un mximo local. Es por ello que la definicin

de X es determinante para el resultado.

o Tercera etapa: evaluacin

Una vez terminada la extensin de todas las palabras, cada uno de los alineamientos

realizados es evaluado para determinar su significacin estadstica. Para ello, el

programa elimina los alineamientos inconsistentes (alineamientos que junten la

misma parte de la secuencia problema con distintas partes de una secuencia en la

base de datos). Los alineamientos resultantes son llamados pares de alta puntuacin

(High Score Pairs o HSPs, por sus siglas en ingls). Una vez realizado esto, se calcula la

puntuacin final de los alineamientos resultantes y se determina su significacin

tomando en cuenta la probabilidad que tiene dicho alineamiento de haber sido

obtenido por azar de acuerdo al tamao de la base de datos. Al final se reportan slo

los alineamientos que hayan obtenido una probabilidad menor a E. El parmetro E es

conocido como e -valor (e-value) de corte, y nos permite definir qu alineamientos

queremos obtener de acuerdo a su significacin est adstica. Cuanto menor sea el

valor de E, ms significativo es un alineamiento.

Programas de la familia BLAST

Blastn: Compara una secuencia de nucletidos contra una base de datos qu e

contenga tambin secuencias nucleotdicas.

Blastp: Compara una secuencia de aminocidos contra una base de datos del mismo

tipo. Usualmente usa la matriz de sustitucin BLOSUM o PAM para realizar los

alineamientos, aunque puede usar una matriz definida por el usuario.

BlastX: Este programa usa como entrada una secuencia de nuclotidos. Traduce la

secuencia en sus seis posibles marcos de lectura (tres marcos de lecturas por

hebra) y compara estas secuencias traducidas contra una base de datos de

protenas. Se usa cuando se tiene sospecha de que la secuencia de entrada

codifica para una protena pero no se sabe exactamente cul es su producto.

TBlastn: Compara una secuencia proteica con una base de datos de nuclotidos. Para

realizar esto traduce todas las secuencias de nucletidos en sus seis marcos

de lectura. Se usa cuando se tiene una protena, y el anlisis con Blastp no

ha sido exitoso. Se debe tener cuidado con los resultados de este Blast,

porque una buena cantidad de las secuencias traducidas no son protenas

que existan en la naturaleza.

TBlastX: Es la combinacin del TBlastn con el BlastX. Compara una secuencia de

nucletidos contra una base de datos de nucletidos, pero primero traduce

tanto la secuencia problema como la base de datos a protenas, usando los

seis marcos de lectura posibles. La mayora de los servidores pblicos no

aceptan usar esta opcin en combinacin con las bases de mayor tamao

debido a que la bsqueda es muy intensiva computacionalmente.

Bl2seq: Es un blast que compara dos secuencias entre ellas, en vez de comparar una

secuencia con una base de datos. Al usar el mismo algoritmo de BLAST, este

programa no es recomendable pa ra secuencias donde las regiones de

similitud estn muy separadas.

CLUSTAL

Clustal es un programa de computadora utilizado para realizar alineamientos

mltiples de secuencias.

ClustalW: interfaz de lnea de comandos

ClustalX: esta versin tiene una interfaz grfica. Est disponible para

Unix/Linux, Mac OS y Windows.

Este programa acepta un amplio rango de formatos de entrada. Incluyendo NBRF/PIR,

FASTA, EMBL/Swissprot, Clustal, GCC/MSF, GCG9 RSF y GDE.

El formato de salida puede ser alguno de los siguientes: Clustal, NBRF/ PIR, GCG/MSF,

PHYLIP, GDE, NEXUS

BIOEDIT

En funcin de la complejidad y de la importancia de un buen alineamiento es

recomendable el uso de un editor de secuencias. Uno de los editores ms eficientes

disponibles gratuitamente en la web es Bioedit desarrollado por Ha ll (1999) para la

plataforma de Windows conteniendo funciones bsicas para la edicin, alineamiento,

manipulacin y anlisis de secuencias nucleotdicas y de protenas. Bioedit no es un

poderoso programa de anlisis de secuencias pero ofrece muchas rpida s y fciles

funciones para la edicin de las mismas. La longitud de las secuencias as como si

nmero es limitada solo por la memoria disponible por el sistema del usuario.

Este programa puede importar archivos directamente desde el formato BioEdit,

Genbank, Fasta, NBRF/PIR, Phylip, as como el formato ABI obtenido directamente de

los secuenciadores automticos.

ALINEAMIENTO MLTIPLE DE SECUENCIAS - MSA

Un alineamiento mltiple de secuencias (MSA, por sus siglas en ingls) es un

alineamiento de tres o ms secuencias biolgicas, generalmente protenas, ADN o

ARN. En general, se asume que el conjunto de secuencias de consulta que se ingresa

como entrada (conjunto problema) tienen una relacin evolutiva por la cual

comparten un linaje y descienden de un ancestro comn. Del MSA resultante, se

puede inferir la homologa, y puede llevarse a cabo el anlisis filogentico para

evaluar los orgenes evolutivos compartidos por las secuencias. Las representaciones

visuales del alineamiento ilustran mutaciones tales como mutaciones puntuales (un

solo cambio de aminocidos o nucletidos) que aparecen como diferentes caracteres

en una sola columna del alineamiento, y la insercin o supresin de mutaciones (o

gaps) que aparecen como huecos en una o varias de las secuencias en la alineacin. El

alineamiento mltiple de secuencias a menudo se utiliza para evaluar la conserv acin

de los dominios proteicos, las estructuras terciarias y secundarias, e incluso

aminocidos o nucletidos individuales.

Como puede ser difcil alinear a mano tres o ms secuencias de longitud

biolgicamente relevante, y casi siempre consume mucho tiempo, se utilizan

algoritmos computacionales para producir y analizar los alineamientos. Los MSA

requieren metodologas ms sofisticadas que los alineamientos de pares porque son

computacionalmente ms complejos de producir. La mayor parte de los programas de

alineamiento mltiple de secuencias usan mtodo s heursticos en

lugar de optimizacin global, porque identificar el alineamiento ptimo

entre ms de unas pocas secuencias de longitud moderada es

prohibitivamente costoso computacionalmente.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se nos proporcion las siguientes secuencias

En vista de que el programa no alcanza a reconocer todos los picos que indican la presencia de

nucletidos marcados con fluorforos, hubo que utilizar el criterio humano para hacer coincidir,

segn tamao y color de los picos, las secuencias dadas.

Despus de completado el emparejamiento se procedi a guardar la secuencia en formato

FASTA

Luego se procedi a copiar la secuencia en una sola plantilla del block de notas

Se abri el archivo fasta que contena las dos secuencias trabajadas previamente, desde el

programa Bioedit, para proceder al alineamiento mediante la herramienta ClustalW.

Luego del alineamineto se procedi a crear la secuencia concenso, con lo cual se seguira el

resto del anlisis.

Se pas a exportar la secuencia consenso a formato fasta

Para la identificacin de la especie a la cual pertenece la secuencia estudiada, se utiliz la base

de datos online Boldsystem.

En la opcin Identification se insert la secuencia consenso.

Dando como resultado que la secuencia analizada perteneca a la genero Philine.

Se realiz el mismo procedimiento con la herramienta Blastn

Con lo cual se obtuvo el siguiente resultado:

Al comparar los resultados de del Bold System y BLASTn: Se tom el criterio para seleccionar

los especmenes que se utilizaran en el anlisis filogentico.

Se descarg en formato Fasta las secuencias de los especmenes con los que se realizar el

anlisis filogentico.

Mediante el software Bioedit se realizo el alineamiento mltiple de todas las secuencias que se

analizaron.

Una vez alineadas se exportaron las secuencias en formato fasta, para su posterior anlisis

con el software MEGA.

Con el software MEGA se convirti el formato Clustal a un formato compatible.

Se realizo el anlisis filogentico utililizando el modelo Neiborg Joining

Los parmetros se utilizaron por default.

A continuacin se muestra el arbol filogentico obtenido mediante el anlisis Neiborg

Joining.

DISCUSIONES: El siguiente rbol muestra las relaciones filogenticas propuestas por el autor

PRICE, R. et al. (2011). En el cual se observa ms de una especie el mismo gnero,

adicionalmente se observan clados monofilticos y algunos otros clados que se han mantenido

a partir de un nodo basal. Los resultados obtenidos mediante nuestro anlisis informtico no

son comparables con esta referencia, pero se obtuvo algunos grupos monofilticos y clados

monotpicos. Se sugiere hacer un anlisis comparado con un mayor nmero de especmenes.

Conclusin

Se concluye que a travs de herramientas bioinformticas se puede realizar un anlisis de secuencias nucleotdicas que nos permitan dilucidar las relaciones filogenticas entre diversos organismos a partir de muestras de ADN secuenciados de genes marcadores.