TESI DOCTORAL

Programa de Doctorat: Bioquímica i Biologia Molecular. Bienni: 1996-1998

ESTUDI DELS MECANISMES IMPLICATS EN LA

REGULACIÓ HORMONAL I CÈL.LULA ESPECÍFICA DEL GEN DE LA

KIDNEY ANDROGEN-REGULATED PROTEIN (KAP), EN EL RONYÓ DE

RATOLÍ.

Memòria presentada per Montse Soler i Codina per optar al grau de Doctora

en Bioquímica i Biologia Molecular

Tesi doctoral realitzada al Centre d’Investigacions en Bioquímica i Biologia

Molecular dels Hospitals Vall d’Hebron, sota la direcció de la Dra. Anna Meseguer Navarro

Tesi adscrita al departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de

Ciències, Universitat Autònoma de Barcelona

Tutor: Dr. Simó Schwartz Riera

La interessada: La directora de Tesi:

Montse Soler i Codina Dra. Anna Meseguer Navarro

Universitat

Autònoma

de Barcelona

Índex i

ÍNDEX

Índex ii

ÍNDEX

INTRODUCCIÓ

I. Control transcripcional de l’expressió gènica en

eucariotes. Aspectes generals

II. Les hormones en el control de l’expressió gènica

II.a. Hormones esteroïdals, tiroïdals, vitamina D i àcid

retinoic

II.a.1. Receptors

A) Estructura

B) Mecanismes d’acció hormonal

a) Unió a DNA

b) Proteïnes reguladores

c) Fosforilació

d) Efectes no genòmics de les hormones

esteroïdals i tiroïdals

II.b. La cromatina en la regulació hormonal

2

10

10

13

14

16

16

17

22

25

27

1

Índex iii

II.c. Regulació androgènica i tiroïdal

II.c.1. CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs)

II.d. GH i IGF-I

II.d.1. Mecanismes d’acció de GH i d'IGF-I

III. El ronyó de ratolí

III.a. El ronyó com a model de l’acció androgènica

III.b. Descripció anatòmica

III.c. Túbul contornejat proximal

IV. El model cel.lular: Línies cel.lulars de túbul proximal

renal murí

V. La Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) com a

model d’estudi del control multihormonal de l’expressió

gènica en el ronyó

V.a. Control multihormonal de l’expressió del mRNA de

KAP

30

35

38

40

42

42

42

45

48

50

51

Índex iv

V.b. Seqüència genòmica de KAP

V.c. Seqüència nucleotídica del cDNA de KAP

V.d. Anàlisi computacional i funcional de la proteïna KAP

OBJECTIUS

MATERIAL I MÈTODES

I. Animals i tractaments

I.a. Castració

I.b. Tractament amb KClO4 1%

I.c. Tractament amb 3,5,3’-triiodotironina (T3)

I.d. Tractament amb hormona de creixement (GH)

I.e. Sacrifici dels animals

I.f. Disseny experimental

I.f.a. Anàlisi de la necessitat de T3 postnatal

I.f.a.1. Per administració exògena de T3

I.f.a.2. Per substitució del KClO4 1% per

aigua

II. Hibridació in situ

56

59

60

62

65

66

66

66

67

67

67

68

68

68

69

70

Índex v

II.a. Preparació de seccions de teixit i tractament

dels portaobjectes

II.b. Preparació de material lliure de ribonucleases

II.c. Síntesi de sondes de RNA

II.c.1. Preparació del motlle de la transcripció

in vitro

II.c.2. Reacció de transcripció in vitro

II.c.3. Protocol d’Hibridació in situ

II.c.4. Autorradiografia

III. Cultiu cel.lular

III.a. Línies cel.lulars

III.b. Medis de cultiu

III.c. Deplecció d’hormones esteroïdals i tiroïdals

del sèrum boví fetal

III.d. Hormones

III.e. Tripsinització

III.f. Contatge de cèl.lules

III.g. Congelació

III.h. Descongelació

III.i. Clonació per dilució al límit

IV. Soques bacterianes

V. Vectors

70

71

72

72

73

76

77

79

79

79

80

81

82

83

83

84

85

86

86

Índex vi

VI. Clonatge de DNA

VI.a. Preparació del vector i de l’insert

VI.b. Clonatge de productes de PCR

VI.c. Reacció de lligació

VI.d. Electro-transformació amb elevada eficiència

d’E. coli

VI.d.1. Preparació de bacteries competents

VI.d.2. Electroporació

VII. Puricació i extracció d’àcids nucleics

VII.a. Extracció de RNA total de teixit i de cèl.lules

VII.b. Purificació de DNA plasmídic a petita escala

(Miniprep)

VII.c. Purificació de DNA plasmídic a gran escala

(Maxiprep)

VII.d. Digestió del DNA

VII.e. Electroforesi de DNA de gels d’agarosa

VII.e.1. Electroforesi analítica

VII.e.2. Electroforesi preparativa

VII.f. Obtenció de DNA a partir de gels d’agarosa

VII.g. Purificació de productes de RT-PCR o PCR

VIII. RT-PCR semiquantitativa

VIII.a. Plàsmids

VIII.b. Oligonucleòtids

90

90

91

92

93

94

95

96

96

98

98

98

99

99

99

99

100

100

101

102

Índex vii

VIII.c. Condicions d’amplificació

VIII.c.1. Transcripció reversa (RT)

VIII.c.2. PCR

VIII.d. RT-PCR semiquantitativa en un sol pas

VIII.e. RT-PCR semiquantitativa en dos passos

IX. Seqüenciació automàtica

X. Extracció de proteïna

X.a. Separació de la fracció nuclear a partir de:

X.a.1.Extracció de proteïna a partir de teixit

X.a.2.Extracció de proteïna a partir de cèl.lules

X.b. Mètode de Bradford

XI. Western blot

XI.a. Electroforesi i transferència de proteïnes

XI.b. Immunodetecció de la proteïna

XII. Assaig de retardament en gel (EMSA)

XIII. Mutagènesi dirigida

XIII.a. Protocol

XIII.b. Oligonucleòtids

XIV. Transfecció transitòria

103

103

104

104

105

107

109

109

109

111

111

112

113

114

116

117

117

120

122

Índex viii

XIV.a. Plàsmids

XIV.b. Protocol de transfecció transitòria

XIV.c. Assaig CAT

XIV.c.1. Preparació d’extractes cel.lulars

XIV.c.2. Reacció β-galactosidasa

1- Colorimetria

2- Fluorimetria

XIV.c.3. Reacció CAT

XIV.d. Assaig Luciferasa

XIV.d.1. Preparació d’extractes cel.lulars

XIV.d.2. Reacció dual luciferasa

RESULTATS

I. Determinació del període del desenvolupament murí

en el que la T3 permet la resposta cortical dependent

d’andrògens del gen del KAP

I.a. Efecte de T3 i GH en la resposta cortical del gen del KAP

en ratolins C57BL/6 amb hipotiroïdisme postnatal

I.b. Diferències en l’expressió cortical mitjançada per T3 en

mascles i femelles C57BL/6

122

124

126

126

127

127

128

128

130

130

130

131

132

132

139

Índex ix

II. Estudi de la relació entre l’hormona tiroïdal, les

C/EBPs i l’expressió del gen del KAP en el ronyó murí

durant el desenvolupament postnatal

II.a. Expressió endògena de KAP, C/EBPα i C/EBPβ

en ratolins mascles C57BL/6 control, hipotiroïdals i

castrats, a nivell transcripcional i de proteïna (C/EBPα

i C/EBPβ)

II.b. Efecte de la T3 sobre p42C/EBPα i p35C/EBPβ i la

capacitat de transactivació del gen del KAP

III. Determinació de la capacitat de resposta a

andrògens de les línies cel.lulars renals PKSV-PCT i

PKSV-PR, utilitzant com a model el gen del KAP

III.a. Clonació de PKSV-PCT i PKSV-PR

III.b. Transactivació dependent d’andrògens del promotor

del gen del KAP en PCT3 i PR10

III.c. Especificitat cel.lular del promotor del gen del KAP

III.d. Assaig de retardament en gel del putatiu element de

resposta a andrògens (ARE)

140

141

143

145

146

147

149

151

Índex x

III.e. Assaig funcional de l’element de resposta a andrògens

(ARE)

IV. Correlació de la regulació multihormonal del gen

del KAP observada en el ronyó de ratolí amb el

comportament del promotor de KAP en les línies

cel.lulars renals PKSV-PCT i PKSV-PR

IV.a. La T3 i el promotor del gen del KAP en PCT3

IV.b. Expressió endògena del gen del KAP en PCT3 i PR10

IV.c. L’IGF-I i el vanadat sòdic modifiquen la capacitat de

transactivació dependent d’andrògens del promotor del

gen del KAP en PCT3 i PR10

IV.d. Assaig funcional de la capacitat transactivadora de

C/EBPα i C/EBPβ sobre el promotor de KAP

IV.e. Expressió endògena de C/EBPα i C/EBPβ en PCT3 i

PR10

IV.f. Identificació de dos putatius elements de resposta a

proteïnes de la família de C/EBPs

153

155

155

157

159

163

165

169

Índex xi

IV.g. Andrògens i C/EBPs en la transactivació del promotor

del gen del KAP

IV.h. Expressió endògena d’AP-2 en PCT3, PR10 i ronyó

murí

IV.i. Assaig funcional d’AP-2α amb el promotor de KAP

V. Model proposat

DISCUSSIÓ

CONCLUSIONS

BIBLIOGRAFIA

ABREVIATURES

AGRAÏMENTS

172

175

176

178

181

209

214

247

252